（微生物与生化药学专业论文）重组蛋白ggh在毕赤酵母中高效表达及纯化.pdf

摘要摘要g l p 1 是由肠道l 细胞合成和分泌的由3 0 个氨基酸组成的多肽，它不仅能促进胰岛素合成，而且能够促进胰p 细胞增殖和抑制胰p 细胞凋亡。g l p 1 独特的降血糖作用机制，是现有抗糖尿病药物无可比拟的，但由于其在体内的半衰期非常短，大大限制了其应用。为克服g l p 1 半衰期短的缺点，实现其在体内的长效作用，本实验室成功构建了胰高糖素样多肽i ( g l p 1 ) 突变串联体与人血清白蛋白的表达质粒p p i c 9 k ( g l p 1 a 2 g ) 2 h s a ，并且初步实现了在毕赤酵母k m 7 1 中的表达。在此基础上，本文主要围绕提高融合蛋白g g h 的产量和分离纯化进行研究，主要结论如下：( 1 ) 统计分析了融合基因g g h 在不同毕赤酵母宿主( k m 7 1 、g s l l 5 、s m d l1 6 8 ) q b的表达，并通过荧光定量p c r 研究了三株产量差异较大的g s l l 5 重组子基因剂量与融合蛋白g g h 表达量的关系，实验结果表明：宿主g s l l 5 更有利于融合蛋白g g h 的表达，融合蛋白的表达量与目的基因的剂量成正相关，最终确定高一株产菌株g s l l 5 f 2 ，在摇瓶中的稳定表达量为3 2 8m g l 。( 2 ) 研究了高表达菌株的发酵过程，确定了其在5l 发酵罐上的发酵工艺。实验结果表明有机氮源培养基更有利于融合蛋白g g h 高密度表达及控制目的蛋白的降解；在有机氮源培养基中，0 5 的甲醇脉冲式流加方式和3 0 诱导温度为最佳诱导条件，最终融合蛋白g g h 的产量达到6 4 2m g l 。( 3 ) 初步建立了融合蛋白g g h 的分离纯化路线，即发酵液8 0 0 0r m i n 离心5m i n ，1 0k d a 截留量的超滤膜超滤浓缩2 0 倍，b l u es e p h a r o s e 亲和吸附、s e p h a d e xg 2 5 脱盐、qs e p h a r o s ef f 离子交换层析，整个纯化过程回收率为3 3 4 ，经s d s p a g e 和h p l c检测纯度大于9 5 ，符合下一步生物活性和药代动力学实验和药剂学试验的要求。关键词：融合蛋白g g h ，毕赤酵母，发酵工艺，分离纯化a b s t r a c ta b s t r a c tg l u c a g o n l i k ep e p t i d e i ( g l p 一1 ) i s30 - r e s i d u a lp e p t i d eh o r m o n es e c r e t e db yi n t e s t i n a ll - c e l l si nr e s p o n s et on u t r i e n ti n g e s t i o n i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ns i m u l a t i n gi n s u l i ns e c r e t i o n ，i n d u c i n gp a n c r e a t i cb e t ac e l l sp r o l i f e r a t i o na n di n h i b i t i n gp a n c r e a t i cb e t ac e l l sa p o p t o s i s t h eu n i q u eh y p o g l y c e m i cm e c h a n i s mo fg l p 一1i su n p a r a l l e l e dt ot h ee x i s t i n ga n t i d i a b e t e sd r u g s c o n s e q u e n c et oi t sn a t u r a lf u n c t i o na sl o c a l l ys e c r e t e ds h o r t t e r mm e s s e n g e r ，i t sh a l f - l i f ei nc i r c u l a t i o ni sv e r ys h o r ta n dp r o v i d e dm a i n l yb yf a s tr e n a lc l e a r a n c ed u et oi t sl o wm o l e c u l a rw e i g h ta n dp r o t e o l y s i ss u s c e p t i b i l i t y ，r e s u l t i n gi nl o wc l i n i c a lu t i l i t y i no u rl a b ag l p - 1f u s i o np r o t e i nn a m e dg g hc o m p r i s i n gd o u b l et a n d e mg l p 1a n dh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) w a sc o n s t r u c t e dt op r o l o n gi t sh a l f - l i f e n l eg l p 一1f u s i o np r