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m p e g b p l a 共聚物的合成及载b s a 微球性能研究 专业：高分子化学与物理 硕士研究生；李晓杰 指导老师：全大萍副教授廖凯荣教授 摘要 生长因子的控制释放，已成为组织工程研究中一个关键课题。聚乳酸( p l a ) 类材料由于具有良好的生物相容性和可完全降解吸收性能，在药物控制释放体系 中有着特殊的优势。由于p l a 有较强的疏水性，在蛋白类药物控制释放应用中存 在着包封率较低，降解产物弱酸性导致蛋白失活等不足，因此对p l a 进行共聚改 性是目前研究的一个重要方向。聚乙二醇( p e g ) 无毒，具有优异的亲水性能， 在体内无免疫原性，最终可通过肾排出，是目前药物控制释放体系中普遍采用的 一类辅助材料，美国f d a 已批准其在体内使用。因此，设计合成分子链中含单甲 氧基聚乙二醇( m p e g ) 嵌段的p l a 类材料，通过改变单甲氧基聚乙二醇一b 一聚乳 酸嵌段共聚物( r i l p e g b p l a ) 中两者的相对含量和共聚物的分子量，可在一定 范围内调控材料的亲，疏水性和降解速率，进一步提高对生长因子这类蛋白的包 封率和控制它们的释放行为。主要内容如下： 以m p e g 作为大分子共引发剂，辛酸亚锡为催化剂，通过丙交酯( l a ) 开环 聚合，合成了系列预定结构的两亲性嵌段共聚物m p e g b p l a ，采用n m r 、i r 对其结构进行详细表征。以牛血清蛋白( b s a ) 为模型药物，采用双乳化溶剂挥 发技术( w ，o ，w ) 制备载药微球。通过考察微球制备过程中不同条件对载b s a 聚合物微球粒径和b s a 包封率等的影响，优化了实验条件。在上述优化条件下研 究了m p e g b p l a 两亲性嵌段共聚物的分子参数( m p e g 、p l a 分子量及相对含 量) 对载b s a 聚合物微球的粒径、微球表面形貌、b s a 包封率及b s a 体外释放规 律的影响。最后，以m - p e g s b - p l a 4 5 为基质材料制备载胶质细胞源性神经营养因 子( g d n f ) 微球，进行了恒河猴受损脊髓的修复实验。 巾山大学硕士学位论文 关键词：单甲氧基聚乙二醇一b 一聚乳酸共聚物( m p e g b p l a ) ；双乳化溶剂挥发 技术( w o w ) ；牛血清蛋白( b s a ) ；体外释放；神经营养因子( g d n f ) i i a b s t r a c t s y n t h e s i so fm p e g - - b - - p l ac o p o l y m e ra n d p r o p e r t i e so fb s a - l o a d e dc o p o l y m e rm i c r o s p h e r e s m a j o r ：p o l y m e rc h e m i s t r ya n dp h y s i c s n a m e ：x i a o j i el i s u p e r v i s o r ：d a p i n gq u a nk a i r o n gl i a o a b s t r a c t c o n t r o l l e dr e l e a s eo fg r o w t hf a c t o r si nt i s s u ee n g i n e e r i n gh a sa t t r a c t e d c o n s i d e r a b l ea t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s p o l y ( 1 a c t i ca c i d ) ( p l a ) h a sas p e c i a l a d v a n t a g e i nt h ec o n t r o l l e d d r u g d e l i v e r ys y s t e m b e c a u s eo fi t s g o o d b i o c o m p a t i b i l i t ya n db i o d e g r a d a b i l i t y ；h o w e v e r , t h ea p p l i c a t i o n o fp l ai nt h e c o n t r o l l e dd e l i v e r yo fp r o t e i nh a sb e e nl i m i t e dd u et oi t sh y d r o p h o b i c i t y ，l o wp r o t e i n e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c ya n dd e n a t u r i n gt h ep r o t e i n al o to fm o d i f i c a t i o n so np l a a f ef o c u s e do n i n t r o d u c i n gh y d r o p h i l i cs e