（物理化学专业论文）以邻苯二酚为配体的钼氧转移酶的仿生合成、表征及性质研究.pdf

首都师范大学硕士毕业论文 摘 钼是一种具有生物活性的微量生命元素， 面 交 微量元素铝进入生命体内后，主要以两种方 式参与物质的代谢过程：一是以无机盐的方式，与其他营养物质相互络合；二是作为钼酶 的重要组分一铝辅助因子，参与许多生化反应。自上世纪5 0 年代以来，研究发现除固氮 酶含钼以外，生物体内还存在另一类含钼酶，即钼氧转移酶，该类酶包括黄嘌呤氧化酶、 硝酸盐还原酶、亚硫酸盐氧化酶和醛氧化酶等，这些酶与碳水化合物、脂肪、蛋白质、含 硫氨基酸、核酸( d n a 和r n a ) 及铁蛋白中铁的代谢密切相关。通过钼酶的x 射线晶体结 构分析研究表明，其活性结构因子由金属铝与二硫烯上的s 原子配位而形成。手性八面体 配位构型的金属配合物具有切割识别d n a 以及抗肿瘤的功能，而呈手性八面体配位构型的 钼配合物是钼氧转移酶活性结构因子的仿生配合物之一，而且也是著名无机抗癌药物顺铂 分子的八面体类构物，随着钼酶在生物体内的作用逐步得到重视，及其模拟的功能配合物 在探究钼酶的生理活性和催化机理研究中所作的突出贡献，使钼氧转移酶活性结构因子的 仿生合成、生理活性以及催化机理研究成为研究热点。 多羟基酚由于其抗肿瘤和抗病毒活性，它的衍生物一直是研究的热点。多羟基酚作为 抗氧化剂，可以影响体内金属的生物利用度，此外金属l 茶酚配合物存在有趣的电子效应。 这种电子效应和金属的多价态和配体电荷分布有关，被认为是生物体中离子传输和儿茶酚 奎宁相关酶和生物分子的模型。本文以邻苯二酚为配体，合成了一系列钼氧转移酶活性中 心仿生配合物，并对其进行了晶体结构测定和i r 、1 h n m r 、t e m 、s e m 、e p r 等谱学表 征，主要内容如下： 1 以含有邻位取代基的邻苯二酚为配体，在甲醇乙腈混合溶剂中与( n b u 4 n ) “m 0 8 0 翻 反应，分别向体系中加入乙二胺、1 ，2 丙二胺和1 ，3 丙二胺，得到五种呈手性八面体构型的 单核钼配合物( n h 3 c h 2 c h 2 n h 2 ) 3 ( n h 2 c h 2 c h 2 n h 2 ) m o ( v ) 0 2 ( o c 枇o ) 2 ( 管状) 、 ( n h 3 c h 2 c h 2 n h 2 ) 2 ( n h 2 c h 2 c h 2 n h 2 ) 3 m o ( v i ) 0 2 ( o c 6 h 4 0 ) 2 ( 片状1 ( 2 ) 、( n h 3 c h 2 c h n h 2 c h 3 ) 2 m o ( v i ) 0 2 ( o c 6 1 1 4 0 ) 2 ( 3 ) 、( n h 3 c h 2 c h c h 2 n h 2 ) 3 m o ( v ) 0 2 ( o c 批o ) 2 ( 片状x 4 ) 和( n h 3 c h 2 c h c h 2h 2 ) 4 m o ( v 1 ) 0 2 ( 蚴o ) 2 1 2 ( 管状1 ( 5 ) 。 ( a ) x - 射线单晶衍射：五种配合物离子中心价态不同，抗衡阳离子不同，阴离子显示 相同【m 0 0 6 】八面体配位几何构型，但是配合物的晶体结构数据和晶胞堆积方式不 同，并且具有不同的抗肿瘤活性。 ( b ) e p r ：m o v 化合物因的d 1 电子组态而具有e p r 活性，与牛奶中黄质氧化酶的e p r 呈相似性， 首都师范大学硕士毕业论文 ( c ) n m r * 利用n m r 研究了配合物( 3 ) 与a t p 的相互作用，结果发现手性特征的 1 ，2 丙二胺及邻苯二酚苯环的1 h 化学位移在与a t p 混合前后均呈现出较大的差异， 配合物中的金属离子在d 2 0 中大多数均以m o ( v m 态存在，但在与a t p 共存时转 化为m oo n ) ，并与配体发生解离。 2 以邻苯二酚位配体，在甲醇乙腈混合溶剂中与n a m 0 0 4 2 h 2 0 反应，分别向体系 中加入7 , - - 胺、1 ，2 - 丙二胺和1 ，3 一丙二胺，得到四种结构截然不同的产物，( n h 3 c h 2 c h 2 n h 2 ) 3 【m o ( v i ) 0 2 ( o c 6 h 4 0 ) 2 ( 6 ) 、 n a 2 l u 2 一( c 桃0 2 ) 2 ( c 6 h s 0 2 ) 2 k 7 ) 、 ( n f l 3 c h 2 c h ( n i - 2 ) c h 3 ) m 0 0 2 n a ( c 6 h 4 0 2 ) 2 ( n h 2 c h 2 c h ( n h 2 ) c h 3 ) 8 ( 8 ) 、( ( c 扎0 2 x t t 2 - o c , 6 h 4 0 ) 2 【( m o o - n a - n h 2 c - h 2 a 昆 c h 2 n i - 1 2 - n a - o - m o ) 2 ( c h 3 c h 2 0 h ) 2 ( h 2 0 ) ( n h 2 c h 2 c h 2 c h 2 n h 3 ) 8 ( 9 ) 。 ( a ) x 单晶衍射：配合物为独立的二金属钠簇合物，( 8 ) 为一维链状结构，( 9 ) 为一 维双链结构。 