（发育生物学专业论文）果蝇rrainy+head靶基因+dret2的功能研究.pdf

i 摘要 ， 一 果蝇是一种重要的模式生物，已经在遗传和发育研究工作中做出了 突出的贡献，g r a i n y h e a d ( g r h ) 是一类在线虫、果蝇、蛙类、小鼠和人 中表皮细胞中都有表达的转录因子家族，在系统发生中相当的保守。最 近的研究表明g r h 在表皮屏障形成和伤后修复中发挥重要的作用，并且 从多细胞动物出现，g r h 在表皮屏障形成和伤后修复功能上具有保守性。 尽管目前人们很确信，g r a i n yh e a d 转录因子直接参与了表皮创伤 修复，但是对其中g r a i n yh e a d 的下游靶基因和调控路径的认识还相当 有限。于是本课题组通过在数据库中对g r h 靶基因的搜索，筛选到1 个 新的g r h 靶基因一d r e 蜴它编码一个哺乳动物酪氨酸激酶受体 ( r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s er e t ) 的同源蛋白。在f l y b a s e 中的基因序 列登入号为c g l 0 2 4 4 。该基因全长为2 9 4 1 个碱基，定位于3 号染色体的 r 臂9 6 c 4 - 9 6 c 5 区。它含有一个长为2 3 2 2 个碱基的开放阅读框，编码一 个含7 7 3 个氨基酸的蛋白质，蛋白质分子量大约为8 6 千道尔顿，包括了 氮末端( n - t e r m i n u s ) 的c a d h e r i n 结构域和碳末端( c ：t e r m i n u s ) 的 t y r o s i n ek i h a s e ，c a t a l y t i c 结构域。 我们研究d r e t 2m r n a 的表达，通过m r n a 原位杂交，发现该基因在 胚胎发生后半期几乎所有表皮组织中都有表达，如表皮，气管。同时我 们还在该基因中鉴定出一个2 k b 内含子的增强子，其中含有一个高度保 守的g r h 蛋白结合序列。这个增强子能驱动报告基因g f p 在表皮表达， 而在g z h 突变体胚胎中，报告基因g f p 的表达消失。从已知的研究中知 道g r h 参与了表皮屏障形成和伤后修复的转录调节，我们对d r e t 2 的突 变体和野生型果蝇胚胎进行无菌表皮创伤修复比较试验，发现野生型果 蝇胚胎伤口在受伤后约70 分钟完全愈合，而50 的d r e t 2 突变体胚 胎伤口不能完全愈合，剩下的胚胎伤口愈合时间延长至15o 分钟。这 表明在果蝇中对于创伤后快速的愈合需要d r e t 2 的参与。运用r t - p c r 检测到在野生型果蝇中d r e t 2 的表达水平受到创伤诱导而上调。利用 ，l u a s g a l 4 系统异位表达a r e t 2 弓 起f - a c t i n 表达的增加，说明d r e t 2 雕3 表达可能控制了机动蛋白( a c t i n ) 的聚合，并且通过对机动蛋白( a c t i n ) 的影响来参与了表皮创伤修复过程。 关键词：g r a i n y h e a d ( g r h ) ，d r e t 2 基因，创伤修复，表皮再植 h j ：f ? j a b s t r a c t a sa ni m p o r t a n tm o d e lo r g a n is m ，d r o s o p h il ah a sm a d eg r e a t c o n t r i b u t i o nt ot h er e s e a r c ho n g e n e t i c sa n dd e v e l o p m e n t a l b i o l o g y d r o s o p h i l a g r a i n yh e a di sap h y l o g e n e t i c a l l yc o n s e r v e d t r a n s c r i p t i o nf a c t o re x p r e s s e di ne p i d e r m a lc e l l si nf i e m a t o d e s ， f lie s ，f r o g s ，m ic ea n dh u m a n s r e c e n t s t u d yh a ss h o w n a n i n t r i g u i n g f u h c t i o nf o rg r hp r o t e i ni n e p i t h e l i a l b a r r i e r f o r m a t i o na n d r e p a i ru p o nw o u n d i n g ， a b i o l o g i c a lp r o c e s s c o n s e r v e ds i