（农业昆虫与害虫防治专业论文）虫酰肼对甜菜夜蛾表皮形成相关酶活性的影响.pdf

缩写符号说明 英文缩写 英文全称 p o p h e n o l o x i d a s e t ht y r o s i n eh y d r o x y l a s e d d c d o p a d e c a r b o x y l a s e g g r a m c m 3 c u b i cc e n t i m e t e r d d a y k g k i l o g r a m l l i t e r l c 5 0 m e d i a ll e t h a lc o n c e n t r a t i o n i c 5 0 m e d i a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t l o n m g 1 0 弓g ，m i l l i g r a m n 曲 m i n u t e m l 10 弓l ，m i l l i l i t e r 衄 1 0 - 9 m ，1 0 9 m e t e r o d o p t i c a ld e n s i t y p r p r o t e i n h h o u r r m i n - 1 r o t a t i o np e rm i n u t e s s e c o n d p g 1 0 g ，m i c r o g r a m u l 10 l ，m i c r o l i t r e u m 0 1 l - 1 10 6 m o l l i 伽n o l 。l - l 10 。t o o ! l - 1 r n i n 0 儿m h f l 10 3 m o l l - 1 m i n l 哪0 1 l 一h 酊1 10 6 m o l l - 1 + m i n l 11111i iii iif i i i i i i ii iii r f lil l r l lr y 17 8 6 8 2 2 中文全称 酚氧化酶 酪氨酸羟化酶 多巴脱羧酶 克 立方厘米 天 千克 升 致死中浓度 抑制中浓度 毫克 分钟 毫升 纳米 光密度 蛋自质 小时 转| 食锇 秒 微克 微升 微摩尔升 毫摩尔升 毫摩尔升分钟 微摩尔升分钟 u v u l t r a - v i o l e t紫外 m e s 2 。( n m o f p h 0 1 i n 0 垮n l a n e s m f o m ca c m2 ( n 吗啉基) 乙磺酸 n y a r a t e d t t d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 。吣4 州2 删- a m i n 只o - 8 6 , 蛐7 - d i m e m t h y 衅l - 础m 墨6 - 6 , 7 8 - 茗麓 目录 中文摘要1 a b s t r a c t - 3 1 引言5 1 1 甜菜夜蛾的发生危害5 1 2 昆虫蜕皮机理- 6 1 2 1 昆虫的蜕皮过程。6 1 2 2 蜕皮过程中有关酶的作用8 1 3 昆虫蜕皮激素及其类似物研究现状1 1 1 3 1 昆虫蜕皮激素的现状1 1 1 3 2 蜕皮激素与e c r 的作用方式。1 2 1 3 3 具有蜕皮激素活性杀虫剂1 2 1 4 本研究的目的意义1 6 2 材料与方法17 2 1 供试甜菜夜蛾1 7 2 2 供试药剂18 2 3 供试化学试剂1 8 2 4 主要仪器1 9 2 5 毒力测定方法2 0 2 6 试虫处理方法2 0 2 6 1 不同龄期幼虫处理方法2 0 2 6 2 虫酰肼对5 龄幼虫不同处理时间的处理方法j 2 0 2 6 3 5 龄幼虫不同组织取样方法2 1 2 。6 4 测定蛹期酚氧化酶的幼虫处理方法2 1 2 7 数据处理方法2 1 2 8 酶源蛋白质含量测定2 1 2 8 1 试剂配制2 1 2 8 2 标准曲线的制备2 2 2 8 3 酶源蛋白质含量测定方法2 2 2 9 虫酰肼对酚氧化酶活性的影响2 2 2 9 1 酶源制备方法2 2 2 9 2 酚氧化酶活性测定方法2 2 2 1 0 虫酰肼对几丁质酶活性的影响2 4 2 1 0 1 酶液制备方法2 4 2 1 0 2 几丁质酶活性测定2 4 2 11 虫酰肼对多巴脱羧酶活性的影响2 5 2 11 1 酶液制备方法2 5 2 11 2 多巴脱羧酶活性测定2 5 2 1 2 虫酰肼对酪氨酸羟化酶活性的影响2 6 2 1 2 1 酶液制备方法2 6 2 1 2 2 酪氨酸羟化酶活性测定2 7 3 结果与分析2 9 3 1 虫酰肼对甜菜夜蛾不同龄期幼虫的毒力2 9 3 2 虫酰肼对酚氧化酶活性的影响3 2 3 2 1 甜菜夜蛾离体酚氧化酶活力的影响3 2 3 2 2 甜菜夜蛾活体酚氧化酶活力的测定结果3 6 3 2 3 蛋白质标准曲线4l 3 3 虫酰肼对几丁质酶活性的影响4 1 3 3 1 