（植物学专业论文）黄金菊组织培养及植株再生体系的建立.pdf

学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 签名日期： 锄f 。年5 具2 | b 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 本研究对黄金菊 p e r e n n i a lc h a m o m i l e 进行了组织培养及再生体系建立技术的探 索。分别以黄金菊的无芽茎段和带芽茎段为材料，系统地研究了基本培养基、生长调节 剂等因素对黄金菊组织培养器官发生各途径的影响，筛选出了适宜黄金菊各阶段培养的 理想培养基，成功地获得了黄金菊的无性系，系统的建立了黄金菊植株的再生体系，为 保护这种野生资源及工厂化育苗提供了理论与技术依据。 本研究主要研究结果如下： 1 愈伤组织的诱导：以黄金菊无菌苗的无芽茎段作为外植体，成功地诱导出了愈 伤组织。有利于诱导黄金菊无菌苗茎段形成愈伤组织的理想培养基是：m s + b a l 0 m g l 1 + n a a 0 1m g l - 1 ，出愈率为9 0 。 、 2 愈伤组织的增殖：适合黄金菊愈伤组织增殖培养的理想培养基是：m s + b a l 0 m g l 1 + n a a 0 1m g l 1 ，增殖率为9 3 3 3 。 3 愈伤组织的分化：适合黄金菊愈伤组织分化的理想培养基是：m s + b a l 0 m g l 1 + n a a 0 5m g l - 1 ，分化率是8 2 。 4 腋芽增殖：有利于黄金菊腋芽增殖的适宜培养基是：m s + b a 0 5m g l + n a a 0 。2 m g l ，增殖率为9 2 ，每个腋芽的平均增殖数为5 4 个。 5 生根培养：黄金菊试管苗生根培养的理想培养基为1 2 m s + i a a 0 2m g l - 1 ，生根 率为1 0 0 ，平均生根数为4 9 条。 6 生根继代培养及各种处理：适合黄金菊生根继代的培养基是：1 2 m s + i a a 0 2 m g l 1 ，生根率为1 0 0 ，平均生根数为4 9 3 条；在光照变温的条件下，培养基1 2 m s + i a a 0 2m g l 1 是黄金菊生根培养的理想培养基，生根率为1 0 0 , 在光照恒温的条件下， 1 2 m s + i a a 0 2m g l - 1 和1 3m s + i a a 0 2m g l 1 两种培养基是黄金菊生根培养较好的培 养基，试管苗生根率均为8 6 ；在无光照恒温和无光照变温的条件下培养基w h i t e + m a 0 2m g l _ 1 是黄金菊生根培养的较好培养基，生根率分别为7 3 和8 7 。 7 移栽与扦插：炉灰渣是黄金菊试管苗移栽和扦插的理想基质，不仅成活率高， 而且长势良好。 关键词：黄金菊；组织培养；快速繁殖；无性系；再生体系 黄金菊组织培养及植株再生体系的建立 s t u d i e so nt i s s u ec u l t u r ea n dp l a n tr e g e n e r a t i o no fp e r e n n i a l c h a m o m i l e a b s tr a c t 1 1 1 es t u d yw a sm a i n l yt op r o b ea l le f f i c i e n tw a yt h r o u g ht i s s u e sc u l t u r ea n dr a p i d p r o p a g a t i o no fp e r e n n i a lc h a m o m i l e t h es t e m sw i t ha x i u a r yb u d sa n dt h es t e m sw i t h o u t a x i l l a r yb u d sw e r eb o t ht a k e na se x p l a n t s ，刀彬f a c t o r st h a ta f f e c tt i s s u ec u l t u r ei n c l u d i n gb a s i c m e d i u ma n dh o r m o n e sw e r ed e t a i l e di n v e s t i g a t e d a sar e s u l t , t h eo p t i m u mm e d i u m so ft i s s u e c u l t u r ew e r es c r e e n e d ap l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mo