（耳鼻咽喉科学专业论文）人血管内皮生长因子受体3胞外13区基因的表达.pdf

目的 人血管内皮生长因子受体一3 胞外卜3 区基因的表达 摘要 1 血管内皮生长因子受体3 基因的原核表达载体构建 2 血管内皮生长因子受体一3 基因的原核融合表达 方法 以本实验室构建的克隆质粒为模板，设计合适引物，在上游引物中加入酶切位点和起 始密码，在下游引物中加入终止密码和酶切位点，把上述v e g f r 3 扩增产物经切胶回收纯 化后与p b v 2 2 0 质粒经双酶切纯化后的产物连接，把该质粒命名为p b v 2 2 0 一v e g f r 3 ，转化大 肠杆菌d h 5a ，筛选出阳性菌株，温控诱导表达，超声破菌，对包涵体进行洗涤纯化以 p b v 2 2 0 v e g f r 3 为模板通过p c r 方法构建c 端含有h i s t a g 的p b v 2 2 0 v e g f r 3 h i s 质粒 并转化大肠杆菌d h 5q ，用w e s t e r n b l o t t i n g 鉴定，用n i 2 + - n r i a 树脂柱对表达产物进行纯化。 结果 构建了p b v 2 2 0 一v e g f r 3 质粒表达载体，s d s p a g e 电泳表明在大肠杆菌d h 5 中 成功表达出v e g f r 3 因子，同时构建了p b v 2 2 0 - v e g f r 3 融合表达载体，s d s p a g e 电泳 和w e s t e r n b l o t t i n g 结果表明在大肠杆菌d h 5 中成功表达出v e g f r 3 融合蛋白，用 n i 2 + _ n t a 树脂柱纯化后获得v e g f r 3 融合蛋白纯品。 结论 应用基n i 程技术，成功构建了p b v 2 2 0 一v e g f r 3 质粒表达载体，表达纯化出蛋白， 为进一步的研究奠定了基础。 关键词 人血管内皮生长因子受体一3 ，蛋白表达，融合 e x p r e s s i o no fh u m a n v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r3e x t r a c e l l u l a rd o m a m1 - 3 m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：c a o j i n g d i r e c t o r ：p r o f e s s o rw a n g b i n q u a n m a j o r ：o t o l a r y n g o l o g y d e p a r t m e n to f t h e f i r s th o s p i t a lo fs h a n x im e d i c a lu n i v e r s i t y o b j e c t i v e ： a b s t r a c t 1 ：t oc o n s t r u c tt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro f h u m a nv e g f r 3 2 ：t oe x p r e s st h ef u s i o np r o t e i no fh u m a nv e g f r 3 m e t h o d ： w ed e s i g n e dp r o p e rp r i m e r t h ep m d i8 t - v e g f r 3w h i c hc o n s t r u c t e dp r e v i o u s l yb yo u r l a b o r a t o r yw a su s e da st e m p l a t ea n da m p l i f i e dw i t hu ps t r e a mp r i m e rc o n t a i n i n ge c o ris i t ea n d d o w ns t r e a mp r i m e rc o n t a i n i n gb a m his i t e a f t e rc o l l e c t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，w es u b c l o n e dt h i s p c r p r o d u c ti n t op b v 2 2 0a n dt r a n s f o r m e dec o l id h5 t h ep o s i t i v eb a c t e r i aw a ss e l e c t e d a n di n d u c e da t4 2 t h eb a c t e r i aw a sb r o k e nb yu l t r a s o n i c a t i o n t h ei n c l u s i o nb o d yc o n t a i n i n g t a r g e tp r o t e i nv e g f r 3w a ss e p a r a t e da n dw a s h e