（微生物学专业论文）绿色巴夫藻的纯化培养及cdna文库的构建.pdf

山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及e d n a 文库的构建 绿色巴夫藻的纯化培养及e d n a 文库的构建 摘要 绿色巴夫藻( p a v l o v av i r i d i s ) 属于真核微藻，多不饱和脂肪酸如d h a 和e p a 含量较高，是克隆脂肪酸去饱和酶的很好实验材料。本论文通过对绿色巴夫藻的 藻种纯化，得到微藻的纯培养，进行培养条件的优化，获得大量藻体。提取绿色 巴夫藻总r n a ，建立其e d n a 文库，为筛选脂肪酸去饱和酶基因打下基础。 微藻的保存方式多以传代接种，在操作过程中极易被杂菌污染，由此为微藻 的生理生化和遗传学研究带来困难。为了获得纯藻种，分别使用不同抗生素的混 合加入法、逐步加入法及过滤除菌等技术对绿色巴夫藻进行了纯化研究。实验结 果表明，以逐步加入氨苄青霉素钠，硫酸庆大霉索，硫酸阿米卡星以抑制细菌生 长为最佳，并通过此方法得到了绿色巴夫藻的纯培养。 微藻为自养生活，生长缓慢，细胞得率低，为提高其生物量，得到大量藻体， 对影响绿色巴夫藻生长的主要培养条件如微量盐离子( s t o c ks o l u t i o n1 i ) 、微量营 养元素( s t o c ks o l u t i o n1 1 1 ) 及光照时间等因素进行了优化。实验结果表明，以海水 f 2 培养基为基础，加入5 0 溶液l i i ，全天光照条件下培养，该藻的生长状况最 好。 在全天光照条件下，1 6 。c 培养微藻4 5 天，收集指数生长期的藻体。用改进 后的异硫氢酸胍法提取绿色巴夫藻的总r n a ，经过电泳检测，可看到清晰的2 8 s r r n a ，1 8 s r r n a 两条带；利用o l i g o ( d t ) 从总r n a 中分离m r n a 以m r n a 为 模板，o l i g o ( d t ) 为引物，在逆转录酶作用下合成单链e d n a ，然后进一步合成双 链e d n a 。利用s m a r t 技术构建了绿色巴夫藻的e d n a 文库，经测定，所构建 的e d n a 文库的滴度为7 5 x 1 0 5 p f u m l ，重组率为9 2 。利用p c r 方法对文库进 1 1 i 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及e d n a 文库的构建 行了扩增实验，检测到文库中的插入片段长度在5 0 0 b p - i 2 k b 之间，符合构建 c d n a 文库的要求。 对已报道的a 9 脂肪酸去饱和酶基因序列进行同源性分析，发现不同来源的 脂肪酸去饱和酶具有高度保守性，即含有三个富含组氨酸的保守区。根据第一个 保守序列h x x x x h 和第三个保守序列h x x h h ，设计简并引物，以绿色巴夫藻 染色体d n a 为模板，进行p c r 扩增，得到一段长约6 0 0 b p 的片段( h i s b o x ) 。 将扩增产物与p g e m t e a s y 载体连接，成功构建了重组质粒p g e m - te a s y - h i s b o x ，经过双酶切及p c r 分析，证明克隆到p g e m - te a s y 载体上的片段为扩 增后产物。进行核苷酸序列测定表明，该h i sb o x 片段由5 8 9 个碱基组成：经 d n a t o o l s 分析，该序列不含内含子，编码由1 9 6 个氨基酸残基组成的多肽； 通过b l a s tx 在g e n b a n k 中进行同源性比较，该多肽与p i r e l l u l a s p 的9 脂肪 酸去饱和酶同源性达到6 9 。该多肽含有三个组氨酸保守序列，第一个与第二 个之间的距离为3 1 个氨基酸残基，第二个与第三个之间的距离1 4 9 个氨基酸残 基：利用t m h m m2 0 对该多肽进行分析，发现该片段有两个跨膜区域，均与已 报道的a 9 脂肪酸去饱和酶保守区相同。 关键词：绿色巴夫藻，a 9 脂肪酸去饱和酶，纯化，c d n a 文库，s m a r t 技术， 基因克隆，序列分析 i v 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及c d n a 文库的构建 p a v l o v av i r i d i s ，am a r i n em i c r o a l g a , i sr i c hi nt h ev e r y l o n g c h a i n p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( v l c p u f a s ) s u c h 豁e i c o s a p e n t a e n o i c ( 2 0 ：5 n - 3 ) a n d d o c o s a h e x a e n o i c ( 2 2 ：6 n - 3 ) a c i d s i t h a sb e e nc o n s i d e r e dt ob ean e w p o w e r f u l s