g m e n t s i n t op l ac h a i n s u c ha s p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g ) ，w h i c hi st h ec o m m o n l yu s e dm e d i c a lm a t e r i a l ，a n d a p p r o v e db yf d ao fa m e r i c af o ri t so u t s t a n d i n gp r o p e r t i e s t oi m p r o v et h e e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yo fp r o t e i na n dt h er e l e a s eb e h a v i o r , i tm a yc h a n g et h er a t i o s o fp e gt op l ab l o c k sl e n g t hi nt h ec o p o l y m e r sa n dt h em o l e c u l a rw e i g h t so ft h e c o p o l y m e r s t h ed e t a i l sa r el i s t e da sf o l l o w as e r i e so fm o n o m e t h o x y lp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) 一b - p o l y ( d , l l a c t i ca c i d ) ( m p e g - b - p l a ) w e r es y n t h e s i z e db yr i n g o p e n i n gp o l y m e r i z a t i o no fl a c t i d eu s i n g m p e ga sam a c r o m o l e c u l a rc o i n i t i a t o ra n ds t a n n o u so c t o a t e ( s n ( o c t ) 2 ) a sac a t a l y s t t h e i rs t n l c m r e sa n dc o m p o s i t i o n sw e r ea p p r o v e db y1 hn m ra n di r t h e b s a 1 0 a d e dm p e g - b - - p l a m i c r o s p h e r e s w e r ef a b r i c a t e d b y w o w d o u b l e e m u l s i o ns o l v e n te v a p o r a t i o nt e c h n i q u eu s i n gb s aa sam o d e ld r u g i no r d e r t oh a v eah i g hb s a e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y ，t h ee x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r ss u c ha s i 中山大学硕士学位论文 t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ec o p o l y m e rs o l u t i o na n dt h er a t i oo fi n t e r n a la q u e o u sp h a s e v o l u m et o o r g a n i cp h a s ev o l u m ew e r eo p t i m i z e d a c c o r d i n g t ot h e o p t i m a l c o n d i t i o n s t h em o l e c u l a rp a r a m e t e r so fm p e g - b p l ac o p o l y m e r s s u c ha st h er a t i o s o fm p e gt op l ab l o c k sl e n g t hi nt h ec o p o l y m e r sa n dt h em o l e c u l a rw e i g h t so f c o p o l y m e r sw e r es t u d i e di nd e t a i lt h r o u g har e s p o n s eo ft h es i z eo fb s a l o a d e d m i c r o s p h e r e s ，s u f a c em o r p h o l o g yo fm i c r o s p h e r e s ，b s ae n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y