（分析化学专业论文）荷叶、芦荟、茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究.pdf

摘要 荷叶、芦荟、茶叶都是常见的植物类保健食品原料，含有多种活 性成分。荷叶具有降血脂、减肥、抗菌、清除自由基等作用，它的主 要活性成分是生物碱、黄酮类物质和荷叶精油等。芦荟含有葸醌类、 多糖、有机酸、矿物质等多种化学物质，而茶叶中含有茶多酚、茶多 糖，茶叶皂甙及多种挥发性成分。随着它们在医疗、美容、保健等方 面的广泛应用，这些有效成分的提取，分离纯化及分析等方面的研究 也取得了迅速的发展。 本论文在综述了近年来植物类保健食品有效成分提取、分离纯化 和多成分同时分析检测方法进展的基础上，结合本实验室前期工作， 开展了一些对植物类保健食品原料荷叶、芦荟、茶叶中有效成分的分 离、分析及稳定性研究，并取得了一些有意义的结果。 本论文研究内容及所得结果如下： 1 以荷叶中的阿朴啡类生物碱为目标，研究了荷叶中生物碱的 分析方法，为荷叶中阿朴啡类生物碱的大孔吸附树脂分离纯化提供检 测方法：优化了大孔吸附树脂对不同阿朴啡类生物碱的洗脱条件，找 到了将荷叶碱和_ 降荷叶碱、0 降荷叶碱较好的分开，并使- 降荷 叶碱和d - 降荷叶碱同时得到有效富集的工艺条件。本方法操作简单， 重复性好。从提取率，纯度和生产成本方面考虑，是一种分离富集荷 叶中阿朴啡类生物碱的好方法，具有工业化应用前景。 2 芦荟应用非常广泛，芦荟中有效成分的稳定性直接关系到芦 荟的利用和人民的身体健康。本部分以芦荟的主要有效成分芦荟苷为 对象，研究了芦荟苷在水和甲醇中的稳定性，结果表明芦荟苷在这两 种溶剂中并不稳定。文章还以h p l c d a d - e s i - m s 为手段，初步探讨 了芦荟苷在这两种溶剂中变质可能与溶剂的极性有关，并根据实验数 据预测了2 0 时芦荟苷在甲醇和水中的储存期。 3 茶叶是中国传统饮品，茶叶香气成分的研究历来就是茶叶研 究者的研究热点。本部分采用同时蒸馏萃取装置，以铁观音、毛尖和 红茶为研究对象，对这三种茶叶的香味成分进行提取，并利用g c m s 对香气成分进行了定性定量分析，比较了三种茶叶在香气成分上的差 异，结果表明由于制作工艺上的差别，造成了三种茶叶香气成分上有 很大的区别，为进一步研究茶叶制作工艺提供了理论参考，有利于茶 叶的综合利用。 关键词：荷叶，芦荟，茶叶，大孔吸附树脂，液质联用，气质联用， 同时蒸馏萃取 a b s t r c t l o t u sl e a f , a l o ea n dt e aa r ef a m i l i a rp l a n tm a t e r i a l sf o rh e a l t hf o o d s ， a n d 也e yc o n t a i nm a n yk i n d so fa c t i v ec o m p o n e n t s t h eb i o a c t i v e c o m p o n e n t si nl o t u sl e a fw h i c ha r ea l k a l o i d s ，f l a v o n o i d s ，e s s e n t i a lo i l s a n ds oo nc a nr e d u c eb l o o d - l i p i d ，l o s ew e i g h t , h e l pa n t i m i c r o b i a la n d e l i m i n a t ef l e er a d i c a l s a l o ec o n t a i n s a n t h r a q u i n o n ec o m p o u n d s ， p o l y s a c c h a r i d e s ，o r g a n i ca c i d s ，m i n e r a le l e m e n t s ，e ta 1 a n dt h e r ea r et e a p o l y p h e n o l s ，t e ap o l y s a c c h a r i d e ，t e as a p o n i na n dv o l a t i l ec o m p o n e n t si n t e a w i t ht h e i rw i d ea p p l i c a t i o n si nm e d i c a lt r e a t m e n t s ，c o s m e t o l o g ya n d h e a l t hc a r e ，t h ee x t r a c t i o na n da n a l y s i st e c h n o l o g i e sa sw e l la ss e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o np o w e rh a v eb e e nd e v e l o p i n gq u i c k l y i nt h i sp a p e r , w es u m m a r i z e dt h ed e v e l o p i n gt e c h n o l o g i e sa n dn e w m e t h o d o l o g yo fe x t r a c t i o