o u r c e f o r 一3f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e s s e l e c t i o no f p a v l o v av i r i d i sf r o mt h em i x e d c u l t u r ew a sm a d e b y a n t i b i o t i cf o rp u r i f y i n gs t r a i n t h eg r o w t hc o n d i t i o nw a s o p t i m i z e d t o t a lr n a f r o mp a v l o v av i r i d i sw a se x t r a c t e da n de d n a l i b r a r yo f p a v l o v av w i d i sw a sc o n s t r u e t e d b e c a u s eo fn os u i t a b l em e t h o df o rp a v l o v av i r i d i ss t o r a g e ，t h em e t h o do f i n o c u l a t i n gf r e q u e n t l yw a s c a r r i e do u t ，w h i c hr e s u l t e di nt h ec o n t a m i n a t i o nw i t h b a c t e r i aa n df u n g io c c a s i o n a l l y b a s e do nt h ed i f f e r e n ts e n s i t i v i t yt oa n t i b i o t i cf o rc e l l w a l ls y n t h e s i sb e t w e e nb a c t e r i aa n d m i c r o a l g a e ，i t sp o s s i b l e t oa d da n t i b i o t i ct ot h e m i x e d m i c r o a l g a ec u l t u r ef o re l i m i n a t i n g b a c t e r i ac o n t a m i n a t i o n t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tp u r i f i e dp a v l o v av i r i d i ss t a i nw a so b t a i n e db y a d d i n gp e n i c i l l i n 、 g e n t a m y c i na n d a m i k a c i nt ot h ec u l t u r eo n eb yo n e p a v l o v av i r i d i si sa u t o t r o p h i co r g a n i s m 谢ml o wc e l ld e n s i t y t oh a r v e s tal a r g e q u a n t i t yo fm i c r o a l g a ec e l l s ，c u l t u r a lc o n d i t i o n w a s o p t i m i z e d t h e r e s u l t ss h o w e d t h a tp a v l o v av i r i d i sg r e wb e s ti ns e a w a t e rf 2m e d i u mb ya d d i n g5 9 6 0s t o c ks o l u t i o n i i ia n di l l u m i n a t e da l ld a y p a v l o v av f ，i d i sw a sc u l t i v a t e di n5 0 0 m lf l a c k sw i t hf 佗m e d i u m t h ec u l t u r e s w e r ei n c u b a t e da t1 6 0 cf o r5d a y sw i t hs h a k i n ga t1 0 0r p m n l ec e l l si nt h em i d d l e o f t h ee x p o n e n t i a lp h a s ew e r eh a r v e s t e db yc e n t r i f o g a t i o n t o t a lr n aw a se x t r a c t e d f r o mp a v l o v av i r i d i su s i n ga c i dg u a n i d i n i a mt h i o c y a n a t e m r n aw a si s o l a t e da n d p u r i f i e dt h r o u g ho l i g o 一( d