虫酰肼对不同龄期幼虫几丁质酶活力的影响j 4 1 3 3 2 虫酰肼对5 龄幼虫不同处理时间酚氧化酶活力的影响4 2 3 3 3 虫酰肼对5 龄幼虫不同组织几丁质酶活性的影响4 4 3 4 虫酰肼对多巴脱羧酶活性的影响4 6 3 4 1 虫酰肼对5 龄幼虫不同时间多巴脱羧酶活力的影响4 6 2 虫酰肼对5 龄幼虫不同组织多巴脱羧酶活性的影响4 7 3 5 虫酰肼对酪氨酸羟化酶活性的影响4 9 3 5 1 虫酰肼对5 龄幼虫不同处理时间酪氨酸羟化酶活力的影响4 9 3 5 2 虫酰肼对5 龄幼虫不同组织酪氨酸羟化酶活性的影响5 0 4 讨论5 ：1 4 1虫酰肼对甜菜夜蛾不同龄期幼虫的毒力5 2 4 2 虫酰肼对酚氧化酶活性的影响5 3 4 3 虫酰肼对几丁质酶活性的影响5 4 4 4 虫酰肼对多巴脱羧酶活性的影响5 5 4 5 虫酰胼对酪氨酸羟化酶活性的影响5 6 5 全文结论及主要创新点。5 8 5 1 虫酰肼对不同龄期甜菜夜蛾的毒力5 8 5 2 虫酰肼对甜菜夜蛾表皮形成有关酶的生化作用5 8 5 3 酰基肼类杀虫剂作用机理的探讨5 8 6 参考文献5 9 7 致谢7 0 8 攻读学位期间发表论文情况。7 1 i 学硕士学位论文 审寺墒季 本文采用饲料浸毒法测定了虫酰肼对甜菜夜蛾2 至5 龄幼虫的毒力； 并进一步测定了虫酰肼对甜菜夜蛾幼虫体内酚氧化酶、几丁质酶、多巴脱 羧酶和酪氨酸羟化酶的酶活力的影响，探讨了虫酰肼的作用机理。主要实 验结果如下： ( 1 ) 采用饲料浸毒法测定了虫酰肼对甜菜夜蛾2 至5 龄幼虫的毒性， 药剂处理7 2h 结果表明，虫酰肼对2 至5 龄幼虫的l c 5 0 值分别为3 5 3 2 p m o l l 、8 6 8 01 t m o l l 、1 1 5 9 7p m o l l 和1 5 1 2 8g m o l l 。 ( 2 ) 虫酰肼对甜菜夜蛾幼虫酚氧化酶活性的测定结果表明，随着虫酰 肼浓度增大，酚氧化酶活力呈逐渐下降趋势，虫酰肼对酚氧化酶的抑制中 浓度( i c 5 0 ) 为5 4 3g m o l l 。虫酰肼对酚氧化酶的抑制作用表现为混合型 抑制，游离酶抑制常数( k ) 和酶底物络合物抑制常数( k 。) 分别为11 2 2 3 p m o l l 和3 4 0 3 6g m o l l ；推测虫酰肼对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用不 是与该酶活性中心的铜离子结合，而可能是与酚氧化酶蛋白结合发生作用 有关；虫酰肼对甜菜夜蛾不同龄期体内酚氧酶酶活也表现为抑制作用，随 着龄期增加、药剂浓度增大和处理时间的增长，抑制作用也逐渐加强，到 5 龄时达到最大；随着化蛹后日龄增多，虫酰肼对酚氧化酶的抑制作用增 强。虫酰肼对不同组织部位酚氧化酶、多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶活力的 测定结果表明：随着用虫酰肼处理时间延长，两个剂量的抑制作用基本呈 逐渐增大趋势；处理后相同时间，高剂量的虫酰肼对酚氧化酶、多巴脱羧 酶和酪氨酸羟化酶活性的抑制率基本上高于低剂量的抑制率；虫酰肼对头 部酚氧化酶的抑制率最高，表皮最低。2 4h 和4 8h 后虫酰肼对幼虫不同组 织多巴脱羧酶的抑制率顺序为：脂肪体 表皮 血淋巴 中肠 头。但到7 2h 后抑制率顺序为：表皮 血淋巴 脂肪体 中肠 头部。虫酰肼对幼虫不同 组织酪氨酸羟化酶的抑制率顺序为：表皮 脂肪体 血淋巴 中肠 头部。 ( 3 ) 用虫酰肼处理甜菜夜蛾幼虫几丁质酶活力测定结果表明，虫酰肼 对甜菜夜蛾不同龄期体内几丁质酶表现为激活作用，随着龄期增加、药剂 浓度增大和处理时间的增长，激活作用也逐渐加强，到5 龄时达到最高； 虫酰肼对不同组织部位几丁质酶活力的测定结果表明：随着用虫酰肼处理 时间延长，两个剂量的激活作用基本呈逐渐增大趋势；处理后相同时间， 皇堕堕翌堕茎壅丝室鏖垄盛塑茎墼垩丝塑堑堕 高剂量的虫酰肼对几丁质酶活性的激活率基本上高于低剂量的激活率；虫 酰肼对幼虫不同组织几丁质酶的激活率顺序为：中肠 表皮 脂肪体 血淋 巴。 关键词：甜菜夜蛾；虫酰肼；酚氧化酶；多巴脱羧酶；酪氨酸羟化酶； 作用机理。 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，t h et o x i c i t yo ft e b u f e n o z i d et o2 n d 5 mi n s t a rl a r v a eo ft h e c o m m o na r m y w o r m ，s p o d o p t e r ae x i g u a ( h f i b n e r ) ，w a sd e t e c t e da n dt h ee f f e c t o ft e b u f e n o z i d eo np h e n o l o x i d a s e ( p o ) ，c h i t i n a s e ，d o p ad e c a r b o x y l a s e ( d d c ) a n dt y r o s i n eh y d r o x y l a s e ( t i - i ) a c t i v i t yo fl a r v a ea n dp u p a ，w a sd e t e r m i n e d t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t h et o x i c i t yo ft e b u f e n o z i d et 0 2 n d 5 也i n s t a rl a r v a et e s t e db ys u p p l y i n g w i t ht e b u f e n o z i d e - t r e a t e da r t i f i c a ld i e tt oe a tf o r7 2hw a st h a tt h el c 5 0f r o m2 r i a lt o 5 t hi n s t a rl a r v a ew e r e3 5 3 2i _ t m o l l ，8 6 8 0l - t m o l l ，1 15 9 7i - t m o l la n d151 2 8 l a m o l l ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) t h ei n h i b i t o r ye f f e c to ft e b u f e n o z i d eo np oi n5 t hi n s t a rl a r v a eo f e x i g u aw a sd e t e r m i n e d f i f t hi n s t a rl a r v a eo f & e x i g u aw e r es u p p l i e d 、析t h t e b u f e n o z i d e - t r e a t e da r t i f i c a ld i e tt oe a tf o rd i f f e r e n tt i m e sa n dt h ei n h i b i t o r y e f f e c to f t e b u f e n o z i d eo np 0e x t r a c t e df r o mt e b u f e n o z i d e t r e a t e da n d n o n - t r e a t e d5 t hi n s t a rl a r v a ew e r ed e t e r m i n e db yb i o c h e m i c a lm e t h o d s t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt e b u f e n o z i d ec o u l di n h i b i tp oa c t i v i t yo b v i o u s l y ，a n dt h e i n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o no ft e b u f e n o z i d em i x e d 、) l ，i mp od i r e c t l yl e a d i n gt o 5 0 a c t i v i t yl o s s ( i c 5 0 ) w a s5 4 3i - t m o l l t h ei n h i b i t o r ym e c h a n i s mo f t e b u f e n o z i d eo np ow a sam i x e d - c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o nf o ro x i d a t i o no f o - d i h y d r o x y b e n z e n e ，t h ed i s s o c i a t i v ee n z m y ei n h i b i t i o nc o n s t a n t ( 墨) a n d e s i n h i b i t i o nc o n s t a n t 慨) w e r el1 2 2 3i - t m o l l a n d3 4 0 3 6i t m o l l 1 ， r e s p e c t i v e l y t h i si n h i b i t i o nm a ye a r l yo u tt h r o u g ht e b u f e n o z i d ed i r e c t l y c o m b i n