o t e i nw a se x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i sk m 71t r a n s f o r m e dw i t hv e c t o rp p i c 9 k ( g l p 一1a 2 g ) 2 一h s a i nt h i ss t u d y , i m p r o v i n gt h ee x p r e s s i o nl e v e la n dp u r i f i c a t i o no ff u s i o np r o t e i ng g hw e r ef o c u s e do n t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ：t h ef u s i o np r o t e i ng g he x p r e s s i o nl e v e li nd i f f e r e n th o s ts t r a i n s ( k m 71 ，g s1 15a n ds m d116 8 ) w a sd e t e r m i n e da n da n a l y z e db ys t a t i s t i c a lm e t h o d s t h er e l e v a n c eo fg e n ed o s a g ea n df u s i o np r o t e i ng g he x p r e s s i o nl e v e lw a si n v e s t i g a t e db yr t p c ri nt h r e eg s115r e c o m b i n a n t sw i t hd i f f e r e n te x p r e s s i o nl e v e l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh o s ts t r a i ng s115w a sm o r es u i t a b l ef o re x p r e s s i n gf u s i o np r o t e i ng g h i tw a sap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e ng e n ed o s a g ea n df u s i o np r o t e i ng g he x p r e s s i o nl e v e l ah i g hy i e l dr e c o m b i n a n ts t r a i ng s115 f 2w i t he x p r e s s i o nl e v e lo f3 2 8m g li ns h a k ef l a s kc u l t u r ew a ss e l e c t e do u tf o rf u r t h e rs t u d y a f t e ri n v e s t i g a t i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fh i g hy i e l dr e c o m b i n a n ts t r a i n ，t h ep r o c e s sw a sc o n f i r m e d t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a to r g a n i cn i t r o g e ns o u r c e sw e r em o r ec o n d u c i v et 0m g hd e n s i t yc u l t u r eo fr e c o m b i n a n ts t r a i na n di n h i b i t i n gp r o t e o l y s i s ap u l s ef e e d i n gs t r a t e g yo fo 5 m e t h a n o le a c ht i m ew a st h eo p t i m a lm o d ef o ri n d u c i n gf u s i o np r o t e i ne x p r e s s i o n 30 cw a st h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o ri n d u c i n g 1 1 1 ey i e l do ff u s i o np r o t e i ng g hi nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fr e c o m b i n a n ts t r a i nr e a c h e dt o6 4 2m g l 。