f p e r e n n i a lc h a m o m i l ew a se s t a b i l i s h e d i nt h i sr e s e a r c h ，w h i c hp r o v i d et h et h e o r e t i c a lb a s ea n dt e c h n i c a lm e a s u r e sf o rp r o t e c t i o na n d i n d u s t r i a lp r o d u c i n go ft h i sw i l d l i f er e s o u r c e t h em a i nr e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 c a l l u si n d u c t i o no fa s e p t i cs t e m s ：t h e a s e p t i cs t e m sw i t h o o u ta x i l l a r yb u d si nv i t r o c a nb eu s e df o ri n d u c i n gc a l l u s a n dt h eo p t i m u mm e d i u mw a sm s + b a l o m g l + n a a o 1 m g l 一t h ei n i t i a lr a t ew a s9 0 2 p r o l i f e r a t i n gc u l t i v a t i o no fc a l l u s ：t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mf o rp r o l i f e r a t i n g c a l l u sw a sm s + b a l 0 m g l + n a a 0 1m g l 1 ，p r o l i f e r a t i n gr a t ew a s9 3 3 3 3 c a l l u sd i f f e r a t i a t i o n ：t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mf o rd i f f e r e n t i a t i n gc a l l u sw a s m s + b a l 0m g l 1 + n a a 0 5m g l d i f f e r e n t i a t i n gr a t ew a s8 2 4 i n d u c t i o no fa x i l l a r yb u d so fs t e m s ：t h es t e m sw i t ha x i l l a r yb u d so fy o u n gb r a n c h e s w e r et a k e na se x p l a n t s t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mf o ra x i l l a r yb u d si n d u c t i o nw a s m s + b a o 5m g l - 1 + n a a 0 2m g l 1 t h ei n d u c t i o nr a t ew a s9 2 ，b u dn u m b e rw a s5 4 5 r o o t i n gc u l t u r e ：t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mf o rr o o t i n gw a s1 2 m s + i a a 0 2 m g l - 1 t h er o o t i n gr a t ec o u l db eu pt o10 0 t h er o o tn u m b e rw a s4 9 6 p r o l i f e r a t i n g c u l t i v a t i o no fr o o t s ：t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mf o rp r o l i f e r a t i n g r o o t sw a s1 2 m s + 认a o 2m g l - 1 t h er o o tn u m b e rw a s4 9 3 u n d e rt h ec o n d i t i o n so f v a r i a b l e t e m p e r a t u r ea n di nt h el i g h t s ，t h eo p t i m u mm e d i u mf o rr o o t i n gw a s1 2 m s + i a a 0 2m g l 1 ， t h er o o t i n gr a t ew a s10 0 u n d e rt h ec o n d i t i o n so fc o n s t a n tt e m p e r a t u r ea n di nt h el i g h t s 1 2 m s + i a a 0 2m g 。