n c et h ea d v e n to fm u l t i c e l l u l a ra n i m a l s a l t h o u g ht h e r ei sc o m p e l l i n ge v i d e n c et h a tg r hp r o t e i n d i r e c t l y o r c h e s t r a t e sr e e p i t h e l i a l i z a t i o np r o c e s s ， 1 i t t l ei s k n o w na b o u ti t sr e g u l a t o r ys i g n a l i n gp a t h w a yo rt a r g e tg e n e s i n v o l v e di nw o u n dh e a li n g w ep e r f o r m e da ni n s ili c od a t a b a s e s e a r c hf o rg r ht a r g e t sa n df o u n dd r e t 2 ，ah o m o l o go fm a m m a li a n r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e ( r e t ) d r e t 2m r n ai s2 9 4 1b p ，m a p p i n gt o c h r o m o s o m e3 r9 6 c 4 9 6 c 5r e g i o n t h ec d n as e q u e n c eo fi tc o n t a i n s a no p e nr e a d i n gf r a m eo f2 3 2 2b p ，e n c o d i n gap u t a t i v ep r o t e i no f 7 7 3a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f8 6l 【d a t h en 。t e r m i n u so fd r e t 2c o d i n gr e g i o nh a sac a d h e r i nd o m a i na n d t h ec t e r m i n u sh a sat y r o s i n ek i n a s ec a t a l y t i cd o m a i n w es t u d i e dd r e t 2m r n aa n df o u n di te x p r e s s e di na 1 1e p i t h e l i a l t i s s u e si n c l u d i n ge p i d e r m i sa n dt r a c h e ad u r i n gt h es e c o n dh a l f o fe m b r y o g e n e s i sb yi ns i t uh y b r i d i z a t i o n w eh a v ei d e n t i f i e da 2 k bi n t r o n i ce n h a n c e rw i t hah i g h l yc o n s e r v e dg r hb i n d i n gs i t e i nt h ed r e t 2g e n e t h i se n h a n c e rd r i v e st h ee x p r e s s i o no fag f p r e p o r t e rg e n ei na l le p i t h e l i a lt i s s u e s ，a n di sa b o l i s h e di ng r h m u t a n t s g i v e nt h ec o n s e r v e dr o l e so fg r hi nf o r m a t i o no f 卜二 ，l e p it h e li as h e e ta n dw o u n dh e a li n g ，w et e s t e da n dc o m p a r e dt h e d r e t 2m u t a n t sa n dw i l dt y p ed u r i n gw o u n dh e a l i n gp r o c e s s a s e p t i c p u n c t u r ew o u n d sb e c o m e s e a l e dw i t h i n7 0m i n u t e si nw i l dt y p e e m b r y o s t h ew o u n d so f5 0 o fd r e t 2e m b