ap r e l i m i n a r yp u r i f i c a t i o np r o c e s sw a se s t a b l i s h e d t h ep r o c e s sw i t hat o t a lr e c o v e r yo f3 3 4 i n c l u d e df i v es t e p s ：c e n t r i f u g a t i o n ，f i l t r a t i o n ，b l u es e p h a r o s e ，s e p h a d e xg 2 5a n dqs e p h a r o s ec h r o m a t o g r a p h y t h ef u s i o np r o t e i ng g hw a sp u r i f i e dt oa p p a r e n th o m o g e n e i t y晰t l lp u r i t yg r e a t e rt h a n9 5 a n a l y z e db ys d s p a g ea n dh p l c ，m e e t i n gt h er e q u i r e m e n to ft h es t u d yo fp h a r m a c o d y n a m i c s ，p h a r m a c o k i n e t i c sa n dp h a r m a c y k e y w o r d s ：f u s i o np r o t e i n ，p i c h i ap a s t o r i s , f e r m e n t a t i o np r o c e s s ，p u r i f i c a t i o np r o c e s si i 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：塑7 鱼日期：刀。歹，j a 汐关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：绚涛导师签名：日期：第一章绪论第一章绪论1 1 人胰高血糖素样肽i ( g l p 1 ) 概况1 1 1 人胰高血糖素样肽- i ( g l p 一1 )1 9 8 4 年美国波士顿总医院首先发现人胰高血糖素样肽一1 ( g l u c a g o n 1 i k ep e p t i d e 1 ，g l p 1 ) 是一种肠肽激素，主要由肠道l 细胞所分e , 3 0 个氨基酸的多肽【l 捌。它是胰高血糖素原( p r o g l u c a g o n ) 基因翻译后，酶解去掉n 端的6 肽并且c 端酰胺化后生成的具有高度活性的g l p 1 ( 7 3 6 ) 酰胺。g l p 1 ( 7 3 6 ) 酰胺是人体内g l p 1 主要的天然形式，约占8 0 ，其促进胰岛素分泌的作用最强。g l p 1 既有刺激胰b 细胞增殖、促进胰岛再生的作用，又有减少食物摄取、减慢胃排空、抑制胰高血糖素分泌的功能，且无胰岛素和磺脲类降糖药物给药后的低血糖危险【3 】。然而，g l p 1 在体内的半衰期较短，静脉注射不足5m i n ，其新陈代谢的速率为1 2 1 3m i n 。这主要是g l p 1 在体内被二肽基肽酶i v ( d i p e p t i d y lp r o t e a s e i v ，d p p i v ) 快速降解所致。d p p i v 将g l p 1 从n 端第2 位丙氨酸( a l a ) 处水解掉两个氨基酸，使其转变为无活性的g l p 1 ( 9 - 3 6 ) 酰胺和g l p 1 ( 9 3 7 ) ，后者是活性肽的拮抗剂，但是，一般认为，以g l p 1 ( 1 3 7 ) 存在的形式无生物活性【4 ，5 】。1 1 2g l p 1 的生物学作用及临床作用g l p 1 具有多种生理功能，主要包括【6 】：( 1 ) 具有血糖依赖性的促进胰岛素分泌作用；( 2 ) 能够刺激b 细胞再生，诱导前胰岛素基因的转录，促进胰岛素的成熟和分泌；( 3 ) 增加生长抑素分泌，从而抑制胰高血糖素的产生；( 4 ) 抑制胃酸分泌，延迟胃排空；( 5 ) 作用于中枢神经系统，抑制食欲等。由于g l p 1 的上述生理功能，使其在i i 型糖尿病的治疗中显示了较好的效果。大量动物试验和临床研究表明，g l p 1 能明显降低i i 型糖尿病患者的空腹和餐后血糖，而且它的肠促胰岛素分泌作用是血糖依赖性的，只有在高血糖情况下，才促进胰岛素分泌，不会出现低血糖现象，防止了抗糖尿病治疗中最严重的急性副作用【7 弗j 。1 1 3g l p 1 长效类似物的研究进展由于g l p 1 在体内极易被二肽基肽酶i v ( d p p i v ) 降删9 1 ，其生物半衰期非常短，这就限制了其在临床上的应用，为此人们一直致力于对g l p 1 的结构进行改造，或者从天然活性物质中筛选其类似物，或者寻找能抵抗d p p i v 降解的特异性突变体。( 1 ) 利用基因工程定点突变技术对g l p 1 的氨基酸组成改造g a l l w i t z 和s i e g e l 等利用定点突变技术对g l p 1 不同位点的氨基酸进行突变，结果表明：n 末端组氨酸残基的修饰导致g l p 1 能明显抵抗d p p i v 的降解，但同时也降低了其与受体的结合活性；而将n 末端第2 位a l a 残基被取代或修饰的突变体，不仅能抵抗d p p i v 的降解，且与受体的亲和力和体内的生物学活性与g l p 1 相比无明显差别。张志珍等【lo j 采用基因工程的方法，以甘氨酸( g l y ) 取代第2 位舢a 对人g l p 1 的结构进行改造，动物试验表明，该重组人g l p 1 能显著改善试验糖尿病大鼠的血糖水平，促进江南大学硕士学位论文血浆胰岛素的分泌，并且具有较长的半衰期。