l - 1 a n d1 3m s + i a a 0 2m g l w e r et h eo p t i m u mm e d i u m sf o rr o o t i n g ， t h er o o t i n gr a t ew e r eb o t h8 6 u n d e rt h ec o n d i t i o n so fc o n s t a n tt e m p e r a t u r ea n di nt h ed a r k t h eo p t i m u mm e d i u mf o rr o o t i n gw a sw 1 1 i t e + i a a 0 2m g l 1 ，t h er o o t i n gr a t ew a s7 3 u n d e rt h ec o n d i t i o n so fv a r i a b l et e m p e r a t u r ea n di nt h ed a r k , t h eo p t i m u mm e d i u mf o r r o o t i n gw a sw h i t e + i a a 0 2m g l 1 ，t h er o o t i n gr a t ew a s8 7 7 t r a n s p l a n t i n ga n dc u t t i n g ：t h eo p t i m u mt r a n s p l a n t i n ga n dc u t t i n gm e d i u m f o r p e r e n n i a lc h a m o m i l ei sc i n d e r , i nw h i c ht h es u r v i v a lr a t ew a sv e r yh i g ha n dg r o w i n gv e r y i i 辽宁师范大学硕士学位论文 w c l l k e yw o r d s ：p e r e n n i a lc h a m o m i l e ：t i s s u ec u l t u r e ：r a p i dp r o p a g a t i o md o n e ：r e g e n e r a t i o n i i i 黄金菊组织培养及植株再生体系的建立 目录 摘要k i a b s t r a c t i i 1 绪论1 1 1 黄金菊的概况1 1 1 1 黄金菊的生物学特性一1 1 1 2 黄金菊的利用价值。2 1 1 3 黄金菊的常规繁殖4 1 2 植物组织培养研究进展4 1 2 1 植物组织培养研究的历史发展5 1 2 2 植物组织培养的理论和实践意义7 1 3 菊科植物组织培养研究概况1 0 1 3 1 菊苣族植物组织培养研究概况11 1 3 2 菊科其它植物组织培养研究概况1 2 1 4 目的与意义13 2 试验材料与方法1 4 2 1 材料与仪器设备1 4 2 1 1 材料一：14 2 1 2 灭菌1 4 2 1 3 仪器设备1 4 2 2 技术路线与培养条件1 5 2 2 1 技术路线15 2 2 2 培养条件。1 6 2 2 3 基本培养基的配制1 6 2 3 试验方法18 2 3 ：1 愈伤组织的诱导：18 2 3 2 愈伤组织的增殖培养1 8 2 3 - 3 愈伤组织分化18 2 3 4 腋芽增殖18 2 3 5 生根1 8 2 3 6 生根继代培养及各种处理1 9 2 3 7 炼苗与移栽、扦插1 9 辽宁师范大学硕士学位论文 3 试验结果_ 2 0 3 1 愈伤组织的诱导2 0 3 2 愈伤组织的增殖培养2 1 3 3 黄金菊愈伤组织的分化2 2 3 4 腋芽增殖和继代培养2 4 3 5 黄金菊生根的培养2 6 3 6 生根继代培养及各种处理2 8 3 6 1 生根继代培养2 8 3 6 2 不同培养基在光照变温条件下对黄金菊生根的影响2 9 3 6 3 不同培养基在光照恒温条件下对黄金菊生根的影响2 9 3 6 4 不同培养基在无光恒温条件下对黄金菊生根的影响3 0 3 6 5 不同培养基在无光变温条件下对黄金菊生根的影响3 1 3 7 炼苗与移栽、扦插3 2 4 讨论3 4 4 1 外植体的选择对黄金菊组织培养的影响3 4 4 2 植物生长调节剂对黄金菊组织培养的影响3 4 4 3 生根培养3 5 4 4 移栽基质的差异3 6 4 5 褐变现象3 7 4 6 玻璃化现象一3 7 结论。