（茶学专业论文）茶叶中二氢黄酮醇还原酶无色花青素还原酶性质研究.pdf

摘要 儿茶素类是茶多酚的主体组分，是茶叶最重要的特征代谢成分，同时也是构成茶 叶品质的主要化学成分。 儿茶素合成途径中可能涉及的酶类有肉桂酸羧化酶( c 4 h ) 、4 香豆酰c o a 连接酶 ( 4 c l ) 、查耳酮合成酶( c h s ) 、查耳酮异构酶( c h i ) 、二氢黄酮3 一羟化酶( f 3 两、二氢黄 烷醇4 还原酶( d f r ) 、无色花色素还原酶( l a r ) 、花青素还原酶( a n r ) 等。d f r l a r 是黄酮类化合物合成下游途径中的重要酶类，在儿茶素合成途径中具有重要的调节作 用。本课题对茶叶中d f r l a r 酶反应产物进行了鉴定，建立了d f r l a r 酶活性的简 单测定方法，较系统地研究了d f r l a r 的动力学性质，并探讨了不同部位茶鲜叶和 茶细胞系中儿茶素c 和g c 与d f r l a r 活性间的相关性。主要研究结果如下： 1 利用高效液相色谱( h p l c ) 、薄层层析( t l c ) 、紫外可见光扫描和香草醛盐酸 比色法分别对d f r l a r 酶促反应的产物无色花青素、儿茶素c 和g c 进行了鉴定。在 此基础上，建立了1 香草醛盐酸比色法检测d f 刚l a r 酶活性的简便方法。 2 建立了以辅酶n a d p h 在反应体系中的消耗为基础的d r f l a r 酶活性检测方 法。 3 采用1 香草醛盐酸比色法、n a d p h 消耗方法分别对d r f l a r 酶动力学特 征进行了研究，结果表明，当底物为二氢槲皮素( d h q ) 时，d r f l a r d h q 酶反应的 最适温度在4 5 - - - 6 5 c 表现最高、最适p n 为5 0 、7 5 8 o ；当底物为二氢杨梅素( d h n i ) 时，d r f l a r d h m 酶反应的最适温度为4 5 ( 2 、最适p h 为7 0 。底物浓度与酶反应速 率间的关系不表现为典型的米氏方程，存在底物抑制现象，经直接线性作图法得到两 种底物的四个表观米氏常数为k n a d p h - d h o _ o 8 8 8m m o l l 、k n a d p h d h m = 0 9 2 5m m o l l 、 k d h q - n a d p h = 0 3 3 7m m o l l 、k d h m n a d p h = i 1 4 5m m o l l 。研究结果还显示，4 m m o l l m 9 2 + 、1 0 0 m m o l ls d s 对d r f l a r 的活性有一定提高；e d t a 在0 - - - 1m m o l l 范围 内对d r f l a r 活性有极强的抑制作用，而f e 3 + 在0 1m m o l l 范围内对d r f l a r 活性有一定的抑制作用。 4 对不同部位茶鲜叶与茶细胞系云茎6 3 中的总儿茶素含量、儿茶素c 和没食子 儿茶素g c 含量、d r f l a r 酶活性进行了测定，结果表明，无论茶鲜叶还是细胞系， d r f l a rd h m 的酶活性均高于d r f l a r d h q ；随着茶鲜叶成熟度的增加，d r f l a r 酶活性逐步下降，儿茶素g c 的含量与d r f l a r d h m 酶活性呈正相关性。 关键词：茶；二氢黄酮醇还原酶无色花青素还原酶；酶学性质 a b s t r a c t c a t e c h i n s ，t h ep r i n c i p a lc o m p o n e n t so ft e ap o l y p h e n o l ，a r en o to n l yt h em o s t i m p o r t a n tc h a r a c t e r i s t i cm e t a b o l i z i n gc o m p o n e n t si nt e ap l a n t ，b u ta l s ot h em a i nc h e m i c a l c o m p o n e n t so f t e aq u a l i t y s o m ee n z y m e sr e l a t e dt ot h ep r o c e d u r eo fc a t e c h i n sb i o s y n t h e s i si n c l u d ec i n n a m a t e 4 - h y d r o x y l a s e ( c 4 i - d ，4 一c o u m a r o y l c o al i g a s e ( 4 c l ) ，c h a l c o n es y n t h a s e ( c h s ) ，c h a l c o n e i s o m e r a s e ( c h l ) ，( 2 s ) 一f l a v a n o n e - 3 一h y d r o x y l a s e ( f 3 h ) ，d i h