南开大学的高志慧等l 在g l p 1 的n 端加上一个赖氨酸( l y s ) 然后和人血清白蛋白融合，不仅抵抗了d p p i v 的降解作用而且提高了其在体内的半衰期。( 2 ) 通过化学方法对g l p 1 修饰对于一些分子量比较小，半衰期比较短的蛋白可己通过脂肪酸或者p e g 的修饰来延长其在体内的代谢时间，从而达到长效的目的。在g l p 1 的c 末端上有许多位点可以用脂肪酸进行衍生。2 6 位和3 4 位的赖氨酸是衍生的最佳位点，2 6 位衍生的化合物作用最强、最稳定【1 2 】。目前，诺华诺德制药公司通过在g l p 1 的赖氨酸残基上加上1 6 碳的酞基链，并由精氨酸取代3 4 位赖氨酸的方法开发了g l p 1 的类似物l i r a g l u t i d e( n n 2 2 1 1 ) ，该药物分子能够在血浆中与白蛋白结合而缓慢释放，且能够抵抗d p p i v降解作用，可由皮下缓慢吸收，代谢稳定，血浆半衰期长。已有的药效学研究表明该药物分子单独或与二甲双胍联合应用能显著降低i i 型糖尿病患者空腹血糖，联合用药时能显著降低体重。目前，l i r a g l u t i d e ( n n 2 2 11 ) 已经上市。( 3 ) 通过细胞模型筛选天然g l p 1 类似物e x e n d i n 4 是从蜥蜴唾液腺分离出来的g l p 1 类似物，有3 5 个氨基酸组成，可以和g l p 1 受体高度亲和并使其活化【1 3 】。由于它不是d p p 的底物，因而具有较长的半衰期和较强的生物活性。美国a m y l i n 医药公司将e x e n d i n 4 命名为a c 2 9 9 3 ( 商品名e x e n a t i d e ) ，该药现在已经上市。1 2 人血清白蛋白的融合技术1 2 1 人血清白蛋白人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 是有5 8 5 个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质，分子呈心型，理论分子量6 6 4 3 8 d a ，p i4 7 4 9 ，沉降系数( s 2 0 ，w ) 4 6 ，电泳迁移率5 9 2 ，单链分子内通过17 5 对二硫键交叉连接，分子稳定性较好1 1 剞。它是人血浆中含量最高的蛋白质，占血浆总蛋白的6 0 ，每升成人血液中约有4 0 9 ，白蛋白除存在于血浆中，也存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中【15 1 。1 2 2 白蛋白融合技术人血清白蛋白( h s a ) 是血液中含量最高的蛋白( 浓度达4 0 9 l ) ，在体内能维持血液渗透压，无酶活性和免疫原性，人体相溶性好，半衰期长约1 9 d 。并且h s a 的基因在毕赤酵母中可以高效分泌表达，其发酵液表达量可以达到7e e l t l 6 】，上清液杂质含量较少，纯化方便，因此将蛋白质药物基因与h s a 基因融合，在毕赤酵母或酿酒酵母中表达，获得h s a 的融合蛋白，延长蛋白质药物的半衰期。美国g r e e nc r o s s 公司采用酵母表达的h s a 已完成了i 期临床试验和规模化生产的准备，证明酵母表达的h s a 与天然的h s a 表面均无糖基化，具有相同的免疫原性，在效果和安全性方面两者基本一致。这一研究结果促使更多的学者和一些医药公司关注该技术的药物化条件开发利用，如h g s 公司1 17 1 2 0 0 5 年研发的a l b u f e r o n 2 a 是h s a 和i f n 2 a 的融合蛋白药物，2 0 0 8 年8 月2第一苹绪论在加拿大已完成i i 期临床试验显示了很好的结果。通过白蛋白融合技术增加重组药物的稳定性、提高其生物利用度和改善重组多肽药物的溶解度已成为目前长效重组药物研发的技术热点。国际上，h g s 和g s k 公司联合开发了长效g l p 1 制剂a l b u g o n ，其是由两个g l p 1的突变体( 突变点为第8 位氨基酸) 和一个人白蛋白分子组成，a l b u g o n 在猴体内的半衰期达3 天，并能2 4 h 维持糖尿病大鼠的血糖接近正常水平，但该融合蛋白的表达比较困难。国内南开大学课题组【i l 】利用毕赤酵母表达了重组g l p 1 与人血清白蛋白融合蛋白，表达量为6 3 6m g l ，其生物活性仅为4h 左右；军事医学科学院的龙娟、刘志敏等人在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽i ( h g l p 1 ) 突变体( 2 g l y h g l p 1 ) 与人血清白蛋白( h s a ) 的融合蛋白，表达量为2 0 0m g l ，在糖耐量实验中证明该化合物具有明显的降糖生物活性。大连帝恩生物工程有限公司研发中心的孙纯义、李元等【1 9 】人研究了的h g l p 1 白蛋白融合蛋白的纯化工艺，未见进一步的药效学研究结果。1 3 毕赤酵母表达系统1 3 1 毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s )甲基营养型酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点【2 们。