i n gw i t he n z y m ep r o t e i nw h i l em a yb en o tc h e l a t i n gw i t hc 十i n 也e a c t i v ec e n t e ro fp o w i t hl a r v a ei n s t a ri n c r e a s i n g ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c tt op o b e c a m es t r o n g e r ，e s p e c i a l l yt ot h e5 协i n s t a rl a r v a e w 弛t h et r e a t e dt i m e i n c r e a s i n g ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c ta l s ob e c a m es t r o n g e r 1 1 1 ep oa c t i v i t y i n d i f f e r e n tt i s s u eo f5 t hi n s t a rl a r v a ew a sa l s os i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e da f t e rt h e l a r v a ew e r et r e a t e dw i t ht e b u f e n o z i d e 1 1 1 ei n h i b i t i o nr a t e si n c r e a s e dw i t h t e b u f c n o z i d e t r e a t e dt i m ei n c r e a s i n g ，a n di n h i b i t i o nr a t e so f8 5 2 3i ，t m o l l 1 w e r ea l m o s th i g h e rt h a nt h o s eo f2 8 4 1l a m o l l 。1i nt h es a m et i s s u e sa tt h e 3 虫酰肼对甜菜夜蛾表皮形成相关酶活性的影响 s a m el e n g t ho ft e b u f e n o z i d e t r e a t e dt i m e s t h eo r d e r so fi n h i b i t i o nr a t e so fp o b yt e b u f e n o z i d ei nd i f f e r e n tt i s s u e sa tt h es a m el e n g t ho ft i m e sw e r eh e a d h e m o l y m p h e p i d e r m i s t l l eo r d e r s o fi n h i b i t o r yr a t e so fd d cb y t e b u f e n o z i d ei nd i f f e r e n tt i s s u e sa t2 4ha n d4 8hw e r ef a tb o d y e p i d e r m i s h e m o l y m p h m i d g u t h e a d ，a n d a t7 2 hw e r ee p i d e r m i s h e m o l y m p h f a t b o d y m i d g u t h e a d t h eo r d e r so fi n h i b i t o r yr a t e so ft hb yt e b u f e n o z i d ei n d i f f e r e n tt i s s u e sa tt h es a m el e n t ho ft i m e sw e r ee p i d e r m i s f a tb o d y h e m o l y m p h m i d g u t h e a d ( 3 )ma c t i v 撕o ne f f e c to ft e b u f e n o z i d eo nc h i t i n a s eo f1 a r v a eo f & e x i g u ad e t e r m i n e dw a st h a tw i t hl a r v a ei n s t a ri n c r e a s i n g ，t h ea c t i v a t i o ne f f e c t s b e c a m es t r o n g e r ，e s p e c i a l l yt ot h e5 恤i n s t a rl a r v a e w i mt h et r