c o ) n m r , * 配合物仍固态与重水中的1 3 cn m r 比较表明桥联配体2 - ( c 6 h 6 0 2 ) 和端基 配体( c 6 i i 4 0 0 田- 在溶液中会发生快速交换。 关键词：钼氧转移酶晶体结构e p ri rn m r 踮m 首都师范大学硕士毕业论文 a b s t r a t m o l y b d e n u mj sa ne s s e n t i a lt r a c ee l e m e n tt h a tp l a y si m p o r t a n tm l e si nt h eg l o b a lc y c l e so f n i t r a t e ，s u l f u r , a n dp h o s p h o r i tt a k e st w of o r m sw h e np a r t i c i p a t e di nt h ee l e m e n tm e t a b o l i s m , o n ei s 勰i n o r g a n i cs a l ta n dc o m p o s e dw i t hn u t r i t i o n , t h eo t h e ri sa st h ec o f a c t e ro f m o l y b d e u m e n z ya n dt a k e sp a r ti nm a n yb i o c h e m i s t r yr e a c t i o n s s i n c el a s tc e n t u r y5 0 1 st h e r e s e a r c hs h o w st h a tt h e r ei sa n o t h e rk i n do fe n z y m ec o n t a i n i n gm o l y b d e n u me x c e p tf o rn i t r o g e n e n z y m e ，w h i c hi n c l u d e sx a n t h e n e so x i d a s e ，n i t r a t er e d u c t a s e ，s u l f i t eo x i d a s ea n da l d e h y d e o x i d o r e d u c t a s ec ta 1 t h o s em o l y b d e u m e n z yh a di m p o r t a n ti n f l u e n c eu p o nt h em e t a b o l i s mo f c a r b o h y d r a t e , f a t , p r o t e i n , s u l f a m i n oa c i d , n u c l e i ca c i d ( d n aa n dr n a ) 。a n di r o ni n i r o n a l b u m e n c h i r a lo c t a h e d r a lm o l y b d e n u m - c o n t a i n i n gc o m p l e x e sa r ea c t i v ec o f a c t o ro fb i o m e m i c m o l y b d e u m e n z y b e i n gs i m i l a rc o m p l e xc o m p a r e w i t hc i s - p l a t i n u m ，t h e r ep r o v i d e dw i t h i n c i s i n g a n di d e n t i f y i n gd n aa n da n t i e a n c e r a c t i v i t y s ob i o m e m i cs y n t h e s i sa n db i o c h e m i c a l m e c h a n i s ms t u d yo fa c t i v ec o f a c t o ro fm o l y b d e u m e n z ya t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea r e n f i o n x - r a yc r y s t a la n a l y s e sr e v e a lt h a tt h ec o f a c t e ro fm o l y b d e u m e n z yi sc o m p o s e do fm o a t o m s a n dsa t o m so fd i s u l f u l e n e p o l y p h e n o i sa r ea n t i o x i d a n t s ，w h i c ha t ek n o w nt oi n f l u e n c e b i o a v a i l a b i l i t yo