y d r o f l a v o n o l 一4 - r e d u c t a s e ( d f r ) ，l e u c o a n t h o c y a n i d i nr e d u c t a s e ( l a r ) ，a n t h o c y a n i d i nr e d u c t a s e ( a n r ) a n ds oo n d f r l a ri sv e r yi m p o r t a n te n z y m e si nf l a v o n eb i o s y n t h e s i sp a t h w a ya n dh a v es i g n i f i c a n t r e g u l a t i n gf u n c t i o ni nc a t e c h i nb i o s y n t h e s i s t h ed e t e r m i n a t i o no fd f r l a ra c t i v i t yw a s p r i m a r i l ye s t a b l i s h e da n dt h ek i n e t i c sp r o p e r t i e so fd f r l a rw e r ei n v e s t i g a t e di nt h i s p a p e r t h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nd f r l a ra c t i v i t ya n dt h ec o n t e n to fc a t e c h i n ( c ) o r g a l l o c a t e c h i n ( g c ) i nt e ac a l l u st i s s u s ea n dd i f f e r e n tp a r t so ft e al e a fw e r ea l s os t u d i e d 1 t h ep r o d u c t so fd f r l a re n z y m er e a c t i o ni n c l u d i n gl e u c o c y a n i d i n ，ca n dg c w e r ei d e n t i f i e db ym e a n so fh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) ，u l t r a v i o l e t v i s i b l es c a n i n ga n dv a n i l l i n - h y d r o c h l o r i ca c i d c o l o r i m e t r y a c c o r d i n gt ot h e s er e s u l t s ，i tw a sc o n f i r m e dt h a tt h ev a n i l l i n h y d r o c h l o r i ca c i d e o l o r i m e t r yw a sas i m p l em e t h o dt od e t e c t i n gt h ea c t i v i t yo f d f r l a r 2 t h ea n o t h e rd e t e c t i n gm e t h o df o rt h ea c t i v i t yo fd f r l a rw a sa l s oo b t a i n e d a c c o r d i n gt ot h ec o n s u m p t i o no fc o e n z y m en a d p h i nr e a c t i n gs y s t e m 3 ，n l ek i n e t i c sc h a r a c t e r i s t i c so fd f r l a rw e r e i n v e s t i g a t e db yu s i n g v a n i l l i n - h y d r o c h l o r i ca c i dc o l o r i m e t r ya n dn a d p hc o n s u m i n gm e t h o d t h er e s u l t s s h o w e dt h a to p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s6 5 a n do p t i m u mp hw a s5 5a n d7 5 8 0w h e n d h q a ss u b s t r a t e ，w h i l e4 5 o fp t i m u mt e m p e r a t u r ea n d7 0o fo p t i m u mp hw h e nd h m a ss u b s t r a t e t