（植物学专业论文）杜仲不同类型树皮的组织结构及化学成分的比较研究.pdf

摘要 杜仲( e u c o m m i au l m o i d e s o l i v ) 是中国特有的名贵经济树种，国家二级 保护植物。千百年来，杜仲皮作为中药在人们医疗保健等方面起着十分重要的作 用。虽然杜仲为单科单属单种，但从文献报道和实地调查来看，杜仲的树皮发生 了显著的变异，一般可划分为光皮、浅裂、深裂、龟裂4 种。本论文从组织结构 和主要活性成分含量的角度，对杜仲4 种类型的树皮进行了较为系统的比较研 究。为杜仲种内的分类研究和杜仲优良品种的选育提供科学依据。 本试验制作了光皮、浅裂、深裂、龟裂4 种不同类型树皮的永久石蜡切片， 进行了显微观察和比较。浅裂、深裂、龟裂3 种类型之间差异不大，光皮型与其 余3 种类型存在差异。其差异首先表现在木栓层结构上：光皮型杜仲的周皮明显 比其余3 种类型树皮薄，木栓层层数少：浅裂、深裂、龟裂这些糙皮型杜仲的周 皮很厚，由旧有的木栓层和新形成的木栓层以及两层中间被挤压的皮层等颓废组 织组成。另外，光皮型杜仲在栓内层分布有较少的，质地紧密的石细胞群；而糙 皮型杜仲在栓内层分布有很多石细胞群，其构造粗糙，质地疏松。 光皮型杜仲的周皮与糙皮型有不同的形成路径。光皮型杜仲新的木栓层形成 后，旧有的木栓层就脱落掉，周皮始终只由新的木栓层构成；糙皮型杜仲在新的 木栓层形成的同时，旧有的木栓层会产生积累。周皮由新木栓层、旧木栓层以及 新旧木栓层之间被挤压的皮层等颓废组织组成。初步推测，杜仲树皮的变异是由 遗传水平上的变化引起的。 建立了杜仲树皮中绿原酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷、京 尼平苷酸的h p l c 测定方法。对全国各地杜仲主产区的不同类型杜仲树皮中这5 种药效成分进行了含量测定和差异性分析。五种化学成分在4 种树皮类型的含量 趋势是：光皮 浅裂 深裂 龟裂，而京尼平苷酸在4 种树皮类型的的含量梯度晟 明显，松脂醇二葡萄糖苷的含量变化最小。 具体统计学差异是，桃叶珊瑚苷：光皮与浅裂的含量没有差异，深裂与龟裂 的含量没有显著差异，但光皮、浅裂与深裂、龟裂之间差异极显著。松脂醇二葡 萄糖苷：光皮、浅裂、深裂3 者之间含量没有差异，但这3 种树皮类型与龟裂的 含量差异极显著。京尼平苷酸：光皮与其他3 种树皮类型的含量差异极显著，浅 裂与其他3 种树皮类型差异极显著，而龟裂与深裂之间的含量没有差异。京尼平 苷：4 种树皮类型的含量没有显著性差异。绿原酸的含量随树皮类型的不同有较 大差异。其中光皮型含量最高浅裂型次之，深裂型最低，光皮型与深裂型能相 差几十倍。 从所采集样品的实验结果看，枝皮中，松脂醇二葡萄糖苷的含量比较高能 与光皮相当；京尼平苷酸和绿原酸的含量很低：未检测出京尼平苷和桃叶珊瑚苷。 炮制后的杜仲，只检测出绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷，而且含量很低：京尼平苷 酸，京尼平苷和桃叶珊瑚苷都未检测出。 关键词：杜仲：树皮类型；显微构造；高效液相色谱技术；化学成分分析。 s t u d i e so nt h et i s s u ea n dc h e m i c a l so f v a r i o u st y p e s b a r k o f e u c o m m i au i m o i d e so l i v s p e e i a l i t y ：b o t a n y m a s t e rc a n d i d a t e ：s h is h a o - l a n s u p e r v i s o r ：d o n gj i n g a o a b s t r a c t e u c o m m i au l m o i d e s0 l i v i so n eo fv a l u a b l eu n i q u es p e c i e so n l yd i s t r i b u t e di n c h i n aa n dp r o t e c t e db yt h e g o v e r n m e n t i t sb a r k ，b e i n g ac h i n e s et r a d i t i o n a l m e d i c i n e h a sb e e np l a y e dav e r yi m p o r t a n tr o l ei nm e d i c a lu s e sa n dh e a l t hc a r ef o r t h o u s a n d so f y e a r s a i t h o u g he u c o m m i a u l m o i d e si ss i n g l es p e c i e s ，s i n g l eg e n u sa n d s i n g l ef a m i l y ，v a r i a n c e sw e r ef c ) u n d a st h ef o u rt y p e s b a r kb yn o w , i n c l u d i n g s m o o t ht y p e ，s u p e r f i c i a ls