t ) c e l l u l o s ec o l u m n ，a n d e d n aw a s s y n t h e s i z e db y v 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及e d n a 文库的构建 r t - p c r t e c h n i q u eu s i n g r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e t h eb l u n te n d o f d se d n a w a s l i g a t e d w i t h v e c t o r 九t r i p l e x 2 t h e r e c o m b i n a n tv e c t o r sw c l _ ep a c k a g e di nv i t r oa n d t r a n s f o r me c o l ix l l - b l u e c o m p e t e n c ec e l l s t h et i t e ro f t h e c o n s t r u c t e de d n a l i b r a r yw a s 7 5 x1 0 5 p f u m l a n dr e c o m b i n a t i o nr a t ew a s9 2 ，s u g g e s t i n gt h a tt h e l i b r a r yb e s u i t a b l ef o rs c r e e n i n gl o wa b u n d a n tm r n a g e n e s i nc o n t r a s t a l l 9 一f a t t ya c i dd c s a t u r a s e sh a v et h r e ec o n s e r v e dd o m a i n sw i t hr i c h h i s t i d i n ec o n t e n t ( s u c ha sh x x x x h ，h x x h ha n dh x x h h ) t h ep r i m e r sw e r e d e s i g n e do n b a s i so f t h ef i r s ta n dt h et h i r dc o n s e r v e dh i s t i d i n es e q u e n c e s a n a p p r o x i m a t e6 0 0 b p d n a f r a g m e n t w a so b t a i n e db yp c r t h e a m p l i f i e dp r o d u c t w a s s u b c l o n e di n t op g e m - t e a s ya n ds e q u e n c e d a n a l y s i s o f t h en u c l e o f i d es e q u e n c e s h o w e da 5 8 9 b p d n a f r a g m e n tc o d i n g f o r1 9 6a m i n oa c i d sw i t hn oi n t r o n t h e d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c er e v e a l e dh i 曲h o m o l o g yw i t ha 9 一f a t t ya c i dd e s a t u z a s e o f p i r e l l u l as p ( 6 9 ) nh a st h et h i n ec o n s e r v e dh i s t i d i n er e g i o n sa n do n el o n g h y d r o p h o b i cd o m a i ns p a n n i n g t h em e m b r a n eo n c e k e y w o r d s ：p a v l o v av i r i d i s ，e d n a l i b r a r y , s m a r tt e c h n i q u e s ，a 9 一f a t t ya c i d d e s a t u r a s e ，v e r yl o n gc h a i np o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：缝丝篷。日期：鲤空：支：圣7 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：罐些龟导师签名：纽锺日期：堡垒：力 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及e d n a 文库的构建 第一章前言 多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，p u f a ) 例如二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) ，在营养强化、防治动脉粥样硬化、防癌抗癌、促进 大脑发育、预防老年痴呆、保护视力等方面具有重要作用。