h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e ns u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dr e a c t i o nr a t eo f d f r l a re n z y m ew a sn o tat y p i c l am i c h a e l i s - m e n t o ne q u a t i o nd u et ot h es u b s t r a t e i n h i b i t i o n f o u ra p p a r e n tk mw i t ht w os u b s t r a t e sb yu s i n gl i n e a r i t yg r a p h i c a lw e r e o b t a i n e da s0 8 8 8 m m o l lo fi ( n a d p d h q ，0 9 2 5 m m o l lo fk n a d p h d h m ，0 3 3 7 m m o l lo f k d h q - n a d p h ，1 14 5m m o l lo fk d h m - n a d p h 1 1 1 er e s u l t sa l s or e v e a l e dt h a t4 m m o l lo fm g z + a n do 1m o l lo fs d sc o u l di m p r o v ee n z y m ea c t i v i t y , b u to 1m m o f lo fe d t ac o u l d s t r o n g l yr e s t r a i ne n z y m ea c t i v i t ya n df e ，十h a ds o m ei n h i b i t i o no ne n z y m ea c t i v i t yw i t h i n r a n g ef r o m0t o1m m o l l 4 1 1 1 ec o n t e n t so ft o t a l c a t e c h i n s ，c a t e c h i n ，g a l l o c a t e c h i na n dt h ea c t i v i t yo f d f r l a rw e r em e a s u r e di nd i f f e r e n tp a r t so ft e al e a fa n dt e ac a l l u st i s s u s eo f y u n j i n g 6 3 ”t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo fd f r l a r d h mw f l $ h i g h e rt h a nt h a to f d f r f l a r d h q n om a t t e ri nt e al e a ro rt e ac a l l u st i s s u s e 1 1 1 ea c t i v i t yo fd f r l a rd e c l i n e d g r a d u a l l ya l o n gw i t ht h em a t u r i t yo ft e al e a f , a n dg cc o n t e n tp r e s e n t e dap o s i t i v e c o r r e l a t i o nw i t ht h ea c t i v i t yo fd f r l a r d h m k e y w o r d s ：t e ap l a n t c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e ；d f r l a r ；e n z y m ep r o p e r t y 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：一髓盈一一 时间： 纺年6 月，7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 【保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 曼曼歪 时间： 盯年b 月，7 日 第一导师签名：时间： 钐年厂月f 徊 1 文献综述 荣树新梢和其它器官都富台茶多酚类( t e ap o l y p h e n o l s ) 物质，一股占茶叶干重 的1 8 3 6 。其中最重要的是以儿茶索( c a t e c h i n s ) 为主体的黄烷醇类，其含量约 占多酚类总量的7 0 8 0 ，是茶树次生物质代谢的重要成分，也是茶叶保健功能的 首要成分对茶叶的色香味品质的形成有重要作州。 1 1 儿茶素生物合成途径及其相关酶类 类黄酮( f l a v o n i d s ) 化合物是很多植物的次生代谢产物，广泛分布于植物界且具 有较强的生物活性。