（生态学专业论文）铜砷单一污染对赤子爱胜蚓体腔细胞的影响.pdf

中国农业大学硕士学位论文摘要 摘要 本研究以人工土壤为介质并以蚯蚓作为土壤环境的指示动物，进行了铜与砷单一污染对 蚯蚓本身、溶酶体以及参与防御反应体腔细胞的影响，从个体以及细胞水平对重金属的环境 安全性提供依据研究结果如下： 1 通过瑞氏染色的方法对蚯蚓的体腔细胞进行了分类。结果表明，蚯蚓的体腔细胞分为 四类：组织黄细胞、嗜中性细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞同时，尝试了用不同的 方法提取蚯蚓体腔细胞，其中超声波法得到的细胞数量最多，可达到2 0 3 x 1 0 6 个，但 是细胞存活率很低；纤维针法得到的细胞成活率最高，可达到8 0 5 ，但是细胞数量 最少；电压刺激的方法简单快捷，是最常用的方法 2 溶酶体作为生物标记物，利用铜与砷单一污染对蚯蚓进行诱导正常条件下，中性红 保持时问平均为9 4 3 分钟研究结果表明：诱导后，蚯蚓的生长率明显下降中性红 保持时间也缩短，而且当铜为s o o m g k g 时，诱导1 4 天后，甚至会降到0 中性红保 持时间同重金属的浓度大小以及诱导时间密切相关 3 对照中。体腔细胞吸收的结晶紫与中性红量分别为4 2 9 徽克与i 5 3 徼克。重金属作 用后，蚯蚓体腔细胞的活性受到抑制，胞饮结晶紫与中性红的量随着重金属浓度的增 加而不断减少，体腔细胞总致也受到重金属的影响，单位重量的细胞数目也逐渐减少 但是砷为l o m g k g 时，诱导1 4 天后，单位重量的细胞数量反而增加这也说明，蚯 蚓对重金属污染有一定的忍耐性。 关键诃：铜，砷，体腔细胞，中性红保持时间，饱饮能力，细胞黏附性 中国农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h er e s e a r c h i s b a s e d o n t h e a r t i f i c i a l s o i l t e s t ( o e c d - g u i d e l i n e n o 2 0 7 ) w i t he a r t h w o r m a s t h ei n d i c a t o r d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fc o p p e ra n da r s e n i ca r et e s t e do ne a r t h w o r me i s e n i a f o e , l 讹，l y s o s o m ea n dc o e l o m o c y t e si n v o l v e di nt h ed e f e n s er e a c t i o n , b yw i n c hw ec o u l da s s e s s t h et o x i c i t yo fh e a v ym e t a l so nc a r t h w o r m sa ti n d i v i d u a la n dc e l ll e v e lt h cr e s u l t so ft h er e s e a r c h a r ca sf o l l o w s ： 1 n ec o e l o m o c y t e so fe a r t h w o r ma r ec l a s s i f i e di n t of o u rc a t e g o r i e s ：c h i n r a g o c y t e s , n e u t r o p i n l a c i d o p h i l ，b a s o p h i l a tt h e m ct i m e ，d i f f e r e n te x t r a c t i o np r o t o c o l sa r et r i e dt oo b t a i nt h e c o e l o m o c y t e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eh r g e an u m b e ro f2 0 3 x 1 0 0c e l l sc a l lb eh a r v e s t e d u s i n gu l t r a s o u n dp r o t o c o l , h o w e v e r , t h ec e l lv i a b i l i t yi st h el o w e s t i ti so p p o s i t ew i t ht h ef i b e r n e e d l ee x t r a c t i o n ，t h ec e l lv i a b i l i t yc o u l dr e a c h8 0 5 e l e c t r i c a le x t r a i o ni sw i d e l yu s e df o