d a l s ow e c o n s t r u c t e de x p r e s s i o np l a s m i do f v e g f r 3f u s i o np r o t e i nw i t hh i st a gb ya d d i n ge n c o d i n gs e q u e n c eo fs i xc o n s e c u t i v eh i s t i d i n e t od o w ns t r e a ms p e c i f i cp r i m e r t h ei n t e r e s t i n gf u s i o np r o t e i nw a si d e n t i f i e db yw e s t e r n b l o t t i n g w i t hh i st a ga n t i b o d ya n dp u r i f i e db yn t a - n i ”r e s i o n r e s u l t ： t h ep b v 2 2 0 - v e g f r 3e x p r e s s i o np l a s m i dw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y t h et a r g e tp r o t e i n v e g f r 3c a i le x p r e s sa si n c l u s i o nb o d yi ne c o l id h5d m e a n w h i l ew ec o n s t r u c t e dv e g f r 3 f u s i o ne x p r e s s i o ns y s t e ma n dt h r o u g hn t a n i 2 + r e s i o nw eo b t a i n e dp u r i f i e dv e g f r 3f u s i o n p r o t e i n c o n c l u s i o n ： a p p l y i n gt e c h n o l o g yo fg e n e t i ce n g i n e e r i n g ，w ec o n s t r u c t e dp b v 2 2 0p l a s m i d a l s ow e o b t a i n e dv e g f r 3f u s i o np r o t e i nw i t hh i g hp u r i t y k e yw o r d s ：v e g f r 3 ，e x p r e s s i o np r o t e i n ，f u s i o n v 月u舌 头颈部鳞状细胞癌是一类恶性程度较高的肿瘤，在全世界肿瘤发病中位居第五，多 循淋巴道转移，给治疗段预后带来困难。目前认为头颈鳞癌( h e a d - n e c ks q u a m o u sc e l l c a r c i n o m a ) 中淋巴结转移的存在是最独立的预后因子1 2 j ，如何抗喉癌淋巴转移就成为研究的 热点。 随着淋巴管生成因子和淋巴内皮特异性标记物的相继发现，肿瘤的淋巴道播散己在动 物模型实验研究中得到证实。目前公认的淋巴管生成因子为v e g f c 和v e g f d ，它们属 于生长因子v e g f 家族。v e g f 家族成员发挥其生物学效应，均须与相应受体结合，因此 对受体的研究具有重要意义。v e g f c 和d 均可与其特异受体v e g f r - 2 、3 结合，发挥相 应的作用。动物模型研究结果表明，二者能结合到其位于淋巴管内皮细胞上的受体 ( v e g f r 3 ) ，继而诱导毛细淋巴管的增殖和生长，促进肿瘤内淋巴管的生成，从而发生 淋巴结转移口4 1 。v e g f r 一2 及v e g f r 一3 属于酪氨酸蛋白酶激酶受体( r e c e p t o rt y r o s i n e r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e s ，r t k s ) 家族。其中血管内皮生长因子受体3 ( v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r3 ，v e g f r - 3 ) 又称f m s 一样酪氨酸激酶4 ( f i n s l i k et y r o s i n ek i n a s e4 ， f l t - 4 ) ，表达于多种肿瘤组织中，在肿瘤淋巴管生长和转移的病理和生理过程中起着重要 的调节作用【5 ”。f i t 4 的特异配体即v e g f c 、v e g f d 结合到f l t 4 的胞外区引起受体酪 氨酸激酶活化，导致f l t 4 胞内区酪氨酸自动磷酸化，促使受体从休眠态转到活化态，激 活的f l t 4 进而活化下游信号分子，促进淋巴管内皮细胞有丝分裂、增殖，为肿瘤淋巴转 移提供途径f 7 。提示以v e g f r 一3 为靶点的抗肿瘤淋巴管形成可以作为新的肿瘤治疗手段 v e g f 。