n , s e p a r a t i o n , p u r i f i c a t i o n ，a n ds i m u l t a n e o u s a n a l y s i sf o rl o t so fe f f e c t i v ec o m p o n e n t s o nt h eb a s i so fi t , w ed i ds o m e r e s e a r c hw o r kf o rt h ea n a l y s i s , s e p a r a t i o na n ds t a b i t i t yo ft h ee f f e c t i v e c o m p o n e n t so fl o t u sl e a f , a l o ea n dt e a , f o rt h er e f e r e n c eo ft h ef o r m e r w o r k , a n ds o m es i g n i f i c a n tr e s u l t sh a v eb e e ng o t t e n t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t so f t h i sp a p e ra r ea sf o l l o w s ： 1 i nt h ef i r s ts e c t i o n , w ed e v e l o p e dt h ea n a l y t i c a lm e t h o do f a l k a l o i d s i nt h el o t u sl e a f a n dw i t ht h ed e t e r m i n a t i o nu s i n gt h i sm e t h o d ，w e 1 1 1 o p t i m i z e dt h ee l u t i o nc o n d i t i o n so fm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nf o r d i f f e r e n ta l k a l o i d sb e l o n g i n gt oa p o r p h i n er e s p e c t i v e l y a tl a s t ，w ef o u n d as u i t a b l ee l u t i o nm e t h o dt h a tc o u l d s e p a r a t e n u c i f e r i n ef r o m n - n o m u c i f e r i n ea n do - n o m u c i f e r i n e w e l l ， w h i l e e n r i c h i n g n - n o m u c i f e r i n ea n do - n o r n u c i f e r i n et oo u rs a t i s f a c t i o n t h i si sas i m p l e m e t h o dw i t hg o o dr e p e a t a b i l i t y a n dt a k i n ge x t r a c t i o ne f f i c i e n c y , p u r i t y a n dc o s ti n t oc o n s i d e r a t i o n s ，i th a sm u c hi n d u s t r i a l i z a t i o np r o s p e c t 2 b e c a u s eo fw i d eu s eo fa l o e t h es t a b i l i t yo ft h ee f f e c t i v e c o m p o n e n t si ni ti sc l o s e l yb o u n du pw i t ha l o e sa p p l i c a t i o na n dp e o p l e s h e a l t hd i r e c t l y i nt h i ss e c t i o n ，w ed i dt h er e s e a r c hf o ra l o i n ss t a b i l i t yi n m e t h a n o la n di nw a t e r , r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea l o i ni n b o t ho ft h et w os o l v e n t sw a sn o ts t a b l e w ea l s op r o b e dt h er e a s o nf o rt h e p h e n o m e n o nu s i n gh p l c d a d e s i m ss i m p l y , a n di ts h o w e dt h a ti t w o u l db el i k e l yt oh a v es o m er e l a t i o n sw i t l ls o l v e n tp o h r i t y a n d