r y o sd idn o tc l o s e ，a n d i nt h er e m a i n i n go ft h em u t a n t st h ew o u n d sc l o s e di n1 5 0m i n u t e s ， b yr t p c r ，w ed e t e c t e dt h a td r e t 2m r n ai si n d p c e db yw o u n di nw i i d t y p ee m b r y o s w h i c hi n d i c a t i n gt h a td r e t 2i sr e q u i r e df o rr a p i d r e 。e p i t h e l i a l i z a t i o nd u r i n gw o u n dh e a l i n g 0 v e r e x p r e s s i o nd r e t 2 c a ni n c r e a s ef - a c t i n ，w h i c hs u g g e s t st h a td r e t 2m a yc o n t r o la c t i n p 0 1 y m e r i z a t i o na n dm a yf u n c t i o ni nw o u n dh e a l i n gt h r o u g h c o n t r o l l i n ga c t i n k e y w o r d s ：g r a i n y h e a d ( g r h ) ，d r e t 2 ，w o u n dh e a li n g ， r e 。e p i t h e l i a l i z a t i o n i v 文、j 目录 摘要? i a b s t r a c t 】 1 引言和文献综述l 1 1 果蝇一理想的模式生物一l l ：1 1 果蝇生物学简介1 1 1 2 果蝇研究历史1 1 1 3 果蝇作为模式生物的优势2 1 1 4 果蝇作为模式生物的应用2 1 2 转录因子g r a in yh e a d 和创伤愈合3 1 2 1 简介3 1 2 2g r h 在表皮屏障形成中的不同靶基因4 1 2 3g r h 蛋白对伤后表皮屏障修复的必要性：5 2 实验材料与方法6 2 1 果蝇品系6 2 2 果蝇饲料的配制7 2 3 基本分子生物学方法“7 2 3 1 本研究所用的引物7 2 3 2 本研究所用的实验方法8 3 实验结果17 3 1d r e t 2 基因的计算机预测17 3 2d r e t2 的基因表达模式18 3 3d r e t 2 是g r h 的靶基因：2 0 3 4d r e t 2 突变体胚胎在创伤后表皮再植中的缺陷2 2 3 5 异位表达d r e t 2 引起f - a c t i n 的变化? 掣2 4 4 实验讨论25 5 结语：a d o a 27 6 其他工作28 6 1 锌指蛋白转录因子与心脏发育基因调控2 8 6 2 材料与方法公31 6 2 1 生物信息学软件- 3l 6 2 2 主要材料与试剂31 6 2 3z n f 3 8 3 基因的全长克隆_ 3 2 6 2 4z n f 3 8 3 基因的序列特征分析结果3 6 6 2 5z n f 3 8 3 基因的表达分析3 8 6 2 6z n f 3 8 3 基因的亚细胞结构中的定位分析4 0 6 2 7 结语4 2 参考文献4 3 附录一攻读学位期间发表的学术论文和综述4 9 附录二缩略词表5 1 致谢。5 3 湖南师范大学学位论文原创性声明5 5 湖南师范大学学位论文版权使用授权书5 5 o 、 曝；，j 果蝇g r a i n yh e a d 靶基因一d r e t 2 的功能研究 ，”， 。! 1 ，引言和文献综述 1 1 果蝇一理想的模式生物 1 1 1 果蝇生物学简介 黑腹果蝇( d r o s o p h il am e l a n o g a s t e r ) ，现一般简称果蝇，在分类 地位上属于节肢动物门( a r t h r o p o d a ) ，昆虫纲( i n s e c t a ) 、双翅目 ( d i p t e r a ) 、果蝇科( d r o s o p h i l i d a e ) 、果蝇属( d r o s o p h i l a f e l l e n ) 。 在自然界中，果蝇一般以腐烂的果实为食。其生活史包括卵、幼虫、蛹、 成虫四个阶段。幼虫要经过两次蜕皮：第二次蜕皮后的3 龄幼虫长度一 般可达2 毫米以上，并在三龄幼虫末期开始化蛹。果蝇有4 对染色体， 雌蝇有3 对常染色体和一对x x 性染色体：雄蝇有3 对常染色体和一对x y 性染色体o ，一 1 1 2 果蝇研究历史 2 0 世纪初，m o r g a n 选择黑腹果蝇作为研究对象，通过简单的杂交及子 代表型计数的方法，建立了遗传的染色体理论，奠定了经典遗传学的基 础并开创利用果蝇作为模式生物的先河【l 】。