但在哺乳动物内质网 上缺乏9 以上的去饱和酶，以致缺乏e p a 和d h a 的前体物亚麻酸，需由外 源途径供给；e p a 和d 姒仅存在于深海鱼油和微藻中。目前鱼油是e p a 和d h a 的主要商业来源，由于提取工艺复杂，导致成本较高，并多具鱼腥味，作为e p a 和d h a 初级生产者的微藻，代替鱼油生产p u f a 得到国际认可。 自9 0 年代初，国外许多学者对e p a d h a 生物合成及酶工程进行了大量工 作，发现脂肪酸去饱和酶( f a t t ya c i dd c s a t u r a s e ) 是不饱和脂肪酸合成途径的关 键酶，它决定着机体内脂肪酸的不饱和程度。2 0 0 1 年j a m e sg 等人对原核生物 海洋细菌s h e w a n e l l as p 和真核生物真菌s c h i z o c h y t i r u ms p 控制多聚不饱和脂肪 酸( e p a d h a ) 生物合成途径的关键酶及其合成关键酶的基因进行了分析，指出 了两条合成途径的差异和去饱和酶基因的同源性。微藻中e p a d h a 的合成途径 主要有两条，即以1 8 ：2 n - 6 开始的n - 3 途径和n _ 6 途径。其中n - 6 途径是3 p u f a 合成的主要途径，它涉及三个位点a 9 、a 1 2 和a 6 的去饱和反应，a 6 去饱和酶 ( l i n d e o y l c o a d e s a t u r a s e ，简写为a 6 d e s ) 催化亚油酸l i n d e o y l - c o a ( 1 8 ：2a 9 ，a 1 2 ) 转化为y 亚麻酸7 - 1 i n d e o y l c o a ( 1 8 ：3a 6 ，a 9 ，a 1 2 ) ，它催化的反应是整个p u f a 生 物合成途径中的限速步骤。 由于微藻生长缓慢，细胞得率低，并且产生的不饱和脂肪酸提取工艺复杂， 以微藻为材料大规模生产e 附d h a ，尚存在一定困难。随着对多不饱和脂肪酸 生物合成调控机制的认识，从分子水平上研究微藻不饱和脂肪酸合成的影响因 素，通过对脂肪酸去饱和酶基因的克隆，实现基因的异体高效表达，以得到大量 的不饱和脂肪酸，对解决! a ，d h a 资源、降低生产成本，将提供一条新途径。 本章从以下几方面介绍工作研究背景。 山东大学硕士学位论文绿色巴夫蕞的纯化培养及e d n a 文库的构建 1p u f a 的分类与结构 多不饱和脂肪酸口u f a ) 是指含有两个以上双键且碳原予数为1 6 至2 2 的直链 脂肪酸。根据第一个双键在分子中所处的位置分为3 类，即m - 9 、6 、3 。其 中二十碳四烯酸( a a ，又名花生四烯酸) 、二十碳五烯酸( e p a ) 、二十二碳六 烯酸( d h a ) 被认为是比较重要的多不饱和脂肪酸。 oo c = 3 按c 乏套、= 、 _ “o 1 7 、4 1 8 ：2 a m ”犯对 1 8 ：3 ”4 唧” oo r v 飞r ，、m 、u 一一= 、一一冒、一一、，、q 幽、一一一、。一， 2 0 ：3 a u m 诫孤舢：4 a 辣糕l i 屯 ) 90 r v 飞广、一飞 屯，皇 、 v 昌v 、c = 、= = ， l l ：3 a 幢啦气 i ，如：s a 枷也崞。丑口队) 2 厂h 、，弋。v p = ，、= ，、= - 一，o 兹：6 。2 “噼 l a ) 图1天然存在的多不饱和脂肪酸的结构 2p u f a 的生物合成途径 植物能将单烯酸转化成多烯酸，是通过从分子的较远端( 即从所在双键到- 甲基) 进一步脱饱和，并按照亚甲基隔开的样式引入顺式不饱和中心。而动物只 能在单烯分子或从植物衍生的多烯衍生物的较近端( 即从所在双键至羧基) ，插 入另外的双键。因此，动物不能生物合成亚油酸和亚麻酸【l j 。一般认为，p u f a 的合成是亚油酸和亚麻酸通过链伸长以及脱饱和作用逐步完成的，在微藻细胞中 的具体合成途径如图2 所示【”。 也有人认为p u f a 在微藻体内的合成途径存在着种属的特异性。例如，在 e u g l e n a g r a c i l i s z h 中，亚油酸通过链伸长转化为相应的二十碳酸，然后逐步脱饱 和为a a ：1 8 ：2 1 9 ，1 2 - - - - 2 0 ：2 1 l ，1 4 - - - - 2 0 ：3 1 8 ，l l ，1 4 - - - - - 2 0 ：4 1 5 ，8 ，1 l ，1 4 ：而在 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及c d n a 文库的构建 o c h r o m n a sd a n i c a 和p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m 中，a a 的合成则需经由亚麻酸的途 径：1 8 ：2 1 9 ，1 2 - * 1 8 ：3 1 6 ，9 ，1 2 - - - - 2 0 ：3 1 8 ，1 1 ，1 4 - - - - 2 0 ：4 1 5 ，8 ，1 1 ，1 4 。 