fm e t a l si nt h eb o d y i na d d i t i o n , m e t u l - c a t e c h o lc o m p l e x e s 啪e x h i b i t i n t e r e s t i n ge l e c t r o n i ce f f e c t sa s s o c i a t e dw i t ht h ev a r i a b l em e t a la n dl i g a n dc h a r g ed i s t r i b u t i o n ， d u et ot h ed e l i c a t eb a l a n c ei ne n e r g yb e t w e e nt h e 丘o n t i e rq u i n i n ea n dm e t a lo r b i t a i sa n d t h e ya m b e l i e v e dt ob eam o d e lf o rt h eb i o l o g i c a lt r a n s p o r to fi r o na n dc a t e c h o l q u i n i n er e l a t e de n z y m e s a n db i o m o l e c u l e s i nt h i st h e s i s ，as e r i e so fb i o m i m e t i cc o m p l e x e sw i t hc a t e c h o ll i g a n do f m o l y b d e u m e n z yc o f a c t o rh a v eb e e ns y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yi r 、1 h n m r 、t e m 、s e m 、 e p r 、x - r a ya n a l y s e s t h em a i np o i n t sa r ea sf o l l o w s ： 1f i v ed i f f e r e n tc o m p l e x e sw e f es y n t h e s i z e d b yt h e r e a c t i o no f t e t r a - b u t y la m m o n i u m a - o c t a m o l y b d a t ew i t hc a t e c h o li nt h em i x e ds o l v e n to fc h 3 0 h 、c h 3 c n , w i t hn i - 1 2 c h 2 c h 2 n h 2 , n h 2 c h 2 c h n h 2 c h 3 ，a n d r 1 2 c h 2 c h 2 c h 2 n h 2a d d e dd i f f e r e n t l y , a n ds t r u c t u r a l l yc h a r a c t e r i z e d b yx r a yd i f f r a c t i o n 、i r 、l h n m r 、t e m 、s e ma n de p r ( 砂s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i z a t i o nb yx - r a yd i f f r a c t i o n ：t h ec r y s t a ls t r u c t u r er e s u l t ss h o wt h a tt h e m o n o n u c l e a ra n i o n i cu n i to ft h et h r e ec o m p l e x e sd i s p l a y e dt h es a m ec i s d i o x of a s h i o nw i t h p s e u d o - o c t a h e d r a l 【m 0 0 6 】c o o r d i n a t i o ng e o m e t r y h o w e v e r , t h ef i v ec o m p l e x e sh a v e d i f f e r e n tc r y s t a lf i g u r e ，s t a b i l i t ya n da n t i - c a n c e ra c t i v i t y ( b ) e p rs t u d y s ：t h o s ec o m p l e x e ss h o wt h es i m i l a re p rs i g n a l sw i t hx a n t h e n e so x i d a s ei nm i l l 【 a n ds e m b l a b l eu v - v i ss i g n a l sw i t hx a n t h e n e sd e h y d r o g e n a s ei nc h