1 9 2 7 年，m o r g a n 的学生 m u l l e r 发现放射线可以导致遗传损伤和突变，从而可以进行人工诱变。 2 0 世纪3 0 年代，p a i n t e r 和b r i d g e s 发表了果蝇的多线染色体图，为 基因组的物理图谱奠定基础。l e w i s 、n u s s l e i n v o l h a r d 与w i e s s c h a u s 由 于在胚胎早期发育遗传机制的重大发现而获得了1 9 9 5 年的诺贝尔医学 或生理学奖。这些成就也反映了模式生物果蝇在生命科学研究中的重要 地位。利用果蝇进行遗传学研究的历史悠久，对其染色体组成和表型、 基因编码和定位的认识，都是其他生物无法比拟的。2 0 世纪8 0 年代 以来，针对果蝇的基因组操作取得了重大进展，在果蝇中发展出一系列 有效技术，许多这样的技术如今已应用到其他后生动物，但有些技术仍 然只能应用于果蝇，如增强子陷阱技术、定点同源重组技术、双组分异 位基因表达系统、嵌合体分析技术及果蝇中基因定点敲除技术等。 硕士学位论文 1 1 3 果蝇作为模式生物的优势 果蝇作为模式生物的优势主要有体积小、易于操作、饲养简单、成本低 廉、生命周期短( 约两周) 、繁殖力强、子代数量多，以及便于进行表型 分析、有利于一般实验室使用等。一百余年的研究积累了很多有关果蝇 的知识与信息，制备了大量的分布于数以千计的基因中的突变体j 果蝇 还有许多携带便于遗传操作的表型标记、分子标记或其他特性的特征染 色体，这些工具可以进行大规模基因组筛选分离一系列可见或致死表 型，甚至可以分离那些只在突变个体的第二或第三代才表现的表型。 2 0 0 0 年，果蝇全基因组测序基本完成，全基因组约1 6 5m b ( 人类基因 组约33 0 0 m b ，约有3 00 0 0 个基因) 。编码蛋白的基因有1 36 0 0 种， 约一半蛋白与哺乳动物蛋白有序列同源性。所以果蝇作为模式生物的优 势还在于，果蝇的许多基因、基本的生化途径及信号通路在脊椎动物到 人中都高度保守。在很多情况下，果蝇的单个基因便具有哺乳类多个相 关家族成员的功能，如果蝇的p 5 3 基因相当于人p 5 3 、p 6 3 、p 7 3 基因 共同的祖先。 。， 1 1 4 果蝇作为模式生物的应用 果蝇作为遗传学研究的经典模式生物，用以阐明真核生物遗传学的基本 原理与概念，包括性别诀定的染色体结构基础、遗传连锁、染色体动力 学与行为等。2 0 世纪7 0 年代以来，果蝇广泛应用于发育生物学研究， 以了解一个相对简单的受精卵如何演变成复杂的生物体的，包括胚胎发 育唿副，各种成体器官的形成h j l ，如眼睛、翅膀、腿、脑、心脏等器官 是如何发育而来。当人们分离了一个功能不明的重要哺乳动物基因的果 蝇同源物时，可以利用果蝇系统丰富的遗传学方法来研究该基因的功 能。果蝇基因在发育中的表达模式、功能失活表型与过表达表型均可说 明该基因的功能。在突变表型或表达模式相似及突变增强或抑制表型的 基因中可以鉴定出在同一信号通路中发挥功能的其他成员。果蝇还提供 了通过“修饰子筛选”鉴定相互作用基因的机会，这样就可以对人类疾 病同源基因在信号通路背景下进行研究。分离果蝇信号通路中新鉴定基 因的哺乳动物同源物也有助于说明哺乳动物相应的信号通路阳】。果蝇遗 00l 果蝇g r a i n yh e a d 靶基因一d r e t 2 的功能研究 传学的优势在阐明肿瘤生物学、细胞周期、受体酪氨酸激酶( r e c e p t o r t y r o s i n ek i n a s er e t ) 等信号通路信息7 引。 总之，近一个世纪以来，果蝇在生物学舞台上占有举足轻重的地位，是 一种理想的模式生物，不论是在过去、现在还是将来，它为人类探索生 命真谛做出的贡献都是不可磨灭的。 1 2 转录因子g r ain yh e a d 和创伤愈合 1 ：2 1 简介。 在动物表皮的最外层是一层基质表层，用来防御病原微生物，防止生物 体脱水和受到机械的损伤。尽管组成这一表皮保护屏障的蛋白和多聚糖 在动物界中各有不同，但是表皮保护屏障形成的遗传学机制和创伤后愈 合的机制却呈现出高度的保守性随1 们。在这一高度保守的过程中， g r a i n y h e a d ( g r h ) 起到了重要的作用。g r a i n y h e a d ( g r h ) 是二类在线虫、1 + 果蝇、蛙类、小鼠和人中表皮细胞中都有表达的转录因子家族，在系统 发生中相当的保守。 1 9 8 4 年，当人们对果蝇的胚胎发生展开深入研究时，作了一次大的遗 传筛选，其中发现有些基因的突变会引起表皮屏障的缺陷。其中人们 发现了g r a i n yh e a d ( g r h ) 的突变体呈现出松弛的胚胎表皮( c u t i c l e ) ： 和不完整的粒状头骨骼表型n 引。