c 和v e g f r 一3 f l t 4 信号通路可能是肿瘤淋巴管生成或扩张的机制或是一个主 要环节，并且增生或扩张的淋巴管为肿瘤细胞向淋巴结转移提供了路径。因此，对v e g f c 和v e g f r - 3 f l t 4 信号通路的抑制研究可能是抗肿瘤淋巴道转移治疗的一种新方法。 m a k i n e nt 8 】等已发现可溶性v e g f r 3 与v e g f c 结合，可抑制促淋巴生成作用，其机制 是使淋巴内皮凋亡和淋巴网络分解，而对血管则无影响。k a r p a n e n t 【9 j 等研究发现v e g f c 促进肿瘤淋巴管生成的效应可被一种可溶性v e g f r - 3 融合蛋白抑制。k r i s h n a n 【lo 】等采用 基因转导技术，将可与v e g f r - 3 竞争性结合v e g f c 的可溶性v e g f r - 3 受体球蛋白导入 高淋巴结转移倾向的肺m t - 4 5 0 肺癌细胞中，然后将细胞种植于免疫缺陷性裸鼠体内，与 对照组相比，试验组小鼠局部淋巴结转移和肺部转移病灶明显减少。k u b oh 【川等发现抗 v e g f r 3 抗体可以抑制f g f 2 上调v e g f c 进而诱导的淋巴管增殖。国外己有研究发现 鼠源的v e g f r - 3 单克隆抗体能彻底特异地阻断v e g f r 3 的功能，能抑制生理性的和肿瘤 因过表达而增强的淋巴管再生【。 v e g f r - 3 在体内的表达微量，采用传统的生化技术和生物合成技术不仅成本高而且很 难得到大量制品，而基因工程技术使其成为可能，它可使外源性基因高效表达，从而生产 出有重要价值的蛋白质产品。本研究通过d n a 重组技术，构建了v e g f r 3 胞外1 3 区基 因片段表达载体，表达出目的蛋白，并对表达出的蛋白进行了纯化，为进一步的研究奠定 了基础。 v t t 英文缩写英文名称 v e g f r 3 v e g f p c r d n a c d n a l b e d t a s d s s d s p a g e t b e x g a l i p t g r p ” u 1 m l b p i r i s 1 r i s h c l b s a h r p d a b d n t p 英文缩写词表 中文名称 v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r3 血管内皮生长因子受体3 v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r 血管内皮生长因子 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 c o m p l e m e n t a r yd n a互补d n a l u r i a b e r t a i nb o r t h l b 培养基 e t h y l e n e d i a m i n o t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 硫酸十二烷酸钠 s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 硫酸十二烷酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 t r i s b o r i ca c i d e d t ab u f f e r t r i s 硼酸e d t a 缓冲液 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l b d - g a l a c t o s i d e i s o p r o p y l t h i o b d g a l a c t o s i d e r e v o l u t i o n sp e rm i n i t e m i c r o l i t r e m i l l i l i t e r b a s ep a i r ( s ) t r i ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a t r i h y d r o x y m e t h y la c i db u f f e r b u l ls e r u m a l b u m i n h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e d i a m i n o b e n z i d i n d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e v 5 一溴4 一氯3 一吲哚半乳糖苷 异丙基硫代b d 半乳糖苷 每分钟转数 微升 毫升 碱基对 三捶甲基氨基甲烷 t r i s 盐酸盐缓冲液 牛血清白蛋白 辣根过氧化物酶 二氨基联苯氨 脱氧核糖核营三磷酸 山西医科大学硕士学位论文 第一章v e g f r 3 的原核表达条件的研究 1 1 材料 1 1 1 质粒和菌株 p m d l 8 t - v e g f r 3 质粒：由本实验室前期构建并保存。 