e a t e dt i m e i n c r e a s i n g ，t h ea c t i v a t i o ne f f e c ta l s ob e c a m es t r o n g e r t h ec h i t i n a s ea c t i v i t yi n d i f f e r e n tt i s s u e so f5 t hi n s t a r1 f l r v a ew a sa l s os i g n i f i c a n t l ya c t i v a t e da f t e rt h e l a r v a ew e r et r e a t e dw i t h t e b u f e n o z i d e ，r e s p e c t i v e l y t h ea c t i v a t i i o nr a t e s i n c r e a s e dw i t ht e b u f e n o z i d e t r e a t e dt i m ei n c r e a s i n g a n da c t i v 撕o nr a t e so f 8 5 2 3 m 0 1 lw e r ea l m o s th i g h e rm a l lt h o s eo f2 8 4 1b m o l li nt 1 1 es a m e t i s s u e sa tt h es a m el e n t ho ft e b u f e n o z i d e t r e a t e dt i m e s t h eo r d e r so f a c t i v a t i o nr a t e so fc h i t i n a s eb yt e b u f e n o z i d ei nd i f f e r e n tt i s s u e sa tt h es a m e l e n t ho ft i m e sw e r em i d g u t e p i d e r m i s f a tb o d y h e m o l y m p h k e y w o r d s ：s p o d o p t e r ae x i g u a ；t e b u f e n o z i d e ；p h e n o l o x i d a s e ( p o ) ；d o p a d e c a r b o x y l a s e ( d d c ) ；t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ( t h ) ；a c t i o nm e c h a n i s m 4 山东农业大学硕士学位论文 1 1 甜菜夜蛾的发生危害 1 引言 甜菜夜蛾( s p o d o p t e r ae x i g u ah t i b n e r ) 又名贪夜蛾、褐纹夜蛾，属鳞 翅目( l e p i d o p t e r a ) 、夜蛾科( n o c t u i d a e ) 、杂夜蛾亚科( a m p h i p y r i n a e ) 、 灰翅夜蛾属( s p o d o p t e r a ) ，是一种世界性分布的多食性重要农业害虫。 甜菜夜蛾从北纬4 0 - - - 5 7 0 到南纬3 5 - - 4 0 0 之间均有分布，在亚洲、北美洲、欧 洲、澳洲及非洲均有发生危害记录( 罗礼智等，2 0 0 0 ) 。该虫起源于南亚地 区，在热带和亚热带地区常年发生( 任兰花等，2 0 0 5 ) ，温带地区亦经常 大发生。该种害虫在我国长期以来一直为次要害虫，二十世纪中后期以来， 在我国发生地区不断扩大，危害程度也日趋严重。特别是近年来随着气候 条件和栽培制度的变化，甜菜夜蛾不仅连续多年在我国南方地区和长江流 域暴发危害，而且北方地区也常遭受其严重危害。因其食性杂、寄主范围 广，迁飞性，又特别喜食蔬菜、大豆、花生、玉米及棉花等作物，给农业 生产带来很大影响( 王开运等，2 0 0 2 ) ，据统计，甜菜夜蛾在我国的危害 已遍及2 0 多个省市，寄主植物涉及g u 3 5 科，1 0 8 属的1 3 8 种植物( 刘向阳等， 2 0 0 7 ) 。不仅严重危害玉米、高粱等粮食作物，而且还对蔬菜、花卉、果 树、烟草、棉花、甜菜等经济作物以及城市绿化草坪进行为害，造成重大 损失( 张悦丽等，2 0 0 4 ；迟立鹏等，2 0 0 5 ；代建堂等，2 0 0 6 ；郭平等，2 0 0 7 ； 朱加萍等，2 0 0 8 ) 。甜菜夜蛾成为制约我国农业生产发展的主要害虫之一。 目前，我国对甜菜夜蛾的防治仍以化学防治为主，但据抗性监测结 果表明，甜菜夜蛾对农药的抗性发展非常迅速，甜菜夜蛾易对有机磷、拟 除虫菊酯、氨基甲酸酯类和苯甲酰苯脲类等多种常规化学农药产生抗性 ( 董易之等，2 0 0 5 ；何玉仙，2 0 0 6 ；张纯胄等，2 0 0 7 ；刘玮玮等，2 0 0 8 ) ， 很难控制甜菜夜蛾的爆发危害，必须寻找其它的方法。