基因g r h 编码一个核蛋白，最初人们将 这个蛋白命名为e i f - i n t f ，同时基因g r h 也成为了这个新的转录因子家 族的第一个被鉴定的成员n 纠引。g r h 功能的执行是通过激活多巴脱羧酶基 因d o p a d e c a r b o x y l a s e ( d d c ) 在表皮中的表达实现的n 幻jd d c 编码的多 巴脱羧酶作用在表皮角质层铰链蛋白形成过程中n 引。 。 尽管人们在各种各样不同的动物中都能找至l j g r h 蛋白质，但在单细胞生 物中却不含有此蛋白 1 4 - 1 9 。在果蝇和线虫中只有- - 种g r h 基因，而在复杂 的脊椎动物中，它们进化出3 种g r h 相似基因。像果蝇的g r h 一样，3 种 脊椎动物的g r h 相似蛋白( g r h l l ，2 ，3 ) 在胚胎发生过程中都在外胚层来 源的表皮中有表达n 4 。驯。这提示人们在表皮细胞分化过程中，g r h 蛋白功 能相对于进化是保守的。最近两篇同时发表在杂志s c i e n c e 上的论文提 硕士学位论文 出了g r h 在表皮屏障形成和伤后修复中的功能保守性n h 1 2 2g r h 在表皮屏障形成中的不同靶基因 表皮细胞最重要的功能就是分泌和组成具有保护性的屏障，抵御不利的 外界环境，从而保护生物体。不管是昆虫还是脊椎动物，其包裹在表皮 外的那层不溶且高度铰链的基质成为了生物体的第一道防御。但是如图 1 - - 1 所示，在脊椎动物和昆虫中，这层表皮屏障的结构和分子构成有着 根本的不同，因此仅从果蝇表皮形成需要g r h 的这一方面去阐明g r h 的保 守功能不太有预见性。所幸的是，最近s t e p h e nt i n g 和他的同事从实验 中发现，小鼠胚胎发生中，表皮屏障的形成必须要有g r h l 一3 的参与。对 g r h l - 3 的表达检测证明发生在鼠胚发育中的外胚层表层， 物陋嘲蜘掣蝴愀印妇帅螺洲q 舣糖 图l l 脊椎动物和昆虫表皮结构图 ( 此图摘自m o t i s sj a nb ，u v e b i o e s s a y s 2 0 0 5o c t ；2 7 ( 1 0 ) ：9 8 7 - 9 0 ) g r h l - 3 - - 胚胎在晚期呈现出表皮屏障缺陷，从而导致出生后过度失水。 在探寻导致这一非正常表型的g r h l - 3 下游靶基因过程中，他们在 g r h l - 3 - - 胚胎表皮中检测到急剧减少的转谷氨酰胺酶基因 t r a n s 9 1 u t a m i n a s e l ( t g a s e l ) 。t g a s e l 是一种参与表皮外角质层s t r a t u m c o r n e u m ( s c ) 发育和成熟的酶，同时也铰链s c 各成分使得水分和盐类无 法穿过侧。对t g a s e l 启动子的分析发现其中包含了g r h l - 3 的d n a 结合位 点，并且d n a 结合位点的序列与果蝇中g r h 的非常一致，这证明了t g a s e l 是g r h l 3 的直接作用靶基因晗射。这一发现与果蝇中通过g r h 结合并激活 d d c 的表达来完成表皮蛋白的铰链过程有惊人的相似，尽管d d c 和 t g a s e l 编码不同且不相关联的酶蛋白，而且d d c 也不在小鼠表皮中表达。 因此g r h 在体表屏障形成中功能的保守性并不是通过作用于相同的靶基 4 果蝇g r a i n yh e a d 靶基因一伽绾的功能研究 因，而是在生物水平中的保守。 1 2 3g r h 蛋白对伤后表皮屏障修复的必要性 脊椎动物s c 的分化是贯穿终生的过程，昆虫表皮的沉积不仅仅只发生在 胚胎时期，还会在幼虫期和变态期继续。组成型的g r h 在动物体的整个 生命过程都在表皮中被表达。因为面对外界，表皮总是遭受最直接和最 频繁的损伤，所以表皮的修复( e p i t h e l i a lr e p a i r ) 和再生能力 ( r e e p i t h e l i a l i z a t i o n ) 是表皮器官的重中之重。最近对g r h 功能的 研究也揭示了这个转录因子在表皮修复中的作用。 ， 虽然果蝇和小鼠在表皮结构上有根本的不同，可是在表皮伤后愈合过程 中，两者有着相同的特点。在表皮受伤的最初时期，血淋巴( 昆虫的 血液) 和被破坏的细胞残骸一道凝结在一起形成凝块暂时的堵住伤口， 类似于脊椎动物中蛋白酶级联反应产生的血纤维凝块。同时伤口周围的 细胞开始朝向伤口中心迁移试图愈合组织裂缝心3 一制。2 0 0 5 年，k i m b e r l y m a c e $ 口同事观察到，当果蝇晚期胚胎受到创伤后，在伤口周围的细胞里 两种与表皮屏障形成相关的蛋白酶基因受创伤诱导表达升高。这两种酶 分别是d d c 和p a l e ，其中p a l e 是酪氨酸羟化酶，位于d d c 上游嗌一嗣。