类黄酮化合物因其结构差异可被分多种类型，其中包括黄酮、黄 酮醇、黄烷醇( 儿茶素类) 、花色素苷、缩合单宁( c t s ，原花青素) 和其他一些衍 牛物。花色素苷能使植物的花和叶子产生颜色，缩舍单宁可使植物对微生物有定抗 逆性在植物生长发育和与环境的相互作用中发挥不同的功效”“4 1 。自上世纪9 0 年 代以来类黄酮生物合成研究成为植物次生代谢基因工程的主要目标”) 。 签，一娄；喜熬： i 强黼避鞠拉 毛一一“渊 竺竺曼! 囊b 静酾狲 ! 釜 ：警墓。 出= “二一毽一 5 ” 蠢瓣”“懿? ，簿： 目1 】婪黄酮生物合成选径 f i gi - it h ep a t h w a y o f f l a v o n o i db i o s y n t h e s i s 围圈 关于类黄酮物质生物合成和遗传学的研究已有诸多报道【2 5 “。目前植物类黄酮 合成的大致步骤已基本得到探明。同位素示踪实验证明，类黄酮分子中的a 环是由三 个乙酸分子头尾相接而成的，而b 环与c 环上的碳原子则来自于由莽草酸途径合成的 苯丙氨酸。苯丙氨酸经过苯丙酸盐途径形成查尔酮后，再进入各种不同的类黄酮合成 途径，形成不同的类黄酮物质( 图1 1 ) 。 p a l 、c 4 h 、4 c i f 3 h 、 a n s l 矢车菊苷元 i 香豆酰c 。a i d f r 上 无色矢车菊苷 n r l 表儿茶素e c 没食子转移酶 r 7 i 二氢杨梅素 、5 i 无色飞燕草苷a n s 没食子转移酶? 1r l 表没食子儿茶素没食子酸酯e g c g 图l - 2 儿茶素生物合成途径 f i g 1 - 2t h ep a t h w a yo fc a t o c h i nb i o s y n t h e s i s p a l 苯丙氨酸脱氨酶( p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e j ；c 4 h ：肉桂酸羧化酶( c i n n a m a t e4 一h y d r o x y l a s ej ；4 c l ： 4 一香豆酰c o a 连接酶( 4 一c o u m a r o y l c o al i g a s e ) ；c h s ：查耳酮合成酶( c h a l c o n es y n t h a s e j ；c h h 查耳酮异构酶 ( c h a l c o n ei s o m e r a s e j ；f 3 h ：二氢黄酮3 - 羟化酶( ( 2 s ) f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ) ；f 3 h ：黄烷酮3 一羟化酶( f l a v o n o i d 3 - h y d r o x y l a s e ) ；f 3 5h ：黄烷酮3 ，5 一羟化酶( f l a v o n o i d3 ，5 - h y d r o x y l a s e ) ；d f r ：二氢黄烷醇乒还原酶 ( d i h y d r o f i a v o n o i4 - r e d u c t a s e ) ；l a r ：无色花色素还原酶( i e u c o a n t h o c y a n i d i nr e d u c t a s e ) ；a n s ：花青素合成 酶( a n t h o c y a n i d i ns y n t h a s e j ；a n r , 花青素还原酶( a n t h o c y a nidinr e d u c t a s e ) ；没食子转移酶( g a i io yi t r a n s f e r a s e ) 2 在茶树上的一些研究已经证明，茶树中类黄酮物质的合成途径与大多数植物基本 一致【1 0 1 。儿茶素的化学结构主体是由a 、b 、c 、d 四个环组成，其中a 、b 、c 三环 组成了2 苯基苯并吡喃的基本结构，即类黄酮物质的基本结构，再连接上d 环即形 成酯型儿茶素。这些途径中可能涉及到的酶类有p a l ( 苯丙氨酸脱氨酶) 、c 4 h ( 肉 桂酸羧化酶) 、4 c l ( 4 香豆酰c o a 连接酶) 、c h s ( 苯基苯乙烯酮合成酶或查耳酮 合成酶) 、c h i ( 苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶或查耳酮异构酶) 、f 3 h ( 黄烷酮3 羧化 酶) 、d f r ( 二氢黄烷醇4 一还原酶) 、l 讯( 无色花色素还原酶) 、花青素合成酶( a n s ) 等、花青素还原酶( a n r ) 【l l j ( 图1 2 ) 。 在各种与儿茶素合成有关的酶中，由于p a l 是连接初生代谢与莽草酸途经的纽 带，所以也是研究较多的酶类之一。在p a l 、c a h 、4 c l 等酶的作用下，苯丙氨酸被 催化形成香豆酰一c o a ；c h s 处在类黄酮合成的早期阶段，是类黄酮合成途径中研究 最清楚的酶类之一；几乎所有的类黄酮类化合物都是由黄烷酮衍生而来的，黄色的苯 基苯乙烯酮在c h i 催化下，c 环闭合而转变成了无色的黄烷酮。 