d h 5a ：适合于质粒p b v 2 2 0 表达的宿主菌，购于大连宝生物公司。 p b v 2 2 0 空质粒载体：由中心实验室- 7 0 。c 冻存，为温控诱导表达载体。 1 1 2 工具酶 e x t a q d n a 聚合酶、限制性内切酶e c o r i 、b a m h i 购自大连宝生物公司。 1 1 3 试剂 d n am a r k e rd l 2 0 0 0 、p c r 扩增试剂盒、d n a 凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公 司，引物合成由上海生工生物技术服务有限公司完成，其余试剂由本实验室前期购买保 存。 1 1 4 培养基与溶液 l b 培养基：1 0g l 胰蛋白胨，5g mn a c i ，1 0g l 酵母提取物，调节p h 7 4 ，高压灭 菌。 l b ( a m p + ) 培养基：含1 0 0 m g l a m p 的l b 培养基。 l b ( a m p + ) 平板：含1 0 0 m g l a m p 的l b 平板。 s t e ：o i m o u l n a c t 1 0 m m o l l t r i s c 1 ( p h 8 o ) ，l n u n o l l e d t a 溶液h5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5 m m o l lt r i s c 1 ( p h 8 o ) ，1 0 m m o i l e d t a 高压消毒灭菌，4 保存。 溶液i i ：o 2 m o l l n a o h ，i s d s 。( 新鲜配制) 溶液i i i ：6 0 m l5 m o l lk a c ，l1 5 m l 冰醋酸，2 8 5 m l 水 1 1 5 主要仪器 低温离心机 e p p e n d o r f 公司 t h i n 医科犬带龋士学豫照丈 超净工作台 紫外分光光度计 电泳槽 p o l y s t a lc c l 水浴箱 瑗温冰缀4 、一2 0 低温珠麓，7 09 c d y - 3 a 型稳压稳流电泳仪 p t c l 0 0 p c r 仪 z f - 9 0 多功能紫外透射仪 电泳凝黢定量分辑系统 垂蠢电泳撩 震荡墙潞器 超声破碎仪 1 2 实验方法 北京昌平长城空气净亿工程公司 e p p e n d o f f 公司 北京六一厂 江苏兴华仪器厂 h a i e r 公司 s a n y o 公司 江苏兴华仪器厂 美国m j 公司 上海顾村电光仪器厂 美国援达公司 j l 京六一厂 北京六一厂 e p p e n d o f f 公司 + 2 把v g f 鼢基溺亚克隆ap b v 2 2 0 袭达载热中 ( 1 ) p c r 扩墙产秘酶镯爱点分毒嚣 e n z y m e s i z e# c u t s p o s i t i o n s ( f r a g m e n ts i z e s ) a a t1a g g “c c t3 1 3 0 4 ( 2 8 0 9 ) 4 1 1 3 ( 2 2 ) 4 1 3 5 ( 1 6 1 9 ) a g e i a p a l a p a r t a s c l b a ll a 4 c c g g t g g g c c “c g “t g e a c g g “c g c g e e t g g “c c a b g l l l a “g a t c t b s p l 4 0 7 it “g t a c a b s p m i lt “c c g g a b s r d ig c a 艘g e c 0 3 1 ig g 零c e c o r ig 6 a 铘c e s p 3 1 c g t c m c k p n l g g t a c “c k s p 6 3 2 1 t 曩c ￥x c m s t lt g c “g a n a e ig c c “g g c n a r l g g “c g c c n c o lc “c a t g g 熬t ie t g c a 4 a 3 2 2 l 7 1 4 8 ( 4 4 5 0 、 2 7 8 1 ( 6 4 4 ) 6 8 5 ( 2 0 8 1 ) 1 9 1 1 ( 4 4 5 0 2 0 2 0 4 & 3 4 3 7 ( 3 0 3 ) 3 0 5 7 ( 1 1 9 3 4 2 5 ( 3 8 0 6 ) 2 7 6 6 ( 2 3 6 9 ) 5 5 0 ( 2 5 3 3 ) 3 7 4 0 ( 9 1 2 ) 3 1 7 6 ( 1 6 2 ) 3 0 8 3 ( 3 5 3 3 3 8 ( 4 1 6 9 ) 1 6 1 3 ( 1 6 7 7 ) 3 2 9 0 ( 2 7 7 3 ) 3 4 7 8 ( 6 4 0 ) 4 1 1 8 0 8 1 m 2 4 9 9 ( 4 4 5 0 ) 6 4 0 ( 1 3 ) 6 5 3 ( 9 7 3 ) 1 6 2 6 ( 1 5 0 2 ) 3 1 2 8 ( 3 5 4 ) 3 4 8 2 ( 1 3 ) 3 4 9 5 ( 2 5 9 ) 3 7 5 4 ( 1 3 3 6 、 2 5 3 