在鉴 定d d c 启动子区内创伤反应因子时，他们找到了a p i ( 能被j n k 信号途径 激活并且在进化上保守的转录调控因子，这一途径存在于伤口周围细胞 内) 的结合位点，以及一个n f - k b ( 能调控创伤诱导的发炎反应的转录 因子) 的结合位点，同时还含有两个g r h 的d n a 结合位点盟7 。3 5 1 。在g r h 突变 体胚胎中，创伤诱导的d d c 的表达消失，但是伤口仍然愈合，表明g r h 是 在创伤愈合的最后实质性阶段即表皮屏障的表皮再植 ( r e e p i t h e l i a l i z a t i o n ) 过程中发挥功能。因此在果蝇表皮被打断出 现伤口后，表皮内已存在的g r h 蛋白活性会迅速变化以满足表皮修复的 眉昏扭 而承o ， 在小鼠中，t g a s e l $ f l k e r a t i n 6 受创伤诱导后在小鼠皮肤伤口处显著上 调表达。在g r h l 一3 - - 胚胎中，伤口愈合明显晚于野生型，这种相对于 野生型的表皮再植的失败揭示了鼠类中g r h l 3 对于细胞的迁移是很重要 的。因此，如图l 一2 中所示在脊椎动物和昆虫中，在创伤后表皮修复 硕士学位论文 ，：i | 0 lj ：ri 2 实验材料与方法 2 1 果蝇品系 本研究中所用到的果蝇品系如下： 野生型果蝇w 1 1 1 8 ； d r e t 2 缺失突变体d r e t 2 - - ： g r h 缺失突变体g r h - - ； e n g r a i l e d g a l 4 品系； - i i 一 果蝇g r a i n yh e a d 靶基因一d r e t 2 的功能研究 u a sd r e t 2 品系； 5 k bd r e t 2 - g f p 转基因品系； 3 k bd r e t 2 - g f p 转基因品系； 2 k bd r e t 2 - g f p 转基因品系： m o e - g f p 转基因品系 2 2 果蝇饲料的配制 t 1 如配制总体积为9 0 0 m l 的饲料，量取6 0 9 玉米粉，9 9 黄豆粉，9 9 琼脂，1 5 9 干酵母，加3 0 0 m l 冷水，搅拌均匀： 2 再加3 0 0 m l 沸水，煮沸1 0 分钟： 3 加1 8 9 对羟基苯甲酸甲脂，另加3 0 0 r a l 冷水： 4 再次煮沸，加4 2 9 麦芽糖； 5 冷却片刻。，加入3 m l 丙酸： 6 将饲料装瓶，约2 c m 厚即可 。 2 3 基本分子生物学方法 2 3 1 本研究所用的弓 物 用于m r n ai ns i t u 的探针合成引物： f o r w a r d5 ，一3 ：a c c c t t c c t g c c a a a c t 。 r e v e r s e5 一3 ：c c g a g g c c c a c a a t c a g 。 用于表达g r h 蛋白的融合表达载体p g e x - g r h ( 6 0 3 - 8 6 5 a a ) 获赠于 a n n ee u v 博士。 用于克隆d r e t 2 的5 序列到g f p 报告基因载体p h s t i n g e r 引物： 5 k b d r e t 2 一g f p f o r w a r d5 一3 ： g c t c t a g a t g t g t a c t c t t c c g a t g g a t t ( x b a i ) 。r e v e r s e5 一3 ：g g g g t a c c g a c t a g c a t c g t t t t c a c c a c ( k p n l ) 3 k bd r e t 2 一g f p f o r w a r d5 一3 ：g c t c t a g a t g t g t a c t c t t c c g a t g ( 认。r t ( x b a i ) r e v e r s e5 一3 ： g g g g t a c c c c t t c t t g t g a a a t c a g t g ( k p n l ) 2 k bd r e t 2 一g f p f o r w a r d5 一3 ；g c t c t a g a t g a t t g t g g c c c t c g g c t g ( x b a i ) r e v e r s e5 一3 ：g g g g t a c c g a c t a g c a t c g t t t t c c c a c ( k p n i ) 用于r t - p c r 的引物： r p 4 9f o r w a r d5 一t g a c c a t c c g c c c a g c a t a c a - 3 7 r e v e r s e5 一t c t c g c