a n dt h er e l e a s eb e h a v i o r nv i t r o f i n a l l y ，g d n f ( g l i a lc e l ll i n e d e r i v e dn e u r o t r o p h i c f a c t o r ) 一l o a d e d m p e g 5 一b p l a 4 5 m i c r o s p h e r e s w e r e p r e p a r e db y w o w d o u b l e e m u l s i o ns o l u t i o ne v a p o r a t i o nt e c h n i q u ea n dt h er e c o n s t r u c t i o no ft h e d a m a g e ds p i n a lc o r do fr h e s u sw a sp r o c e s s e d k e y w o r d s ：m p e g - b - p l ac o p o l y m e r , w o wd o u b l e e m u l s i o ns o l u t i o ne v a p o r a t i o n t e c h n i q u e ，b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，r e l e a s e nv i t r o ，g l i a lc e l l l i n e d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ( g d n f ) 材料，通过改变p l a p e g 嵌段共聚物的组成，调控材料亲疏水性，可在一定范 围内调控材料的降解性能及生长因子的释放行为。简单吸附难以对生长因子实行 有效的控制释放，喷雾干燥法所需设备较复杂昂贵，w o w 所需设备简单，操 作方便，包封率高，因此w o w 法是实验室通常采用的方法。 为此，本论文拟合成一种系列单甲氧基聚乙二醇b 聚乳酸嵌段共聚物 ( i n p e g b p l a ) ，亲水链段为单甲氧基聚乙二醇( m p e g ) ，疏水链段为聚乳酸 ( p l a ) 。利用两亲性聚合物容易形成胶束状微球的特点，采用( w o ) z w $ l j 备聚 合物微球。以b s a 为模型蛋白研究载药微球的载药性能及体外降解释放规律，并 深入讨论聚合物分子参数对微球性能及对b s a 控制释放规律的影响。 本论文具体拟进行如下工作： ( 1 ) 以m p e g 作为大分子共引发剂，辛酸亚锡为催化剂，通过对丙交酯 ( l a ) 开环聚合，合成了系列预定结构的m p e g b p l a 两亲性嵌段共聚物，并 对其结构进行详细表征。 ( 2 ) 以b s a 为模型蛋白，采用w o w n 各载药微球。通过考察微球制备过 程中各种条件对载b s a 聚合物微球粒径和b s a 包封率等的影响，优化实验条件。 ( 3 ) 研究了m p e g - 扫一p i a 两亲性嵌段共聚物的分子参数( m p e g 、p l a 分子 量及相对含量) 对载b s a 聚合物微球粒径、b s a 包封率、微球表面形貌、微球体 外降解规律及b s a 体外释放规律的影响。 ( 4 ) 制备载胶质细胞源性神经营养因子( g d n f ) 微球，研究其在脊髓损 伤修复中的应用。 本论文得到国家自然科学基金“组织工程中生长因子的控制释放”( 编号： 3 0 2 7 0 3 9 3 ) 、广东省科技攻关项目“功能化的组织工程支架材料的设计与构建” ( 编号：a 3 0 2 0 2 0 2 0 1 ) 和国家“8 6 3 ”计划“血管、神经化组织工程骨的研发与 临床应用研究”( 编号：2 0 0 3 从2 0 5 0 1 0 ) 的资助。 参考文献 1 l i p k i nr b o d i e si nm o t i o n ：s c i e n t i s t sb r i n ga n a l y t i c a lm o d e l st ob e a ro ns p o t s 1 3 前言 1 1 组织工程 第1 章前言 1 1 1组织工程的产生和定义 组织和器官的衰竭、损伤是最主要的临床医学问题，据估计全球每年有超 过1 0 0 万的患者需要进行整形修复手术修补组织缺陷，仅美国每年花在组织缺 损和器官衰竭的治疗费用超过4 0 0 0 亿美元，而全球人口老龄化带来的老年病 增多使这些问题更加突出。临床上对受损组织和器官的修复和治疗目前主要有 自体组织器官移植、异体组织器官移植、异种组织器官移植、人工替代物、医 疗器械和某些情况下的药物治疗。白体组织器官移植的最大优点是可以避免免 疫排斥，然而这种“以伤养伤”的治疗方法不仅供源有限，而且会造成患者更 多的损伤。异体组织器官移植虽增加了人体组织和器官的供应来源，但同样也 存在供应来源不足的问题，同时异体间的免疫排斥常常引起移植最终失败。异 种组织器官移植虽然可以完全解决组织器官的供应来源问题，但异种组织和器 官问的组织相容性问题使移植体难以存活。人工替代物由人工合成制备，可以 无限制地大批量生产，解决了供源问题，但存在组织相容性问题。