6 ( 1 2 5 4 ) 3 7 9 0 ( 3 1 9 6 ) 1 0 6 4 ( 2 3 4 3 ) 3 4 0 7 ( 8 0 1 ) 4 2 0 8 ( 1 3 0 6 ) 1 7 9 0 ( 5 7 2 ) 2 3 6 2 ( 3 8 7 8 ) 2 9 6 2 ( 6 0 0 ) 3 5 6 2 ( 4 2 ) 3 6 0 4 ( 3 8 0 8 ) 1 8 2 1 ( 4 4 5 0 ) 2 4 2 7 ( 4 4 5 0 ) 3 1 ( 1 8 8 ) 2 1 9 ( 9 3 2 ) 1 1 5 1 ( 1 4 3 0 ) 2 5 8 1 ( 9 0 ) 2 6 7 1 ( 18 1 0 ) 2 9 0 6 ( 1 4 4 ) 3 0 5 0 ( 5 8 2 ) 3 6 3 2 ( 3 7 2 4 ) 1 7 1 ( 4 6 0 ) 6 3 1 ( 3 0 5 1 ) 3 6 8 2 ( 9 3 9 ) 2 2 3 2 3 l l 5 3 3 山西医科大学硕士学位论文 p v l j i ic a g “c t g s a c lg a g c t “c 2 5 s a i l g “t c g a c1 s m a i c c c “g g g3 s p h i g c a t g n cl s s e 8 3 8 7 ic c t g c a “g g1 v s p i a t “1 1 a p 汀1 x c m ic c a n n n n n “n n n a r r g g5 x 1 1 0 ic t c g a g x m a l l ic “g g c c g 1 3 7 1 8 ( 1 9 1 6 ) 2 6 3 4 ( 2 5 3 4 、 2 0 9 ( 4 9 4 ) 7 0 3 ( 2 0 0 4 ) 2 7 0 7 ( 2 0 7 ) 2 9 1 4 ( 6 8 3 ) 3 5 9 7 ( 1 0 6 2 ) 2 1 9 1 ( 4 4 5 0 ) 2 4 7 6 ( 7 2 1 ) 3 1 9 7 ( 5 3 3 ) 3 7 3 0 ( 3 1 9 6 ) 5 9 0 ( 4 4 5 0 ) 17 0 ( 4 4 5 0 ) 4 4 3 1 ( 4 4 5 0 ) 6 7 1 ( 5 7 ) 7 2 8 ( 7 9 2 ) 15 2 0 ( 7 8 3 ) 2 3 0 3 ( 1 5 3 1 ) 3 8 3 4 ( 1 2 8 7 ) 19 0 ( 4 4 5 0 ) 1 3 ( 3 7 9 ) 3 9 2 ( 2 5 4 6 ) 2 9 3 8 ( 1 5 2 5 ) n o n c u r i n ge n z y m e s ： a a t l ia l li ia s u i a v r i ib a m h i b c l i b s p h i c l a id r a ie c 0 4 7 i i ie c o r v h i n d i i i h p a i m l u in d e in h e in o t in r u ip a c ip m a c ip m e ip v u i s a c i i s a p i s c a is n a b i s p e i s p l i s r f l s s p i s w a ix b a i ( 2 ) p c r 引物的设计 按照v e g f r 3 片段的cd n a 序列，用o l i 9 0 6 4 4 软件设计引物，在上游引物中加入 e c o ri 酶切位点和起始密码，在下游引物中加入终止密码和b a m hi 酶切位点。上游引物 为5 c g g 儿玎t c a t g a g t g a c t a c t c c a t g a c c c 一3 ，c g 为保护碱基，g a a t t c 为e c o r i 酶切位点，a t g 为起始密码，a g t g a c t a c t c c a t g a c c c c 是与模板互补的序列；下游 引物为5 一c g g g a t c c t c a t t a g t t g t t g g c c t t g c a c a c 3 ，其中c g 为保护碱基， g g a t c c 为b a m hi 酶切位点，t c a t t a 是串联终止密码，g t t g t t g g c c t t g c a c a c 为 与模板互补的序列。引物设计好后由上海生工生物技术服务有限公司合成。 ( 3 ) 用p c r 扩增v e g f r 3 基因 按照p c r 试剂盒说明书在o 2 m l 的e p p e n d o r f 管中加入下列试剂： 1 0 e xt a qb u f f e r5 u l d n t p 5 u l 上游引物l u l 下游引物l u l p m d l 8 t v e g f r 3 l u l 灭菌水3 6 u l 壁酗必霾金酶q ：5 坠l t o t a lv o l u m e 5 0 u l 用移液器轻柔混匀，瞬时离心，9 4 。c 2 分钟后，9 4 。c 3 0 秒，5 7 。c 1 分钟，7 2 。c 1 分钟， 进行3 5 个循环后，7 2 。