黄烷酮在f 3 h 的催化下，c 环第三位置羟化而形成二羟黄酮醇，它可以直接进 一步在二氢黄酮醇还原酶( d f r ) 作用下还原成无色花青素( l e u c o a n t h o c y a n i d i n ) ，也可 以先在黄烷酮3 羟基化( f 3 t h ) 或黄烷酮3 5 一羟基化酶( f 3 5 - h ) 作用下分别生成二氢槲 皮素( d h q ) 或二氢杨梅素( d h m ) 后，再由二氢黄酮醇还原酶( d f r ) 催化还原成无色花 色素。由f 3 h 、f 3 h 和f 3 5 h 三种羟化酶所催化反应的产物是合成花色素苷、儿 茶素类物质的直接前体，该过程可通过其产物的比例来决定花的颜色，依次为天竺葵 色素控制红色到橘色、花青素控制红色到紫色、飞燕草色素控制紫色到蓝色，还有花 色素苷也对颜色有一定影响 2 5 9 】。 f 3 h 酶是一个可溶性的依赖于2 酮戊二酸的双加氧酶，它需要氧分子、亚铁离子 和抗坏血酬1 2 1 。f 3 h 在一般条件下不稳定，具2 个亚基，最先在矮牵牛花中被纯化【1 3 】， 最新从牵牛花上分离到有活性的f 3 h ，是一个分子量为4 2 k d a 的单体蛋白【1 2 j 。f 3 h 最早是从金鱼草( a n t i r r h i n u m m a j u s ) q b 被克隆【1 4 1 ，现已从翠菊( c a l l i s t e p h u sc h i n e n s i s ) 等 多种植物中分离得到【1 5 1 。f 3 h 催化形成的二氢黄酮醇在细胞浆中产生后转移到液泡 中转化为花色苷【l6 1 。 f 3 t h 催化类黄酮b 环上的3 位的羟基化反应，生成花青苷类，f 3 t h 在矮牵牛不 同组织由h t l 和h t 2 控制，在金鱼草中由e o s m 。a 控制【l7 1 。f 3 h 已在香石竹( d i a n t h u s f r a g r a n s ) 等植物中克隆得到【l8 1 。f 3 h 突变使花中积累花葵素而非花青素，花更多地呈 现橙、红色【l 刿。 f 3 5 h 催化类黄酮b 环上的3 和5 位的羟基化反应生成花翠素类呈蓝紫色的花色 素苷，f 3 5 1 - 1 已在矮牵牛、马鞭草( v e r b e m a ) 等植物中得到纯化【2 0 】，其功能由h f l 和 h f 2 控制【2 l 】，矮牵牛h f l 和h f l 表达将趋向于合成翠雀素苷、使花偏耐勿，h f 2 负责 3 花瓣中f 3 5 t i 的活性 2 3 1 。f 3 5 h 也在茄子( s o l a n u m m e l o n g e n a ) 2 4 】、龙l j _ 0 _ ( g e n t i a n a ) 2 5 】 等植物中克隆得到。缺乏f 3 5 h 的植物种，如郁金香( t u l i p a g e s n e r i a n a ) 、玫瑰( r o s a r u g o s a ) 、香石竹等，不能形成蓝色花，但蓝色花不全是依赖f 3 5 th 1 1 9 。f 3 5h 的克隆 为创造蓝色提供了可斛2 6 】。 d f r 是类黄酮合成下游途径中的一个重要酶，可控制类黄酮合成途径中生成花色 素苷和原花色素支路的通量。几种植物中提取的d f r 可将三种二氢黄酮醇，如二氢槲 皮素( d h q ) 、二氢杨梅素( d h m ) 、二氢三羟黄酮醇( d h k ) 还原转变为相应的 无色花青素，而无色花青素又是花色素苷、儿茶素和原花色素合成的共同前体。在某 些植物的d f r 蛋白如矮牵牛、兰花等不接受三羟基的底物d h k ，因此不能生成相应的 三羟基天竺葵色素斜2 7 2 8 2 9 1 。植物中d f r 酶活性的诱导已经和原花色素的积累相联 系，而原花色素对于植物抵御食草动物至关重要【3 0 1 。失去d f r 活性的突变体产生象牙 色或白色。 a n s 可以进一步将无色花青素转变为花青素，因此是花色素苷生物合成途径中的 第一步【3 1 1 。 l a r 最初被认为是植物原花色素合成支路中的重要酶，转化无色花色素为2 ，3 反式黄烷三醇，例如儿茶素( b 环有两个羟基) 【7 3 2 1 。编码无色花青素还原酶的基因 最近被分离出来并在埃氏大肠杆菌中成功表达【3 3 】。 最近x i ed y 3 4 从拟南芥和蒺藜状苜蓿的花色素研究中报道了能编码a n r 的b a n 基因，a n r 利用n a d p h ，使原花色素，如花青素、飞燕草素转变成相应的黄烷3 a 醇，如儿茶素e c 。儿茶素c 和e c 等顺式、反式黄烷3 醇单体进一步缩合形成原花青素 聚合体的诱导机理仍然不清楚。该试验的意义在于表明了花色素原不仅是花色素苷的 合成前体，也是黄烷3 a 醇的合成前体，即花色素苷和黄烷3 a 醇合成时竞争共同的 底物。 