目前，人们对p u f a 在藻体内的合成的具体部位所知甚少。但是有一点是可 以肯定的，由于不同种类微藻存在着光合自养生长、异养生长或混合生长等营养 方式的差异，因此p u f a 在藻体内的合成位点与其生物合成途径必将会随藻的不 同而有所不同的。例如，对微藻细胞体内花生四烯酸( a a ) 的生物合成研究表 明：在e g r a c i l i s z h 中。a a 主要是异养生长的代谢产物，而不是光合自养生长 下的光合作用产物；而在p c r u e n t u m 和m o n o d u ss u b t e r r a n e u s 细胞内大量的c 2 0 四烯酸和c 2 0 五烯酸是构成叶绿体脂质的主耍成分，可见，在p c r u e n t u m 和 ) d o 胛o d u ss u b t e r r a n e u s 中，a a 的合成位点在细胞的光合器官中。 油酸1 8 ：l ( 一9 ) 亚油酸1 8 ：z ( m 6 ) 、l 1 8t3 ( m 一6 ) 7 - - 噩麻酸a 一囊麻酸1 8 ：3 ( - - 3 ) i 2 0 ：3 ( w - 6 ) 双高7 - - 驱麻酸= 十碳兰烯酸2 0 3 ( = - - 3 ) + 2 0 ：4 ( 呻一6 ) 花生圈烯醴：十碳四烯酸2 0 4 ( = - - 3 ) 2 2t4 ( = - - 6 ) 肾上腺酸二十碳五烯敬2 0 t 5 ( 埘一3 ) 2 2 ：5 ( = - - 6 ) - - 十二碳五烯陵= 十二碳五烯酸2 2 ：5 ( = - 3 ) 二十二碳六烯酸2 2t6 ( 婚一3 ) 图2 微藻体内的p u f a 的合成途径 3p u f a 的生理功能及生物活性 现代研究指出p u f a 在生物体内具有以下重要的生理功能： 1 调节膜的结构与功能嘲。必需脂肪酸的膜效应可能是最重要的功能，在 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及c d n a 文库的构建 体内所有膜的流动性和柔韧性都受到必需脂肪酸含量的影响【4 j 。必需脂肪酸对膜 的流动性的影响取决于它在膜中的浓度及其所含双键的个数【2 5 1 。具有同样双键的 0 3 - 3 系列的多不饱和脂肪酸不能改变因缺乏6e p a 造成的缺乏症，因而必需脂 肪酸双键的构型也是重要的。另外，膜中脂肪酸的构型也影响膜内许多蛋白的结 构和功能，例如离子通道、受体蛋白和a t 水解酶等1 5 , 6 。 2 p u f a 具有调节某些基因表达的作用。如调节编码脂肪酸合成酶、钠离子 通道蛋白、氧化氮合成酶、7 - c t 胆固醇脱氢酶基因的表达，从而直接影响脂肪酸 合成及与此有关的疾病的发生【7 i 。 3 p u f a 是一些重要的生理活性物质的前体物【8 l 。如 亚麻酸是合成前列腺 素、白三烯、过氧羟基脂肪酸等的前体物，尤其是十亚麻酸的氧化衍生物是具 有调节癌细胞分化的功能【9 ，1 0 1 。 4 控制细胞膜的通透性。机体缺乏必需脂肪酸皮肤就会失去防水性。另外， 体内的一些膜系，例如，血脑屏障或肠道屏障表现的选择性通透性也是由必需脂 肪酸调控的。 由于p u f a 在机体物质代谢和功能上发挥重要作用，其表现出许多重要的生 物活性： 1 抗肿瘤美国的经验证明：有些癌症，特别是乳腺肿瘤，如果不是膳食中 的n 6v u f a 束i j 激，一般不易变化。n - 6p u f a 会转变成一种促进肿瘤增大的前列 腺素p g e 2 ，相反，膳食中的n - 3p u f a 在动物体内能抑制p g e 2 的产生，因此起到 抑制肿瘤的作用【】。n - 3p u f a 在肿瘤形成早期对肿瘤生长的抑制作用。e p a 喂 养大鼠后，乳腺肿瘤生长被明显抑制，以n - 3p u f a 和n 6p u f a 不同比例的饲料 喂养大鼠，观察对重氮丝氨酸诱发胰腺癌前病变不典型腺泡细胞结节( a a c n ) 的 影响时，发现n - 3p u f a 和n - 6 p u f a 的比值升高，a a c n 的发生率相应下降，表明 n 3p u f a 对胰腺癌同样有抑制作用【1 2 】。e p a 能促进细胞释放胞内贮存的c e + 而 抑制c a 2 + 流回细胞。激活了蛋白激酶，抑制真核生物的起始因子2 a 即抑制了蛋 白起始阶段的合成，减少了生长调控蛋白合成表达【l 3 1 。 2 降血压、降血脂、防治心脑血管疾病缺血性心脑血管疾病的主要病理 基础是动脉粥样硬化，可由高血压、高血脂、血管细胞、血液细胞、凝血系统和 纤溶系统等诸因素失调或相互影响造成。c l a 可使血液中总胆固醇，非高密脂蛋 4 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及c d n a 文库的构建 自胆固醇及血清中甘三酯的含量显著降低，可以减少动脉壁上脂质斑的形成与沉 积，防止动脉粥样硬化症的发生【1 4 】。另有研究表明增加亚油酸含量不影响血压， 而增加1 廿亚麻酸可使动脉压平均下降0 6 7 1k p a 。显示n 3p u f a 具有降血压 作用。