c g c a g t a 从c - 3 d r e t 2f o r w a r d5 ，一g g a g c t t c g g c a t a c t g a t 一3 r e v e r s e5 一t a t t t g c a g t g c g a c t c g t - 3 d d cf o r w a r d5 一c t a t c g t c a c t g g c a a a t c c 一3 r e v e r s e5 一g a t g g a c g a a c c a t c t t t t g 一3 2 3 2 本研究所用的实验方法 2 3 2 1 感受态细胞的制备 1 接种一个单菌落到5m 1l b 培养基中：。 2 3 7 。c ，1 5 0 r p m 摇过夜； 3 接i m l 菌液到l o o m ll b 培养基中( 加l m lt e t r a c y c l i n5 m g m 1 ) ： 4 当o d 6 0 0 = 0 5 - 0 6 ，将菌液置于冰上3 0 分钟，以停止生长； 5 4 ，4 5 0 0 r p m 离心5 分钟； 6 移去上清； 7 加2 5 m lc a c l ：( 5 0 m m - l o o m m ) ，重新悬浮沉淀； 8 在冰上放置1 小时： 9 4 ，4 5 0 0 r p m 离心5 分钟： l o 移去上清； 1 1 加4 m lc a c l 2 ( 5 0 m m - l o o m m ) ，l m l8 0 甘油； 1 2 分装成5 0 0ul ，- 7 0 。c 保存。 l b 培养基： t r y p t o n el o g y e a s te x t r a c t 5 9 n a c i 1 0 9 1 5 p s i ( 1 0 5 k g c m 2 ) 灭菌2 0 分钟 2 3 2 2 质粒的转化 1 将连接产物加进1 5 0u1 感受态细胞中； n 2 在冰上放置3 0 分钟； 3 4 2 。c 热击9 0 秒； 8 f 果蝇g r a i n yh e a d 靶基囚一加凹的功能研究 4 在冰上放置1 - 2 分钟； 5 加4 0 0u1l b 培养基： 6 3 7 摇4 5 分钟： 7 用2 0 0pl 涂a m p i c i l l i n 平板； 8 3 7 过夜培养。 a m p i c i l l i n 平板： t r y p t o n e 1 0 9 y e a s te x t r a c t 5 9 n a c l l o g a g a r1 5 9 + d d h 2 0 叫l 1 5 p s i ( 1 0 5 k g c m 2 ) 灭菌2 0 分钟，稍加冷却，加2 m la m p i c i l l i n ( 5 0 m g m 1 ) ，倒板。 2 3 2 3 质粒的小量制备 。 1 挑单菌落到3 m l 含1 0 0pg m la m p i c il li n 的l b 培养基中，3 7 培养过夜； 。 2 用1 5 m le p p e n d o r f 管收集菌液，离心3 0 秒，移去上清： 3 可重复步骤2 ； 4 。用8 0 0u1 p b s 洗一下，离心i m i n ； 5 加入1 0 0n1 冰冷的溶液i ，充分振荡： 6 在室温下加入2 0 0u1 溶液i i ( 混合1 0 0ulo 4 nn a o h 和i 0 0u 12 s d s ) ，翻转管子5 次，在冰上孵育5 分钟； 7 加1 5 01 1 冰冷的溶液i i i ，翻转管予5 次，冰上孵育3 - 5 分钟； 8 1 3 9 0 0 r p m 离心1 0 分钟，将上清转移到新管子里； 9 加h n ! 纯乙醇，在室温下沉淀1 0 分钟，1 3 9 0 0 r p m 离心1 5 分钟； 1 0 用7 0 z = 。醇洗一下，1 3 9 0 0 r p m 离心5 分钟： 1 1 在室温下干燥； 1 2 溶于3 0uld d h 2 0 ： 1 3 可用限制性酶切鉴定质粒。 9 硕士学位论文 溶液i ： 5 0m mg l u c o s e 2 5m mt r i s h c lp h8 0 1 0m me d t a a d dr n a s e at o1 0 0ug m l 1 5 p s i ( 1 0 5 k g c m 2 ) 灭菌2 0 分钟。 溶液i i ： - _ _ _ - _ _ _ _ _ - 一 0 2nn a o h 0 1 s d s 溶液i i i ： 6 0 m l5mk o a c l 1 5m l g l a c i a lh o a c 2 8 5m lh 2 0 p b s ： 1 3 7 i n mn a c l 2 7 n 1 mk c i 10 i i 姒n a 2 h p 0 4 2 槲k h 2 p 0 4 调节p h 至7 4 2 3 2 4 通过n u c l e o b o n d 纯化质粒 1 用n 2 溶液l m l 平衡n u c l e o b o n da x 柱子； 2 将质粒d n a ( 用d d h 2 0 稀释到l o o u l ) 上柱，如需要可将流出物 再上一次柱； 3 用n 3 溶液l m l 洗柱子3 次； 4 用n 5 溶液0 7 m l ( 预热到5 0 ) 洗脱质粒d n a ，。