p u n y a s i f i apa n 【1 1 j 通过体外酶学反应，研究了茶叶中c h s 、f 3 h 、d f r l a r 、 f n r l a r 、a n r 等酶的底物特异性，发现在n a d p h 的协助下，茶叶中的a n r 可 催化花青素和飞燕草色素转变成e c 和e g c 。这与以前认为e c 、e g c 是由c 、g c 异构化而来的推测不同，由此他推测出一条儿茶素生物合成的新途径，即经过c h s 、 c h i 、f 3 h 和d f r 作用形成3 ，4 一黄烷二醇，3 ，4 黄烷二醇若在a n s 、a n r 的作用 下可产生e c 、e g c ，若在l a r 催化下则产生c 和g c 。此研究结果为进一步阐明儿 茶素的生物合成途径提出了新的实验依据。 儿茶素合成途径中，虽然没食子酸与儿茶素的酯化作用的研究至今未取得突破性 进展，但已有没食子转移酶的报道【3 5 】。 在以往的儿茶素合成途径的研究中，大多数研究主要集中一些上游酶类，女h p a l 、 c 4 h 、4 c l 等。茶树细胞培养的一些结果表明 3 6 】，细胞生长分化及酚类物质的合成 4 与p a l 、c 4 h 和4 c l 活性变化有关，在黑暗条件下生长的茶树愈伤组织转移到连续白 光条件下，刺激了的p a l 活性的增加，促进酚类化合物的合成。但成浩从细胞系的生 长、色素和儿茶素等次生代谢产物组成与含量、p a j l 活性以及产物合成动态分析等方 面，研究比较了积累色素与不积累色素的两类茶树培养细胞系之间的差异，得出细胞 系的p a l 活性大小与其儿茶素等产物形成水平间没有明显的相关性的结果 4 5 - 4 6 ； s h i p i l o v a 等表明茶树中的p a l 与细胞壁中木质素的合成更相关，p a l 似乎并非是酚类 生物合成的限速酶m 。在茶树枝条上，z a p r o m e t o vm n 4 8 发现同位素标记的莽草酸 比苯丙氨酸更多地渗入儿茶素，因此推测除了苯丙氨酸途径之外，可能还存在其他途 径。 目前除了p a l 外，对涉及茶树中酚类物质合成途径的其它酶类的研究很少，这也 限制了对儿茶素等酚类物质合成的深入了解。 近年来，植物次生代谢物合成途径中有关酶的基因克隆及其分子生物学研究倍受 重视。目前，在基因水平上研究得最清楚的植物次生代谢途径是合成黄酮类及花青素 的代谢途径【4 9 1 ，许多研究者利用蛋白质纯化、转座子标签、p c r 及鉴别筛选等手段从 玉米、金鱼草、矮牵牛、拟南芥等植物中分离并克隆了部分与花青素生物合成相关的 结构基因与调节基因【5 们。已经克隆的相关基因有p a l 基因，c h s 基因，f 3 5 h 基因， f 3 h 基因，编码a n r 的b a n 基因等，调节基因主要有r 基因及其同族的c 、s n 和l c 基 因，另外还有b 、e l 、p l 、v p l 、d e l 、a n 2 、a n 4 基因，并发现这些调节基因具高度同源 性 5 1 】。 茶树儿茶素合成上游的一些关键酶已被克隆，截至2 0 0 7 年6 月，在g e n b a n k 上登 录的与茶几茶素合成有关的全长基因已有9 个t 5 2 】，有多篇文章对儿茶素合成中的 基因进行了鉴定，如m a t s u m o t os 和t a k e u c h ia 从茶树中分离出p a l 、3 个 c h s 、d f r 基因的c d n a 5 3 5 4 5 5 1 。有研究对有关这些酶与多酚合成之间的关系进行了初步研究， 如m a m a t ige 利用r t p c r 技术探讨了茶树生长发育期间儿茶素和多酚类的积累与多 酚类生物合成途径中p a l 、c h s 、d f r 基因表达的相关性，研究表明p a l 、c h s 基因 在茶芽和嫩叶中高度表达，但在老叶中几乎检测不到；在茶树芽叶发育期间，d f r 的 表达与儿茶素和多酚类的积累密切相关【4 1 1 。马春雷对不同茶树品种间与儿茶素合成相 关7 个酶的表达差异分析表明，l a r 和d f r 是主导儿茶素合成的两个重要酣钇j 。 但这些基因在植物体内并非单一的，其种类多样性有待深入研究。以d f r 基因为 例，拟南芥基因组中只含有单一的d f r 基因，而百脉根基因组中含有5 个d f r 基因【5 7 。 这可能与拟南芥体内类黄酮代谢途径简单，豆科植物体内代谢较复杂多样有关。有关 茶儿茶素合成途径中的调控机制的研究，如调控基因的克隆，未见报道。 5 表l 在g e n b a n k 登录的与茶儿茶素合成相关的全长基因f 5 2 1 t a b l e1f u l ll e n g t hg e n ec o r r e l a t e dc a t c c h i nm e t a b o l i s md e p o s i t e dt og e n b a n k 1 2d f r 酶类研究进展 d f r 是类黄酮途径中合成花青素和原花青素的关键酶，该酶可将二氢黄酮醇还原 为相应的黄烷三醇( 图1 3 ) ，而二氢黄酮醇也是由黄酮醇合成酶催化的黄酮醇合成途 径的中间产物【57 1 。很多d f r 的e d n a 已经从多种植物中分离出来，有文献报道一些植 物的d f r 是由单基因或多基因编码【5 蹦6 1 。