短短几年已经有3 0 0 多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。目前美国f d a 已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的c e p h e l o n 制剂已获得f d a 批准，所以该系统被认为是安全的p p a s t o r i s 表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：( 1 ) 具有醇氧化酶a o x l 基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。( 2 ) 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。( 3 ) 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。( 4 ) 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。1 3 2 毕赤酵母宿主茵及表达载体根据对甲醇的利用能力，巴斯德毕赤酵母可以分为三个表型【2 1 1 。m u t + ( m e t h a n o lu t i l i z a t i o np l u sp h e n o t y p e ) 含有a o x l 和a o x 2 两个启动子，能够在含有甲醇的培养基上快速生长。通过敲除a o x 基因中的一个或两个后，可以得到两种类型的菌株。与野生型相比，a o x l 基因突变的菌株也能够较好的表达外源蛋白。k m 7 1 ( h i s 4 a r 9 4 a o x l v ：?江南大学硕士学位论文s a r g 4 ) 菌株的a o x l 被c e r e v i s i a ea r g 4 基因插入失活，因此，只能利用较弱的a o x 2进行甲醇的代谢，在甲醇作为碳源时生长缓慢( m u t 8 ，m e t h a n o lu t i l i z a t i o ns l o wp h e n o t y p e ) 另一株菌，m c l 0 0 3 ( h i s 4a r 9 4a o x l v ：s a r g 4a o x 2 v ：? p h i 4 ) ，两个a o x 基因全部缺失，并且不能在甲醇上生长( m u t 一，m e t h a n o lu t i l i z a t i o nm i n u sp h e n o t y p e ) 所有这些菌株，即使m c l 0 0 3 ，都保留着a o x l 启动子高水平诱导表达的能力。为了防止外源蛋白产物被蛋白酶降解，利用基因工程的方法构建了一系列蛋白酶缺陷型菌株。s m d l1 6 3 ( h i s 4 p e p 4 p r b l ) ，s m d l1 6 5 ( h i s 4 p r b l ) ，a n ds m d l1 6 8 ( h i s 4 p e p 4 ) 。这一点在高密度细胞发酵时非常重要，但是由于敲除了胞内的蛋白酶，导致s m d 系列的菌株生长活性非常低，限制了其应用和发展。表1 1 p p a s t o r i s 表达宿主菌t a h l - 1 p p a s t o r i se x p r e s s i o nh o s t菌株名称( n a m e )基因型( g e n o t y p e )表型( p h e n o t y p e )1 3 3 毕赤酵母表达系统对外源蛋白表达的影响外源蛋白在p p a s t o r i s d p 的表达影响因素很多，它不仅受宿主菌表型，基因剂量的影响，也受到外源基因特性、外源蛋白自身的理化特点的影响。( 1 ) 宿主菌的甲醇利用表型( m u t + ，m u t 8 和m u t 一)在毕赤酵母中主要有3 种表达宿主菌m u t + ，m u t s 和m u t 一，它们的区别在于a o x 启动子的一个或二个基因的缺失而造成对甲醇利用能力的不同。最常用的宿主菌为g s l l 5 ，它含有a o x l 和a o x 2 基因，在甲醇的培养基上以野生型速率生长。与野生型m u t + 比较，m u t 3 细胞对氧的要求较低，生长较慢。p a uf e r r e r 等【2 2 】运用山梨醇和甲醇混合批量培养发酵，使得大部分碳源由山梨醇提供，减少了总的甲醇消耗，因而效率大大提高。( 2 ) 基因剂量( g e n ed o s a g e ) 2 3 j基因剂量对外源蛋白的表达具有重要的影响，许多试验表明外源目的蛋白表达盒的一个拷贝就足够外源蛋白的高效表达，再增加表达拷贝数对外源蛋白表达量并无显著影响。但是也有一些试验表明，拷贝数大于1 0 是外源蛋白高水平表达的必要条件。在p p a s t o r i s 表达外源蛋白如t n f ，b o r d e t e l l ap e r t u s s u sp e r t a c t i np 6 9 ，e g f 等发现拷贝数对表达量有很大的影响作用。不过也有些实验表明拷贝数的增加对外源蛋白的表达会有负面的影响。( 3 ) 外源基因特性f 2 3 】外源基因在p p 傩f d ，缸中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。