a c c o r d i n g t ot h ee x p e r i m e n td a t e s ，w ea l s op r e d i c a t e di t ss t o r a g ep e r i o di n m e t h a n o la n di nw a t e ru n d e rt h et e m p e r a t u r eo ft w e n t y d e g r e e ， r e s p e c t i v e l y 3 i e ai sak i n do fc h i n e s et r a d i t i o n a ld r i n ka n dt h er e s e a r c hf o ri t s f r a g r a n c ei n g r e d i e n t si sah o ts p o ti nt e ar e s e a r c h e r s e y e s 【nt h et l l i i d s e c t i o n , w ec h o s et i e g u a n y i nt e a , m a o j i a nt e aa n db l a c kt e aa so b j e c t s ， e x t r a c t e dt h ef r a g r a n c ec o m p o u n d sa n dt h e nc a r r i e do u tt h eq u a l i t a t i v e a n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sf o rt h e s ef r a g r a n c ec o m p o u n d sf r o mt h et h r e e k i n d so ft e au s i n gg c m se q u i p p e dw i t hs i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o na n d s o l v e n te x t r a c t i o ni n s t r u m e n ti no r d e rt ot e l lt h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h e m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e yd i f f e r e dm u c h 劬me a c ho t h e rb e c a u s eo f t h ed i f f e r e n c e si nt h e i rf a c t u r et e c h n i q u e s t h e s er e s e a r c h e sa n dt h e i r r e s u l t sc a np r o v i d et h e o r e t i cr e f e r e n c ef o rt h et e af a c t u r et e c h n i q u e k e yw o r d s ：l o t u sl e a f , a l o e ，t e a , m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o n r e s i n ， h p l c m s ，g c m s ，s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o na n ds o l v e n t e x t r a c t i o n v 荷叶、芦荟、茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 第一章绪论 随着经济的发展，人们的生活水平逐渐提高，对健康的要求也日 益提高。由于环境污染日益严重，人们非常渴望接近大自然，因此人 们对和天然有关的事物都非常热衷，这就使植物类保健食品具有很大 的市场潜力。世界各国相继引发了研究植物类保健食品的热潮，市面 上出现了大量由植物中提取分离出来的有效成分制成的保健食品 【，这成为食品行业发展的趋势之一睁引。由于很多植物中的有效成 分被证明具有各种良好的药理活性睁1 3 1 ，这些有效成分构成了植物类 保健食品的物质基础。 但是，目前在开发植物类保健食品的过程中，还存在不少问题。 如苦味、令人难以接受的味道、不溶解性和沉淀性以及颜刨1 4 】；有些 植物中的有效成分本身没有毒害，但它与被加入的食物中的某些正常 成分是否会发生作用，从而产生有害人体健康的物质等。为了解决这 些问题，并提高我国保健食品的国际竞争力，我们必须科学地、深入 地研究植物类保健食品中的有效成分，研究这些有效成分的稳定特 性，结构特征等各种信息：研究它们的量效关系、构效关系；并且为 了提供这些有效成分检测的质量标准以及为了进行相应的毒理学等 研究，还必须尽可能多的获得高纯度的单体。而达到这些目的的前提 是必须要加强各种有效成分的分离分析和结构鉴定方法的研究；提高 各种有效成分的提取、分离纯化技术。而且有效成分的分离分析方法 硕士学位论文 和分离纯化手段是相辅相成，互相促进的，都是使植物类保健食品的 研究和开发走向现代化的重要组成部分。 