p l i t t i n gt y p e ，d e e ps p l i t t i n gt y p ea n dc h a pt y p e ，a c c o r d i n gt o l i t e r a t u r er e p o r ta n df i e l ds u r v e y w h a ti st h ed i f f e r e n c ea m o n gt h ef o u rt y p e s b a r k ? f r o mt h ep o i n to fv i e wo ft h et i s s u es t r u c t u r ea n dt h ec o n t e n to fm a i n l ye f f e c t i v e c o m p o s i t i o n s t h i sp a p e r m a k e das y s t e m i cc o m p a r i n gs t u d yo nt h ef o u rt y p e s b a r ki n o r d e rt 0p r o v i d es c i e n t i f i cf o u n d a t i o nf o re u c o m m i au l m o i d e s v a r i e t a lc l a s s i f i n g a n dc h o i c e n e s sr e s e a r c h t h i se x p e r i m e n tm a d ep e r m a n e n to l e f i ns l i c eu p so fd i f r c r e n tt y p e s b a r ka n d o b s e r v e dt h e mw i t hm i c r o s c o p e e v i d e n td i f f e r e n c ei i t l t h et h r e et y p e so fs u p e r f i c i a l s p l i r i n g ，d e e ps p l i t t i n ga n dc h a pt y p e s w e r e n tf o u n d ，b u tt h es m o o t hb a r kw a s d i f f e r e n tt ot h eo t h e l t h r e et y p e si nt w oa s p e c t s f i r s t l y , d i f i e r e n c eo nt h ep h e l l e m ：t h e p e f i d e r mo fs m o o t ht y p ew a sd i s t i n c t l yt h i n n e rt h a nt h eo t h e rt h r e et y p e s b a r k ，i t s n u m b e ro fl a y e rw a sf e w ；t h o s er o u g ht y p e s p e f i d e r ms u c ha ss u p e r f i c i a ls p l i t t i n g ， d e e ps p l i r i n ga n dc h a pt y p ew a sv e r yt h i c k , a n d i tw a sc o m p o s e do ft h eo l dp h e l l e m ， t h en e wp h e l l e ma n dt h ed e c a d e n c es t r u c t u r ew h i c hw a sp r e s s e db yt h et w ol a y e r s s e c o n d l y , t h e r ew a sa1 i t t l eo fc o l l e n c h y m aw h o s e t e x t u r ew a st i g h ti ns m o o t ht y p e s e n d o t h e c i u mo fp h e l l e m ；w h i l e t l l e r ew a sal o to fc o l l e n c h y m aw h o s es t r u c t u r ew a s r o u g ha n dw h o s e t e x t u r ew a sl o o s e n i n gi nr o u g ht y p e s e n d o t h e c i u mo f p h e l l e m 1 1 1 es m o o t ht y p e sp e r i d e r mf o r m i n gp a t hd i d n tl i k et h er o u g ht y p e s o nt h e t i m eo f s m o o t h t y p e sn e wp h e l l e mf o r m i n g t h eo l d e rp h e l l e mw o u l d b el o s e da n dt h e p