而且有人认为甜菜 夜蛾在我国的发生危害逐渐严重，其原因是过分单一应用化学农药、杀虫 剂的不合理使用，加之这些杀虫剂本身固有的缺点，引发了一系列问题， 如害虫的抗药性持续增长，药剂防效降低；药剂在环境中残留期长，不易 降解造成环境污染；药剂选择性差，对人畜不安全，杀伤天敌和非靶标生 虫酰肼对甜菜夜蛾表皮形成相关酶活性的影响 物，不利于害虫的综合治理等( 兰亦全等，2 0 0 5 ；刘永杰等，2 0 0 5 ) 。 随着人们对环境意识的提高以及可持续农业发展战略的实施，蔬菜害 虫生物防治在害虫综合治理中的作用已越来越被人们重视，人们越来越需 要一种新型的“公共植保”和“绿色植保”为理念的治理方法。在众多的农药 类型中，昆虫生长调节剂( i n s e c tg r o w t hr e g u l a t o r s ) 是通过抑制昆虫生理 发育，如抑制蜕皮、抑制新表皮形成、抑制取食等导致害虫死亡的一类药 剂，其以安全、高效、对人类和天敌以及环境友好等特点可称为“第三代 农药 ( 王彦华等，2 0 0 7 ) 。以胃毒作用为主、新作用靶标、与有机磷、 拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类杀虫剂无明显交互抗性( 幕卫等，2 0 0 5 ) ，且 具有良好的生态安全性的昆虫蜕皮激素类杀虫剂虫酰肼则被纳入到i p m 和i r m 的防治体系中。模拟昆虫蜕皮激素作用开发的虫酰肼等酰基肼类杀 虫剂对鳞翅目、双翅目及鞘翅目害虫具有突出的选择杀虫活性( 崔全敏等， 2 0 0 8 ) ，对益虫等非靶标生物和环境非常安全( 张钟宪等，2 0 0 7 ；贾变桃， 2 0 0 8 ) ，是实施有害生物综合治理的重要优选药剂，也是当前环境友好杀 虫剂新品种开发和毒理机制研究的重点领域( c a r m i c h a e l 等，2 0 0 5 ；刘永 杰等，2 0 0 7 ；k e 等，2 0 0 9 ) 。虫酰肼是双酰肼类仿2 0 羟基蜕皮酮杀虫剂， 系昆虫生长调节剂的一种，主要通过抑制害虫取食、加速并重复蜕皮，使 幼虫表皮发黑、变薄、变脆且不能正常爬行，最终导致害虫死亡( 王贻莲 等，2 0 0 6 ) 。 1 2 昆虫蜕皮机理 昆虫的体壁由里到外可分为底膜、皮层细胞和表皮层三部分。 1 2 1 昆虫的蜕皮过程 昆虫的蜕皮过程一般需要经过皮层溶离、新表皮沉积、蜕去旧表皮、 新表皮的鞣化和暗化等步骤，这些过程必须在蜕皮激素的调控作用下，才 能有条不紊的进行。 1 2 1 1 皮层溶离 昆虫在脱皮前，首先表现为不食不动，排空肠道内容物，并进入静止 状态。在此期间虫体进行一系列复杂的生理生化变化。真皮细胞首先进行 6 山东农业大学硕士学位论文 有丝分裂，并有原来扁平状变为排列紧密的圆柱状，基膜皱缩，顶膜出现 微绒毛，与旧内表皮层分离，并开始分泌蜕皮液。皮细胞与旧表皮之间出 现离层的现象叫皮层溶离。 蜕皮液包含蛋白酶和几丁质酶等许多酶类，但这些酶最初是无活性 的，当真皮细胞顶端分泌出小片表皮质，并迅速相互愈合，经其中的多元 酚和多元酚氧化酶的作用鞣化表皮质层时，这些酶即活化并开始消化旧的 内表皮。 1 2 1 2 新表皮的沉积 新表皮沉积是真皮细胞将新表皮成分分泌于真皮层之外、脱皮液和脱 皮膜之下的过程。具体步骤如下：分泌表皮质层于脱皮液下方。分泌 几丁质、蛋白质等混合物沉积于表皮质层下方，形成原表皮，同时分泌消 化液消化和吸收旧内表皮。分泌多元酚和氢醌类化合物及相应的酶类经 孔道输送到表皮质层上方，形成多元酚层。行将脱皮前，分泌蜡质于多 元酚层或角质精层上方，形成蜡层。脱皮时或脱皮后，由皮细胞腺分泌 脂类、蜡质及蛋白质等混合物经孔道输送到蜡层上方，形成护蜡层。 1 2 1 3 脱皮和虫体长大 脱皮过程：在新表皮形成的同时，旧内表皮被脱皮液消化并由真皮细 胞吸收，最后仅剩下旧上表皮和外表皮，有时还剩下内表皮的几个片层， 这些层次与脱皮膜作为蜕一同脱去。 虫体长大：刚脱皮的虫体由于外表皮尚未形成，色浅而柔软，具有 一定的延展性，虫体可通过吸入空气增加血液压力，使体壁展开，体积也 随之迅速增大，翅也随之展开。 1 2 1 4 表皮的鞣化和暗化 表皮的鞣化和骨化一般出现在昆虫蜕皮后不久。鞣化作用是指醌类物 质同原表皮中的蛋白质分子发生交联，形成鞣化蛋白，使表皮变硬的过程。 表皮的鞣化作用有两种途径，即醌鞣化和p 一骨化。首先由血液内的酪氨酸 转化成n _ 一乙酰多巴胺，然后进入表皮层，它在表皮内酚氧化酶的作用下 变成n 一乙酰多巴醌，然后通过苯环与蛋白质交联，形成鞣化蛋白质。由 7 虫酰肼对甜菜夜蛾表皮形成相关酶活性的影响 于鞣化过程中所产生的醌常聚合成色素，因而在醌鞣化时往往同时发生暗 花。骨化是表皮变硬的另一个机制，是由n 二乙酰多巴胺经过支链活化后， 一苯环支链p 一碳原子与蛋白交联，使之脱水变硬的过程，也称p 一骨化。