1 1 植物类保健食品中有效成分的常用研究技术 1 1 1 植物类保健食品中有效成分的提取技术 要研究和开发植物类保健食品，就必须清楚地了解植物中的化学 成分，而提取是进行植物化学成分研究的第一步。实验室传统提取方 法大多数是采用溶剂提取，主要包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流 提取法、固液萃取法、液液萃取法等，这些方法使用的装置比较常 见，使用较为普遍，但却耗费比较多的时间、入力和溶剂。现在逐渐 发展起来的一些新的提取方法在这些方面与传统方法相比有很大的 优势，这些新方法主要有超声波提取技术、微波辅助萃取技术、固相 微萃取技术、超i 临界流体萃取技术、同时蒸馏萃取技术。 1 1 1 1 超声波提取技术 超声波是一种频率大于2 0k h z 的高频声波，它在液体中振动时， 产生一种空化作用。当发生空化现象时，产生了许多具有巨大破坏作 用的小气泡。在超声波的作用下，样品细胞壁被破坏，而且溶剂也更 容易渗透进细胞膜，细胞内外的质量传输加强，细胞内的物质也就更 容易被提取出来。超声波形成的微流效应也是提高提取效率的重要原 因之一。超声波提取法具有简便、快速、一次可以提取多个样品、适 用面广等特点，它在食品提取、灭菌、干燥等方面都有广泛的应用【 5 1 8 1 。 、 1 1 1 2 微波辅助萃取技术( m a e ) 荷叶、芦荟、茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 微波一般是指波长在lm m 到lm 范围( 相对频率为3 0 0 3 0 0 0 0 0m h z ) 的电磁波，由于微波频率很高，故在某些场合也称为超高频【l 9 1 。微波辅助萃取( m i c r o w a v ea s s i s t e de x t r a c t i o n ，m a e ) 的机理可 以从两方面考虑，一方面微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质， 到达物料内部的过程。由于吸收了微波能量，细胞内部温度迅速上升， 使细胞内部压力超过细胞膨胀承受能力，细胞破裂，细胞内有效成分 自由流出，在较低温度下被萃取介质捕获并溶解。另一方面，微波所 产生的电磁场加速被萃取成分向溶剂界面扩散的速率。用水作溶剂 时，在微波场下，水分子高速转动成激发态，这是一种高能量不稳定 状态，或者水分子气化，加强萃取组分的驱动力：或者水分子本身释 放能量回到基态，所释放的能量传递给其它物质分子，加速其热运动， 缩短萃取组分的分子由物料内部扩散到溶剂界面的时间，从而使萃取 速率提高数倍，同时还降低了萃取温度，最大限度保证萃取的质型2 哪。微波萃取使用极性溶剂比用非极性溶剂更有利。g a u z l e r 等首次将 大功率微波应用在浸取方面。他们用微波浸取了羽扇豆、玉米等中的 油脂、棉籽酚等有效成分口m 2 1 起，微波辅助萃取技术在天然产物有效 成分提取方面得到了广泛的应用。有文献对微波、超声、索氏提取方 式作了对比1 。与传统的索氏提取等热萃取相比，微波萃取具有质量 高、可有效地保护食品中的功能成分、产量大、对萃取物具有高选择 性、省时、溶剂用量少和低耗能等特点 2 4 1 。 1 1 1 3 固相微萃取技术( s p m e ) 固相微萃取( s o l i dp h a s em i c r o - e x t r a c t i o n ，s p m e ) 是一项样品 硕士学位论文 萃取技术，是1 9 8 9 年p a w i i s 巧等人瞄1 在固相萃取( s p e ) 的基础上研 制出来的。它的基本原理如下：s p m e 技术利用石英纤维表面的色谱 固定相或吸附剂对分析组分的吸附作用，将组分从试样基质中萃取出 来，并逐渐富集，完成此试样前处理过程2 6 。固相微萃取具有操作速 度快、不需要溶剂、不污染环境等特点叨，易于与多种仪器联用。在 植物有效成分，特别是风味物质的提取上有着广泛的应用【2 硒o l 。 1 1 1 4 超临界流体萃取技术( s f e ) ， 超临界流体是指处于临界温度( t c ) 和临界压力( p c ) 以上的流体p 。它既不是液体，也不是气体，但它性质独特，既象液体一样密度 较高，又具有气体的低黏度特征，而且它的扩散系数也是介于气液态 之间的，溶解能力较高。超临界流体萃取( s u p e r c d t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 是一种以超临界流体作为流动相，利用该状态流体具有 的高渗透能力和高溶解能力萃取分离混合物的过程。自从z o s e l ( 1 9 6 2 ) 首先提出采用超临界流体萃取技术脱除咖啡因及以后使之工业化 以来 3 2 1 ，凭着自己的特点【3 3 l ，s f e 作为新型分离技术日益受到世人瞩 1 目 3 2 1 ，而且广泛应用到糖苷等有效成分的提取分离中来1 3 5 1 。像c 0 2 、 氨、乙烯、丙烷、水等都可以被用于超临界流体萃取技术中，而目前 研究较多的为c 0 2 【”1 ，它在食品工业中经常被用到。c 0 2 超临界流体 萃取技术综合了各类提取方法的特点，分离有效成分安全、萃取效率 高，尤其适用于含有热敏性组分物质的提取p 6 1 。且分离在低温的无氧 状态下进行，对从食品中富集天然活性成分有着无可比拟的优势 3 2 1 。 