e r i d e r mw a so n l yc o m p o s e d o fn e w p h e l l e m a n d ，o nt h et i m eo fr o u g ht y p e s n e w p h e l l e mf o r m i n g ，t h eo l d e rp h e l l e mw o u l d a c c u m u l a t e t h ep e r i d e r mw a sc o m p o s e d o fn e wp h e l l e m o l d e rp h e l l e ma n dt h ec o r t e xw h i c hw a sp r e s s e db vb o t hn e wa n d o l d e rl a y e r so f p h e l l e m i ti sp r e s u m e dt h a tt h eb a r kv a r i a n c eo f e u c o m m i au l m o i d e s i sc a u s e d b y t h eh e r e d i t y c h a n g i n g t h i se x p e r i m e n ts t u d i e dt h eh p l cm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f c h l o r o g e n i c a c i d ，a u c u b i n ，p i n o r e s i n o l - d i - o b d - g l u c o p y r a n o s i d e ，g e n i p o s i d ea n dg e n i p o s i d i c a c i di nd i f f e r e n tt y p e s b a r ko fe u c o m m i au l m o i d e si nt h e m a j o rd i s t r i b u t i o n r e g i o n ，a n dc o m p a r e dt h e f i v em e d i c i n a lc o n s t i t u e n t s c o n t e n t sa m o n gd i f f e r e n t t y p e sb a r ko f e u e o m m i a u l m o i d e s t h ea m o u n to f t h ef i v em e d i c i n a lc o m p o n e n t si nd i f f e r e n tt y p e sb a r kw a s i nf o l l o w i n go r d e r ：s m o o t ht y p e s u p e r f i c i a ls p l i t t i n gt y p e d e e ps p l i t t i n gt y p e c h a p t y p e t h ea m o u n to fg e n i p o s i d i ca c i dv a r i e dt h em o s tw i d e l y i nt h ef o u r t y p e s ，a n d t h ea m o u n to fp i n o r e s i n o ld i g l u c o p y r a n o s i d ev a r i e d t h em o s t n a r r o w l y s t a t i s t i c a l a n a l y s i ss h o w e dt h a t ，f o ra u c u b i n ，t h e r ew a sn od i f f e f e n c e b e t w e e ns m o o t ha n ds u p e r f i c i a l s p l i t t i n gt y p e s ，a n d n 0d i f f e r e n c eb e t w e e nd e e p s p l i t t i n g a n dc h a pt y p e s ，b u ts m o o t h ，s u p e r f i c i a ls p l i t t i n gt y p e sa n dd e e ps p l i c i n g ， c h a pt y p e sh a d n o t a b l ed i f f e r e n c e ；f o r p i n o r e s i n o l d i 一0 - b d g l u c o p y r a n o s i d e ， t h e r ew a s n oo b v i o u sd i f e r e n c e a m o n g s m o o t h t y p e ，s u p e r f i c i a l s p l i t t i n gt y p ea n dd e e ps p l i t t i n gt y p e ，b u tt h e r ew a s