i c k e nl i v e r i na d d i t i o n , s o m eo ft h ec o m p l e x e sh a v ee x c e l l e n ta n t i c a n e e ra c t i v i t y 首都师范大学硕士毕业论文 ( c ) n m rr e s u l t s ：t h en m r s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no ft h ec o m p l e x3w i t ha t pr e v e a lt h a t1 hc h e m i c a l s h i f t 8o f1 , 2 - p r o p a n e d i a m i n ea n dc a t e c h o lw i t ha n dw i t h o u ta t pe x h i b i td i s t i n c td i f f e r e n c e t h er e d u c t i o n o fm o ( v i ) t om o t v ) o c c u r sw h e nt h ec o m p l e x3i sd i s s o l v e di nd 2 0 ，a n dt h em o ( v ) i so x i d i z e da g m w h e na t ps o l u t i o ni sm i x e dw i t ho r i g i n a ls o l u t i o n ，a n dt h eh y d r o l y s i so ft h ec a t e c h o ll i g a n dt a k ep l a c e s a tm e a nt i m ew h i c hw e r em o n i t o r e db y1 hn m r 2c a t e 圮h o lw a sc h o s e nt or e a c tw i t hn a 2 m 0 0 4i nt h em i x e ds o l v e n to fc h 3 0 h 、c h 3 c n , w i t hn h 2 c h 2 c h 2 n h 2 ，n h 2 c h 2 c h n h 2 c h 3a d d e dd i f f e r e n t l y , a n df o u rd i f f e r e n tc o m p l e x e s w e r es y n t h e s i z e d w h e n q h 2 c h 2 c h 2 n i - 1 2a d d e dt ot h em i x e ds o l v e n lt w od i f f e r e n tc o m p l e x e s o b t a i n e di nt h es a m et u b e o n ei st h em o n o n u c l e a rm o l y b d e n u m c o n t a i n i n gc o m p l e xw i t ht h e s a m es t r u c t u r ea sb e f o r e t h eo t h e ri sat w o d i m e n s i o nc o m p l e xi nw h i c hs o d i u mc o o r d i n a t e d w i t hc a t e c h o lb u tn o tc o n t a i nm o l y b d e n u ma t o m o n e - d i m e n s i o nm o n o n u c l e a rm o l y b d e n u m c o m p l e xs y n t h e s i z e da n dt h en ap a r t i c i p a t e di n i tw h e nn h 2 a a 珊a 禹a d d e d w h e n n h 2 c h 2 c h 2 c h 2 n i - 1 2w a sa d d e di n t ot h em i x e ds o l v e n t , w og o tao n ed i m e n s i o nd i c h a i n d i n u c l e a rm o l y b d e n u mc o m p l e xw h i c hw a sb r i d g e db ys o d i 啪m e t a la n d1 3 - d i a m i n o p r o p a n e t h ef i v ec o m p l e x e sw e r es t r u c t u r a l l yc h a r a c t e r i z e db yx - r a yd i f 丘a c t i o n 、s e m 、t e ma n d n h b t l l d i e sw e r et a k e na l s o ( a ) s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i z a t i o nb yx - r a yd i f f r a c t i o n ：t h ec r y s t a ls t r u c t u r er e s u l t ss h o wt h a t c o m p l e x 6c o n s i s t so ft w on h 2 c h 2 c h 2 n h 2a n dad i s c r e t em o l e c u l a r n a 2 l t t 2 - ( c 6 h 6 0 2 ) 2 ( c 6 h 4 0 0 i - i ) 2 d u s t e r w h i l ei nc o m p l e x8 m ea t o m sa r eb r i d g e db y o - n a - ou n i t sc o n s t i t u t i n gao n e - d i m e n s i o n a l ( 1 d ) i n f i n i t ec h a i na l o n gt h e 口- a x i s , a n dt h e n e i g h b o r i n gc h a i n sa r el i n k e db yv a nd e rv a a i sf o r c ea n dh - b o n d s i nc o m p l e x9 ， m o l y b d e n u ma t o m sa r eb r i d g e db yt w os o d i u ma n do n e1 3 一d i a m i n o p r o p a n ec o n s t i t u t i n ga o n ed i m e n s i o nd i c h a i ns t r u c t u r e ，a n dt h en e i g h b o r i n gc h a j l 塔a r el i n k e db yp r o t o n a t e d1 3 一 d i a m i n o p r o p a n et h r o u g hh y d r o g e nb o n d s 凹t h ec o m p a r i s o no f ”cn m rs p e c 灯u i no ft h ec o m p l e x7 i ns o l i ds t a t ew i t ht h a ti ns o l u t i o n i n d i c a t e st h a tt h e r a p i de x c h a n g eb e t w e e n t h e b r i d g i n gf 1 2 - ( c 6 h 6 0 2 ) a n dt e r m i n a l ( c 6 h 4 0 0 a ) u g a n d s i sp r e s e n t e di ns o l u t i o n k e y w o r d s ：m o l y b d e n u mo x o t r a n s f e r a s ec r y s t a ls t r u c t u r e e p ri rn m rs e m 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：庞小丽 勉a 、向1 日期：2 0 0 7 年5 月1 6 日 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电予版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文作者签名：庞小丽勉刁、翻 学位论文作者签名：庞小丽石为矧j 日期：2 0 0 7 年5 月1 6 日 首都师范大学硕士论文 第一章综述 第一节钼氧转移酶的活性结构因子和生物活性 钼属于第五周期b 族元素，钼是动植物及人体所必需的微量生命元素。钼酶存在 于所有生物体内，生物体内所含有的铝酶对生物体的氮、硫、磷的代谢起重要的作用【1 捌。 微量元素钼进入生命体内后，主要以两种方式参与物质的代谢过程：一是以无机盐的方 式，与其他营养物质相互络合；二是作为钼酶的重要组分一铝辅助因子，参与许多生化 反应。钼在生物体内主要与蛋白结合，构成含钼酶的辅助因子，简称m o c o 。它能与各 种酶的底物和抑制剂相结创3 1 钼的生理功能主要集中于对铝酶的研究。生物体内的铝 酶主要分为两类，第一类是含f o 、m o - c o 的固氮酶，可催化n 2 还原为n h 3 。固氮酶含 有铝、铁和不稳定的硫，由钼铁蛋白和铁蛋白大致以2 ：1 的比例构成。固氮酶所催化的 反应好像植物一个高效的小型氮肥厂，对豆科植物的氮素营养具有举足轻重的作用。自 5 0 年代起，研究发现除固氮酶外，生物体内还存在第二类含m o - c o 因子的酶，通过铝 中心催化底物电子的氧化( 水解) 还原( 脱氢) 作用，被称为氧转移酶。