据报道，给一名缺乏n 亚麻酸患者补充舡甄麻酸乙酯，两周后t c 和t g 下降 7 0 l l ”。此外从是人体中含量最高、分布最广的一种p u f a 。尤其是在脑和神 经组织中，a a 含量一般占总p u f a 的4 0 5 0 ，在神经末梢甚至高达7 0 。 由于从具有促进生物体内脂肪代谢，降低血脂、血糖、胆固醇、l d l c 、v l d l c 、 a p o b ，升高h d l c 和a p o a 的作用，因此，对心脑血管疾病的预防具有重要的作 用【1 6 , 1 7 。 3 免疫调节1 1 3 和1 1 6p u f a 合成具有免疫应答生理活性的前列腺素和白 三烯的前体，同时脂质中的多不饱和脂肪酸又可作为生物体内细胞因子基因转录 的响应因子。含不同浓度c l a 的饲料喂养小鼠，发现血浆中c l a 的浓度与摄入量 正相关，c l a 能促进了脾脏淋巴细胞的增殖及白细胞介素2 ( i l 2 2 ) 和抗体的合成， 使动物血清中i g g 和i g m 浓度上升【1 0 】。丫_ 亚麻酸能增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡 红细胞的能力；增强小鼠的迟发性过敏反应：能提高糖尿病模型大鼠t 细胞、b 细胞的水平；能消除实验免疫脑脊髓炎( e a e ) i 涵床和组织症状，促进伴刀豆蛋白 对t 细胞的分化，能抑匍 i l 2 2 的生成i l ”。关节炎是局部二十烷类化合物过多引起 的，起因是n 一6p u f a 摄入过多，如果膳食中增加n 3p u f a ，则能抑制二十烷化 台物的形成。近期研究表明：膳食中的脂肪酸含量及其组成，与免疫力有关。 4 抗糖尿病1 9 9 8 年h o u s e k n e c h t 等人发现c l a 有防治糖尿病的作用。c l a 能提高肝细胞中胰岛素受体的敏感性，使受损的葡萄糖耐受性恢复正常，对糖尿 病有防治作用。 5 有利于大脑与视网膜视网膜中存在大量d h a ，它对婴幼儿眼的机能发 育及保护视力是必需的。d h a 是大脑皮质的主成分，南美洲智利的u a u yd a g a c h 证明d h a 对神经系统有重要作用。最近，l a u r i t e n 等【1 9 l 证明在肌暂时缺血性萎缩 动物模型中，亚麻酸能阻止神经死亡。p u f a 能激活大脑中k + 通道，对神经系统 起保护作用，而饱和脂肪酸不能激活，不起保护作用 2 0 1 。 6 抗氧化c l a 有抗氧化作用，而且此作用还可导致抗癌。c l a 在食物脂 肪中的含量达0 2 5 时抗氧作用最强；l 时对肿瘤生长的抑制作用最大。 5 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及c d n a 文库的构建 7 抗炎爱斯基摩人很少患喘息性气管炎、风湿性关节炎等慢性炎症性疾 病与他们常食鱼有关。人们发现e p a 的抗炎作用机理主要是抑制中性细胞和单核 细胞的5 ，脂氧合酶代谢途径，增加白三烯b 5 m 5 ，几乎无生理活性) 的合成， 同时抑制l 1 、b 。( f l j a a 产生，具有强的收缩平滑肌与致炎作用) 介导的中性白细胞 机能并通过降低白介素2 1 的浓度而影响自介素的代谢。 近年来p u f a 受到医学界的普遍关注和重视，已在预防和治疗动脉粥样硬化、 血栓形成、高血压、类风湿关节炎、糖尿病、皮肤老化、红斑狼疮、胃肠疾病和 癌症等方面展开了临床应用研究，对机体抵抗疾病和抗衰老等方面取得了显著效 果。由此使得具有生物活性的多不饱和脂肪酸的生产成为商业关注的焦点。 4 p u f a 的生物资源 4 1p u f a 传统的生产来源 传统上鱼油是p u f a 的主要来源。通过传统生产来源获取e p a 和d h a 存在 以下缺点【2 “： 1 p u f a 的产量不稳定 由于鱼油脂肪的组成及含量依鱼的种类、捕获季节、气候和地点的不同而异， 鱼油产量波动很大。 2 p u f a 纯化工艺复杂瞄】 鱼油中含有难以去除的胆固醇成分、脂溶性维生素，这些物质可储存在人体 的脂肪组织中。高剂量的脂溶性维生素可导致肾脏疾病及失明。同时，鱼油中含 有高达8 0 的饱和脂肪酸，过量摄食对人体有很大的副作用。工业上从鱼油中 提炼p u f a 时，要经过分离、浓缩、蒸馏、精制、脱臭等复杂的步骤，提高了生 产成本。因此，纯度为9 9 的e p a 每克售价为2 0 0 0 美元。 3 鱼油产品难以用于食品添加剂行业 从鱼油中提纯的p u f a 含有难以消除的鱼腥味，限制了这些高价值产品在食 品行业中的应用。 此外，若将p u f a 的纯产品应用于医药工业，则鱼油产品市场上的p u f a 会 供不应求，因此必须开辟p u f a 新的替代资源。 6 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及c d n a 文库的构建 4 2p u f a 的植物资源 p u f a 主要存在于植物种子中，尤以胚芽含量最高。近年来。人们分析了豆 油、花生油、棉子油、芝麻油等植物油，其中p u f a 含量约在2 0 一5 0 之间， 其中亚油酸含量最为丰富。因为亚油酸最早从月菟草( q e n o t h e r a b i e n n i s l ) 的种 予油中发现的，所以月苋草成为了一种天然的亚油酸来源。