c 延伸5 分钟，取1 0u l p c r 产物加入2u 1 6 l o a d i n gb u f f e r , 用1 5 琼脂糖凝胶1 0 0 伏电泳l 小时，其余置2 0 保存待用。 ( 4 ) p c r 产物的纯化 p c r 产物的纯化采用a g a r o s e g e l d n a p u r i f i c a t i o n k i t v e r 2 0 纯化试剂盒。 1 1 ) 将p c r 反应结果在含t b e 缓冲液的1 5 琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙啶染色，1 0 0 v 稳压，5 0 分钟； 2 1 紫外光下切出目的d n a 的琼脂糖凝胶，切碎胶块并称其重量，按l m g = l m l 计算 胶块体积，向胶块中加入5 个凝胶体积的胶块融化液d r - ib u f f e r ，均匀混合后7 5 加热融 化，加入2 5 凝胶体积的d r i ib u f f e r 并均匀混合； 3 ) 将操作液转移到s p i nc o l u m n 内并安置于c o l l e c t i o nt u b e 上，3 ，6 0 0 r p m 离心3 0 秒， 弃滤液； 4 ) 将5 0 0u l 的r i n s e a 加入s p i n c o l u m n ，3 , 6 0 0 r p m 离心3 0 秒，弃滤液； 5 ) 将7 0 0 u 1 的r i n s e b 加入s p i n c o l u m n ，3 ，6 0 0 r p m 离心3 0 秒，弃滤液： 6 ) 重复上一步，1 1 , 0 0 0 r p m 再离心一分钟； 7 ) 将s p i n c o l u m n 安置于新的1 5 m l 离心管上，在s p i n c o l u n m 膜的中央加入2 5u l 的水，室温静置一分钟，1 1 ，0 0 0 r p m 再离心一分钟洗脱d n a 。 ( 5 ) p c r 产物的双酶切及p b v 2 2 0 空质粒的双酶切 1 ) p c r 扩增产物的双酶切 酶切体系v e g f r 3 基因( p c r 产物纯化后) 2 3 u l 1 0 hb u f f e r3u l e c o r i 2u l 亟菌盔2 坠! t o t a lv o l u m e3 0u l 用移液器轻柔混匀，瞬时离心，3 74 c 水浴l 小时，跑电泳，切胶回收纯化目的片段。 v e g f r 3 基因 2 3 u l l o k b u f f e r3 u l b a m h i2 u l 丕菌丞2 女! t o t a lv o l u m e3 0u l 用移液器轻柔混匀，瞬时离心，3 0 水浴1 小时，跑电泳，切胶回收纯化目的片段。 2 ) p b v 2 2 0 质粒的双酶切 酶切体系p b v 2 2 0 质粒 2 3 u l 1 0 h b u f f e r 3u 1 e c o r i2u l 及苴丞2 坠! t o t a lv o l u m e3 0u l 用移液器轻柔混匀，瞬时离心，3 7 。c 水浴1 小时，跑电泳，切胶回收纯化目的片段。 p b v 2 2 0 质粒 2 3 u l 1 0 kb t u f f e r3 1 1 1 b a m h l 2 u l 亟菌丞 2 u l 1 0 t a lv o l u m e3 0u l 用移液器轻柔混匀，瞬时离心，3 0 。c 水浴l 小时，跑电泳，切胶回收纯化目的片段。 ( 6 ) v e g f r 3 基因酶切片段和线性载体p b v 2 2 0 的连接 分光光度计测定v e g f r 3 基因片段和线性载体p b v 2 2 0 的浓度，使v e g f r 3 和 p b v 2 2 0 的摩尔比约为3 ：1 进行连接反应。 反应体系： 1 0 t 4 l i g a s eb u f f e r 3t tl v e g f r 3 ( 双酶切纯化后) 1 2 5ul p b v 2 2 0 ( 双酶切纯化后) 1 2 5 ul ! 堡旦窑曼! i g 垒s 曼 2 丛! t o t a lv o l u m e3 01 t1 用移液器轻柔混匀，瞬时离心，1 6 。c 水浴过夜，然后7 0 。c 1 0 m i n 灭活连接酶。 ( 7 ) d h 5n 感受态细胞的转化 1 ) 1 0 u l 连接产物加入到1 0 0 u ld h 5 感受态细胞中，置于冰上3 0 分钟，4 2 。c 热休克 9 0 秒后，迅速放回冰中，将细胞冷切2 分钟，加入2 0 0 u l l b 培养基，5 0 转振荡培养2 小 时。 2 ) 将转化混合物铺于含有x - g a l 、i p t g 、a m p 的l b 琼脂平板上，室温放置1 0 分钟， 待溶液被琼脂吸收后，倒置平板3 7 。c 培养1 8 小时。 ( 8 ) 阳性重组子的筛选和p c r 鉴定 1 ) 重组质粒的小量抽提 1 取2 m l l b 培养液的过夜培养菌液，1 1 0 0 0 r p m 离心2 分钟，弃上清； 2 用2 5 0 “ls o l u t i o ni ( 悬浮液) ，充分悬浮细菌沉淀； 3 加入2 5 0 uls o l u t i o ni i ( 裂解液) ，轻轻上下颠倒5 次，至液体变清亮； 4 加入4 0 01 1l4 c 预冷的s o l u t i o ni i i ( 中性混合液) ，轻轻上下颠倒5 次， 使形成紧 实的凝集块： 5 室温放置2 分钟后1 1 0 0 0 r p m 离心5 分钟，吸取上清转移到套放于收集管的s p i n c o l u m n 中，3 6 0 0 r p m 室温离心1 分钟，弃滤液； 6 将5 0 0 u l 的r n a s e a 加入s p i n c o l u m n ，3 6 0 0 r p m 室温离心3 0 秒，弃滤液； 7 将7 0 0 ul 的r n a s eb 加入s p i nc o l u m n ，3 6 0 0 r p m 室温离心3 0 秒，弃滤液，重复 上一步后1 1 ，0 0 0r p m 室温离心1 分钟； 8 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 - 5 m l 的离心管上，并在其膜的中央加入6 0ul 的三蒸 水，室温静置1 分钟，1 1 ，0 0 0r p m 离心1 分钟，离，t d 管中洗脱下来的溶液即为所需的质粒 d n a 。 山毡逅辩大学礤士举位论空 2 ) 重瀣屡糖斡p c r 鉴定 1 0 xe xt a qb u f f e r5 u l d n i 甲5 u l 上游引物l u l 下游弓| 物l u l p b v 2 2 0 - v e g f r 3 l u l 灭菌水3 6 5 u l 亘基盈g 旦盟器盒隧 q ：血l t b t a lv o l u m e5 0 u l 反应条件丽髓 ( 9 ) p b v 2 2 0 - v e g f r 3 d h 58 魏穰扩缮器镶存 将鉴定的阳性菌株新铺于l b 琼脂平板上，3 7 倒羲熔葬2 4 小时，魂取阳| 黢克隆，接 种于5 m l l b ( a m p l o u l ) 液体培养基中，3 7 。c 2 0 0 转过夜培养至a 。约为0 6 左右，然后取 i m l 加入到灭菌e p 管中，加入2 5 0 u i 灭菌甘油，一7 0 。c 保存。 1 2 2v e g f r 3 的原核表达条件的研究 ( 1 ) p b v 2 2 0 * v e g f r 3 d h 5a 叟长筵线趣磅究 1 ) 鼠成功转化黪琼箱平板上蕊取令阳往克隆，接秘戮5 m l l b ( a m p l o u l ) 液俸培养基， 3 0 2 0 0 转过夜培养至a 。1 0 左右。 2 ) 取8 份样品按照l ：5 0 扩种于1 0 m l l b ( a m p l o u l ) 液体培养基，3 09 c 分别与1 、2 、 3 、4 、5 、6 、7 、8 小时取样，然后在6 0 0 h m 波长下测定a 。并绘制p b v 2 2 0 ，v e g f r 3 d h 5 n 生长叠线。 ( 2 ) p b v 2 2 0 + v e g f r 3 d h 58 表达蛋鑫条件靛饶诧 1 ) 挑取一个阳性克隆，接种于5m l l b ( a m p 5 u 1 ) 液体培养基，3 0 。c 2 0 0 转培养至a 。o 6 左右，升温至4 2 诱导表达4 小时，收集菌液，4 c 高谴离心1 分钟，收集黼体沉淀和上 情，取适量进行s d s p a g e 凝胶电泳。余4 保存。 2 ) 配制1 5 的分离胶帮5 豹积矮胶，取适量样品加入等体积豹上样缓冲液， 在沸承孛窳3 分镑，霞蛋鑫变馁，敬1 5 u l 上群，在蘧燕逄溶禧中露s d s - p a g e 分板。 积层胶电压为8 0 v ，进入分离胶后加剐1 2 0 v ，电泳l 小时餍，卸下胶进行考马斯尧兰染色， 脱色，照相保存。 ( 3 ) 利用优化条件表达v e g f r 3 利用优化蓐鲍袈件，3 0 、2 0 0 r r a i n 振荡培养到a 6 c o = 0 。6 时，4 2 。c 温控诱导表达6 h ， 黉心褒萤薅沉淀抒1 5 s d s p a g e ，莠掰k o d a k 凝茨进毒亍获凌扫摇，黯表达羹逡纾分撰。 ( 4 ) v e g f r 3 包涵体的分离 1 ) 取适量菌体沉淀，每一克沉淀溶于1m l 水中，超声破菌进行裂解。 2 1 细胞裂解物4 v 高速离心1 5 分钟。 3 ) 倾倒除去上清，每克( 湿重) 麓体沉淀重悬于lm l 水中，每支1 0 0 u l 装4 支离心 管，其余4 保存。 4 ) 4 高速离心1 5 分钟。 5 ) 每份沉淀重悬于l o o u 含不同浓度( 0 5l25 m o l h ) 尿素的t r i s c l ( p h 8 5 ) 。 6 ) 4 高速离心1 5 分钟。 7 ) 倾倒上清，留置待用，每份菌体沉淀重悬于l o o u l 水中。 8 ) 各取l o u l 上清和沉淀，分别与l o u l 2 s d s 凝胶加样缓冲液混合，s d s p a g e 分析 哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。 