n o t a b l ed i f f e r e n c e b e t w e e n c h a pt y p e s b a r ka n dt h eo t h e rt h r e e t y p e s b a r k ；f o r g e n i p o s i d i ca c i d ，t h e r ew a s n o t a b l ed i f f e r e n c eb e t w e e ns m o o t ht y p ea n dt h eo t h e r t h r e et y p e s ，a n db e t w e e ns u p e r f i c i a ls p l i t t i n gt y p ea n dt h eo t h e rt h r e et y p e s ，b u tn o d i f f e r e n c eb e t w e e nd e e ps p l i t t i n gt y p ea n dd i a pt y p e ；f o rg e n i p o s i d e ，t h ef o u r t y p e s b a r kh a d n oo b v i o u sd i f i e r e n c e ；f o rc h l o r o g e n i ca c i d ：t h ea m o u n ti n s m o o t ht y p e sb a r kw a st h eh i g h e s ta n dt h ea m o u n ti nd e e ps p l i t t i n gt y p e sb a r kw a s t h el o w e s ta m o n gf o u rt y p e s s e e nf r o mt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ，t h ea m o u n to fp i n o r e s i n o ld i g l u c o p y r a n o s i d e w a sv e r yh i g hi nb r a n c hb a r k w h i c hw a sa sm u c ha st h ea m o u n ti nt r u n kb a r k t h e a m o u n t o f g e n i p o s i d i ca c i da n dc h l o r o g e n i ca c i dw a sv e r yl o w g e n i p o s i d ea n d a u c u b i nw e r en o tf o u n d k e y w o r d ：e u c o m m i au l m o i d e so l i v ；v a r i o u st y p e s b a r k ；t i s s u es t r u c t u r e ；h p l c ； a n a l y s i s o fc h e m i c a lc o n s t i t u e n t s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑a 垦壅些盘茔或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：少_ ： 莉签字日期； z o o s 年6 月z i 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些盔些盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑韭壑些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：7 0 0s 年 石少澜 6 月z f 日 学位论文作者毕业后去向： 工作 工作单位： 石药集团 通讯地址：河；f 吕为家五韦c 出西踮z 7 6 - 5 导师勰苏另 少 一77 签字日期知d 厂年当月f 目 电话： 邮编：穆o o 岁 杜仲不同类型树皮的组织结构及化学成分的比较研究 1 引言 杜仲e u c o m m i au l m o i d e so l i v 是中国特有的名贵经济树种，国 家二级保护植物】。杜仲皮为中药上品，也是我国传统的出口创汇 商品之一 2 1 。千百年来，杜仲皮作为中药在人们医疗保健等方面起 着十分重要的作用。近2 0 年来，随着杜仲叶药用功能及杜仲胶特殊 性能的不断被发现【3 “ ，杜仲的经济价值稳步提高。 长期以来，一直认为杜仲为单科单属单种植物。但文献上很早 就有关于杜仲外部形态变异的记载。中华本草中曾将杜仲分为粗 皮( 青冈皮) 和光皮杜仲( 白杨皮) 【5 j ；周志翔( 1 9 9 8 ) 、沈作 奎( 1 9 9 9 ) 【7j 则划分为光皮、浅纵裂、深纵裂、龟裂4 种。 为了实地考察杜仲的变异情况，作者选择了杜仲的原始产地作 为采样地点。因为，一般来说，某一物种的原始产地和中心分布区 应当包含有该物种大部分的生物多样性。陕西、湖北、湖南、贵州、 四川等省位于秦巴山脉以南，是杜仲的原始产地，也是历代本草记 载的杜仲产量最高、质量最好的地区，全国有多个大型杜仲专业林 场都分布于此l sj 。