除月苋革外，p u f a 还存在于其他某些含油的植物种子中。如紫草科( b o r a g i n e a s e ) 的玻璃苣、玄参 科( s c r o p h u l a r i a c e a e ) 及虎耳草科( s a x i f r a g a c e a e ) 的黑加仑( b l a c k c u r r a n t ) 、 红加仑( r e d c u r r r a n t ) 和醋粟( g o o s e d e r r y ) 等植物的种子中。 但是由于植物天然资源有限，人工种植受到化肥和农药的污染，同时植物种 子资源受气候、产地等诸多因素的影响，加之生产周期长等原因，远远不能满足 社会的广泛需求，因此人们把视线转向了p u f a 的原始生产者微藻。 4 3p u f a 的微藻资源 微藻是海洋中p u f a 的原始生产者。鱼类本身并不能合成p u f a ，它们通过食 物链的关系( 海洋徽藻一浮游动物一鱼) 在其体内大量积累p u f a 。各种微藻的 p u f a 含量和合成能力有很大差异( 表1 ) ，因此，人们一开始就致力于寻找具有 高含量p u f a 的藻株。用来筛选的藻类几乎涉及到已经发现的所有可以人工培养 的微藻。 表l 各种藻类的脂肪酸组成的比较 7 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及e d n a 文库的构建 利用藻类生产p u f a 具有以下优点【2 3 1 ： 1 微藻细胞脂肪酸组成简单，某些藻类细胞p u f a 的含量占总脂肪酸的3 0 一5 0 ，较鱼油容易提纯分离。 2 与鱼油相比，从微藻细胞中提取的产品无腥臭味，可用于食品行业的生产。 3 藻类具有较高含量的蛋白质、微量元素、维生素及抗氧化物质，藻粉可以 直接利用。 由于微藻生长缓慢，细胞得率低，以微藻为材料大规模生产e p a d h a ，尚 存在一定困难。随着对多不饱和脂肪酸生物合成调控机制的认识，从分子水平上 研究微藻不饱和脂肪酸合成的影响因素，通过对脂肪酸去饱和酶基因的克隆，实 现基因的异体高效表达。以得到大量的不饱和脂肪酸，对解决e p a d h a 资源、 降低生产成本，将提供一条新途径。 5 脂肪酸去饱和酶 脂肪酸去饱和酶( f a t t ya c i dd e s a t u r a s e ) 是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶。 它催化与载体结合的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸在脂肪酸链上形成双键。动物、 植物和微生物的膜脂与贮脂都包含有特定组成的脂肪酸，而其不饱和程度就是由 催化不同脱饱和反应的去饱和酶所控制。由于其决定性的作用，脂肪酸去饱和酶 受到相当大的关注，尤其是近年来脂肪酸去饱和酶的研究和应用均取得了引人注 目的成就。 5 1 脂肪酸去饱和酶种类和分布 脂肪酸去饱和酶可以根据它们的底物特异性、细胞内定位和调节模式加以划 分。根据其所作用的底物脂肪酸结合的载体不同可分为三类【2 9 l ：1 脂酰c o a 去 饱和酶。它存在于动物、酵母和真菌细胞中，与内质网相结合，催化以c o a 为载 体的脂肪酸形成双键；2 酯酰a c p 去饱和酶。它存在于植物质体基质，催化与 a c p 结合的脂肪酸形成双键：3 脂酰脂去饱和酶。它存在于植物内质网膜、质 体膜和蓝藻类囊体膜上，催化与甘油脂结合的脂肪酸形成双键。最后一类去胞和 酶是膜脂不饱和程度响应温度变化最有效的调节器。 脂酰脂去饱和酶可以根据电子供体不同分为两类。一类定位于植物细胞的 8 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及e d n a 文库的构建 内质网，以细胞色素b 5 为电子供体。另一类存在于植物细胞质体和蓝细菌中，以 铁氧还蛋白为电子供体。 去饱和酶还可以根据其在脂肪酸链形成双键时参考点的不同分为两种类型。 a 型去饱和酶朝向羧基端以亚甲基间隔模式形成双键。型去饱和酶则朝向甲基 端【24 1 。 5 2 脂肪酸去饱和酶的分子生物学 脂肪酸去饱和酶的分子生物学研究起步较晚，2 0 世纪8 0 年代末和9 0 年代 初陆续发表了一些脂肪酸去饱和酶基因的克隆和表达的资料。 脂肪酸的去饱和酶系统由3 种蛋白质组成：n a d h 细胞色素b 5 还原酶、细 胞色素b 5 和脂肪酸去饱和酶，该酶系统需要氧分子和n a d h 或n a d p h 参与。 目前，只有植物的脂酰a c p 去饱和酶是唯一可知的可溶性去饱和酶家族它包 括4 软脂酰a c p 去饱和酶、6 软脂酰a c p 去饱和酶和9 豆蔻酰a c p 去饱 和酶等，其余都是膜结合蛋白。包括哺乳动物、真菌、昆虫、植物和藻类的5 、 6 、a 9 、a 1 2 及a 1 5 去饱和酶，由于用常规的生物化学方法很难分离纯化到这 些酶，所以严重限制了对这些酶的研究。 5 2 1 脂肪酸去饱和酶的结构特点 分析目前已知的各种膜结合蛋白去饱和酶序列，发现其结构具有共同的特 点：n 端和c 端部分缺乏明显的同源性，但中部序列相对保守，都有两段长的 疏水区，可以形成4 个跨膜区( 图3 ) 3 5 1 ，含有3 个极度保守的组氨酸区。