1 3 结果 1 3 1p m d l8 t - v e g f r 3 的扩增产物 p m d l 8 t - v e g f r 3 质粒经p c r 扩增，扩增产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观 察出现很亮的条带，没有出现明显的非特异性扩增产物，扩增产物片段的大小与分子量标 准相比较，与理论推测的9 1 3 b p 相符合，表明目的基因得到了特异的扩增。 图1 - 1v e g f r 一3 基因p c r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 1 ：d n am a r k e rd l 2 0 0 02 ：v e g f r 一3p c r 扩增产物 1 3 2 重组质粒p b v 2 2 0 - v e g f r 3 的p c r 鉴定结果 以重组质粒p b v 2 2 0 一v e g f r 3 为模板进行p c r 扩增v e g f r 3 基因，扩增产物经观察 出现的条带与预期片段相符合。 1 3 3p b v 2 2 0 一v e g f r 3 d h 5a 生长曲线 山西医科大学硕士学位论文 3 0 。c 时不同培养时间p b v 2 2 0 一v e g f r 3 d h 5d 菌体密度a 。值 1 2 1 0 8 毒o 0 6 0 4 0 2 0 。 图卜2p b v 2 2 0 一v e g f r 3 d h 5 生长曲线 根据p b v 2 2 0 一v e g f r 3 d h 5n 的生长曲线，选择生长进入对数期进行诱导，即菌密度 a 。为0 6 左右进行诱导表达。 1 3 4 利用优化条件表达v e g f r 3 蛋白 p b v 2 2 0 一v e g f r 3 d h 5d 在菌密度a 。为0 6 进行诱导表达，表达6 小时，目的蛋白获 得较高的表达量，分子量为3 3 k d ，与理论计算的分子量相同。见下图 图i - 3v e g f r 一3 蛋白因子在d h 5a 中的表达量分析 1 ：蛋白分子量标准( 9 7 4 k d6 6 2 k d4 3 o k d3 1 0 k d2 0 i k d1 4 4 k d ) 2 ：p g v 2 2 0 一v e g f r 3 d h 5o 诱导前3 ：p b v 2 2 0 一v e g f r 3 明5a 诱导后( 箭头所指为目的蛋白) 1 3 5 包涵体的纯化 用2 m o l l 的尿素洗涤包涵体获得了较高的纯度。见下图 图卜4 分离纯化的v e g f r 3 电泳图 1 ：蛋白分子量标准2 ：洗涤后的包涵体 1 4 讨论 在构建原核表达载体时，为满足下一步表达蛋白的要求，需要在设计引物时，加入酶 切位点，以便使目的基因序列正好在所规定的区域内；靶蛋白编码序列插入载体时，仔细 选择酶切位点，可以最大程度减少切割后附加在靶蛋白氨基端的氨基酸残基“，此位点应 在载体上同时存在以便连接。另外，还应加入起始密码和终止密码及序列保护碱基。因此， 我们首先要对目的基因序列进行限制性内切酶位点分析，以保证序列中的部分不被切割。 v e g f r 3 的胞外有7 个超二级免疫蛋白样结构域，其中1 3 区与配体结合有关，此区 基因表达的蛋白可以刺激被免疫动物产生抗体，该抗体可以阻断v e g f r 3 与其配体的结 合，进而阻断淋巴传导通路。因而我们的目的序列位于2 2 9 6 3 个碱基，其中2 2 8 7 个碱基 为信号肽区，编码成蛋白后是被分泌出去的，需去掉该部分。经0 1 i g o6 4 4 软件分析， 设计引物从7 6 个碱基开始，终止于9 7 1 个碱基。以本实验室构建的经测序证实序列正确 的克隆质粒为模板，进行扩增并构建表达载体。 大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表 达许多异源蛋白质的首选表达系统。大肠杆菌遗传图谱明确，容易培养且费用低，对许多 蛋白质有很强的耐受能力，能高水平地表达这些蛋白质“。 在原核细胞中高效表达外源基因时，需要一个可调控的启动子，因为某些外源蛋白对宿主细 胞可能有毒性，并且在短时间内快速合成外源蛋白质，可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白 的破坏作用。p b v 2 2 0 载体具有p r p 。强串联启动子“，为温控诱导表达。r 和p 。启动子为 嗜菌体启动子，为强启动子，受 嗜菌体c i 基因的负调控，c i 阻遏蛋白是温度敏感蛋白， 山西鞋科丈学璇士学位论文 在2 8 3 0 露，e l 疆遗蛋自产生鞠糊 乍用，在舞瀑至4 2 ，c i 被破坏，艮鞭p 。启动子开 始转录，这样利用温度控制，使宿主菌在3 0 。c 生长到对数期，4 2 诱导表达目的蛋白。温 控诱导的方式合理地调节了宿主菌的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，减少了大量外 源蛋自给宿主菌生长和代谢带来的损伤“”。除了强的细菌启动子外，有效启动翻译需要起 始密码上游豹核耱侮结台位点( h u t t e n h o f e ra n dn o t l e r1 9 9 4 ) 。熟译起始过程中，5 曲令援 昔酸长静s h i n e - d a l g a m o