如贵州遵义林场、湖北郧西黑山林场、湖北巴东 三峡林场、湖南慈利江垭林场、陕西略阳金家河林场等。因此，此 次调查及采样的中心以这些林场为主( 见附图2 8 ) 。经调查发现， 杜仲种内确实存在很大的变异。其变异主要体现在外部形态树皮上。 树皮可划分为光皮、浅裂、深裂、龟裂4 种。光皮型树皮呈灰白色， 干皮光滑；浅裂型树皮浅灰色，干皮只有很浅的纵裂：深裂型树皮 呈灰色，干皮粗糙，具有较深的纵裂纹：龟裂型树皮呈暗灰色，干 皮较粗糙，呈龟背状开裂( 见附图2 7 ) 。另外，本次调查中发现， 四种树皮类型的分布存在定的地域性。如湖南慈利以光皮型为主， 湖北郧西及贵州遵义以深裂和浅裂为主，陕西略阳则4 种类型都有。 目前还没有人对杜仲4 种类型的树皮进行系统的显微比较，另外， 不同类型树皮的形成机制是什么，它们的分布是否具有规律性，还 未见文献报道。 国内外有关学者对杜仲的化学活性成分进行了大量的研究 2 “，发现杜仲皮、叶和枝条中含有类似的化学成分。目前已确定 的化学成分主要有木脂素类、环烯醚萜类苯丙素类以及其它萜类化 合物，还有多糖、黄酮、酚类等。 木脂素类：从杜仲分离出的木脂素类化合物已有2 7 种，包括双 环氧木脂素类( 如松脂素单糖苷、松脂醇二葡萄糖苷，中脂素，丁 香素等) ；单环氧木脂索类( 如橄榄素、橄榄素二糖苷) 、环木脂素 河北农业大学硕士学位论文 类；新木脂素类：倍半木质素类( 如耳草素二糖苷) 等，其中松脂 素二糖苷为杜仲皮主要降压成分。 环烯醚萜类：目前从皮内分离出l5 种环烯醚萜类化合物。包括 京尼平昔、京尼平苷酸、桃叶珊瑚营、杜仲苷、筋骨革营、京尼平 苷三、四聚体及其乙酸酯等。其中京尼平苷酸具有预防性功能下降、 增强记忆功能、抗癌，抗氧化( 抗衰老) 、泻下、促进胆汁分泌及降 压作用；京尼平苷具有抗肿瘤活性，并具有抗补体性；桃叶珊瑚苷 对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用。 苯丙素类：苯丙素类物质广泛存在于杜仲根皮、茎皮、绿叶、 落叶中，包括绿原酸、绿原酸甲酯、咖啡酸、松柏酸、松柏苷、丁 香苷、香草酸等1 1 种。绿原酸具有抗菌、消炎、止血、抗氧化及升 高白细胞的作用，对急性咽喉炎及皮肤病有明显疗效，并且有肾上 腺素类似的作用。 其它萜类：目前对杜仲皮中分离出来的其它萜类物质主要有自 桦脂醇、白桦脂酸、熊果酸、b 一谷甾醇、胡萝h 苷等。 多糖类：从杜仲皮内分离出杜仲糖a 和杜仲糖b 。杜仲糖a 为 酸性多糖，其组成为l - 阿拉伯糖，d 一葡萄糖，l 。鼠李糖，半乳糖醛 酸：杜仲糖b 为一种聚糖，由一种鼠李糖和半乳糖组成。以上两种 多糖均对网状内皮系统有活化作用，可增强肌体非特异性免疫功能。 众多研究普遍认为，杜仲的主要活性成分为松脂醇二葡萄糖苷、 绿原酸、京尼平苷、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷以及生物碱、多糖类、 黄酮类化合物等。 对杜仲叶中祧时珊瑚营含量测定的研究方法很多。有李家实的 硫酸铜试剂法 2 5 1 ，邓勇的对二甲氨基苯甲醛法【2 “，董娥娟等对此法 进行了改进，建立了“改进对二甲氨基苯甲醛法” 【2 ”，另外，马 柏林等用薄层，分光光度法对杜仲叶中的桃叶珊瑚苷进行了测定“。 但对杜仲皮中桃叶珊瑚营的测定还未见报道。张丽萍等曾用t c l 、 红外光谱等方法对杜仲叶中松脂醇二葡萄糖苷进行鉴定 2 9 j 。戚向阳 等在杜仲的炮制及降压成分提取工艺的研究中曾用正相高效液相色 谱法对松脂醇二葡萄糖苷进行了测定 3 0 1 ，但未见有回收率和色谱图 的详细资料。一般认为，杜仲叶中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷 的含量测定可同时进行。王嗣岑等曾用r p h p l c 法对杜仲叶中京尼 平昔酸、绿原酸、京尼平苷3 种成分同时进行了测定i l ；张康健等 在杜仲次生代谢物与个体生长发育特性、生态学、各个部位相关性 研究中也对杜仲叶中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷的含量同时进 行了测定 。3 引。而杜仲树皮中这3 种成分的测定方法还未见报道。 综上所述，目前文献对杜仲叶中活性成分的含量测定方法研究 较多，而对杜仲树皮中绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸等活性成 2 杜仲不同类型树皮的组织结构及化学成分的比较研究 分的质量控制方法的研究几乎还是空白。 选择准确可靠的试验方法往往是试验成败的关键。中药的成分 非常复杂，以往常用的薄层色谱、分光光度等方法因其精密度、准 确度、灵敏度、重现性差而不能满足现代中药分析的需要。高效液 相色谱法正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最重要 的分析方法。因此也是本试验的首选方法。 高效液相色谱法，是在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相 色谱的塔板理论，在技术上采用了高压输液泵，高效固定相和高灵 敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化的一 项色谱技术。