不同的培养4第一苹绪论基配方、发酵参数和培养策略主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。外源基因的密码子主要在翻译水平上影响基因的表达。尽管各种生物使用的密码子都大同小异，但巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。如果外源基因中含有稀有密码子，则在翻译过程中会产生瓶颈效应而影响表达。在6 1 个密码子中，酵母细胞偏爱的只有2 5 个。稀有密码子密集区往往制约外源蛋白的翻译速率。在表达植酸酶时，把酵母使用频率为零的精氨酸密码子突变为酵母偏爱的g a g 密码子时，外源蛋白的表达水平提高了3 7 倍。密码子统计学分析表明密码子的偏爱性与基因的表达量密切相关。外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。由于蛋白质在内质网和高尔基体中被加工修饰后的去向由蛋白质自身特点决定，一般不分泌的蛋白很难使其分泌。因此外源蛋白的空间构象，糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其它的理化特点等都影响毕赤酵母对外源蛋白的表达。1 4 毕赤酵母高密度发酵1 4 1 高密度发酵高密度发酵技术( h i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e ，h c d c ) ，也称高密度发酵，是指在培养过程中通过流加补料，也就是不断补充营养，使菌体在较长的时间内保持较高的生长速率，从而提高菌体的浓度，最终提高目的产物的比生产率，也即单位体积单位时间内产物的产量。巴斯德毕赤酵母对氧具有特别的嗜好，这一特性使得它既能高密度培养，又有利于工业化放大生产，由于通常情况下外援蛋白的表达量与菌体浓度基本成正相关，因此人们一般采用高密度深层发酵技术来实现外源蛋白的高效表达。1 4 2 毕赤酵母补料分批发酵1 2 4 l工业上对微生物的培养主要有分批培养、连续培养和分批补料培养三种方式。分批培养可按典型的培养曲线进行，但是其有限的营养成分难以达到高密度培养，单纯的添加营养成分反而会抑制菌体的生长；连续培养使培养物一直处于指数生长期，但是由于基因工程菌和目的产物的不稳定性，限制了这种方式的应用；补料分批发酵是在分批培养的前提下连续或按某一规律向发酵系统中补充营养成分，使发酵系统中保持足够担忧较低的浓度的营养物，其优点在于可消除菌体快速消耗碳源后造成的阻遏效应，避免抑制性副产物的积累。甲醇营养型毕赤酵母补料分批发酵表达外源蛋白一般分为三个阶段，即基础生长阶段、甘油流加生长阶段和甲醇诱导外源蛋白表达阶段。基础生长阶段和甘油流加阶段为积累生物量的间歇培养期，以积累菌体量为目的。当甘油消耗完后，开始第三个阶段诱导蛋白表达，由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的a o x 基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导a o x 基因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因的a o x 的启动子表达外源基因蛋白。为了解除基质过浓的抑制、产物的反馈抑制和c r a b t r e e 效应，以及避免在分批发酵江南大学硕士学位论文中因一次碳源过多造成细胞大量生长，耗氧过多而供养不足的状况，因此，在毕赤酵母高密度发酵中一般采用补料分批发酵的方式。毕赤酵母在葡萄糖、甘油为碳源的培养基中生长的很快，但是这些碳源对a o x 启动子具有抑制作用，抑制外源蛋白的表达，在以甲醇为唯一碳源的培养基中可以诱导外源蛋白的分泌表达，但是菌体的生长缓慢，因此通常采用分批补料发酵的方法来提高目的蛋白的表达量。c a r m e nj 等【25 】在p p a s t o r i s 高密度发酵生产q 淀粉酶时，利用d o s t a t 法控制甘油的补加速率，经优化后细胞干重可以到达1l o l 。根据补料方式是否受到生物传感器的的反馈控制，可以分为反馈补料和非反馈补料两种方式：( 1 ) 反馈补料d o s t a t 法：菌体在利用碳源生长代谢过程中，需要一直消耗0 2 ，表现为发酵系统中溶解氧( d o ) 的浓度降低，但是当碳源被消耗完或菌体生长缓慢时，d o 的水平就会急剧上升，因此可以利用d o 的上升反馈补加碳源。p h s t a t 法：当发酵系统中的碳源消耗完，p h 就会升高，因此可以利用d o 的上升反馈补加碳源。但是p h 得升高并不一定都是碳源消耗的结果，容易造成补料的错误。a n n p r c t r l 法：人工神经网络状态模式识别控制法控制补料。( 2 ) 非反馈补料恒速流加法：在发酵过程中按照预先设定的速率流加营养物质，菌体总量成线性增加。此法的缺点是可能会导致碳源的不足或者基质的过量积累。变速流加法：在发酵过程的不同阶段，根据菌体生长的不同时期，按照设定的不同速率流加营养物质。指数流加法：根据在发酵过程中，菌体的生长速率成指数增加的特点，营养物的流加速率也呈指数增加。1 5 重组蛋白的分离纯化1 5 1 重组蛋白质的特性分离方法的选择蛋白质分子是由数十个、数百个、甚至上千个各种氨基酸通过肽键连接起来，并以各自特殊的方式组合而成的生物高分子物质。随着肽键数目、氨基酸组成及排列顺序的不同，使形成不同的蛋白质大分子。具有完整空间构象的蛋白质分子，由于其所含氨基酸数量和空间排列方式的不同，从而使蛋白质具有不同的分子量和大小。