r i t sc o n v e n i e n c e 乞l y s o s o m ci su s e da st h eb i o m a r k e r m e n o - c o n t a m i n a t i o no fc ua n da si si n d u c e do nt h e e a r t h w o r m u n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s ，t h ea v e r a g en r ri s9 4 3 m i n t h er e s u l t si n d i c a t et h a l a f t e ri n d u c e m e n t , t h ec a n h w g r o w t hr a t e sa r eo b v i o u s l yr e d u c e d t h en e u t r a lr e dr e t e n t i o n t i m ej sa l s os h o r t e n e d m o r e o v e r , i ft h em e t a lc o n c e n t r a t i o ni sh i g h e ra n dt h ee x p o s u r et i m e l o n g e r , t h er e t e n t i o nt i m ec o u l dc v e nr e d u c et o 姗n r ri sc l o s e l yr e l a t e dt ot h em e t a l c o n c e n t r a t i o na n de x p o s u r et i m e 3 t h ep i n o c y t t z e dc r y s t a lv i o l e ta n dn e u t r a lr e db yt h ec o n t r o lc o e l o m o c y t e sa r er e s p e c t i v e l y 4 2 9 u ga n d1 5 3 u g w i t ht h ee f f e c t so fh e a v ym e t a l s , t h ec e l la c t i v i t yi ss e r i o u s l yi m p a i r e d t h cp i n o c y a z e dc r y s t a lv i o l e ta n dn e u t r a lr e dd e c r e a s e sg r a d u a l l yw i mt h ei n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no fh e a v ym e t a l s t h et o t a ln u m b e ro fc o e l o 娜i sa l s oa f f e c t e db yt h eh e a v y m e t a l sa n dt h ec e l ln u m b e rp e rw e i g h ti sl e s s e n e d h o w e v e r ，t h ec e l ln u m b e rp e rw e i g h ti s m a n i f o l dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fa r s e n i ci s1 0 m g k ga f t e r1 4d a y s e x p o s u r e , w i n c h i l l u s t r a t et h a te a r t h w o r mh a ss p 嘶矗ce n d u r a n c ef o rt h ep o f l u f i o no fh e a v ym e t a l s 1 【e yw o r d s ：c 0 孵a r s e n i c , c o e l o m o c y t c s ，n e u t r a lr e dr e t e n t i o n , p i n o c y t o s i s ，c e l la d h e r e n c e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 一虢栅军 时间：7 研年多月f 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间：年月日 时间：堋年白雁 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 蚯蚓在土壤的物理、化学和生物过程中扮演重要的角色它们在土壤中分布广泛，在有 机质降解、营养循环和土壤形成中起重要作用，同时蚯蚓通过加速碳的分解，影响生态系统 的碳分配，还能直接或问接地控制植物群落的组成，促进植物群落的演替，影响陆地生态系 统在食物链中，蚯蚓是陆生生物与土壤生物之间传递污染物的桥梁，是一种非常重要的环 境有毒物质的非靶标陆生土壤生物。