包含黄嘌呤氧化酶 ( x 0 ) 、亚硫酸盐氧化酶( s o ) 、醛氧化酶( a o ) 、同硝酸还原酶( n r ) 和黄嘌呤脱氢酶( ) ( d ) 等 枷，这些酶均含有金属铝成份。该类酶与碳水化合物、脂肪、蛋白质、含硫氨基酸、核 酸( d n a 和r n a ) 及铁蛋白中铁的代谢密切相关。 1 钼氧转移酶的分类 1 1 钼氧转移酶的定义 钼氧转移酶存在于大多数的有机体内，迄今为止所发现的钼氧转移酶，绝大多数在 其活性部位内都有一个或两个含有二硫烯基团的配体与铝配位，有的钼氧转移酶还结合 一个或两个终端氧配位原子 4 1 。大多数的钼氧转移酶在其活性部位都存在m o - - o 双键结 构单元，因此又被称为氧钼酶。由于它们催化可以指向底物或从底物出发的氧迁移反应， 如前所述，也被称为氧转移酶但是，有一些多硫化物的还原酶如甲酸盐脱氢酶，并不 能催化氧迁移反应，还有一些酶，并不含有m o - - o 基团，但在习惯上仍称为铝氧转移酶 翻。 首都师范大学硕士论文 1 2 钼氧转移酶的分类 h i l l e l 4 l 在多年对钼酶研究的基础上，把钼氧转移酶分为三大类：d m s o 还原酶 ( d i m e t h y l s u l f o x i d er e d u c t a s er e d u c t a s e ，简称d m s o ) 、亚硫酸盐氧化酶( s d f i t c o x i d a s e ，简称s o ) 和黄嘌呤氧化酶( x a n t h i n e0 x i d 鸽e ，简称x o ) ，其基本分类由图 1 1 所示。 守黾撼o o h s d m s 0 还原酶 d m s 0r e d u c t a s e s e c y 曩 寸j j 尸旧 e 尹两 甲酸盐脱氢酶异硝酸盐还原酶 f o r m a t ed e h y d r o g e n a s e d i s s i m i l a t o r yn i t r a t er e d u e t a d m s o 还原酶( d m s or e d u c t a f a m i l y ) 冒庐 s c 姆 0s 瓠矿 0 、。心 亚硫酸盐氧化酶同硝酸盐还原酶黄嘌呤氧化酶醛氧化还原酶 s u l f i t e o x i d a a s s i m i l a t o r y n i t r a t e r e d u e t a s e x a n t h i n eo x i d a s e a l d e h y d e o x i 蛐c t a s e 亚硫酸盐氧化酶( s u l f i t eo x i d a s ef a m i l y )黄嘌呤氧化酶( x a n t h i n eo x i d a s ef a m i l y ) 圈1 1 三类钼氧转移酶 f l g 1 1 t h r e ek i n d so f m o l y b d e n u mo i o t r a n s f e r a s e s d m s o 还原酶包含的钼氧转移酶种类很多，研究较多的有d m s o 还原酶本身、三 甲胺氮氧化还原酶( t m a o r ) 、异硝酸盐还原酶和甲酸盐脱氢酶。d m s o 还原酶的活性 部位含有一个m o = o 单元，两个喋呤辅因子通过其二硫烯侧链与金属钼中心配位形成两 个五元环。d m s o 还原酶只具有一个氧化还原活性中心即钼配位中心。亚硫酸盐氧化酶 主要包括亚硫酸盐氧化酶和同硝酸盐还原酶，这些酶的活性部位含有一个m 0 0 2 单元， 即有两个终端m o = o 双键结构，单个喋呤辅因子通过其二硫烯侧链与金属钼中心配位 亚硫酸盐氧化酶均催化杂原子上的或指向杂原子的氧迁移反应。黄嘌呤氧化酶包括黄嘌 呤氧化酶和醛氧化还原酶，其活性部位含有一个m o = o 单元和一个m o = s 单元，单个喋 呤辅因子通过其二硫烯侧链与金属钼中心配位，可催化羟化反应。 2 首都师范大学硕士论文 2 钼氧转移酶的生理功能 2 1 黄嘌岭氧化酶( x 0 ) 黄嘌呤氧化酶( x o ) 在核酸代谢过程中不仅能催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，而且 能进一步使黄嘌呤氧化生成尿酸，其反应如下。每分子黄嘌呤氧化酶含有8 个钼原子和8 个铁原子，铝以一个变形的四方锥几何构型配位，喋呤辅因子通过其二硫烯侧链与钼配 位嘲。黄嘌呤氧化酶主要分布于肝、肾、肺和小肠粘膜内嘲。x o 可以氧化嘌呤、喋啶、 嘧啶、吡啶和醛类等化合物m 。然而，其中某些反应的生理意义仍未完全清楚。 次黄嘌呤 n 心 i + h 2 0 2 n l t = l 黄嘌呤 h 五。勘卜 黄嘌呤 尿酸 底物的氧化羟基化发生在钼的中心部位，e p r 研究表明，从底物传递出来的电子将 六价的钼原予还原为四价。x o 的活性可被氰化物、亚砷酸和甲醇所抑制，这些抑制剂 可以明显影响m 0 5 + 的e p r 信号。该现象表明抑制作用与它们对钼的直接作用密切关系【g l 。 自兔肝提纯的醛氧化酶( a o ) 的结构与功能与x o 十分相似，两者同时存在于许多 不同的生物体内，它们的底物也区别不大。