又由于在构成蛋白质分子的二十种氨基酸中，许多氨基酸含有可解离侧链，如天冬氨酸上的1 3 c o o h 、谷氨基酸上的y c o o h 、组氨酸上的咪唑基、半肮氨酸上的s h 、赖氨酸上的a ) - n h 2 ，精氨酸上的胍基，此外还有末端氨基和末端羧基。这些可解离基团在不同p h 下表现不同的解离状态，使蛋白质分子带有电荷。因为蛋白质分子由许多氨基酸组成，所以它们的带电状态也千差万别，又因为蛋白质分子具有完整的空间结构，使得蛋白质分子表面的电荷排布也各不相同1 26 。虽然蛋白质都具有单链结构，但在分子大小和形状、极性和电荷、溶解度和密度上6第一章绪论仍会有所差异，因此，应用各种化学和物理化学方法，可以将它们分离。蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来【2 7 】。表1 - 3 蛋白质物化性质和分离纯化方法t a b 1 - 3p r o t e i np h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n di t ss e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d s1 5 2 重组蛋白分离纯化的特点重组蛋白质分离纯化的特点为：( 1 ) 大多数重组蛋白质产品是生物活性物质，在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液p h 值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。( 2 ) 重组蛋白质产品在物料中含量很低，且物料组成非常复杂。例如，利用基因工程菌发酵生产蛋白质，物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等，目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1 。有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体，为获取蛋白质，还需进行细胞破碎，结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。( 3 ) 含蛋白质产品的物料不稳定，蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。( 4 ) 很多重组蛋白质产品作为医药、食品被人类利用，因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的，产品无菌、无致热源等。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分：女i d n a 、r n a 等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、粒径分布宽，并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱。蛋白质种类多，性质差异大，且处于不同的体系中，因此，很难有一个固定的程序适用于各类蛋白质的分离工作，但对任何蛋白质分离需注意的共性问题是：( 1 ) 充分了解目的蛋白的物化性质；( 2 ) 纯化工艺应尽可能简单，分离步骤要尽可能少；( 3 ) 建立一个灵敏方便的目的蛋白检测方法；( 4 ) 尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性【2 8 】。1 6 本课题研究的意义和内容1 6 1 本课题研究的意义本课题组的窦文芳博士采用重叠p c r 构建了含有人g l p 1 二联体和h s a 的融合基因的表达载体p p i c 9 k ( g l p 1 a 2 g ) 2 h s a ，并将其转入pp a s t o r i sk m 7 1 菌株中表达，得到了有活性的融合蛋白，但表达量不高，限制了大规模的发酵生产。7江南大学硕士学位论文1 6 2 本课题的研究内容尽管已有多种外源蛋白在毕赤酵母中成功表达，但是不同的外源蛋白的表达量差异非常大，最高的可达2 2 9 l t 2 9 1 ，最低的只有l m l ，因此有必要对毕赤酵母工程菌高产菌株的选育及发酵条件进行摸索。本课题是在窦文芳博士研究的基础上电转选育高产菌株，并对其发酵条件进行优化，并通过发酵罐上过程控制，以期望获得高表达量，同时对目的蛋白的分离纯化条件进行研究，以获得高纯度的目的蛋白，为下一步药理、药代动力学及药剂学等方面的评价奠定基础。本文的研究内容主要包括以下几个方面：( 1 ) 将融合基因g g h 用不同的尸p a s t o r i s 宿主进行表达，以筛选到一株稳定的高表达菌株，并研究了基因剂量与融合蛋白g g h 表达量之间的关系。( 2 ) 从培养基、甲醇诱导方式、甲醇浓度及诱导温度等方面，分别考察工程菌5l发酵罐上的表达量，以摸索出既能获得高产量同时又能节约成本的发酵工艺。( 3 ) 摸索从发酵液中分离纯化g g h 融合蛋白的条件，以获得高纯度的目的蛋白并对其纯度进行鉴定。第二章不同宿主及基因剂量对融合蛋白g g h 表达的影响第二章不同宿主及基因剂量对融合蛋白g g h 表达的影响2 1 引言g s l l 5 、k m 7 1 和s m d l l 6 8 为甲醇酵母表达系统常用的宿主菌。