它们是生态系统中的重要物种并被广泛用做环境污染的 生物指示者( b - r mda 1 ，1 9 9 6 ；s c o t t - f o r d s m a n da n dw e c l r b , 2 0 0 0 ) 因此，常常利用蚯蚓对陆生 环境有毒物质进行生态风险评估 重金属，主要来自人类活动的，在土壤污染中已经形成一种主要的复合物组c y a r o n d a l ， 1 9 9 回它们都是土壤生物的基本元素，但是浓度较大时它们可能直接对生物体产生毒害 ( r a a r a d e l l a s d a l 。1 9 9 7 ) 铜是生命所必需的微量元素，但过量的铜对人和动、植物都有害 环境化学污染物中，砷是最常见、危害居民健康最严重的污染物之一特别是随着现代工农 业生产的发展，砷对环境的污染日趋严重土壤环境中重金属盐的毒性效应直接与暴露剂量 和时间有关，低浓度暴露下，生物体能够恢复正常以对细胞毒性效应的大小，重金属可以 分为三类口a t r ae ta l ，2 0 0 4 ) ：( 1 ) 效应极显著的重金属为c d 、c u 、h g 、c o 、n i 和b c 等； ( 2 ) 效应显著的重金属为z n 、a 1 、m n f e 、s c 、s r 、s b 、c a 和砸等；( 3 ) 效应相对较弱 的重金属为m g 、v 、a s 、m o 、b a 和孙等 蚯蚓的抗萤免疫系统由先天免疫防街屏障、细胞免疫和体液免疫三个方面组成。蚯蚓的 免疫防御体系由防止异物侵入的外部屏障结构和防止侵入后进一步蔓延的内部免疫机制所 组成后者又分为自然免疫和获得性免疫，包括细胞免疫和体液免疫在蚯蚓的免疫防御体 系中，屏障结构和自然免疫起主要作用，故又将这两者总称为自然抵抗力，而获得性免疫不 发达蚯蚓免疫系统作为土壤重金属污染指示物已经得到了证实，而且免疫系统比较敏感经 常并容易发生变化，因此，蚯蚓免疫系统可被用作免疫毒性的早期指示者 溶酶体对中性红保持时间的分析在环境风险评定与常规检测中有潜在的作用，因为它能 在没有引起蚯蚓生理损害前准确地预测生态毒性中性红保持时间已经被确定作为蚯蚓对污 染物响应的生物标记，如重金属铜、锌镍、铅和镉( o a u s es v e n d s e ne t a l ，1 9 9 7 ；s p u r g e o nd j d4 l 。2 0 0 0 ；, s c o t t f o r d s m a n dda l ，1 9 9 8 ) 。具有免疫活性的体腔细胞和它们的生存能力是用来 评估免疫毒性风险的一种最有前途的分析方法饵u da 1 ，1 9 9 6 ；b u t c h 甜a l ，1 9 9 9 ；f u g e ：r e 甜 a l ，1 9 9 6 ) 土壤重金属污染是为世界所关注的主要问题，利用土壤动物尤其是蚯蚓开发和构 建土壤重金属污染的敏感指示物。充分利用蚯蚓免疫系统对环境污染的敏感性从细胞水平、 亚细胞水平甚至分子水平来评价土壤重金属污染情况，对制定我国土壤环境质量基准和标准， 开展土壤污染毒性评价和土壤生态功能诊断均有重要的意义 中目农业大学硕士学位论文第一章文献综述 1 2 国内外研究现状 1 2 1 蚯蚓体腔细胞的提取与分类 到目前为止，许多方法已经被用来获得蚯蚓的体腔细胞。通过刺破体腔有时候可以很容 易得到体腔细胞并且对细胞没有损害早期获得蚯蚓体腔细胞都是依据物理的方法。对蚯蚓 形成了损害在1 9 7 3 年，v a l e m b o i s 等人用机械以及电压刺激的方法来诱导体腔细胞从蚯蚓 体孔捧出随后，c p c 堤出利用尖的巴斯德吸管来获得陆正蚓的体腔细胞随着对体腔细 胞实验要求的提高，提取方法也不断改进r o d r i g u e z - g r a n 等人提出了一种获得陆正蚓体腔 细胞的非损伤性方法，后来e y a m b e ( 1 9 9 1 ) 详细描述了这种方法。这种方法的创新之处在于应 用酒精作为刺激物并加入了黏渡溶解物这样得到的细胞数量约是原来方法的两倍因为蚯 蚓表面有很多微生物，为了防止提取体腔细胞被污染，通常加入抗生素以及抗菌剂 ( v a l b o i se ta 1 ，1 9 7 3 ；c o o p e r , 1 9 7 4 ；t o u p i ne t 以，1 9 7 7 ) 最近，d i o g e n e ( 1 9 9 7 ) 等人在一个真 空的容器中利用酒精刺激的方法提取细胞以减少污染 v a l e m b o i s 以形态学和来源为基础对蚯蚓的体细胞进行了分类蚯蚓的细胞可以分为两 个含有自由细胞的部分；1 ) 具有红细胞的血液系统，这一部分似乎与免疫关系不大；2 ) 体 腔液中的几种细胞群所有这些体细胞都不同程度地与细胞免疫过程有关，或者通过它们的 分泌作用与体液免疫相关此外，捧除速度快、特异性小、记忆时间短是蚯蚓细胞免疫防卫 系统的三大标志无脊椎动物自环节动物( 蚯蚓等) 起分化出专司吞噬功能的细胞，并能异物 趋化移行，主动的吞噬销毁异物在蚯蚓中，先天性以及适应性免疫的细胞功能是通过不同 的体腔细胞( 白细胞) 起作用的，这些细胞分布在体腔中，和其他的功能细胞类型一样，它 们不连续的特性主要取决于可用的技术和化验方法( c o o p e ra 1 。