以1 5 m l e p p e n d o r f 管收集流出物。 5 加0 7 - 0 8 m l 异丙醇，1 3 9 0 0 r p m 离心3 0 分钟； 6 用7 0 乙醇洗一下沉淀，1 3 9 0 0 r p m 离心5 分钟； 7 在室温下干燥； 1 0 果蝇g r a i n yh e a d 靶基因一加堙的功能研究 8 溶于缓冲液。 2 3 2 5 果蝇基因组d n a 的纯化 1 将3 0 只果蝇放入e p p e n d o r f 管内； 2 加7 5 0 1 l1l y s i sb u f f e r ： 3 将果蝇匀浆； 4 在6 5 。c 孵育5 分钟； 5 力口3 5i lli o s d s ，1 2i llb m e r c a p t o e t h a n o l ，2 5i l1 r n a s ea ( 1 0 m g m 1 ) ： 6 在6 5 。c 孵育3 0 分钟； 7 力日4 8ui d t t ( 1 m ) a n d1 2u1 p r o t e i n a s ek ( 2 0 m g m 1 ) ： 8 在6 5 。c 孵育3 小时； 9 加0 7 m lp h e n o l ，振荡( 注意带手套) ； 1 0 1 3 9 0 0 r p m 离j 心5 分钟； 1 1 将上相溶液转移到新管子中； t 1 2 力目o 7u1 c h l o r o f o r m is o p r o p a n 0 1 ( 2 4 ：1 ) ，振荡； 1 3 1 3 0 0 0 r p m 离心5 分钟； 1 4 将上相溶液转移到2 个新管子中； 1 5 在每个管子中加4 0u1 3 mn a a c ( p h 5 2 ) ，0 8 m l 无水乙醇； 1 6 1 3 9 0 0 r p m 离心1 8 分钟； 1 7 吸去无水乙醇； 1 8 用7 0 乙醇洗一下； 1 9 室温干燥； 2 0 每管加7 5ui d d h 2 0 。 l y s i sb u f f e r ： l o m mt r i s ( p h 8 0 ) 1 0 m l v ! e d t a ( p h 8 0 ) l o o m mn a c i 2 3 2 6 用d n ae x t r a c t i o nk i t 从琼脂糖胶中回收d n a 1 切下d n a 条带，放入e p p e n d o r f 管，称重= ? g ，( 1 9 = i m l ) ； 硕士学位论文 2 加入三倍体积的b i n d i n gs o l u t i o n ： 3 在5 5 。c 孵育5 分钟以溶解胶； 4 加入重新悬浮过的s i l i c ap o w d e r5u1 p o w d e r l u g d n a ) ； 5 在5 5 。c 孵育5 分钟，每2 分钟振荡一次； 6 1 3 9 0 0 r p m 离心5 秒，移去上清； 7 加入冰冷的w a s hb u f f e r ，重新悬浮进行洗涤； 8 重复洗涤步骤3 次； 9 离心，将剩余液体吸干净； l o 空气干燥沉淀1 0 - 1 5 分钟； 1 1 力日1 0uld d h 2 0 以洗脱d n a ； 1 2 重新悬浮沉淀，在5 5 。c 孵育5 分钟： 1 3 离心，将上清转移到新管子中； 1 4 重复洗脱步骤。 2 3 2 7g r h 在大肠杆菌中的诱导表达 将构建好的表达质粒p g e x 5 x - 2 - g r h 质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ，连续 传代2 次后，挑菌培养并用甘油保存。 1 早上接菌，5 0 0ul 甘油菌转接到3 m ll b 液体培养基中，3 7 。c 恒温 振荡培养1 - 2 h ，使菌液浓度达到o d 6 0 0 约为o 6 ； 2 转接到3 m ll b 培养基中，继续振荡培养； 3 当菌液浓度达o d 6 0 0 约为0 3 时，加入i p t g ( 终浓度为i m m 0 1 ) ； 4 以l h 为时间差收集菌体，每次收集5 0 0l al ： 5 离心收集浓缩菌体，加入l o a d i n gb u f f e r 约2 0 3 0ul 重悬菌体； 6 沸水浴l o m f n ： 7 1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，备用