不同的外源基因在不同的宿主菌中表达量有很大的差别，这方面的原因包括外源基因g c 含量，m r n a二级结构，密码子的偏爱性及基因剂量等。基因剂量对外源目的蛋白表达有重要影响【3 0 1 。许多实验表明：基因剂量对外源蛋白表达水平既有正效应，也有负效应。s r e e k r i s h n a 等【3 1 1 整合l 、1 0 和2 0 个肿瘤坏死因子( t n f ) 基因在毕赤酵母染色体上，重组n 师表达水平分别为0 0 5 、4 0 、1 0g l ，2 0 拷贝重组子表达水平是单拷贝重组子的2 0 0 倍；c l a r ej j ，r a y m e n tf b 等【3 2 】将1 4 个破伤风毒素片段c ( t e t a n u st o x i nf r a g m e n tc ) 基因串联后整合在毕赤酵母染色体上，表达水平比单拷贝重组子表达水平提高了6 倍；c l a r ejj ，r o m a n o sma 掣3 3 】将鼠表皮生长因子( m o u s ee p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，m e g f ) 基因连续整合了1 9个拷贝，表达水平提高了1 3 倍，如v a s s i l e v a 等【3 4 】采用g s l l 5 宿主菌，构建外源乙肝疫苗基因拷贝数为l 至8 个，在摇瓶培养时发现乙肝疫苗( h b s a g ) 表达水平明显与拷贝数成正相关。但拷贝数的增加并不总是能够增加外源蛋白的产量。如w a g n e rsl 等【3 5 】在重组毕赤酵母表达牛溶菌酶( b o v i n el y s o z y m e ) 由于基因拷贝数的增加，表达水平反而下降，从1 个拷贝的表达水平0 4 6g l 下降到3 个拷贝基因重组子0 2 5g l 表达量，基因剂量增加反而降低了牛溶菌酶的表达水平。而c o s 等1 3 6 】用毕赤酵母表达r o l 时发现：与单基因拷贝重组子相比，多拷贝重组子的r o l 表达产率和r o l 的单位细胞比产率反而下降，m u t + 和m u t - 型分别下降了3 0 和5 左右。可见，基因剂量对外源蛋白表达量的影响是个因素综合作用的结果。甲醇营养型毕赤酵母( m e t h y l o t r o p h i cp i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌等优点，已被公认是外源蛋白表达的一个优秀表达系统【3 7 】。目前，该表达系统已成功表达了近5 0 0 种外源蛋白，并且很多已经实现了大规模生产，如工程植酸酶、重组乙肝疫苗和重组人生长激素等【3 8 1 。但是不同的外源基因，不同的酵母表型以及不同的基因剂量对外源蛋白的表达水平有很大的影响。本章主要研究了融合蛋白g g h 在不同的毕赤酵母宿主中的表达，以及基因剂量对目的蛋白表达的影响。2 2 材料与方法2 2 1 材料2 2 1 1 质粒、菌株巴氏毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 宿主菌k m 7 1 ( m u t sh i s 4a r 9 4a o x l v ；s a r g 4 ) 、g s l1 5 ( m u t + h s 力、g s l1 5 ( m u t + h i s 4 ) 、s m d l1 6 8 ( m u t + h i s 4 p e p 4 ) 和毕赤酵母酵母分泌型表达质粒p p i c 9 k 均购自i n v i t r o g e n 公司，重组表达载体p p i c 9 k ( g l p 一1 a 2 g ) 2 - h s a 由本室构建保存。9江南人学l 学位论立囤2 - 1 表达栽体p pt c g i ( 结构示毒图f i g2 1t h e p t a y s i c a i m a po f p l 越m i dp p i c g k2 2 12 主要试剂质粒小量抽提试剂盒d n a 聚台酶、d n t p 、限制内切酶s a i lq - p c r 试剂盒丙烯酰胺( a c r )n n 甲叉双丙烯酰胺( b i s )四甲基二乙胺( t e m e d )过硫酸铵( a p s )三羟甲基氨甲烷( t r i s )考马斯亮蓝r 2 5 0酵母浸出粉胰蛋白胨上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司大连宝生物工程有限公司b b i 公司( 加拿大)b b i 公司( 加拿大)b b i 公司( 加拿大)b b i 公司( 加拿大)b b i 公司( 加拿大)a m r e s c o 公司( 美国)o x i d e 公司( 美国)o x i d e 公司( 美国)y n bb b i 公司( 加拿大)其余均为购自国药集团化学试剂公司分析纯试剂2 2 13 主要仪器设备恒温摇床江苏太仓试验设备厂第二章不同宿主及基因剂量对融合蛋白g g h 表达的影响紫外分光光度计超净工作台电热恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅2 2 1 4 培养基1 3 9 】u n i c o 公司产品苏净集团安泰公司上海精宏实验设备公司上海医用核子仪器厂l b 培养基( g l ) ：胰蛋白胨1 0 ，酵母提取物5 ，氯