1 1 1 5 同时蒸馏萃取技术( s d e ) 荷叶、芦茎、茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 “同时蒸馏萃取法”( s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o na n ds o l v e n te 触c f i - o n ，s d e ) 是l i k e n s 和n i c k e r s o n 在六十年代发展起来的一种植物易 挥发成分提取 法【3 7 1 。因为索氏提取法是提取分离天然有机物最常用的 方法。然而，如果用索氏提取器提取天然产物中的挥发性成分，将不 可避免地带入香气大分子成分，为了避免这一现象的发生，最普遍的 办法是采用水蒸气蒸馏进行提取【3 e 1 。然而，采用水蒸气蒸馏分离提取 时间长，效率较低。如果采用同时蒸馏萃取，将水蒸气蒸馏与溶剂萃 取的特点合二为一，对微量成分提取效率高p 9 1 。现在被人们普遍用来 与气相色谱或气质联用技术配套使用，如刘百战等人用固相微萃取和 同时蒸馏萃取与气相色谱质谱联用分析了芥末膏制品中的风味成分 1 4 0 i 。不同的地方使用的装置有略微的差别。 1 1 2 植物类保健食品中有效成分的分析技术 植物类保健食品来源复杂，在采收、运输、加工的过程中都需要 “一双眼睛”严格地监测。而且，由于这些原料本身的成分就很复杂， 它们与品种、地域，种植时间，种植方法和采收季节等都有很大关系， 而目前尚未有非常有效的分析检测方法。这些有效成分分析方法的开 发，是一项非常系统的工程，开发出能简单、快捷、有效地分析各种 植物类保健食品中有效成分的方法对于植物类保健食品的研究和相 关产品的开发是不可或缺的。常用的分析技术有： 1 1 2 1 薄层色谱及薄层色谱扫描技术( t l c t l c s ) 薄层色谱法( t l c ) 是一种简便、快速、微量的定性定量方法。 广泛用于天然产物的分离纯化和结构分析等方面【4 1 4 2 1 ，尤其是用于植 硕士学位论文 物类保健食品原料的鉴别。薄层色谱扫描( t l c s ) 是薄层色谱走向 定量的一个飞跃，在我国得到了广泛的应用和快速的发展。在木瓜、 莲心的有效成分分离分析方面，都有应用m - 4 4 1 。t l c s 法在线性范围、 精密度、重复性和加样回收等各项方法学研究方面均获得良好的结 果。 i i 2 2 气相色谱法及气质联用技术( g c g c m s ) 根据流动相的不同，可以对色谱进行分类。以气体作为流动相的 色谱法称为气相色谱法( g c ) 。气相色谱一般用来分析热稳定物质， 它具有高效、快速、灵敏度高、样品用量小等独特优点，可用于痕量 分析。气相色谱技术已经非常成熟，由于流动相的特点等原因，与其 它的分离分析仪器相比，它分析成本较低，成为效率最高和应用最广 的分离分析手段之一【4 5 1 。然而，虽然g c 能很好的用于定量分析，但 是严格来说，定性分析尚有一定的不足，它用来定性的保留时间，受 色谱仪器、色谱条件( 色谱柱类型、载气流速、系统压力等) 等的影 响较大。而具有强鉴别能力等特点的质谱仪( m s ) 正好可以弥补这 一不足。所以，质谱仪是气相色谱理想的检测器，它们联用发挥了各 自的优点，特别适用于混合样品的结构鉴定方面。现在气质联用技术 ( g c m s ) 普遍用于植物类保健食品有效成分，特别是挥发性成分 的分析中h “7 l 。 i i 2 3 高效液相色谱法及液质联用技术( h p l c h p l c m s ) 高效液相色谱法( h p l c ) 是2 0 世纪6 0 年代末兴起来的。它是在 气相色谱理论与实践的指导下，对经典液相色谱法加以改进，将液体 荷时，芦荟茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 流动相通过高压输送，进入到紧密填充有耐压、分离效能较高的多孔 填料( 直径5 1 0g m ) 的不锈钢柱内( 内径2 2 4 6m m ，柱长1 0 - - 2 5c m ) ， 与在线检测技术联用，并配以一系列自动化技术等，发展而成的分离 分析方法。高效液裙色谱法对于大分子物质分析有独到之处嘲，逐渐 成为天然产物中功效成分分析的主要手段，例如柑橘中类胡萝b 素的 检测等就经常用到 4 9 - 5 0 l 。在卫生部颁发的保健食品功效成分分析中， 液相色谱法已逐步替代以往的比色法和薄层色谱技术成为主导分析 技术。卫生部正式颁发的2 6 个功效成分检验方法中有1 7 个是使用高效 液相色谱技术进行检测的【4 引。但液相色谱在定性方面同气相色谱一 样，也略显不足。液质联用技术( 珊，l c m s ) 的发展弥补了液相色 谱在这方面的不足，它尤其适用于分析混合样品中含量少、不易分离 得到或分离中容易丢失的组分。因此，在功效成分的分析鉴定中也占 有了重要的地位，特别是在未知化合物结构鉴定中具有重要意义，应 用较为普遍 5 1 - 5 3 】。现在液质联用技术正飞速发展，尤其是串联质谱 ( m s m s ) 联用技术也日趋成熟。液质联用中常用的很多软电离技 术如e s i ，a p c i 等，样品分子主要被电离成准分子离子，碎片峰少， 信号弱，两m s - m s 正好弥补了这一点，可以给出丰富的样品结构信 息。