医疗器械不 能替代组织和器官的所有功能，不能很好地修复组织和器官的主要缺陷，使患 者早日康复。可以认为，至今临床上还没有一个十全十美的方法可以真正解决 受损自治和器官的修复问题。 为此，1 9 8 7 年b r a h 和b i o t e c h 两个项目的主管在一次美国国家基金会 ( n s f ) 召开的会议上，提出组织工程的概念，1 9 8 8 年，n s f 的一个专门工作小 组对组织工程的内涵作了界定【2 。 组织工程学的基本原理和方法是1 3 】：将体外培养的高浓度组织细胞，吸附扩 增于一种生物相容性良好并可被人体逐步降解吸收的生物材料上，形成细胞一生 物材料复合物。然后将此细胞一生物材料复合体植入机体组织病损部位。种植的 细胞在生物支架逐步降解吸收过程中，继续增殖并分泌基质，形成新的具有与自 身功能和形态相应的组织和器官。这种具有生命力的活体组织能对病损组织进行 形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。 中山大学硕士学位论文 1 1 2组织工程的关键问题 从材料科学与工程的观点可以把组织看作细胞复合材料【4 ，它由细胞及其 合成的细胞外基质( e c m s ) 组成。细胞指导e c m s 的合成，e c m s 提供细胞所 需要的力学和化学信息，正常组织的e c m s 中含有生长因子，它通过e c m 以 适宜的浓度在精确的时问内释放，对细胞的迁移、分化和增殖提供化学信息。 因此，组织工程研究中的三大要素为：种子细胞，生长因子，支架材料( 即外 源性的e c m s ) 。 1 1 2 1 种子细胞 细胞是生命体的基本单元，它们通过自组装形成组织，不同的多种组织群 集团化成为器官。用于体外构建工程组织、器官的细胞需满足以下三个基本前 提【5 】：具有特定的分化表型或定向分化潜能；可靠的细胞来源：不引发移植排 斥反应。目前用于体外构建工程组织、器官的细胞按其来源分为自体细胞、同 种异体细胞和异种细胞和干细胞。其中自体细胞存在来源严重短缺的限制；同 种异体细胞存在着来源受限和移植排斥反应的问题；异种细胞同时存在移植排 斥反应、传染动物源性病毒和伦理的制约。干细胞是作为组织工程种子细胞最 有前途的一种。 干细胞【6 1 是一种具有无限或长期的自我更新能力( 指这种细胞经过数次有 丝分裂后，基本上仍然保持亲代细胞原有特性，即自我复制) ，至少可向一种成 熟功能细胞分化的细胞群体。这种自我更新能力维持于正常机体的全部生命时 间。一船而言，干细胞的分化具有定向性，不同组织细胞有其特定的于细胞。 根据细胞功能可将于细胞分为全能干细胞、多向干细胞和定向干细胞。前者即 为胚胎干细胞( e s 细胞) 可以向包括生殖嵴在内的所有组织分化。定向干细胞 具有向一种组织分化的能力，如造血干细胞向造血细胞分化，间充质干细胞向 骨、软骨、脂肪等间充质细胞分化。多向干细胞是一种在级系关系上介于e s 细胞与定向干细胞、可以向多种组织分化的于细胞，目前人们称谓的成体干细 胞属于此种类型。干细胞的研究进展为从根本上解决制约组织工程的细胞问题 提供了可能。 前言 1 1 2 2 生长因子 生长因子( g r o w t hf a c t o r ，g f ) 是一类具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存 活等生物效应的多肽类物质，是组织工程研究中不可忽视的重要影响因素之一， 其对细胞增殖、组织或器官的修复、再生具有重要的促进作用，甚至微克级或皮 克级的生长因子也能发挥明显作用。如今被研究及使用的生长因子主要有内皮生 长因子口 t e c g f ) 、血小板源性生长因子 8 。1 0 ( p d g f ) 、成纤维生长因子 i t - 1 2 1 ( f g f ) 、 神经生长因子( n g f ) 、转化生长因子盼1 8 1 ( t g f _ - d ) 、骨形态发生蛋白1 9 - 2 1 ( b m p ) 、 类胰岛素生长因子盼2 5 1 ( i g f ) 、骨衍生性生长因子( b d g f ) 肝细胞生长因子 2 6 - 2 7 1 ( h g f ) 、血管内皮细胞生长因子 2 8 - 2 9 1 ( v e g f ) 、表皮生长因子 3 0 - 3 1 1 ( e g f ) 、神 经胶质生长因子( g g f ) 、软骨调节素一l ( c h m - - 1 ) 、角朊细胞生长因子( k g f ) 等。 生长因子在体内的半衰期大约是数秒至数分钟，很容易失去生物活性，有的 甚至不能在溶液中稳定存在。如若直接对人体使用生长因子粉末或溶液，很容易 使之在生理环境下迅速失活，而达不到预期的生理效应。因此，如何在体内环境 下保持并延长生长因子的生物活性，是生长因子能否真正在临床发挥作用的关键 所在。药物控制释放技术是使生长因子能在体内环境下仍然保持生物活性并且实 现长期有效释放的唯一途径。生长因子控制释放的原理是采用生物降解性高分子 为保护材料，对生长因子实行基体式包埋或微囊化包裹，利用高分子保护材料防 止生长因子直接与主体的生理环境相接触，从而达到保护生长因子在机体内仍然 保持生物活性的目的。 生长因子应用于组织工程中，可采用将生长因子包封后直接注入体内或者将 包封生长因子的复合物负载于三维支架中等多种途径。