如：两者均使次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，但x o 可使黄嘌呤进一步氧化为尿酸，而a o 则不能。兔肝a o 可使n 甲基蓣酰胺在生理p h 条件 下转化为6 _ 毗啶酮；而x 0 则必须在较高p h 值下才能完成上述转变。a o 的生理意义目前 还不是十分清楚。a o 可使别嘌呤醇氧化为羟基嘌呤醇，但是和x o 相反，a o 的活性并 不为后者所抑制，可以利用羟基嘌呤醇对两种酶作用的不同，来鉴别体内由两种酶催化 夕 州 呸 + 、_工 首都师范大学硕士论文 的反_ 应【2 1 。 2 2 亚硫酸盐氧化酶( s o ) 亚硫酸盐氧化酶具有两个m o = o 基团，即m 0 0 2 结构，在钼的配位中互成顺式。虽然 剩下的配位点( 为四方锥或者八面体的几何配位) 足够两个容纳二硫烯配体，但x a s 数 据显示，在钼的球状配位中，总共只有三个硫醇盐，并且从m a l d i - t o f 质谱分析得出， 蛋白质的分子量与只存在一个喋呤辅因子相符。因此，与前述的黄嘌呤氧化酶的结构一 样，很可能亚硫酸盐氧化酶和相关酶中，铝唯一的二硫烯配体限定了一个赤道平面。一 个m o = o 基团必须占据一个顶点位置，其它的位于赤道平面，分别对应于铝酶羟化酶家 族中m o = s 和m o = o 基团的位置。余下的配位位置最可能被水或半胱氨酸硫醇盐所占据， 这与观测的鸡肝中的亚硫酸盐氧化酶和不同来源的硝酸盐还原酶氨基酸序列中保存的 半胱氨酸基相符 9 1 。 亚硫酸盐氧化酶有还原型和氧化型两种，主要分布于肝细胞线粒体两层膜之处。它 难一底物就是亚硫酸盐( s 0 3 2 - 或h s o ；) ，主要的生理作用就是在蛋白质代谢过程中将半 胱氨酸产生的s 0 3 二氧化为的s 0 4 2 。，从尿中排出。s 0 3 2 对人体有毒已经成为共识，它与 核糖核酸( r n a ) 中所含的尿嘧啶和胞嘧啶及d n a 中所含的胸腺嘧啶反应( 单链反应) ，使 细胞突变率上升。体内的亚硫酸盐氧化酶可以使产生的s o f 。转化为无毒的s 0 4 2 ，从尿 中排出。先天性亚硫酸盐氧化酶缺乏的小孩尿中s 0 3 、8 2 0 3 2 和s 2 磺基半胱氨酸含量多， 而s 0 4 2 含量下降，其催化反应为： s o s 0 3 + h ，o - s 0 4 z - + 2 h + 2 3 d m s o 还原酶( o m s o ) 从r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s q b 得到的d m s o 还原酶的晶体结构己被报道i i 0 - 11 】。发现镅 金属被两分子的喋呤辅因子配位( 两者都是鸟嘌呤二核苷酸的形式，两个二核苷酸从活 性部位向相反方向伸展) 。所有的铝配位构型是交形的三棱柱形的，除了由喋呤辅因子 贡献的四个配位原子之外，只有一个m o = o 和一个丝氨酸烷氧化物配体与金属配位， m o = o 近似地朝向一个二硫烯配体。值得注意的是，钨也有类似的金属配位，即单含钨 和含钼的酶之间存在结构的同源性。 硝酸盐还原酶( n r ) 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐的反应为： 4 首都师范大学硕士论文 n 0 3 + 2 h + + 2 e - ! 塑璧生墅至坠n 0 2 + h 2 0 生成的n 0 2 在亚硝酸盐还原酶的催化下还原成n h 3 ，它是进一步合成蛋白质的原料。 钼酶所参与的生物系统内的许多反应的共同特点是将偶数电子转移到底物，或者将底物 的偶数电子向呼吸链传递，从而参与细胞的电子转运【1 2 】。 3 钼氧转移酶的活性部位 由于蛋白质的敏感性和脆弱性，使对钼酶的活性部位的研究相当困难。主要的研究 手段为蛋白质的晶体结构的测定、x - 射线吸收和e x a f s 研究。对酶的x 射线结构分析 可能会导致酶活性部位的改变，而且在对蛋白质进行结晶的过程中也很难说不改变铝氧 转移酶活性部位的结构。 3 1 钼酶活性部位的结构 钼酶辅助因子的概念在3 0 多年前首先被p a t c r m a n 等1 1 3 】提出。他们对一系列缺乏钼 的硝酸盐还原酶和黄嘌岭氧化酶的变异细胞的活性进行研究，得出这两种酶含有同样的 辅因子。n a s o n 等【1 4 l 基于对从变异的菌株中得到的缺乏钼的亚硝酸盐还原酶的改组的研 究支持了这个结论。随之，对其它的氧转移酶如甲酸盐氧化酶、亚硫酸盐还原酶和亚硝 酸盐还原酶中的辅因子的研究也得出同样的结论：单核铝氧转移酶都有一个或者两个与 金属钼直接配位的喋岭二硫烯辅因子，其结构如图1 2 所示【2 】，这一结构已经被从 d e s u l f o v i b r i og i g 勰得到的含铝醛氧化还原酶和r h o d o b a c t c rs p h a c r o i d c s 得到的d m s o 还原酶在晶体学上得到证实【悖1 6 1 。基本的喋呤环结构和二硫烯侧链也已被由从提纯的酶 中的辅因子进行化学分析而得到确认【协嘲，同时也由新陈代谢降解物尿硫烯的化学合成 所证实刚。它们和不同的底物反应表现出不同的活性。 