串联质谱有很多种，常用的几种仪器中，四级杆串联质谱可以进 行m s i 和m s 2 操作检测灵敏度高、线性范围宽、准确，但分辨率不高， 在结构分析上尚显不足；离子阱质谱和傅里叶回旋共振质谱 ( f t - i c r - m s ) 亦可完成多级串联质谱分析【5 舢。串联质谱( m s m s ) 的应用开始日趋增多，例如潘见等人将高效液相色谱电喷雾串联质 硕士学位论文 谱用于定性、定量检测砀山酥梨及其制品中的酚类物质p 5 1 ，g h s h u i 等人用来鉴定杨桃中某些抗氧化物质的结构【5 6 1 。 1 1 2 4 毛细管电泳法( c e ) 毛细管电泳( c e ) 是近几年来迅速发展起来的基于带电组分在 高电场中迁移率不同而进行分离的新方法。毛细管电泳的分离模式有 毛细管区带电泳( c z e ) ，胶束电动毛细管色谱( m e k c ) ，毛细管等 电聚焦( c i e f ) ，毛细管凝胶电泳( c g e ) ，毛细管电色谱( c e c ) 等。 与高效液相色谱相比，毛细管电泳具有高效、快速、溶剂消耗量小和 抗污染能力强等优点，广泛应用于生命科学、医药学、食品科学等领 域，从无机小分子到生物大分子都可以用c e 法进行分析。近年来在 保健食品有效成分分析中c z e 和m e k c 应用较岁5 1 ，珏5 8 1 。c e 是一种 很有前景的方法，但重现性方面还有待提高。 1 1 2 5 其他 考虑到有些有效成分分析的特殊性，还有的是采用滴定法、生物 测定法等分析方法。 。 1 1 3 植物类保健食品中有效成分的分离纯化技术 植物类保健食品中有效成分研究常用的分离纯化技术有分子蒸 馏技术、膜分离技术、吸附柱层析技术、凝胶过滤色谱法、高速逆流 色谱技术等。 1 1 3 1 分子蒸馏技术 分子蒸馏( m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ) 是利用液体混合物各分子受热 十 后会从液面逸出，并在离液面小于轻分子平均自由程处设置一个冷凝 荷叶、芦荟、茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 面，使轻分子不断逸出，而重分子达不到冷凝面，从而打破动态平衡 而将混合物中的轻重分子分离p 9 1 。它是在高真空度下进行分离操作的 连续蒸馏过程。由于在分子蒸馏过程中待分离组分在远低于常压沸点 的温度下挥发，以及各组分在受热情况下停留时间很短，因此，该过 程已成为分离目标产物最温和的蒸馏方法，特别适合于分离高沸点、 粘度大、热敏性天然物料 6 0 l 。目前，分子蒸馏已成功地应用于食品、 医药、石油化工、塑料和化妆品等行业 6 1 - 6 2 1 ，例如天然v e 的提纯【6 3 1 ， 棕榈油中提取类胡萝卜素嗍。 1 1 3 2 膜分离技术 、 膜工业崛起于本世纪6 0 年代，至今已形成了相当大的产业规模， 广泛地应用于化工、电子、食品、医药等行业，被认为是2 0 世纪末 到2 l 世纪中期最有发展前途的高新技术之一【6 5 】。膜分离是利用具有 一定选择透过性的过滤介质进行物质的分离纯化的。膜分离过程可分 为微滤、超滤、纳滤、反渗透、渗透蒸发、渗析、电渗析、气体分离 等 6 6 1 。膜分离的产物可以是单一成分也可以是某一段分子量的多种成 分，它是一项节能、高效的新技术1 6 刀。有研究者用酶辅助膜分离法提 取纯化荔枝核中的氨基酸睇】，以及将膜分离法应用到大豆乳清中分离 蛋白和异黄酮 6 9 1 。 1 1 3 3 吸附柱层析技术 层析法常用于功能性成分的分离、精制f 7 0 - 7 2 。实际工作中常用的 吸附柱层析技术的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、大孔吸附树脂、 聚酰胺等。它们具有各自的特点，我们在研究中往往采用不同的柱层 硕士学位论文 析技术进行多次有针对性的分离，才能得到纯化合物。 硅胶适用范围广泛，能用于非极性化合物也能用于极性化合物。 正相硅胶为一多孔性物质，它具有多孔性的硅氧环及s i - o s i 的交链 结构，其骨架表面的硅醇基团能通过氢键与极性或不饱和分子相互作 用。硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅醇基的数目及含水量。随着水分 增加，吸附能力降低。 氧化铝是一种常用的吸附剂，是由氢氧化铝直接在高温下脱水制 得，由于制造关系它常带有微碱性，对于分离碱性成分颇为理想。但 不宜用于醛、酮、酯和内酯等类型的化合物分离，因为有时碱性氧化 铝可以和上述成分发生反应。 活性炭是用来分离水溶性物质的主要方法之一，对某些苷类、糖 类及氨基酸等成分具有定的分离效果。活性炭的吸附作用，在水溶 液中最强，有机溶剂中较弱，故用有机溶剂洗脱。 大孔吸附树脂是一种不含交换基团的大孔结构的高分子吸附剂。 主要以苯乙烯、二苯乙烯为原料，加入一定比例的致孔剂聚合而成。 它具有良好的网状结构和很高的比表面积，可以通过物理吸附从水溶 液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离纯化的目的。大孔吸附树 脂可以分为非极性、中等极性与极性吸附树脂三类，具有选择性好、 机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等优点，适于从水溶液中分 离低极性或非极性物质。 