暗 化作用是表皮中的酪氨酸氧化反应的另一条重要途径。是醌类物质聚合成 醌多聚物( 真黑素) ，使虫体颜色加深的过程( s u g u m a r a n 等，2 0 0 0 ；w i t t k o p p 等，2 0 0 3 ；f u t s h a s h i 等，2 0 0 5 ；朱福兴等，2 0 0 7 ) 。 1 2 2 蜕皮过程中有关酶的作用 昆虫的脱皮过程般需要经过皮层溶离、新表皮沉积、蜕去旧表皮、 新表皮的鞣化和暗化等步骤，在皮层融离过程中分泌脱皮液。蜕皮液中包 括一些蛋白酶和几丁质酶。表皮形成以后会发生鞣化和暗化作用，即醌类 物质同原表皮中的蛋白质分子发生交联，形成鞣化蛋白，使表皮变硬以及 醌类物质聚合成醌多聚物( 真黑素) ，使虫体颜色加深的过程。这些过程 产生了许多物质和相应的酶系，在这些酶的作用下有条不紊的进行脱皮。 这些酶系有酚氧化酶( p o ) 、几丁质酶( c h i t i n a s e ) 、多巴脱羧酶( d d c ) 、 酪氨酸羟化酶( t h ) 等。 1 2 2 1 酚氧化酶 酚氧化酶( p h e n o l o x i d a s e ，p o ，哺乳动物称为酪氨酸酶) 是生物体内 普遍存在的氧化酶，是昆虫体内的一种重要酶类，酪氨酸酶是二价铜离子 ( c u 2 + ) 与酶蛋白相结合的一种金属酶，兼有加氧酶和氧化酶的双重功能， 能将单酚加氧成二酚，又可以将二酚等多元酚氧化成醌，酪氨酸酶的这种双 重反应功能( 孟凤霞等，2 0 0 4 ) 。在硬化过程中，酚氧化酶产生的醒与角 蛋白及甲壳质相互作用，最终交联形成角质，多酚氧化酶使昆虫体内酪氨 酸发生羟基化作用形成多巴，多巴进而转变成n 一乙酰多巴胺，在多酚氧 化酶作用下进一步形成醌，醌与蛋白质结合导致硬化和黑化( s u g u m a r a n 等，2 0 0 0 ；w i t t k o p p 等，2 0 0 3 ；f u t s h a s h i 等，2 0 0 5 ) 。n 一乙酰多巴胺在 多酚氧化酶作用下先形成醌的衍生物，该衍生物在脱乙酰或羧基后，经 非酶促缩合成为一个吲哚结构，此吲哚结构又以各种方式聚合形成黑色 素( 高兴祥等，2 0 0 4 ；f u t a h a s h ia n df u j i w a r a ，2 0 0 5 ) 。酚氧化酶催化完 成的“醌鞣化”作用可以促进昆虫表皮的硬化与黑化，这个过程对于具有 ii iiliiiliilliilill 山东农业大学硕士学位论文 “外骨骼”的昆虫生命过程至关重要( 肖婷等，2 0 0 7 ) 。 在昆虫体内，酚氧化酶存在于血淋巴、中肠和表皮等组织中。多数昆 虫在正常生理状态下，酪氨酸酶以酶原( p r o p o ) 的形式存在。p o 在角质硬 化、伤口愈合以及在寄生的防御反应中作为非自身识别系统发挥功能 ( s u g u m a r a n 等，1 9 9 8 ；a n d e r s e n 等，1 9 9 6 ；w a n g 等，2 0 0 5 ；陈清西等， 2 0 0 6 ) 。 1 9 9 3 年，我国著名昆虫毒理学家张宗炳先生就曾经指出“探索新杀虫 药剂的一条最有希望的途径是生物合理途径，其中酪氨酸酶( 即酚氧化酶) 抑制剂名列前茅”( 张宗炳等，1 9 9 3 ) 。s u g u m a r a n 等( 2 0 0 0 ) 报道在烟 草天蛾的幼虫表皮中分离出一种热稳定性的酪氨酸酶抑制剂，它有较广的 作用谱，不但能抑制昆虫的酪氨酸酶，而且对植物和真菌的酪氨酸酶也有 抑制作用。高效氯氰菊酯、灭多威和辛硫磷处理甘蓝1 d 后，甘蓝的多酚氧 化酶活性有降低的趋势，表现为先降低，随后逐渐升高( 王丽红等， 2 0 0 4 ) 。马拉硫磷、毒死蜱、乐果、敌敌畏、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯对 家蝇酪氨酸酶无抑制作用( 刘春燕等，2 0 0 4 ) 。 1 2 2 2 几丁质酶 几丁质是昆虫表皮和中肠围食膜的重要组成成分，表皮中的几丁质作 为外骨骼的支架材料，与硬化蛋白一起构成外骨骼，使外骨骼成为一种刚 性结构。围食膜( p e r i t r o p h i c ) 中的几丁质则在食物颗粒与肠道细胞之间 构成一道保护屏障，避免细胞受到较硬的食物颗粒的损伤( 杨化恩等， 2 0 0 7 ) 。昆虫生长发育的各个时期都需要一定量的几丁质，昆虫体内几丁 质处于几丁质合成酶和几丁质分解酶共同作用的动态平衡中，几丁质酶的 表达水平对昆虫几丁质的代谢起着重要的调控作用( 周利琳等，2 0 0 9 ) 。 几丁质酶可以降解几丁质为低分子量，可溶或不可溶的寡糖，通过破坏昆 虫的几丁质，或抑制几丁质酶的活性，都可以影响昆虫的生长发育( 肖业臣 等，2 0 0 3 ) 。 昆虫几丁质酶现已被发现存在于所分泌的蜕皮液，以及毒腺和中肠内 ( r e y n o i 等，19 9 6 ；b e m a l d 等，19 9 9 ) 。