一些观赏植物的花朵颜色可通过d f r 基因表 达水平的控制而被改变【6 1 7 1 ，也有研究表明将d f r 基因导入一种豆科牧草百脉根中可以 改变其中原花青素的含量水平嘲6 9 1 。许多植物中的d f r 蛋白可以与带有不同羟基形 式的二氢黄酮醇结合，比如二氢三羟黄酮醇( d h k ) 、二氢槲皮素( d h q ) 、二氢杨 梅素( d h m ) 等均可作为底物【6 3 7 们。另一方面，矮牵牛和兰花中的d f r 蛋白因不能 +n a d p h= 图l - 3d f r 催化的反应 f i g 1 3 r e a c t i o nc a t a l y z e db yd i h y d r o k q u e r c e t i n4 - r e d u c t a s e 6 + n a d p 产生天竺葵色素苷而被认为很难与d h k 反应生成无色天竺葵色素f 7 1 。7 2 1 。这些关于 d f r 的生化资料大多是通过植物蛋白提取液进行体外分析或突变体和转基因植物的 生化分析得到的。曾经有人用大肠杆菌对不同d f r 蛋白进行表达【7 3 j ，但是没有相关酶 活性的报道。最近d f r 活性在大肠杆菌和酵母表达系统和其他一些植物中被成功测定 7 4 - 7 8 1 。然而还没有足够的证据说明d f r 同工酶的生化性质，而且也没有在单一物种关 于d f r 同工酶定性的任何报道。n o r i m o t os 【5 7 】文献报道了日本百脉根中所有d f r 基 因，其中发现五个d f r 基因组成的一个3 8k b 的基因片段，并且检测到了所有的d f r 基因转录产物，包括两个剪切的变异体。这些同工酶的表达形式有异于所有生物体。 蛋白的差异表达表现了对三种二氢黄酮醇底物的不同特异性。就目前所知，这是第一 次关于d f r 基因的结构、表达和功能鉴定在单一物种中的综合报道。以前没有关于 d f r 同工酶在单一物种中的详细定性报道可能和大多数植物整体的基因序列缺乏有 关。有报道表明拟南芥基因组中只包含一个d f r 基因t 7 9 】，其原花青素和花青苷的组分 也比较简单。在豆科属的其他植物中，这些代谢产物表现出更复杂的形式和多变的生 理功能。因此应该在豆科的模式植物中进行有关d f r 同工酶的基因结构、表达和功能 鉴定的综合分析。结果发现：迄今为止发现的最多的同工酶，五个d f r 基因串联位于 百脉根基因组中同一个基因座上。在类黄酮生物合成中，这种同工酶基因结构的类型 会让人想起百脉根中的c h i 基因：豆科植物三种基因的特定类型- - c h i 在5 脱氧类黄 酮途径和类型一c h i 在普通的5 羟基类黄酮途径共同组成了一个串联组【删。另外编码 类黄酮合成途径中相关酶的基因，比如c h s 、c h r 和i f r ( 异黄酮合成酶) 在百脉根 基因组中组成了各自的基因群。 关于d f r 酶的遗传和代谢调节已经在几种植物，如大麦、西红柿、葡萄、金鱼草、 拟南芥和水稻中广泛展开研究，并且发现它是由单基因或小基因家族决定的。有报道 曾说明d f r 在大麦、西红柿、葡萄、金鱼草、拟南芥和水稻中是单基因决定的【5 姒7 9 8 1 】，在拟南芥中d f r 单基因在t t 3 基因座位置发生变异而导致花青素在种皮中积累较少 而呈现透明种皮【_ 7 9 1 。另外还发现几种载有修饰转录因子的拟南芥突变体致使d f r 表达 改变，包括t t 8 、t t g l 和t t 2 t 7 9 、8 2 8 3 洲。金鱼草d f r 酶是通过单一p a l l i d 瑾因座编码的， 而基因表达至少受到三种转录因子的调控，这三种因子分别为d e l i l a 、e l u t a 、r o s e a 孓 8 5 】。经证实含有多倍基因编码、有催化活性的d f r 蛋白很少在单一组织中表达，矮牵 牛含有三种d f r 基因，但是只有d f ra 基因在矮牵牛花朵中得到表达【5 8 6 】；日本紫牵 牛和普通紫牵牛均含有三个串联的d f r 基因，但只有d f r b 基因的突变才能阻碍花青 素在花朵中的形成【87 】；杂交大丁草中存在多倍d f r 基因，但只有d f r l 基因具有催化 活性并在花朵中表达，分析相应的启动区域表明这种复杂的表达模式和花青素的积累 关系密切【8 8 】。 d f r 酶生化方面的深入研究对于理解黄酮类生物合成方面的问题非常重要，尤其 7 是植物如何调节儿茶素、花青素和原花青素生物合成。早期使用银杏和花旗松的单细 胞体外酶学试验表明d f r 酶将d h q 、d h m 分别转化为无色花青素和无色飞燕草色素 8 9 9 0 。后期关于d f r 底物特异性的数据主要是由突变体或转基因植物的遗传分析和 生化分析相结合得来的【2 7 2 9 8 引。最近在酵母和大肠杆菌中d f r 酶的不同表达仅提供了 些有限的信息 7 3 】。其他关于d f r 同工酶的生化性质很少被报道，而这些同工酶在类黄 酮物质合成途径中特定支路中的调节作用则更不清晰。 l a r 酶是还原酶、异构酶和脱氢酶家族中的一员，它和异类黄酮途径中的异黄酮 还原酶最相关【3 3 1 。