第一种应用方式一般是通 过改变网状内皮系统的吞噬模式，以延长药物在血液中的驻留时间来实现的。有 时，也可通过对药物释放体系的粒径控制或表面修饰，使药物在病体组织和器官 得以富集来实现。对于生长因子这类生物活性药物释放体系的药物载体材料要求 一般很高，有时不仅要求材料必须能在体内降解以防在体内器官和组织中的累 积，而且还需要材料具有抗凝血性以防引起血栓。此外对只在血管内应用的释放 体系，其尺寸要求更高，要求药物制剂的颗粒粒径在某一范围之内( 往往是纳米 级的微粒) ，否则也易形成血栓。 中山大学硕士学位论文 1 1 2 3 支架材料 组织工程的核心为建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的 活体组织，用来对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代3 2 t3 3 1 。 支架材料起到细胞外基质的作用，是对细胞外基质的结构和功能的仿生。其具体 作用主要如下眦3 5 1 ： ( 1 ) 支架材料的结构和形貌控制再生组织的结构、尺寸和形貌，作为连接 细胞和组织的框架，引导组织生长成特定形态。 ( 2 ) 作为信号分子的载体，将其运送到缺损部位，并作为缓释体使诱导因 子缓慢发挥作用。 ( 3 ) 作为组织繁殖分化和新陈代谢的场所，为细胞生长输送营养，排除废 物。 ( 4 ) 支架表面特殊位点与组织起特异性反应，对不同类型细胞起“身份鉴 别”及选择黏附的作用。 ( 5 ) 起到机械支撑作用，可以抵抗外来的压力，并维持组织原有的形状和 组织的完整性。 ( 6 ) 支架材料还可以作为活性因子的载体，可以用来承载一些生物活性物 质，如生长因子，为细胞的生长、分化和增殖提供养分。 除了符合一般生物医学材料的要求外，组织工程学所需的理想支架材料还需 满足以下要求3 7 1 ： ( 1 ) 良好的生物相容性，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会 因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能。 ( 2 ) 可降解性及合适的降解速率，当移植的细胞或组织在受体内存活时， 支架材料可自行降解，降解吸收速率能与细胞、组织生长速率相匹配。 ( 3 ) 合适的孔尺寸、高的孔隙率和相连通的孔形态，以利于大量细胞的种 植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄 以及血管和神经的内长入。 ( 4 ) 高的表面积、合适的表面理化性质和良好的细胞界面关系，以利于细 胞黏附、增殖、分化以及负载生长因子等生物信号分子。 ( 5 ) 与植入部位组织的力学性能相匹配的结构强度，以在体内生物力学微 4 环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提供合适的微应力环境。 ( 6 ) 便于加工成理想的二维或三维结构，可以获得所需的组织或器官形状， 易于重复制作，而且移植到体内后能保持原有形状。 常用的组织工程支架材料有如下三大类： 天然高分子支架：蛋白质支架3 8 3 9 1 ( 如胶原、明胶海绵、丝纤维基材) ，多 糖支架4 0 ，4 1 1 ( 如海藻酸盐、壳聚糖) ，蛋白质一多糖支架，珊瑚及其衍生物1 4 2 ，4 3 1 。 合成高分子支架：聚酯类 4 4 - 4 6 1 ( 如聚乳酸( p l a ) ，聚羟基乙酸( p g a ) ，聚( 乙 交酯一丙交酯) ( p l g a ) ，聚己内酯( p c l ) ) ，氨基酸类聚合物4 7 1 ( 如聚( 一 羟基酸a 一氨基酸) ) ，聚乙二醇【4 8 l ( p e g ) 。 生物陶瓷支架4 9 ，5 0 】：羟基磷灰石( h a ) ，生物活性玻璃，玻璃陶瓷，羟基 磷灰石b 一磷酸三钙( h a j 3 一t c p ) 。 1 2 应用于组织工程中生长因子控制释放的载体材料 1 2 1基本性能要求 作为生长因子控制释放的载体材料首先必须满足如下性能要求1 ： ( 1 ) 具有生物相容性、可完全降解吸收性和细胞相容性，即载体高分子在 体内最终完全降解为小分子碎片被机体吸收或被机体排泄。 ( 2 ) 高分子的降解产物必须无毒和不产生炎症反应。 ( 3 ) 高分子的降解速率易于调控。 1 2 2常用载体材料 1 2 2 1 天然高分子 天然高分子材料主要有明胶、胶原、环糊精、纤维素和壳聚糖等。当天然高 分子不能完全适合应用的要求，常采用化学和酶改性的方法。天然材料的优势在 于它们来源丰富，价格便宜，含有有利于细胞吸附或维持不同功能的物质( 如特 定的蛋白质) ，但是天然材料重现性差、不能大批量生产，同时异种移植的问题以 及可能会带来不可预计的异种生物携带的病毒基因限制了这类材料的应用。 1 2 2 1 1明胶 s 中山大学硕士学位论文 明胶是从动物的皮、白色连结组织、骨所获得的胶原在经部分水解后得到的 产品。其主要成分是蛋白质，水解后的产物为氨基酸。明胶常为浅黄色或琥珀色 半透明固体，易碎，在干燥空气中稳定，但在受潮或溶液状态时易被微生物分解。 在冷水中不溶，浸于水中会膨胀变软，可吸收本身质量5 1 0 倍的水；但是能溶 于热水，形成的水溶液冷却后则成凝胶。