它是7 0 年代发展起来的新技术特别适合高沸点，大 分子和热稳定性差的化合物的分离分析测试。 目前，h p l c 在中草的研究中主要有以下5 方面的应用【3 “4 3 】： 中药材资源开发方面的应用：对探讨亲缘关系化学成分疗效间 的相关性，进而为药材分类寻找、扩大新药源起到了积极的促进作 用。车前为常见中药，目前l 临床多以种子入药，郭月秋等以h p l c 法分别测定地下，地上部分和种子中桃叶珊瑚苛含量，发现地下和 地上部分含量较高，因此认为车前应以全草入药更为合理，此研究 扩大了药用植物资源。鉴别、评价中药材及其制剂质量方面的应 用：中药质量控制和质量标准的制定势在必行，但由于中成药成分 的复杂性，特别是复方制剂，给这方面的工作造成很大困难，h p l c 技术在这方面有很大优势，甘草质量评价常以甘草酸作为指标，用 r p h p l c 以浅性回归法测定甘草酸，结果表明含量随产地，药材粗 细，质地，断面颜色的不同而异。中药炮制方面的应用：研究炮 制机理，探索炮制前后化学成分变化，合理制定炮制工艺是当前中 药炮制研究和中药生产的重要环节。采用h p l c 法测定了干姜，姜 皮，炮制姜中的辣昧成分的姜酚含量，姜酚易受热发生反应，在气 象色谱分析中难以获得准确结果。h p l c 法分离效果最好，在常温 下操作，是测定姜酚等辣昧成分的理想方法。结果测得辣味成分阶 段，干姜炮姜，与中医认为，干姜味辛性温，炮姜味辛性凉相一致。 中药配伍中的应用：中药汤剂多为复方，每种生药又含多种化学 成分，临床共煎过程中可能产生挥发，分解，助溶，吸附，水解， 取代，中和，沉淀等一系列十分复杂的化学物理变化，这些变化直 接影响到制剂的疗效和毒副作用。用反相高效液相色谱法测定川芎 单煎剂及改味四物汤中阿魏酸的含量，结果表明各组汤剂中阿魏酸 的含量有显著差异，配伍熟地对阿魏酸的溶出具有助溶作用。中 药药理研究中的应用：h p l c 法在中药药理研究方面的应用，对临 床及试验研究中血药浓度的监测、药代动力学、药效学等方面的研 究工作起到了积极的推动作用。右旋儿茶素在植物界中分布广泛， 河北农业大学硕士学位论文 具有显著的保肝解毒作用，用h p l c 法测定其血浆浓度及给药后的 分布相半衰期，为配合临床药理研究工作的开展，评价制剂的生物 利用度提供了依据。 基于此，本文旨在做以下两方面的研究：( 1 ) 制作杜仲不同类 型树皮的石蜡切片，对杜仲不同类型树皮进行显微鉴别，系统地阐 述其组织结构的相同与不同。初步探讨不同树皮类型的形成机制， 努力挖掘4 种树皮类型与环境因素、遗传因素之间有何种联系。( 2 ) 建立杜仲树皮中绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、松 脂醇二葡萄糖苷的h p l c 含量测定方法。对不同自然变异类型的杜 仲树皮中绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二 葡萄糖瞢这五静最主要的活性成分含量进行分析，揭示其皮内主要 活性成分的个体变异规律。 杜仲不同类型树皮的组织结构及化学成分的比较研究 2 1 试验材料 2 材料和方法 裹1 杜仲样品来源 2 2 试验设备 注：鉴定人足黄璐琦教授 日本o i y m p u sb h 2 型显微摄影装置。 日本l e i t z 旋转切片机。 s q k c i i i 生物制片快速处理仪( 航空航天部兰州飞控仪器总 厂) 。 w a t e r sa i l i a n c e 高效液相色谱仪( 2 6 9 5s e p a r a t i o n sm o d u l e 四 元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，w a t e r s2 9 9 6 二极管 阵列检测器，m i l l e n n i u m 3 2 色谱工作站) 。 河北农业大学硕士学位论文 润博z y 】j0 4 型k r o m a s i 】c l8 高效液相色谱柱( 4 6 m m 2 5 0 r a m ，5 0 a m ，北京分析仪器研究所) 。 安捷抡x d b c 18 高效液相色谱柱( 4 6 r a m 2 5 0 m m ，5 0 9 m ，北 京安捷抡分析仪器公司) 。 b i s 2 1 0 s 型万分之一电子分析天平( 德国s a r t o r i u s 公司) 。 c x 2 5 0 超声波清洗器( 北京医疗设各二厂) 。 r e 一8 5 a 旋转蒸发器( 巩义市英峪予华仪器厂) 。 徽孔滤膜过滤器( 天津市腾达过滤器件厂) 。 2 3 试验对照品及试剂 绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所( 批号为 5 3 2 0 0 1 1 1 ) 。 桃叶珊瑚苷对照品购自f l u k a 公司( 1 0 t & f i n g c o d e ：4 5 0 5 3 3 ) 。 松脂醇二葡萄糖苷对照品由北京大学药学部药学院提供。 京尼平苷酸和京尼平苷对照品都购自日本和光纯药工业株式会 社( 京尼平苷酸l o t ：p k h 3 7 5 0 和京尼平苷l o t ；p k j 3 5 8 9 ) 。 