l 讯是由a n r 经过m y b 转录因子家族共同调控的，蒺藜苜蓿中用 来编码潜在的l 气r 酶的基因已经被前人鉴别【9 ”2 1 。重组l 心酶经体外纯化后的活性和 用金钱草的叶子【3 3 】纯化过的酶活相比非常低( 只有4 0 p m o l m i n m g 蛋白) 。然而近期 的一些报道也表明不能检测到莲属植物中重组l 讯酶的任何活性除非体系中只有单 一蛋白且用无色花青素做底物时；同时也有用t l c 方法检测到重组l a r 酶的微弱活 性，条件是在同一体系中用重组的d f r 酶催化生成无色花青烈9 3 】。 x i ed v 3 4 在2 0 0 3 年报道中曾提出一种b a n 基因，其氨基酸序列与d f r 的序列 相似，它可以编码l 咀酶，l 幔酶是催化黄烷3 ，4 二醇( 即无色花青素) 转化为2 ， 3 反式黄烷三醇( 如图1 4 ) ，比如儿茶素；而b a n 基因目前是类黄酮合成途径中 发现的唯一基因，它的具体功能还不太清楚。一些报道确定了a n r 酶的存在，它能 催化无手性的花青素转化为相应的2 ，3 顺式黄烷三醇，但同时还有一个潜在的由 l 讯酶催化生成儿茶素的反应【7 】，这两步反应同时存在，很多人把二者视作同一酶促 反应导致对l 气r 的研究很少。也有一些人在花旗松即】、银杏细胞【8 9 1 、百脉草的叶子 【，7 】和生长中的谷子 3 2 】中均检测到了l r 酶活。 +n a d p h = 图l - 4l a r 催化的反应 f i g l 一4 r e a c t i o nc a t a l y z e db yl e u e o a n t h o e y a n i d i nr e d u c t a s e + n a d p + h 2 0 植物次生代谢物合成途径中的关键酶的分离及其基因的克隆是植物次生代谢酶 促反应机制研究的基础。苯丙烷、类黄酮等特定植物次生代谢物合成与积累量取决于 其合成途径中的限速酶，它们在植物次生代谢物生物合成途径中往往位于代谢支路分 叉口或位于次生代谢物合成途径的下游，负责催化合成次生代谢物一般合成前体。但 8 是由于植物次生代谢往往涉及多个层次的酶促反应，给特定次生代谢物合成的关键酶 的确定带来了困难。 虽然现有资料表明( 如茶树细胞培养的一些结果【3 6 小】) ，茶树细胞生长分化及酚 类物质的合成与p a l 、c 4 h 和4 c l 活性变化有关，但这些酶在各种儿茶素合成网络 中的关键作用尚不能确定，除p a l 外，茶树中其他酶的作用很少报道，特别是对位 于儿茶素合成途径下游的一些酶，如c h s c h i 、d f r l a r ，a n r 等缺乏了解。而且， 即便是找到并克服了某个酶活性对次生代谢的限制，可能其它诸如底物供应、产物浓 度的反馈抑制、其它酶的活性制约等又可能上升为限制因子。目前发现次生代谢中许 多酶是协同作用的，受转录因子调控，如玉米花青素的合成至少有2 0 个基因参与控 制。因此在多数情况下单个关键酶基因的遗传操作往往难以大幅度改变特定次生代谢 物的产量。 9 2 引言 茶叶中含有大量的次生代谢产物，包括茶多酚、生物碱、茶氨酸、萜烯类芳香物 质等，它们既与茶树的生长发育、新陈代谢关系密切，又是决定茶叶品质和药理作用 的生物活性成分。 迄今为止，有关茶树类黄酮物质合成途径的大致步骤已基本探明，可能涉及到的 酶类有苯丙氨酸脱氨酶( p a l ) 、肉桂酸羧化酶( c 4 h ) 、4 香豆酰c o a 连接酶( 4 c l ) 、 苯基苯乙烯酮合成酶或查耳酮合成酶( c h s ) 、苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶或查耳酮 异构酶( c h i ) 、黄烷酮3 羟化酶( f 3 h ) 、二氢黄烷醇4 还原酶( d f r ) 、无色花色素 还原酶( l a r ) 、花青素合成酶( a n s ) 掣1 1 。但除了p a l 以外，对这些酶类的性质、 作用及其调控了解很少。研究茶叶中多酚类的生物合成途径及其关键酶的调节，弄清 茶树中多酚类物质相互转化，对提高茶叶产量和质量，改良茶树品种有重要的应用价 值，同时对于研究其它植物中类黄酮物质的生物合成途径与代谢调控也具有理论上的 参考价值。 有资料表明，儿茶素c 和g c 是二氢黄酮醇在d f r 和l a r 的共同作用下合成得 到【l 。d f r 和l a r 属于紧密相连的两步催化酶促反应，p u n y a s i r ip a n 的试验表明， 茶叶中d f r 酶产物原花青素( 无色花青素、无色飞燕草色素) 很难检测到，它们迅 速被l 氓还原成儿茶素c 和没食子儿茶素g c 。有关d f r 酶性质的研究较多，在不 同植物中都曾有过研究报道，如水稻、蒺藜苜蓿等，但茶叶中的相关研究却较少，多 数是从基因表达的角度研究的，如马春雷对不同茶树品种中的儿茶素含量与类黄酮合 成相关的c h s 、f 3 h 、f l s 、d f r 、l 幔、a n r 和a n s 等基因表达关系进行了研究， 结果表明d f r