明胶还可溶于醋酸，但是不溶于如乙醇、 乙醚、氯仿等其他有机溶剂。 由于明胶有受热变形的行为，因此用明胶制备微球时必须通过化学交联使其 稳定。最常用的交联剂是戊二醛，可以通过将戊二醛加到明胶乳液中制得明胶微 球。微球的大小和形态可以通过调节乳化时超声波功率的大小予以控制 5 ”，而交 联度可通过控制戊二醛的用量予以调节。但明胶不易降解，特别是交联后的明胶 微球降解性能较差，限制了它在组织工程中的应用。 1 2 212甲壳质和壳聚糖 甲壳质( c h i t i n ) 广泛存在于有外壳的贝类生物、真菌、昆虫、环节动物、 软体动物和腔肠动物等低等动物。甲壳质经脱乙酰化处理，即可得到脱乙酰壳聚 糖，一般认为脱乙酰度5 0 为壳聚糖( c h i t o s a n ) 。其分子链结构为聚一9 ( 1 ，4 ) 一2 一 氨基一2 一脱氧一9 一d 一葡聚糖，在酸性介质中壳聚糖分子含带正电的n h ，+ ，常通过与 带负电荷的物质( 多聚磷酸盐、藻酸盐、硫酸辛酯等) 作用形成包封生长因子的 微球。由于制备这类微球条件较温和，不必使用有机溶剂，在生长因子的负载中 有很好的应用前景。 s u n g s ，1 等以三聚磷酸钠为沉淀剂制备了载b s a 和t g f b 1 壳聚糖微球，在p b s 缓冲溶液中，缓慢释放5 天，取得良好的缓释效果，t g f - 9 1 的释放速度远小于 b s a 。同时将载t g f 9 1 壳聚糖微球植入壳聚糖的多孔支架，明显促进了细胞的 分化和增殖。 m i t t a l t “i 等以藻酸盐为沉淀剂制备了载b d n f 的壳聚糖微球，并用生物学方法 检测释放出来的b d n f 仍然具有生物活性，证明以壳聚糖为载体材料对生长因子 进行包封能很好地保持生长因子的活性。 1 2 2 13 藻酸盐 6 前言 藻酸盐是一种从褐藻中提得的海藻酸，在用稀碱处理、精制后所得到的阴离 子型聚多糖类碳水化合物，它是由d - 甘露糖醛酸和上广古洛糖酸组成的共聚物。藻 酸盐微球包裹的性质与其化学组成关系密切，尤其是d 一甘露糖醛酸和l 一古洛糖酸 两种成分的含量比。一些研究者发现，含有较高的甘露糖醛酸含量的藻酸盐，具 有免疫激活性，而含有较高古洛糖酸的藻酸盐则具有免疫抑制活性。 将海藻酸钠溶液滴加到含c a 2 + 或z n 2 + 等二价阳离子的溶液中，可形成微球。 这种微球常用于生长因子的包封。 p e t e r s 等嗍用海藻酸钠和碳酸钙制备载v e g f 的藻酸盐微球，结果发现在内皮 细胞培养中，这种控释的v e g f 刺激细胞生长的能力比同样量的v e g f 直接加入 培养基中的刺激能力更强。 e l c i n 等”6 l 用海藻酸钠和氯化钙制备载v e g f 的藻酸盐控释微球，研究它对促 进大鼠模型皮下位点局部新血管形成的作用。标本免疫染色表明该v e g f 控释系统 能促进新血管生成。 1 2 2 2 合成高分子 合成高分子是指通过化学合成方法或生物合成方法合成的高分子化合物。与 天然高分子相比，合成高分子的种类更多、品质的重复性更好、性能更易于调节 和控制，因而综合性能相对也更为优良和全面，具有更为广泛和重要的应用。合 成高分子可分为生物可降解和生物不可降解高分子两大类。在组织工程中常用作 包封生长因子的合成高分子主要有聚羟基羧酸酯和聚磷酸酯。 1 2 2 2 1聚羟基乙酸( p g a ) 及其共聚物 p g a 是由乙交酯( g a ) 开环聚合制得的高分子量聚合物。它分子结构完整， 属结晶性高分子结晶度为4 6 5 2 ，熔点为2 3 0 ，r g = 3 6 ，不溶于一般 的有机溶剂，仅溶于六氟异丙醇，因此加工困难，只能在高温下熔融纺丝成纤维。 鉴于此原因，纯的p g a 不适宜于作为药物载体，通常应用的是p g a 的共聚物。 聚乳酸( p l a ) 通常由丙交酯( l a ) 在催化剂作用下开环聚合制得。p l a 分子 中含一个不对称的碳原子，因此存在两种光学异构体，右旋聚乳酸( d p l a ) 和左 旋聚乳酸( l - p l a ) ，等量的d p l a 和l - p l a 混合后可形成外消旋构型的聚乳酸d 中山大学硕士学位论文 l - p l a ，另一种是内消旋构型，具有实际应用意义的聚乳酸是l ，p l a 和d j 上广p 乙a ： l - p l a 是结晶性高分子，分子链规整。结晶度为3 7 左右，熔点约1 8 0 ，t g = 6 0 6 2 ，降解速度较慢。d ，l p l a 为非晶态结构，t g = 5 8 6 0 ，常用作生 长因子的控制释放材料。但p l a 用于临床的过程中发现患者出现非特异性无菌性 炎症反应率较高，目前认为出现无这种现象的原因可能与聚合物降解过程中酸性 降解产物引起局部p h 值下降有关【5 ”。 聚乳酸的降解速率较慢，将高、低分子量的聚乳酸混合，可在一定范围内调 整其降解速率。g r a n d f i l s t 5 8 1 等将分子量为6 5 0 0 0 ( a ) 和3 5 0 0 ( b ) 的聚乳酸按不同质量 制备微球，纯a 在1 个月降解5 ，当m a m b = 2 5 7 5 时，混合物在1 个月降解3 0 。 