3 9 参考文献4 0 附图。4 4 攻读硕士学位期间发表学术论文情况4 7 致谢。4 8 辽宁师范大学硕士学位论文 1 绪论 黄金菊 p e r e n n i a lc h a m o m i l e l 别名猫儿菊、罗马春黄菊【l 】，是菊科 c o m p o s i t a e ( a s t e r a c e a e ) 猫儿菊属 h y p o c h a e r i sl m 多年生草本花卉。每当金秋时节， 其橙黄色的头状花序，单生于茎顶，远远望去，一丛丛、一片片，十分醒目美丽，是重 要的观赏植物和闻名的宝贵花卉育种材料，可用作花卉及花坛布置。近年来包括辽宁大 连等地区已经开始陆续大规模栽培。除了观赏价值，黄金菊还具有重要的药用价值。菊 科植物中含有3 0 多种化学成分，其中菊花总黄酮具有抗炎杀菌、抗衰老、抗诱变、抑 制肿瘤生长和镇痛等作用【2 1 ；倍半萜酯具有抗肿瘤、止咳、防治心血管疾病、镇痛和抗 疟等方面的作用。黄金菊作为菊科的一个种，在夏季挖取其根，将根部泥土洗净之后晒 干就是一味重要的中草药，可以利水，治疗膨胀【3 】；黄金菊的花含黄酮类化合物【4 】，经 内蒙古中蒙医研究所药物实验室实验证明，可以治疗腹部胀满、肝郁肋痛，并具有和中 止痛、养血、柔肝等功效1 5 j 。 正是由于黄金菊既是重要的观赏野菊，又具有重要的药用价值，近年来人们逐渐关 注起黄金菊。由于黄金菊扦插繁殖速度慢，种子极易丧失活力，依靠传统的繁殖方法难 以满足生产上的需要，使黄金菊的应用受到了一定影响。因此，利用现代生物技术手段 植物组织培养技术，就可以实现自然或人工选择的遗传优良品种的快速繁殖，迅速 拓展野生资源，满足市场要求，还可以进行品种的脱毒、复壮、种质保存等一系列研究， 在推动菊科植物的栽培和育种工作中起到了举足轻重的作用，同时，也为体细胞克隆与 基因工程育种研究奠定了基础。 1 1 黄金菊的概况 1 1 1 黄金菊的生物学特性 菊科是被子植物中最大的一个科，约有1 0 0 0 属，3 0 0 0 0 多个种，广泛分布于世界各 地，但在热带分布较少【6 】，在我国约有2 3 0 属2 3 0 0 多种。 黄金菊是菊科菊苣族猫儿菊属的多年生草本花卉。在我国境内，猫儿菊属有猫儿菊 a c h y r o p h o r u sc i l i a t u s ( l ) s c h - - b i p 等2 种，大多分布于东北、华北和西北。在东北， 黄金菊主要分布在山坡和草原上，有时也见于田边、路旁的草地上，生于向阳处，大连 的庄河县花院公社、长海县大长山岛及新金县安波均有分布。除了我国，黄金菊在朝鲜 北部、日本、蒙古和苏联的西伯利亚也都有分布，是东亚特有的种类【7 j 。 中国高等植物图鉴中记载 8 】：“黄金菊株高3 0 6 0 e m ，茎直立，茎基部常被有 黑褐色的残鞘，全部被有较硬刺毛，稀无毛，不分枝。基部叶长椭圆形也有长匙形，先 端急尖或钝，基部渐狭呈具翅的柄，簇生；茎生叶长椭圆形，长7 2 0 c m ，宽1 5 - - 4 e r a ， 黄金菊组织培养及植株再生体系的建立 中上部叶无柄，基部呈耳状抱茎；上部叶渐小，卵形或长卵形；全部叶边缘被不规则的 尖齿及刚毛，两面被有硬毛，下面叶脉上毛较上面叶脉密。头状花序，单生于茎顶，花 大，呈金黄色；总苞半球形，总苞片呈长圆状披针形，径约3 c m ；总苞片3 4 层，广披 针形或披针形，外层边缘有睫毛；有膜质托片；全为舌状小花，舌片线形，舌片黄色或 金黄色，顶端5 齿裂；瘦果圆柱状，顶端具长喙；灰白色冠毛1 层，呈羽毛状。黄金菊 具有发达的直根系。花期7 - 9 月。 1 1 2 黄金菊的利用价值 ( 1 ) 观赏价值 菊被称为“四君子”之一，因其盛开于百花凋落的深秋，即使枯干残败犹有抱霜枝， 能够代表人们在困难来临时的勇敢精神及不从流俗、不媚世好、卓然独立的君子品格， 成为文人雅士争相吟咏、赞美的对象。历代许多著名诗人都留下不少妙不可言的咏菊诗 句，如白居易的咏菊、黄巢的咏菊、王安石的咏菊、苏轼的赵昌寒菊、 陆游的菊、李商隐的菊花等；东晋著名诗人陶渊明更是留下了“采菊东篱下， 悠然见南山”的著名诗句；唐代大诗人元稹在菊花中赞到“不是花中偏爱菊，此花 开尽更无花 ；还有近代董必武的菊花，陈毅的秋菊等等。 黄金菊是多年生草本花卉，具有一次播种，多年观花的优点，花序直径6 e m 左右， 花期长达2 0 d 左右。野生黄金菊在4 5 月份出苗【9 】，7 9 月份为花期。