乙腈为b u r d i c k j a c k s o nh p l c 色谱纯( 美国h o n e y w e l l 公司生 产) 甲醇为一级色谱醇( 天津市四友生物医学技术有限公司) ， 乙醇、乙酸、二甲苯为分析纯( 北京化学试剂公司) ， 自制重蒸馏高纯水。 2 4 试验方法 2 4 1 杜仲4 种类型树皮的外部形态观察 采集的相同树龄、相同部位的不同类型杜仲树皮样品自然风干 后，观察比较其表面的纹理，皮孔。 2 4 2 杜仲树皮石蜡切片的制作 采用石蜡包埋，番红一固绿二重染色法制作石蜡永久切片。 具体步骤如下： 1 ) 固定：f a a 固定光皮、浅裂、深裂、龟裂四种类型树皮 2 ) 脱水；按照6 0 一7 0 一8 0 一9 0 1 0 0 浓度乙醇的顺序逐级脱 水 3 ) 透明：按照5 0 一7 0 一8 0 一9 0 1 0 0 浓度二甲苯的顺序逐级 透明 6 桂仲不同类型树皮的组织结构及化学成分的比较研究 4 ) 浸蜡：逐步加入沸石蜡，至饱和 5 ) 包埋：将纯石蜡加热熔融，趁热将经过脱水、透明的材料包埋 6 ) 切片：用手动切片机切成1 2pm 厚度的薄片 7 1 粘片：在备好的载玻片上涂上一小滴粘贴剂，涂匀，再加几滴4 的福尔马林溶液，将切好的蜡片置于液面上。再将载玻片置于烘 片台上烘干 8 ) 染色：按照二甲苯( 一) 一二甲苯( 二) 一1 2 二甲苯十l ，2 无水乙 醇一无水乙醇( 一) 一无水乙醇( 二) 一9 5 乙醇一8 5 乙醇一7 0 乙醇一6 0 乙醇一1 番红( 染色1 2 h ) 一6 0 乙醇一7 0 乙醇一8 5 乙醇一1 固绿染色( 8 m i n ) 一9 5 乙醇一无水乙醇( 一) 一无水 乙醇( 二) 一l 2 无水乙醇+ l 2 二甲苯一二甲苯( 一) 一二甲苯 ( 二) 一加拿大树胶封片 9 ) 图片制作：采用日本o i y m p u sb h 2 型显微摄影装置，日本富士日 光型1 0 0 彩色胶片直接拍摄组织切片。 2 4 3h p l c 测定不同类型杜仲树皮中绿原酸的含量 1 ) 色谱条件色谱柱；k r o m a s i l c l8 ( 4 6m m 2 5 0m m ，5 0g m 北 京分析仪器研究所) ；流动相：甲醇乙腈一冰醋酸水( 4 ：3 ：2 ：9 1 ) ； 检测波长：3 2 5n m ；流速：1 0m l r a i n l 。柱温：2 5 。在该色谱 条件下，样品中绿原酸峰与其它非被测成分峰能够达到基线分离， 对照品与样品的色谱图见图1 。 r r 。- r 。1 。p 。t _ 0 a 02 0 o o4 0 0 06 0 o 口 r 。p t 。1 。r t - o 2 g o o4 g ，i i i i i nt m i i m ab 图1 绿原酸对照品及样品杜仲树皮中绿原酸h p l c 色谱围 t 绿原酸a 对照品b 供试品 2 ) 对照品溶液制各精密称取绿原酸对照品1 2 5 r a g ，嚣于1 0 m l 量 瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得0 1 2 5 m g m l 的贮备液， 准确吸取2 。5 m l 的贮备液置另一1 0 m l 量瓶，再用甲醇稀释至刻 河北农业大学硕士学位论文 度，摇匀，即得含绿原酸o 0 31 2 m g m l “的对照品溶液。 3 1 供试品溶液制备取干燥的杜仲树皮，用碾碎机碾成絮状，混合 均匀。精密称定1 g ，置1 0 0m l 锥形瓶中，准确加入5 0 甲醇5 0 m l ， 称重后超声提取6 0 m i n ，取出，放至室温后再称重，补足挥发的溶 剂重量，摇匀过滤，取续滤液2 5r r l l ，5 0 以下减压蒸干，用甲 醇溶解，定容到5 m l 容量瓶中摇匀，用微孔滤膜过滤即为供试品 溶液。 4 ) 线性关系考察分别精密吸取浓度为0 0 3 1 2 m g m l 的对照品溶液 l ，3 ，5 ，7 ，9 ，1 1 ，13 ，15 “l ，在所选择的色谱条件下进样分 析。以进样量( 1 a g ) 为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线， 回归方程为y = 2 7 8 86 x1 0 6 x + 1 9 0 3 9 ，r = 0 9 9 9 8 。结果绿原酸在 o 0 3 1 2 0 4 6 8 8 9 9 范围内，线性关系良好。( 见附图l 和附图3 ) 5 ) 精密度试验精密吸取对照品溶液1 0m l ，连续进样5 次测定峰 面积值，r s d 一0 1 6 。 6 ) 重复性试验准确称取同一样品共5 份，每份l g ，照“供试品溶 液制备”项下操作，测定，测得其平均含量为0 0 l3 ，r s d = 1 1 ， 表明其重复性良好。 7 ) 稳定性试验对同供试品溶液分别于制备后0 ，2 ，8 ，2 4 ，4 8h 测定绿原酸峰面积。结果r s d = i 2 ，表明在4 8 h 内具有良好的稳 定性。 8 ) j j t l 样回收率试验精密称取已知含量的样品5 份，每份l g ，加对 照品适量，按“供试品溶液制各”项下操作，测定，计算回收率， 结果见表2 。 