聚( 羟基乙酸一乳酸) 共聚物( p l g a ) 是由丙交酯( l a ) 与乙交酯( g a ) 共聚 而成，目的是为了改善p g a 的溶解性能和加工性能。通过改变两种单体的比例， 可在一定范围内调控共聚物的降解速率。当p l g a 中g a 组分的摩尔比例下降到5 0 以下就可溶解于一般的有机溶剂。 l o r e n z 等例以p l g a ( 5 0 ：5 0 ) 为包封材料，采用双乳化溶剂挥发技术 ( w o w ) 制备载类胰岛素生长因子( i g f ) ，并将这种载生长因子的微球用于8 h i m 钻孔干骺端软骨和1 0m i l l 裂缝缺陷胫骨的修复，3 周时，8m m 钻孔干骺端软骨有 新骨出现，8 周时，裂缝缺陷胫骨有新骨出现。 k i m b e r l e y 等以p l g a ( 5 0 ：5 0 ) 为包封材料，采用w o t w 制备载c a 微球( c a 是能诱导p 1 9 细胞分化成神经细胞的一种生物活性物质，p 1 9 细胞是由早期胚胎细 胞衍生出的一种多功能干细胞) ，微球粒径在8 0 岬左右，c a 的包封率为4 7 ，c a 的含量为0 1 1 。体外释放实验表明，在开始的1 9 5 时，c a 释放2 5 ，4 天后，释 放5 5 。当将p 1 9 细胞种植在载c a 的p l g a 微球上时，由载c a 微球释放的c a 明显 促进p 1 9 细胞的分化。 聚乳酸类材料由于其疏水性太大，对亲水性生长因子的包封率通常较低，容 易造成生长因子的聚集而失活。因此常引入亲水性物质( 物理共混或者化学结合) 以期改善载体材料的亲水性。同时，亲水性物质的引入还可以调整载体材料的降 解速率m 】。化学结合的方法效果更佳，尤其是单甲氧基聚乙二醇一b 一聚乳酸两亲 性嵌段共聚物( 1 1 1 p e g b p l a 或m p e g b p l g a ) ，能在更温和的条件下形成小粒 径的载生长因子微球，其壳核结构( 亲水链段m p e g 为壳，疏水链段为p l a 或 前言 p l g a ) 特别适宜于生长因子的包封和保护，成为现阶段载体材料的研究热点。 f w u 等旧以p l g a 和壳聚糖为载体材料，牛血清蛋白( b s a ) 为模型蛋白， 考察了壳聚糖的加入对载b s a 混合物微球对包封率和b s a 释放的影响。实验结果 表明壳聚糖的加入能提高b s a 的包封率并加快b s a 的释放，l a g a 越小，释放速 率越快。 t i m o t h y 等【6 3 以p l g a ( 5 0 ：5 0 ) 和5 含量的聚7 , - - 醇( p e g ) 混合物为载体材料 ( 在3 0 天内基本降解完全) ，采用固体包封单乳化溶剂抽提法制各载血管内皮 生长因子( v e g f ) 微球。在微球制备过程中，采用将b s a 与v e g f 共包封的方 法对v e g f 活性进行保护。得到粒径为5 0u m 左右的载生长因子微球，用体外 h u v e c 增殖法对所释放的v e g f 进行活性检测，在4 天和6 天时，细胞分化数目明 显增加。在体外释放实验中，经过开始的暴释后，在接下来的2 8 天，v e g f 的释 放量在生理活性范围内。 y a p i n g 等删以i n p e g b - p l g a 嵌段共聚物为载体材料，b s a 为模型蛋白，采 用w o w s u 备载b s a 微球，在体外释放7 天时，载b s a 的m p e g b p l g a 微球释 放了7 0 ，而载b s a 的p l g a 微球仅释放了5 0 。 a n a 等 6 5 1 以m p e g b p l a 两嵌段共聚物为载体材料，采用w o w $ 0 备载 p c m v 1 3 g a l ( 一种质粒d n a ) 微球，得至1 8 9 1 的包封率。通过鼻腔注入老鼠体内， 在2 4 小时内，血液中药物浓度是p l a 载药微球的4 倍。 1 2 2 2 2聚磷酸酯类 聚磷酸酯“8 1 是一种生物相容性好、结构较易进行修饰和功能化的生物降解 高分子。其合成方法有开环聚合和磷酰缩聚，前者常用二氧五环磷酸酯或二氧六 环磷酸酯均聚或者与丙交酯等进行共聚，后者常用磷酰二氯和含双活性氢基团 ( 羟基或氨基) 的化合物进行缩聚。 x u 等删以聚磷酸酯( p p e ) p ( d a p e e o p ) 为包封材料，采用w o w 对b s a 和神经生长因子( n g f ) 进行包封，当b s a 含量为8 时，包封率在6 6 左右，比 p l g a ( 5 0 5 0 ) 高。在第一周释放4 5 ，第1 0 周释放6 0 。在n g f 的体外释放实验中， 以p c 一1 2 法检测所释放的n g f 的活性，连续1 0 周都能检测到活性n g f 的释放。 x u 等【7 0 1 以p p e 为包封材料，采用w ，o ，w 制备载n g f 微球，并将微球植入聚磷 9 中山大学硕士学位论文 酸酯导管用以修复有1 0 n l l n 缺口的老鼠坐骨神经，三个月后，取得了良好的修复 效果。 多聚磷酸酯和聚膦酸酯带有活性侧链，允许具有生物活性的生物大分子连接 到聚合物上，从而增加了改变聚合物物理化学性质的自由度，因此是一类很有前 途的生长因子包封材料。 