菊花品种繁多， 花色艳丽，花姿隽美多变，花香清新淡雅，其耐寒、耐旱、抗病虫害能力强，成为园林 中不可或缺的点缀，适宜栽种在花坛里，是花卉育种的宝贵材料，既可作花境材料也可 栽于盆栽观赏，目前在城市绿化中的应用越来越广泛，为人们创造了美好的生活环境， 是值得开发的园林绿化好材料。近年来随着我国经济的迅速增长，人民生活水平的不断 提高，鲜切花的消费量大幅增长，切花菊作为鲜切花的一员，其用途十分广泛，不仅可 以作为插花艺术、花篮、花束等礼仪用花，也可以用于室内瓶插、装饰布置等，以美化 家居环境。 ( 2 ) 药用价值 现代药理表明，菊科植物味甘性微寒，入肺、肝两经，主要功效为清热解毒、平肝 明目、疏风利湿，可辅助治疗头疼、头晕眼花、胸闷烦热、预防感冒。菊科植物的提取 物大多具有抗炎抗肿瘤【1 0 小】、抗血小板凝集、抑制n o 生成【1 2 - 1 3 1 、钙拮抗 1 4 。1 5 1 等的活性 作用。目前，从该科植物中已分离提取出了多种化学成分，并对其药理活性方面进行了 分析归纳。从菊科植物中分离得到的一大类化合物为萜类化合物，包括单萜【l 7 】、倍半 萜【1 8 - 1 9 、二萜【2 0 之1 1 、三萜【2 2 2 3 】等。萜类化合物种类繁多，结构复杂，性质也各不相同， 因而其生理活性也是多种多样的。在菊科植物中分离得到的另一大类化合物为黄酮类化 合物。自从19 9 7 年从菊科植物中首次分离得到黄酮类化合物 2 4 2 5 1 后，现在已陆续提取 辽宁师范大学硕士学位论文 出了多种黄酮类化合物，目前分离得到的黄酮类化合物多为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮等 苷元与糖组成的化合物 2 6 - 2 7 ，此外还有花青苷类化合物【2 8 】。菊花总黄酮具有抗炎、镇痛、 抗病毒、抗茵、抗衰老、抗肿瘤、抗诱变等作用【2 9 删】。 菊科植物除具有以上共同成分外，不同植物也因其具有特殊成分从而具有不同的作 用。现已证明菊科堆心菊属( h e l e n i u m ) 的堆心菊( h e l e n i u ma u t u m n a l el i n n ) 全株 均含堆心菊素，具有抗菌、消炎、抗肿瘤的作用；此外，所含的异堆心菊素能够抗白血 病。春黄菊属( a n t h e m i sh m ) 的香春黄菊( a n t h e m i sn o b i l i sl i n n ) ，花中所含的阿魏 酸，具有抑制血小板凝聚的功效；芹菜甙，具有解痉平滑肌，产生镇静的作用。下田菊 属( a d e n o s f e m m a ) 的下田菊 a d e n o s t e m m al a v e n i a 亿) k u n t z e 全草均可入药，煎服能 治支气管炎、感冒高烧、扁桃体炎等。艾属( a r f e m i s i a ) 是最富含多种生物活性物质的 多年生草本植物，其中青蒿( a r t e m i s i aa n n u a “n n ) 全草含挥发油，叶含青蒿素，具有 干扰疟原虫表膜线粒体的功效，对于治疗恶性疟、脑型疟特别有效；艾蒿( a r t e m i s i aa r g y i l e v i e tv a n t ) 其叶含蒿醇，具有平喘作用。紫苑属( 么s 纪r ) 的紫苑( a s t e r f a f a r i c u sl i l l i l ) 内含皂甙，其煎剂可治痰多咳喘，肺结核，慢性气管炎等。土三七属( g y n u r a ) 的菊 叶三七( g y n u r af a p o n i c a ) 肉质根含多种生物碱及有机酸等，具有止血、散本瘀、解毒 消肿的功效，将其研粉外敷，可治骨折、外伤出血等。 在日常生活中，菊花常与其他中草药配成中药煎剂以治疗各种疾病，如菊花与葛根、 桑叶、桔梗、薄荷用水煎服，可治疗感冒发烧、头痛鼻塞；与枸杞、桑叶、生石决明( 或 生牡蛎) 用水煎服可治疗高血压眩晕。除了中药，目前将菊花制成药剂的也不少，如“桑 菊感冒片”、“桑菊饮片 等【3 1 1 。此外，将干菊花作成枕头也能起到治疗病痛的作用。 黄金菊作为菊科的一员，是一味重要的中草药。经内蒙古中蒙医研究所药物实验室 实验证明，其花含黄酮类化合物【3 2 1 ，有养血柔肝，缓中止痛，肝郁肋痛等功效，有利于 消化，可以舒缓胃部不适，治疗腹部胀满，帮助改善溃疡的情况。此外还有松弛神经， 舒减压力的功效。 ( 3 ) 食用价值 菊花不仅能让人赏心悦目，还有多种食用价值。有关于菊花食用的最早记载是在屈 原的离骚中，“朝饮木兰之坠露兮，夕餐秋菊之落英，诗中的“菊之落英 指 的就是菊花的嫩芽，诗人常于傍晚咀嚼菊花的嫩芽以达到强身健体的目的。