第一 个： ( 3 或4 ) h h ，第二个：f i x 伫或3 ) h h ，第三个：h x c 2 或3 ) 上- h h ( a 5 、a 6 去饱和 酶中第三个组氨酸区变成了q x 2 h h ) 2 6 1 。而且三个组氨酸保守区之间的距离也是 保守的，第一个和第二个组氨酸保守区之间的距离为3 1 个氨基酸。第二个与第 三个组氨酸保守区之间的距离在1 3 2 1 7 7 个氨基酸之间。膜结合的脂肪酸去饱和 酶保守区结构域的氨基酸序列分析如表2 。 5 2 2 脂肪酸去饱和酶的催化机理和活性中心 脂肪酸去饱和酶三个极保守组氨酸区与二价铁离子结合形成酶的活性中心 9 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培葬及e d n a 文库的构建 其作用是作为金属鳌合配基，与铁离子结合，在反应中心与氧形成一个反应复合 体( f e o - f e ) 催化双键的形成。氧将作为细胞色素b 5 、铁氧还原蛋白产生的电 子对最终受体。 图3 脂肪酸去饱和酶在膜中的结构模型 表2 脂肪酸去饱和酶的保守组氨酸簇 脂肪酸去饱和酶对底物的识别，一般具有链长特异性和位置特异性，在某些 高等植物中还具有组织特异性。1 9 9 6 年，y l i n d q v i s t 首次得到了蓖麻种子a 9 - - 1 0 山东大学硕士学位论文绿色巴夫蕞的纯化培养及e d n a 文库的构建 硬脂酰a c p 去饱和酶( d e l t a9s t e a r o y l a c pd e s a t u r a s e ，s a d ) 的晶体结构。蓖麻 s a d 是由3 1 3 个氨基酸构成的单体，包括由1 1 个螺旋组成的单一结构方式， 其中9 个形成反向平行螺旋束。酶亚基含一个f e 2 + 中心，与螺旋束中的4 个a 螺 旋相结合，铁离子束缚于高度对称环境。从酶表面到内部有一个深的空穴，该空 穴可能是脂酰基的结合部位，脂肪酸链长的识别主要根据容纳底物的空穴底部氨 基酸残基来决定的。此外，把a 9 硬脂酰a c p 去饱和酶活性部位的两个氨基酸 ( l i l 8 f f m i ) 替换后，变成有活性的a 6 棕榈酰a c p 去饱和酶。另外，细菌 ( s y n e c h o c y s t i s ) a 1 2 脂肪酸去饱和酶基因的突变研究表明，保守区中的8 个组 氨酸对于去饱和酶的催化活性是必需的。近几年，在一系列关于a 5 、a 6 及8 去饱和酶的研究发现，h i s h i 区组成不同于a 1 2 、a 1 5 - 去饱和酶，其第一个组氨 酸被谷氨酰氨取代。这个新的去饱和酶的家族一般在n 端的外延区含有细胞色 素b 5 的结构【2 ”，这类酶被命名为“舶n d e n d ”酶，其特点是底物为单烯不饱和 脂肪酸。现已发现了一些具有细胞色素b 5 结构域的脂肪酸去饱和酶，构成细胞 色素b 5 结构域融合蛋白家族。 5 2 3 脂肪酸去饱和酶的生物学特性及机制 动植物和微生物的膜脂包含有饱和程度不同的脂肪酸。脂肪酸的不饱和程度 决定着膜的相转变温度，即不饱和程度越高，膜的相转变温度越低。通过调节去 饱和酶的酶量和活性，就能够改变膜脂的不饱和度，直接决定着生物的耐寒性【3 2 】。 环境因素( 如温度、光照等) 从分子水平调节去饱和酶的表达及活性，使细胞得 以迅速改变脂肪酸的组成来适应环境的变化。脂肪酸的去饱和作用是低温下细胞 维持正常生长的重要措施之一。 目前，温度对膜脂脂肪酸不饱和度的调控机制存在3 种模型【3 1 】。第一莉模型 认为低温诱导了脂肪酸去饱和酶的合成，即低温激活了去饱和酶基因的转录与翻 译，增加了细胞内的去饱和酶的酶量。使膜脂的去饱和作用得以加强，以维持细 胞完成正常生理功能所需要的生物膜的流动性。已有许多证据支持这种机制，得 到了普遍的认可。 例如，在2 2 。c 下生长的稳定期聚球蓝细菌7 0 0 2 细胞，其d e s a ( a 1 2 一去饱 和酶基因) m r n a 的丰度比3 8 。c 下生长的细胞高出3 倍，半衰期延长了3 5 倍。 山东大学硕士学位论文绿色巴夫藻的纯化培养及c d n a 文库的构建 d e s b ( a 1 2 ，去饱和酶基因) 的转录与温度密切相关，在3 8 0 c 时未检测到转录产 物，而在2 2 6 ( 2 时转录产物大量积累。半衰期延长了1 5 倍。d e s a 和d e s b 基因的 转录水平在细胞转到2 2 0 c 后1 5 分钟内升高到最高值，而再转回3 8 。c 后1 5 分 钟内又恢复正常。在集胞蓝细菌6 8 0 3 也发现了类似的现象，把自养的细胞从3 6 。c 转移到2 2 0 c 时，d c s a 和d c s b 基因m r n a 水平大为提高f 2 8 】。可见，去饱和酶基 因的表达是受m r n a 的合成及其稳定性共同调节的。 低温还可以提高蓝细菌的d e s a 基因在大肠杆菌中的表达水平【3 “。增加d 1 2 d 的合成。n i s h i z a w a 等人从a n i d u l a n s 中克隆到d e s c ( a 9 去饱和酶基因) 并将其