襄2 缀原酸加样回收率试验结果 2 4 4h p l c 测定不同类型杜仲树皮中桃叶珊瑚苷的含量 1 ) 色谱条件色谱柱：安捷抡x d b c 18 ( 5 , u r n ，2 5 0 x4 6 r a m ) ： 8 杜仲不同类型树皮的组织结构及化学成分的比较研究 流动相：甲醇一水( 5 ：9 5 ) ；检测波长：2 0 6 n m ；流速：1 0 m l m i n 。柱温：2 5 。出峰时间1 6 r a i n 左右。对照品与样品的色谱图 见图2 。 ，、凡p ，。p _ 。_ _ - 一l - - 。肿 1 。t t f t t r r r 1 1 1 t 一 t l l2 t 6 肿s i n 1 2 0 0 1 4 0 0 m m 2 0 。j ，2 。南i 盎6 i e 0 01 6 赫i ；4 】；葫葫【1 0 j 0 i i j 20 0 f r a i nt m i m t ab 圈2 桃叶珊瑚苷的对照品殛样品杜仲树皮中桃叶珊瑚苷h p l c 色谱圈 1 桃叶珊瑚苷a 对照品b ，供试品 2 ) 对照品溶液制备精密称取桃叶珊瑚苷对照品i i 1 0 m g ，置于2 5 m l 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得0 4 4 4 m g m l 的贮备液， 准确吸取2 5 m l 的贮备液到另一1 0 m l 容量瓶，再用甲醇稀释至 刻度即得含桃叶珊瑚苷0 1 11 m g m l 的对照品溶液。 3 ) 供试品溶液制各取干燥的杜仲树皮，用铁研船( 注意不能用碾 碎机，以防碾药时温度过高，药效成分分解) 碾成絮状，混合均 匀。精密称定0 5 9 ，置1 0 0 m l 锥形瓶中，准确加入5 0 甲醇2 5 m l ， 称重后超声提取6 0 r a i n ，期间换超声仪中的水2 3 次，把超声时 的温度控制在3 s 下。取出后，放至室温称重，补足挥发的溶剂 重量，过滤。取滤液用微孔滤膜过滤即为供试品溶液。 4 ) 线性关系考察精密吸取浓度为0 1 1 1 m g m l 的桃叶珊瑚苷对照 品溶液2 ，4 ，6 ，8 ，l0 ，12 ，1 4 a l ，在所选择的色谱条件下进样 分析。以进样量( g g ) 为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲 线。经统计学计算，回归方程为】，= 6 3le + 0 0 5 x 一2 4 2 e + 0 0 4 ，r = o 9 9 9 9 。结果桃叶珊瑚苷在o 2 2 2 i t g 1 5 5 4 9 9 范围内，线性关 系良好。( 见附图6 和附图8 ) 5 ) 精密度试验精密吸取对照品溶液1 0 1 a l ，连续进样5 次，测定峰 面积值，其r s d = 0 6 。 6 ) 重复性试验准确称取同一样品5 份，每份0 5 9 ，照“供试品溶 液制各”项下操作。测定，进样量为5 i t l ，r s d = 1 3 ，表明其重 河北农业大学硕士学位论文 复性良好。 7 ) 稳定性试验对同一供试品溶液分别于0 ，2 ，4 ，8 ，l 2 ，1 6 t2 4 h 测定桃叶珊瑚苷峰面积。其r s d = 2 0 ，表明在2 4 h 内只有良好的 稳定性。 8 ) 加样回收率试验取同样品0 2 5 9 ，共5 份，精密称定，分别置 于5 个1 0 0 m l 锥形瓶中。另外，取出o 4 4 4 m g m l 的桃叶珊瑚苷 贮备液，放至室温。将上述5 份样品中，每份分别加入2 m l 的 0 4 4 4 m g m l 的桃叶珊瑚苷贮备液，再准确加入5 0 甲醇2 5 m 1 。其 余按照“供试品溶液的制各方法”制备，测定。相应的取相同的 样品0 5 9 ，共五份，精密称定，分别至于5 个1 0 0 m 1 锥形瓶中。准 确加入5 0 甲醇2 5 m l 。其余按照“供试品溶液的制各方法”制备， 测定。结果平均回收率为9 8 8 ，r s d 为1 1 。具体数据见表3 。 寰3 楗叶珊瑚苷加样回收率试验结果 2 4 5h p l c 测定不同类型杜仲树皮中松脂醇二葡萄糖苷的含量 1 ) 色谱条件色谱柱：安捷轮x d b c 18 柱( 4 6 r a m 2 5 0 r a m ，5 o “m ) ；检测波长：2 2 7 n m ：流速：1 0 m l - m i n 1 。柱温： 3 0 。流动相：甲醇一乙腈水( 10 ：1 0 ：9 0 ) 。出峰时间为1 2 r a i n 左右。色谱图见图3 。 杜钟不同类型树皮的组织结构及化学成分的比较研究 l j i 2 , ( s l4 f m6 但ix i h if n 帅| 2 i m l 4 i m im s i s ( m ：i l “) 卅! f m j i h l n f x js i _ im f i i h l i2 l m l 4 i h i i c m x l h 2 1 ) i h i t r a i nf m i u ab 图3 松膳醇二葡萄糖苷对照品及样品杜仲树皮中松膳醇二葡萄糖苷h p l c 色谱图 l 松脂醇二葡萄糖苷a 对照品b 供试品 2 ) 对照品溶液制各 精密称取松脂醇二葡萄糖萤对照品0 。6 8 r a g ，置 于2 m l 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得0