几丁质分解是通过几丁质降解酶 系完成的，几丁质降解酶系包括儿丁质酶( c h i t i n a s e ) 和n 乙酰葡萄糖胺酶 ( n - n a c e y t g l u e o s m a i n i d a s e ) 。几丁质是a n 乙酰1 3d 葡萄糖氨( n a g ) 为 9 虫酰肼对甜菜夜蛾表皮形成相关酶活性的影响 单体，借d - 1 ，4 糖苷键连接而成的直链多聚物，几丁质酶能够催化几丁质水 解为几丁寡糖和n - 乙酰氨基葡萄糖( 石晓珍等，2 0 0 8 ) 。 几丁质酶可以作为害虫杀虫特定靶标，防治某些害虫并且该类药剂对 人畜较为安全，是环境友好农药( f i t e h e s 等，2 0 0 4 ；杨化恩等，2 0 0 7 ) 。蜕 皮激素类药剂干扰昆虫蜕皮过程不仅是打破激素平衡问题，还可能影响到 昆虫的防御和代谢。烟草天蛾几丁质酶对市场锯谷盗具有毒性( w a n g 等， 1 9 9 6 ) 。几丁质酶可以分解掉昆虫、线虫的表皮、围食膜、虫卵、及真菌 的细胞壁，同时也可引发其它一些防御物质的释放，增强寄主的抗性。烟 草天蛾几丁质酶现己证明能够增强重组杆状病毒的杀虫活性。几丁质酶作 为生物防治的增效因子，已经广泛应用于对鳞翅目害虫的生物防治中( 林 毅等，1 9 9 8 ) 。 1 2 2 3 多巴脱羧酶 多巴脱羧酶( d o p ad e c a r b o x y l a s e ，d d c ) 是一种将多巴( 3 ，4 一d m y _ d r o x y p h e n y l a l a n i n e ，d o p a ) 代谢为多巴胺( d o p a m i n e ) 的酶类( b e r r y 等， 1 9 9 6 ；m o n a s t i r i o t i ，1 9 9 9 ) ，参与表皮形成过程中的的骨化，它也是昆虫 表皮物质黑色素合成中的关键酶( n a g y 等，2 0 0 2 ) 。多巴脱羧酶的活性与 多巴的含量有密切关系。在昆虫体内，它主要存在于表皮、神经系统和卵 巢细胞等中( t i m o l e o n 等，1 9 9 8 ) ，多巴脱羧酶的活性有两个高峰分别是 幼虫蜕皮和羽化时期，从而证实了多巴脱羧酶在昆虫脱皮过程中起到重要 作用。( b o s s i n a k o u 笔i e ；，1 9 9 6 ；n o g u c h i 等，2 0 0 3 ) 多巴脱羧酶的活性已经 在家蝇、果蝇、和地中海实蝇等昆虫上进行了深入的研究。在热胁迫下黑 腹果蝇体内多巴胺含量增加以及多巴脱羧酶的活性加强，证实了多巴脱羧 酶促进了多巴胺的合成。l - 多巴由酪氨酸羟化酶催化形成，是多巴脱羧酶 催化形成多巴胺的前体物质。加入l 一多巴会促进多巴胺的合成，提高多巴 胺水平，改善果蝇的运动行为。通过多巴脱羧酶活性变化影响果蝇运动， 还可间接影响果蝇的寿命( d e l u c a 等，2 0 0 3 ；v e r m e u l e n 等，2 0 0 6 ) 。多巴 脱羧酶活性受昆虫蜕皮激素的调控( n a g y 等，2 0 0 2 ) ，在表皮中当蜕皮激 素量降低时，多巴脱羧酶活性升高。当蜕皮类固醇被移除时，多巴脱羧酶 基因才得以表达( b o s s i n a k o u 等，1 9 9 6 ) 。 l o 山东农业大学硕士学位论文 1 2 2 4 酪氨酸羟化酶 酪氨酸羟化酶( t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ，t h ) 为单胺递质去甲肾上腺 ( n o r e p i n e p h r i n e ，n e ) 、多巴胺( d o p a m i n e ，d a ) 合成的重要酶之一( 李 继硕等，2 0 0 2 ) 是哺乳动物体内儿茶酚胺生物合成的限速酶，t h 在儿茶 酚胺的合成中起着催化限速作用，它的功能变化一定程度上可以反映儿茶 酚胺的合成和功能( f u t s h a s h i 等，2 0 0 5 ) 。t h 是喋呤依赖的加单氧酶 ( m o n o o x y g e n a s e ) ，催化l 一酪氨酸发生羟化反应生成l 一多巴。它以l 一酪 氨酸和分子氧为底物，以四氢生物喋呤( t e t r a h y d r o p t e r i n ，b h 4 ) 为辅酶，生 成l 一多巴、水和醌式二氢生物喋呤( n a g a s t u ，1 9 9 5 ) 。另外，据大量实 验证实t h 并非仅对酪氨酸底物具有绝对的专一性，t h 还可以催化苯丙氨 酸和色氨酸的羟化反应。u d e n f r i n d 等( 1 9 6 4 ) 证明酪氨酸轻化酶 ( t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ，t h ) 存在于脑、交感神经支配的组织核肾上腺髓质。 主要出现在含儿茶酚