聚酰胺是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有 丰富的酰胺基。可与酚类、醌类等形式氢键结合被吸附。化合物中酚 荷叶、芦荟、茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 羟基数目越多，则吸附能力越强。芳香核、共轭双键越多的吸附力也 越大1 7 3 。 1 1 3 4 凝胶过滤色谱法 凝胶色谱法是2 0 世纪6 0 年代发展起来的。使用的固定相是凝胶， 它具有许多孔隙网状结构，具有分子筛的性质。当被分离的物质分子 大小不同时，它能够进入到凝胶内部的能力也不同。当混合物通过凝 胶时，比孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，两比孔隙大的分子不 能进入，因此通过色谱柱的速度就不一样 7 4 1 ，最终得到分离。这种方 法在蛋白质及多糖等大分子化合物的分离中应用较普遍【7 土7 6 1 。 1 1 3 5 高速逆流色谱技术( h s c c c ) 逆流色谱的分离原理是基于某一样品在两个互不混溶的溶剂之 间的分配作用。是一种不用固体支撑的全液态色谱方法。逆流色谱技 术经历了近6 0 年的发展产生了高速逆流色谱技术。高速逆流色谱技术 ( h s c c c ) 最初是由美国国立健康研究院n o 教授m 开发的。它主要是 利用螺旋柱运动时产生的离心力，使两相溶剂系统不断混合，使溶质 在两相间持续分配。它操作简单，无需固体载体，产品纯度高 t s l 。作 为一种对提取物污染小的制备技术，它在许多具有生物活性的有效成 分的制备上得nt 应用1 7 9 - 引1 。 1 1 3 6 其他 另外还有沉淀分离纯化法、升华法、结晶法等技术都是比较有效 的分离纯化方法。 1 2 本论文研究的对象和开展的主要工作 硕士学位论文 本论文选取的研究对象荷叶、芦荟、茶叶都是常见的植物类保健 食品原料，用途非常广泛。它们含有多种对人体健康有益的活性成分。 1 9 9 1 年1 1 月中华人民共和国卫生部卫监发( 1 9 9 1 ) 第4 5 号文件 中，荷叶被列入第二批既是食品又是药品的名单中。它有清热去暑， 止血利水的功效，在减肥、降脂等方面应用广泛【翻。作为其有效成分 的阿朴啡类生物碱的分离纯化是一项十分必要的工作，是要进行荷叶 中阿朴啡类生物碱研究的关键之一。本论文的工作之一就是进行荷叶 中阿朴啡类生物碱的分离纯化工艺研究。 芦荟具有食用价值，芦荟制品在医疗、日用、美容、保健食品和 其它工业领域的研究应用，其声势影响和前景是任何一种野生植物所 无法比拟的i s 3 彤】。芦荟应用如此广泛，那么它的安全性就关系到千千 万万人的切身利益，作为芦荟的最主要有效成分芦荟苷的稳定性应该 受到人们的高度关注，本论文的第二个方面的工作就是研究芦荟苷的 稳定性情况，并试图找到它的稳定性机理。 茶叶是很多国家的人们喜爱的日常饮品。茶叶清香馥郁，茶的香 味闻之令人心旷神怡，可以解乏，养神。很早人们就开始了对茶叶中 挥发性成分的研究，如茶叶中的芳香物质可以防止食品变质，异戊醇 等可作为蛋糕等食品的天然香料成分i s 6 。本论文第三部分工作应用了 同时蒸馏萃取装置这种在提取挥发性成分方面应用广泛的装置，并结 合气质联用技术对红茶、绿茶、乌龙茶三种类型茶叶的挥发性成分提 取分析，进行对比研究。 荷时，芦荟、茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 第二章大孔吸附树脂分离纯化荷叶中阿朴啡类生物碱 2 1 引言 荷叶为睡莲科植物莲n e l u m b on u c i f e r i n eg a e r t n 的干燥叶。我国 南北方均有栽培8 2 】。传统医学认为，荷叶性味苦寒，具有清热解暑， 升发清阳，凉血止血之功8 7 1 。本草纲目载r 荷叶服之，令人瘦劣”， 。生发元气，裨助脾胃，涩精浊，散淤血，消肿痛，发痘疮”。荷叶 中含有丰富的生物碱类、黄酮类、有机酸类及鞣质类等物质。现代临 床研究发现荷叶碱是荷叶中的主要有效成分。荷叶生物碱的研究始于 1 9 世纪。自日本学者福田真雄等硎从荷叶中分离出荷叶碱 ( n u c i f e r i n e ) 、莲碱( r o e m e r i n e ) 及d - 去甲基荷叶碱( o - n o m u c i f e r i n e ) 3 个单体成分以来，至今已从荷叶中分离出众多生物碱类化合物。根 据母核结构不同可将荷叶生物碱分为单苄基异喹啉类、阿朴啡类、去 氢阿朴啡类三类。荷叶的总碱具有显著的降血脂和降低胆固醇活性， 并广泛用于肥胖症及高脂血症的研究 8 9 - 9 。特别是近年来，人们对健 康、对美的追求日益迫切，荷叶在减肥降脂产品中的应用越来越广泛。 市面上出现复方形式的荷叶产品有轻健胶囊、降脂中药煎剂( 由苍术、 荷叶等组成) 、荷叶冲剂、荷菊冲剂、祛脂汤、荷丹片和平脂健心茶 ( 由五叶参、荷叶等组成) 等，还有各式各样的以荷叶为主要成分的 减肥茶，像宁红减肥茶、三叶减肥茶、减肥健身茶、降脂减肥茶、 乌龙减肥茶、三花减肥茶、纤美减肥茶9 2 1 等，但是对于这些保健 硕士学位论文 品尚没有有效的质量控制方法。而且对于长期应用荷叶的复方是否 有毒性和不良反应，有些什么样的毒性和不良反应的问题，需 要进行药效和毒理学的研究。