o o o r 图1 2 钼氧转移酶的蝶呤辅因子的结构i 1 1 w 9 1 2s t r u c t u r e o f t h e p t e r i n e o f a c t o r i n m o l y b d e n u m o x o h 仙s l f 弧。e 1 1 1 5 首都师范大学硕士论文 r a j a g o p a l a a 等 2 1 - 2 3 1 率先对喋呤辅因子进行了研究，通过对铝氧转移酶的蛋白质晶体 结构的测定，发现：喋呤辅因子由一个和钼中心直接成键的喋呤【2 氨基4 ( 1 h ) 喋呤二酮】 构成，喋呤中包含一个具有二硫烯功能的吡喃环，它在酶中对钼中心起到一个二齿配体 的作用，在这些酶中，磷酸盐基团直接和一个核苷酸相连。 蛋白质晶体结构表明 2 4 1 ，亚硫酸盐氧化酶家族和黄嘌呤氧化酶家族的每一种酶只有 个和金属铝相连的喋呤辅因子，而d m s o 还原酶和甲酸盐脱氢酶则为两个喋呤辅因 子与同一个钼相配位，喋呤辅因子很难从与之相连的蛋白质上分开，不过，d a v i e s 等 2 4 1 合成了这一类的物质，并进行了波谱学和电化学性质的测定。 第二节与钼酶活性部位相关的钼配合物的合成研究 钼酶在人体内的生理和生化功能备受重视【2 5 1 ，为对钼酶的结构和生理功能有进一步 了解，人们正从不同的途径和角度对铝酶迸行研究。研究发现，钼酶中的单核钼中心含 有一个或者两个含有硫的配体连接在钼原子上【2 6 1 ，许多钼酶能催化还原一些含硫、氮的 基厨2 刀，而酶中的钼则在m o ( i v ) 、m o ( v ) 、m o ( v i ) 之间进行循环变化幽】。此外，还发 现一些含硫、氮( 氧) 配体，所形成的单核钼配合物的性质与一些钼酶相似【2 9 】，然而， 由于蛋白质极其敏感和脆弱，在进行酶处理培养晶体的过程中可能引起钼氧转移酶活性 因子的结构变化。从而使测定结果出现偏差，至今人们对钼酶中钼的配位环境仍了解得 不够透彻。因此，对含有钼一硫( 氮、氧) 键配合物得合成、表征其性质丙对金属中心 的结构、价态变化做进一步的研究，可望为探讨钼酶的结构及生物功能提供一些信息。 目前，很多研究小组正在展开对铝酶活性结构因子仿生配合物的研究，得到了许多 单核钼硫、钼氮和钼氧的配合物，并对这些配合物进行结构研究、光谱研究和性质研究， 并与相应的钼酶进行了比较，取得了较大的进展。 1 含硫配体的钼配合物的合成 钼氧转移酶的活性部位结构因子的主要部分是一个与含硫配体相连的单核钼配合 物，因此，钼硫配合物的合成一直成为钼配合物合成的重点。 1 1 双( - - 硫烯) 铝配合物的合成方法 双( - - 硫烯) 铝配合物主要是与d m s o 还原酶活性部位相关的配合物，其中钼是 四价或者六价的，文献中对这类物质的研究非常多。所合成的这一类物质中，有的端基 6 首都师范大学硕士论文 有氧，有的端基被其它配体所取代。 h o l m 总结了合成的单氧钼( ) 双二硫烯配合物的反应【枷，也提出了合成单氧 铝( ) 双二硫烯配合物的一般的方法，该方法以 m o ”o c l q 订e n c ) 4 】+ 为基础，通过和 不同的配体反应，得到不同的单氧钼( ) 双二硫烯配合物。该方法如图1 3 所示： 去氧的双( - - 硫烯) 钼配合物的合成，文献中的方法很多，但是没有非常系统的方 法，常见的一种方法【3 2 1 是利用单氧钼( ) 双( - - 硫烯) 配合物通过硅烷化的方法生成。 方程式如下： 【m o o ( b d t ) 2 + + p h 2 b u s i c l 一 m o o ( b d t ) 2 ( o s i b u lv h 2 ) 一+ a 一 【m o o ( e d t ) 2 2 + p h 2 b u s i c l 一 m o o ( e d t ) 2 ( o s i b u le h 2 ) 一+ c l 一 圈1 3 基于 m o w c i ( m e n c ) 4 ”的双( - - 硫烯) m o 。v o 配合物的合成 矾蚤1 3 s c h e m e f o r t h es y n t h e s i s o f b i s ( d i t h i o l e n e ) m o n oc o m p l e x e s b a s e do l i nt h er e a c t i v i t yo f m o j v c ( m e n c ) 4 1 1 + 如果不发生硅烷化而发生电子迁移，则生成相应的m o ( v 0 ( 双二硫烯) 配合物 m o v l 0 2 0 a d t ) 2 。，该物质也可以发生硅烷化反应，方程式为： m 0 0 2 0 a d t ) 2 2 + p h 2 b l l s i c l 一 m o o ( b d t ) 2 ( o s i b u le h g 一+ c l 一 不过，这些物质没有喋呤一二硫烯辅因子所拥有的二烃基二硫烯类型的螯环 另一种方法1 2 4 1 利用如下反应合成二羰基母体： m o ( c o ) 3 ( m e c n ) 3 】+ 2 n i ( s 2 c 2 r 2 ) 2 1 一 m o ( c o h ( s 2 c 2 r 2 ) ”+ 7