自汉代起重 阳节己成为正式节日，在这一天要举行一定的仪式，常要赏菊并饮菊花酒吃菊糕，以驱 邪避害【3 3 】。将菊花花瓣捣碎成泥后与面粉和在一起，即可制成糕点等面食供人食用；菊 花加糯米、酒曲即可酿成味酐甜美的菊花酒【3 4 1 ，也称“长寿酒 ，菊花酒具有养肝明目、 健脑、抗衰老等功效；将菊花泡成花茶，除了给人带来清新淡雅的花香外，还具有保健 治疗的作用【3 5 1 ，黄色的菊花虽然味道稍苦，但清热祛火能力强，常用于散风祛热，如果 黄金菊组织培养及植株再生体系的建立 上火或者口腔溃疡，用它泡水可祛火，经常饮用还可消脂降压、轻身减肥，并可预防肥 胖、高血脂及高血压等疾病的发生。现在，许多地方已经将黄金菊花朵和花瓣作为花茶 饮用【3 6 】。菊花不仅可以做菊花糕、酿酒、泡茶，还可以做成菊花粥。早在明代就有关于 菊花粥做法的记载，文学家高濂在遵生八笺中就记载，“菊花粥，用菊新长嫩头， 丛生叶摘来洗净，细切，入盐同米煮粥，食之，清目宁心。 现代人更是用自己的聪明 才智，将菊花入馔，烹制出各色的佳肴，比较著名的有北京的菊花鱼球，广州的腊肉菊 花饼、菊花蛇羹，杭州的菊花咕噜肉、菊花肉丝，安徽的菊花鸡丝，湖南的菊花竹荪汤 等。菊花菜肴富含蛋白质、脂肪、维生素、黄酮类和挥发油等营养成分，人们在品尝美 味一饱口福的同时又起到健体延年的保健功效。 综上所述，黄金菊在园林观赏、药用、食用等方面都有广泛的应用，极具开发价值。 随着现代社会的发展，人们越来越关注自身的健康和生存环境，极具观赏价值的花装点 了人们的生活环境，给人们带来了感官上的享受，而其食用、药用价值也越来越受到人 们的青睐，成为强身健体的佳品。 1 1 3 黄金菊的常规繁殖 黄金菊喜阳光，适宜栽种在土壤呈中性或略碱性排水良好的沙质土壤或深厚土质 中。在春季或秋季播种均可，因其种子很小，可与细砂混合进行播种，每穴播种2 3 粒， 定植时株距在3 0 , - - 4 0 c m 。要充分浇水，半月左右施一次肥，这样有利于植株生长。 1 2 植物组织培养研究进展 植物组织培养通常具有狭义和广义两个方面的含义。狭义的植物组织培养主要是指 植物愈伤组织的无菌培养技术；广义上的植物组织培养又叫离体培养，是指在人为控制 的条件下，把植物体的器官、组织、细胞或原生质体，通过无菌操作，放在无菌的容器 中，供给它们充足的营养物质，置于适宜的环境中，使它们得以生长和发育的一种培养 方法。 植物组织培养是以细胞生物学、遗传学、植物生理学等学科为基础，并与植物基因 工程等应用学科交叉，主要研究离体培养条件下的植物组织、细胞和原生质体的生长、 分化、遗传转化、基因表达以及遗传变异等规律的边缘学科。植物组织培养的研究已有 近百年的历史，并在近二、三十年里得到了迅速的发展和广泛的应用。植物组织培养以 其独有的离体手段不断揭示出植物生理生化、生长发育、遗传变异的规律，弥补了其他 基础学科研究手段上的不足，而且在作物改良和遗传育种中显示出巨大的应用前景，因 而越来越受到遗传学家和育种学家的广泛重视，并逐渐成为农业生产实践中的一项重要 的实用技术【7 1 。 辽宁师范大学硕士学位论文 1 2 1 植物组织培养研究的历史发展 ( 1 ) 植物组织培养的早期探索 1 9 世纪初，德国植物学家s c h l e i d e n 和动物学家s c h w a n n 创立了被称为十九世纪中 叶自然科学“三大发现 之一的“细胞学说，为植物组织培养奠定了基础。在这个基 础上，德国植物学家h a b c r e l a n d t 于1 9 0 2 年【3 8 】提出“植物细胞全能性学说，即高等植 物的组织和器官可以不断地进行分割，直到分割成单个细胞还能形成一个完整新个体。 h a b e r e l a n d t 为了验证自己的观点，他曾以高等植物的保卫细胞、叶肉细胞、髓细胞、雄 蕊毛等为材料进行了植物组织培养，但是由于他所选的材料是已经高度分化了的细胞， 而且对这些材料的性质也没有进行深入地研究，对离体培养所需的条件也一无所知，所 以他的离体细胞培养并未成功。1 9 0 4 年，h a r m i n g 利用萝卜和辣根胚成功培育出小苗。 据此，b r o w 于1 9 0 6 年提出在人工合成培养基上进行无菌外植体的培养，能使各种胚在 培养基上有增殖生长的反应。1 9 2 2 年，k o r e 和r o b b i n s 分别成功进行了根尖的离体培 养。1 9 2 6 年，h a r l a n 报导了有关大麦幼胚的培养。 这一时期，一些植物的幼胚培养获得了成功，离体培养也有了一定的进展，属于植 物组织培养的探索时期。 ( 2 ) 植物组织培养技术的建立时期 2 0 世纪3 0 年代开始，植物组织培养技术取得了长足的进展。