因此，为了开发出保健效果更好， 毒性较低甚至无毒的荷叶保健制品以及控制荷叶复方的质量，都 需要荷叶中各生物碱的单体及有效成分含量高的荷叶总碱提取物。由 此可见，对荷叶中生物碱的富集和分离方法开展研究是非常必要的。 而有关荷叶中功能成分的提取 9 3 母5 1 ，一般都只是使用水溶剂提取黄 酮类和生物碱类，或者以荷叶生物碱为指标，利用不同的溶剂 回流和超声提取。本文以大孔吸附树脂为分离介质，优化了大孔吸 附树脂对不同的阿朴啡类生物碱：荷叶碱，d 降荷叶碱，降荷叶碱 ( 结构式如图2 1 所示) 的洗脱条件，利用开发的荷叶中生物碱的液 相色谱分析方法，检测了大孔吸附树脂的分离纯化产物，为荷叶中阿 朴啡类生物碱的进一步工艺优化提供参考。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与材料 岛津l c - 1 0 a v p 高效液相色谱仪( 配有s p d - 1 0 a v p 紫外检测器， s i l 1 0 a v p 自动进样器) 。j c x - - 2 5 0 w 超声波清洗器( 山东济宁电子 仪器厂) ：l d 4 2 a 高速离心机( 上海安亭科学仪器厂) 。 i - i p d - 1 0 0 大孔吸附树脂( 河北沧州宝恩化工有限公司) ；荷叶碱， d 降荷叶碱，- 降荷叶碱对照品( h p l c 测定纯度均在9 8 以上) ， 荷叶碱提取物( 每lg 提取物含荷叶生药材1 0g ，产地湖南长沙) 均 荷叶、芦荟、茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 由本实验室制备。 二次蒸馏水，试剂均为分析纯。 1o - 降衙叶碱2 荷叶碱3n - i 雌荷叶城 图2 1 阿朴啡类生物碱结构式 2 2 2 实验方法 。 2 2 2 1 对照品溶液的制备 精密称取荷叶碱对照品5 0m g ，n - 降荷叶碱对照品2 5m g ，o - 降 荷叶碱对照品3 5m g 置于1 0m l 的容量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀 释至刻度。精密量取其中1 0m l ，置于1 0m l 容量瓶中，加甲醇稀 释至刻度，配成标准储备溶液。再将这些标准储备溶液稀释成一系列 不同浓度标准溶液，其中荷叶碱，- 降荷叶碱，口降荷叶碱溶液的质 量浓度范围分别为0 5 0 - 5 0 0p g m l ，0 2 5 - 2 5 0i _ t g m t , ，0 3 5 - 3 5 0p g m l 。 标准品谱图见图2 2 。 。 2 2 2 2 供试样品溶液的制备 精密称取不同比例甲醇沈脱物1 0n a g 左右，置于5 0m l 的容量瓶 中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度。过o 4 5l a m 的油膜，备用。 硕士学位论文 注：a ：o - 降荷叶碱对照品；b ：n - 降荷叶碱对照品；c ：荷叶碱对照品 图2 2 标准品色谱图 2 2 2 3 高效液相色谱法测定荷叶中阿朴啡类生物碱 色谱条件：色谱柱：岛津v p o d s 柱( 1 5 0m m x 4 6m i l l ，5r t m ) ： 流动相t ( a ) o 1 - - - 乙胺水溶液，( b ) 乙腈，按如下的时间程序线 形梯度洗脱：0m i n ，6 0 a ：0 - 1 5r a i n ，6 0 2 0 a ，1 5 2 0m i n 2 0 0 , - 0 a ；检测波长：2 8 0n l t l ：, 流速：1m l m i n ；柱温：室温。各物质的标 准品色谱图见图2 2 。 2 2 2 4 大孔吸附树脂纯化条件的考察 2 2 2 4 1 树脂的预处理及再生 取h p d 一1 0 0 大孔吸附树脂用甲醇浸泡2 4h 后，装入树脂柱。用 甲醇冲洗，直至流出液不产生乳白色浑浊时，再用蒸馏水冲洗至无醇 荷叶、芦荟，茶叶中有效成分的分离、分析及稳定性研究 味即可。 2 2 2 4 2 上柱样品的制各 精确称量o 6 5g 荷叶提取物，以4 0 0m l1 盐酸水溶液超声提取 2h 后，放入4 0 0 0r m i n 超速离心机离心5m i n ，取上清液。余下的沉 淀中再加入4 0 0m ll 盐酸水溶液，继续超声，离心，取上清液。剩 下的沉淀中再继续加入1 盐酸水溶液2 0 0m l ，重复上述步骤，最后 将三次得到的上清液合并，定容至1 0 0 0m l 以供上柱使用。 2 2 243 静态吸附试验 准确平行称取三份处理好的干树脂，每份1g ，置于5 0 0m l 的磨 口烧瓶中，加入已知量的吸附原液，盖紧瓶塞，室温下放置2 4h ，( 每 8h 振荡一次) ，充分吸附后过滤，对滤液进行h p l c 测定，计算吸附 容量。 2 2 2 4 4 洗脱条件的研究 采用小径柱探讨阿朴啡类生物碱的分离富集条件。准确称取 o 6 6g 荷叶提取物，上清液定容至1 0 0 0m l ，得上柱液，上柱( 柱床 体积：直径= 2 5c n l ，柱长= 2 1c m ) 。依次用水，2 0 ，5 0 ，6 0 ， 6 5 ，7 0 ，7 5 ，8 0 ，8 5 ，9 0 ，9 5 的甲醇水溶液( 甲醇： a k = v ：v ) 各5 倍柱体积进行洗脱，流速为7 5m l m i n ，其中水洗得 到的溶液中不含阿朴啡类生物碱。分段收集从2 0 开始的洗脱液( 每 份l 倍柱体积，共5 0