1 3 生长因子的包覆技术 1 3 1吸附法 组织工程中生长因子最简单的包覆技术是在种植前将种植体浸入生长因子 的溶液中吸附所需的生长因子，或通过真空副压吸附。研究证明，采用吸附法固 定的转化生长因子( t g f 一1 3 ) 能提高种植体周围间隙的骨形成能力，以及促进骨 组织长入多孔涂层”1 。7 ”；吸附于种植体表面的碱性磷酸酶也能增强种植体周围的 骨形成”。然而，这种方法中生长因子通过微弱的物理吸附力固定于种植体表面， 随后，依据种植体周围微环境( 不同的种植部位、不同的患者) 的不同，以一种无 控制的方式从种植体表面释放出来。其明显的缺点是生长因子的固定释放以及 定位难以进行有效的控制，我们仍然要寻找更合适的生长因子固定方法。 1 3 2 双乳化溶剂挥发技术( w o w ) 采用药物缓释技术将生长因子包封保护后再应用是一个有效的途径。通常采 用的方法是w o w 。其操作过程一般如下：在搅拌下将生长因子的溶液滴加到 聚合物溶液中，经过超声形成初乳液，再在搅拌下将初乳液滴加到含表面活性剂 的水溶液中，当溶剂挥发后就形成包封生长因子的聚合物微球，通过离心，洗涤， 冷冻干燥，就得到所需的载生长因子的聚合物微球。 在这种方法中，微球形成经历三个阶段陋7 q 即液滴的形成、液滴的稳定及液 滴的硬化。液滴的形成是通过机械搅拌或超声波处理等方式将聚合物溶液在稳定 剂溶液中分散成一定大小的液滴；液滴形成后外水相中的表面活性剂吸附于液滴 表面，阻止液滴相互间的聚结，达到稳定液滴的目的；最后稳定后的液滴通过溶 剂蒸发或溶剂萃取硬化成微球。 “等m ，” 以m p e g b p l g a 两嵌段共聚物为载体材料，采用w o w 制备了载 1 0 外膜蛋白( o m p ) 的微球，并探讨了制备条件对微球粒径、包封率及体外释放 的影响。 p e a n 等删以p l g a 为载体材料，采用w o w 对神经生长因子( n g f ) 进行包 封，并研究了内水相体积、有机相浓度和内水相中是否有表面活性剂( 甘露醇) 等对n g f 包封率的影响，小的内水相体积并加入表面活性剂会提高n g f 包封率。 y a n g 等唧1 以p l g a ( 6 5 ：3 5 ) 和p e g 的混合物( m p l g a m p e g = 9 5 5 ) 为载体材料， 采用w o w 对b s a 进行包封，并研究了温度对包封率和体外释放速率的影响，当 温度为4 时所得到的包封率最高( 5 2 ) ，且在体外释放中初始暴释量最低 ( 1 8 8 ) 。 在微球的制备过程中，由于有机溶剂的存在和剪切力的作用，生长因子很容 易失去活性；而在生长因子的释放过程中，由于p l a 类聚酯降解产生的酸性微环 境，也容易使生长因子失活。为了保持生长因子的活性，国内外学者进行了很多 研究。 j e f f r e y 等4 ”以p l g a 为载体材料，通过w o w 对重组人体生长激素( r h g h ) 进行包封。研究表明包封前将r h g h 和甘露醇复合有利于r h g h 活性的保持。l i 等 m 1 以同样的材料和方法包封d n a 时，先用c a c l 2 和h b s ( n a c l ，k c i ，n a 2 h p 0 4 2 h 2 0 ， 葡萄糖等的混合物) 对d n a 进行处理，形成c a p i d n a 。结果表明d n a 在p l g a 微球中的稳定性得到很大提高，体外释放实验中，初始暴释率小于7 5 ( 前2 4 h ) 。 k a n g 等田1 以p l g a 为包封材料，b s a 为模型蛋白，研究了三种赋形剂( 甘露 醇、羟丙基一8 一环糊精和十二烷基磺酸钠) 对b s a 稳定性的影响，结果表明，羟 丙基一b 一环糊精对b s a 稳定的效果最好。 k a n g 等 8 4 1 d f l , m g ( o h ) 2 和蔗糖为赋形剂，研究其对p l g a 植入体h 6 b s a 稳定性 和释放特性的影响，结果表明，二者都促进p l g a 的吸水性，加快b s a 的释放速 率，增j j l l b s a 的稳定性，m g ( o h ) 2 对稳定性增加效果更好，它们认为是由于 m g ( o h ) ：的碱性起到中和p l g a 为环境的酸性的作用 m a n i s h 等4 ”以p l g a 为包封材料，研究了p e g 化对b s a 稳定性的影响。在包 封前，以m p e g 对b s a 处理形成共轭化的m p e g b s a 复合物。结果表明，p e g 化 对b s a 的稳定性有很大提高( 未处理的b s a 有6 3 聚集，处理过的仅有1 8 聚集) ， 并且p l g a 微球表面吸附的b s a 含量大大降低。 中山大学硕士学位论文 m i c h a e l 等【8 6 1 以p l g a 为包封材料，以重组人体红细胞生成素( e p o ) 为模型 蛋白，研究了b s a 对e p o 稳定性的影响。研究表明采用b s a 为添加剂，能得到聚 集体在1 以下的载e p o 微球，且包封率达n 8 6 。 用w o w , ! j 备在生长因子聚合物微球，工艺流程简便，可操作性强，微球 的特性主要受聚合物的类型、溶剂类型、溶剂挥发速率、稳定分散剂的类型和浓 度以及硬化速率等因素的影响，综合考虑以上因素可以制各得到理想的微球。 1 3 3