1 9 3 3 年，我国植物生 理学的开拓者李继侗在进行银杏的离体培养时，发现利用银杏胚乳提取液能促进离体银 杏胚根的生长，这一发现对后来的植物组织培养，用植物自身的提取物促进培养物的生 长具有重要意义。1 9 3 4 年，w h i t e 以番茄离体根为材料，形成了第一个可以正常生长的 无性系，使非胚器官的培养首先获得了成功，至此有关离体根的培养试验才真正的获得 成功。不久之后，w h i t e 发现b 族维生素对培养离体根的生长具有重要意义，并逐渐认 识到i a a 在控制植物生长中的作用。在这个基础上，1 9 3 9 年，w h i t e 以种间杂种烟 草茎段的形成层为外植体，成功地对其进行了组织培养和继代培养，并首先建立 了人工综合培养基【”】。 上述工作结果使植物组织培养技术得到建立和发展，植物组织培养的基本营养成分 体系基本建立，为以后的深入研究奠定了基础，这一时期是植物组织培养技术的建立时 期。 ( 3 ) 器官形成和个体发生的研究时期 从2 0 世纪4 0 年代至5 0 年代，植物组织培养技术进入了器官形成和个体发生的研 究时期。 1 9 4 1 年，o v e r b e e k 、c o n k l i n 和b l a k e s l e e 等将含有多种不同有机物的天然产 物椰乳( c m ) 附加到培养基中，进行了曼陀罗( d a t u r es t r a m o n i u ml i n n ) 的幼 黄金菊组织培养及植株再生体系的建立 胚培养，使幼胚在离体培养条件下达到了成熟。在此阶段，人们只知道c m 成分 复杂，并不清楚是什么物质在组织培养中起作用，后来的研究表明，其中在组织 培养中起主要作用的是腺嘌呤类激素或类似物。1 9 4 8 年，s k o o g 和崔徽在用烟草 的髓部和茎段进行培养时，观察到腺苷或腺嘌呤可以解除i a a 对芽形成的抑制作 用，使烟草的茎段形成丛生芽。他们的研究表明，当腺嘌呤与生长素的比例较低 时有利于根的形成，当这一比例高时则有利于芽的形成。由此发现了腺嘌呤与生 长素的比例是控制芽或根分化的重要因素之一，这一发现为植物组织培养中形态 的发生和人为控制提供了激素模式。1 9 5 6 年，m i l l o r 等发现了一种促进芽形成的 效果比腺嘌呤高几万倍的细胞分裂素一一激动素( k t ) ，这一发现使在以后的植 物组织培养研究中用k t 代替了腺嘌呤，极大的提高了植物组织离体培养芽的分化 率，建立了用激动素与生长素的比例控制芽分化的模式。1 9 5 6 年，s t e w a r d 和s h a n t z 对胡萝b 根的愈伤组织进行液体培养，成功将含有游离细胞的悬浮液进行继代培 养。1 9 5 8 年，s t e w a r d 等人通过对胡萝卜愈伤组织进行悬浮培养获得了完整小植株。 后来，许多研究者重复s t e w a r d 的上述实验，相继发现胡萝卜悬浮细胞可以形成类 似正常胚胎那样的胚状体。 在这二十年时间里，人工合成的激素种类逐渐增多，使得植物组织和悬浮细胞都 能在人为控制的条件下进行培养和分化，植物组织培养中有关器官形成和个体发生的 研究发展很快。 ( 4 ) 植物组织培养快速发展时期 6 0 年代到8 0 年代，植物组织培养技术得到不断完善，以及对离体培养中细胞的生 长、分化规律的逐步认识，植物组织培养进入快速发展时期。在这一时期研究者在植物 组织培养的研究中都具有较明确的目标，并开始把植物组织培养技术应用于生产实践。 1 9 6 2 年，m u r a s h i n g e 和s k o o g 在烟草的培养中筛选出至今仍被广泛使用的m s 培养 基。1 9 6 7 年，b o u r g i n 等人又从烟草花药培养中获得单倍体植株。1 9 7 1 年，t a k e b e 等人在烟草叶肉原生质体培养中获得了再生植株，并建立了适于烟草原生质体培 养的n t 培养基。从此之后，一批又一批植物的组织或器官通过组织培养的方法获 得了再生植株。 在这一时期，人们以烟草为主要材料获得了许多突破性进展，研究范围也扩展到 花药、花粉、原生质体培养和细胞融合等方面，植物组织与细胞培养逐渐走向了工厂 化和商品化阶段。 辽宁师范大学硕士学位论文 ( 5 ) 植物生物工程的发展时期 在近十多年来，植物生物工程在植物组织培养研究的基础上得到迅速的发展，包括 组织培养、细胞培养和基因转化三个层次的工作都得到了极大的发展，为作物的遗传育 种与改良开辟了一条崭新的途径和广阔的前景。 植物组织培养技术是目前在植物生物工程中研究得最为完善、应用最为广泛的领 域，这一技术在果树、花卉、蔬菜等经济作物的快速繁殖和脱病毒等方面得到了普遍的 使用并进入到产业化生产。在植物组织培养研究不断发展和完善的基础之上，细胞培养 技术由于具有广泛的应用范围而得到了迅速的发展。利用体细胞无性系产生的大量变 异，再结合人工诱变方法对培养的植物组织或细胞进行突变体筛选，已在多种作物中选 育出抗病、抗虫、抗除草剂、矮杆、高蛋白等新品种。 此外，利用大规模的细胞培养技术进行植物次生代谢产物的生产及目前已经获得的 成功经验，进一步拓宽细胞培养的研究领域，并使得工厂化生产植物天然产物这一设想 变成了现实。在植物组织和细胞培养技术不断完善的基础上，与重组d n a 技术相结合 而产生的植物遗传转化的研究是植物生物工程的另一个重要内容。利用植物的组织、细 胞和原生质体为培养材料，进行植物的遗传转化，已经在众多植物中获得成功，为农作 物的遗传育种开辟了一条崭新的途径和广阔的前景。 1 2 2 植物组织培养的理论和实践意义 近几十年来，在进行植物的个体发育、器官发生、生理代谢等理论的研究中，植物 组织培养方法已经成为一种重要的实验手段。同时，根据研究的目的不同，所采用的方 法也各有所异，并得到了发展。由于理论研究的不断深入，这项技术在生产实践中的应 用取得了令人瞩目的发展，并为人们展示了无限广阔的前景。目前，利用组织培养方式 离体再生的植物种类已有1 3 0 个科、1 5 0 0 种以上m 】。据不完全统计，其中得到完整植 株的木本植物( 包括果树在内) 已有4 0 0 余种【4 。现在，植物组织培养技术已在生产上 得到了多方面的应用，并引起广泛重视。植物组织培养技术的应用，现主要有以下几个 方面。 ( 1 ) 苗木的快速繁殖 采用组织培养方法可以使试管苗具有很高的繁殖速度，因此人们又将这一繁 殖方式称作快速繁殖。用组织培养法进行植物的快速繁殖是组织培养应用于生产 的最主要的和最有成效的实例。由于快速繁殖产生的幼苗与其它用无性繁殖所产生的 幼苗相比，生产性能及主要经济指标差异不大，并且具有增殖速度快、成本低、易于批 量生产和管理等特点，因而被广泛用于树木、蔬菜、花卉等经济植物苗木的工厂化生产。 特别对于在短时期内需要达到一定数量，才能创造应有价值的植物，只有通过组 织培养的方法才能满足这一要求。快繁技术首先获得成功的是在兰花上，1 9 6 0 年， 黄金菊组织培养及植株再生体系的建立 m o r e l 首次成功培养出兰花的试管苗【4 2 1 ，很快这一技术就应用于实际生产中，形成 了兰花的快速繁殖工业。而后，快繁技术被人们广泛用于树木、蔬菜、花卉等经 济植物苗木的工厂化生产。据不完全统计，就观赏花卉而言，目前建立起快繁技术的 就包括6 0 余科，近1 0 0 0 种，包括各类兰花【4 3 删、月季【4 5 删、菊花【4 7 。4 8 1 、牡丹【4 9 1 、龟背 竹【5 0 】等。其它植物如柑橘属，桉树和珍贵的针叶树f 5 l 】等也都应用组织培养法来进行快速 繁殖。由于组织培养法繁殖植物速度快，每年都可以数以百万倍的速度繁殖，因此 对一些繁殖系数低，不能用种子繁殖的名特优植物品种的繁殖意义尤为重大。 ( 2 ) 植物脱毒 长期以来，人们已经意识到病毒对农作物造成的危害，并探讨了各种解决的方法， 但收效却甚微。由于病毒是通过维管束传导的，可通过营养体进行传递，逐代积累， 使病毒的危害更为严重。特别是无性繁殖的植物，如草莓、马铃薯、大蒜、康乃馨 等，利用这些植物的营养器官进行繁殖，可以把病毒带到新的植物个体上而发生 病害。随着植物组织培养的不断发展和完善，人们已将这一技术应用到植物脱毒的生产 实践中，并取得了十分理想的效果。2 0 世纪8 0 年代人们就广泛采用了茎尖组培脱毒的 方法，茎尖生长点通常没有或只有很少的病毒，以茎尖为材料或加以适当的热处理，在 无菌条件下培养即可获得脱毒植株。脱毒后的植株长势强，品质得到很大提高，产量也 大大的增加，并保持了品种原有的优良特性。目前，通过植物组织培养过程生产的果树、 蔬菜、花卉等脱毒苗，已在国内外的农业生产上得到普遍使用，产生了明显的经济效 应。 ( 3 ) 新品种培育 在常规的遗传育种中常用的方法是从自然突变和人工诱变中筛选突变体来进行作 物的新品种选育。传统的筛选突变体及选育新品种的过程需要经过许多年的艰苦工作， 而利用植物组织培养技术通过离体胚培养与体外受精、花药和花粉培养、体细胞杂交和 细胞无性系变异及突变体筛选等手段，可以在实验室内就完成筛选过程培育出优良品 种，极大地缩短选育时间。从8 0 年代至今，科学家已培育出了一大批优良新品种，在 作物无性系变异育种方面取得了令人鼓舞的成绩。例如，可以把试管苗置于低温的条件 下筛选抗寒植株，把试管苗置于高盐浓度的培养基上筛选耐盐品种。1 9 9 0 年，r a n u n i n g 等人垆2 】提出把葡萄种子种在培养基上，置于1 下冷藏4 5 d ，比切割胚更能促进发芽； 在多倍体育种方面，1 9 9 3 年，曹孜义等人【5 3 】将葡萄二倍体欧亚种c r e n a c h 的花药接种在 高糖浓度和高盐浓度的b