2 0 0 2 ) 根据它们超显微以及细胞化学的特性，三种主要的蚯蚓自细胞群能够被清楚的定义和确 定：透明的，粒状的阿米巴样细胞和组织黄细胞( c o o e r , 1 9 9 6 ) 这些细胞群曾经被几个作 者分成更多的亚群( s t e i ne t a l ，1 9 7 7 ；j a m i e s o n , 1 9 8 1 a ) 。流式细胞术测定的物理参数能够辨别 出两种细胞类型( 小的和大的体腔细胞) ，这些细胞有不同的功能特性( c o o p 日e t a l ，1 9 9 5 ； c o s s a r i z z a d 口，1 9 9 6 ；q u a g l i n o e t a l ，1 9 9 6 ；c o o p e r 甜a 1 ，1 9 9 9 ) 2 0 0 2 年，e n g e l m a n n 等人用流 式细胞术测量法鉴定出三种不同的体腔细胞群承1 ，r 2 ，r 3 ) ，它们与先前鉴定出的主要体 腔细胞群相对应在与其他门不同的物种中，有关免疫细胞同族关系的信息几乎没有然而， 对于功能方面，就有许多相同保守机制例子( c o o p e r e ta l 。2 0 0 2 ) 。同时，这些研究也有助于 理解无脊椎动物免疫系统的进化并且已经产生了应用于环境诊断有用的细胞生物标志物，体 腔细胞的个体发生学、来源以及功能仍然没有完全搞清楚。 到目前为止，蚯蚓体腔细胞主要依据不同的染色方法。超微结构形态学、它们包含颗粒 的化学性质以及功能特性如黏附性与趋向性( m m e dd 矗2 0 0 2 ) 。主要分两种体腔细胞群， 称为阿米巴样细胞与油细胞) ( c o o p e r a n d s t e i n ，1 9 8 1 ) 它们在不同的物种中有不同的比例 ( k u r e k e t a l ，2 0 0 2 ) 这些细胞类型的来源仍然存在争议有的人指出，阿米巴样细胞来自体 腔的间叶细胞群( - l a m e d d a l ，2 0 0 2 ) ，而油细胞( 组织黄细胞) 是从黄色细胞分化出来的， 黄细胞覆盖在消化道与血管的表面( a f f a r 甜a ，1 9 9 8 ) 。两种类型的细胞都参与吞噬功能 ( a d a m o w i c za n dw o j t a s z e k , 2 0 0 1 ；e n g e l m a n ne fa l ，2 0 0 4 ) ，细胞毒杀( s u z u k ia n dc o o p e r , 1 9 9 5 ； 2 中国农业大学硕十学位论文 第一章文献综述 c o s s a r i z z a e t a l ，1 9 9 6 ；k a n s c h k e e t a ，m 0 1 ) i = ! a r g 被j 明( v a l e m b o i s e t a l ，1 9 9 2 ) 。 1 2 2 蚯蚓体腔细胞的功能 s t e i n 等发现，蚯蚓体内除了组织黄细胞外，所有类型的体细胞都产生伪足，并具有吞 噬能力。蚯蚓的透明细胞与粒状阿米巴样细胞有吞噬作用和包囊作用；然而，粒状的阿米巴 样细胞吞噬的异物比其他的体细胞类型少主要的白细胞至少有两种：小的和大的，它们调 节对几种肿瘤细胞的裂解反应生物体外肿瘤细胞的杀伤作用表明，噬菌作用和自然杀伤细 胞反应是这些白细胞最明显的特性这也推动了对其他系统中的免疫功能和调节更新的 探索 组织黄细胞( c h l o r a g o c y t e s ) 没有噬菌活性但是它们发挥好几项功能包括营养，捧泄以 及细胞毒素和抗菌分子的产生( v a l e m b o i se t a 。1 9 8 5 ；d a l e sa n dk a l a q1 9 9 2 ) 粒状的阿米巴 样细胞经常脱粒到细胞外的空间。这时它们就分布在体液中，就如同脊椎动物的血清( c o o p e r a n d s t e i n , 1 9 8 1 ) 这些效应细胞( 所有的体腔细胞) 在先天免疫应答中的角色以及有关环境 毒理的作用都进行了研究( c o o p e r , 1 9 6 9 ；e y a m b e 甜a l ，1 9 9 1 ；c a n c i oe ta l 。1 9 9 5 b ；v i l l ee l a 1 。 1 9 9 5 ，1 9 9 7 ；r o c he t 口1 9 9 6 ) 有几篇文章讨论组织黄胞( c h l o r a g o c y t e s ) ，它们是蚯蚓白细 胞特有的免疫防御群组织黄细胞的细胞质被称为黄细胞色素体( c l d o r a g o s o m e s ) 的颗粒填 满这些细胞器官大小在1 劫m 之间并且有益于几种酶的活性( 酸性磷酸酶，b 葡糖苷酸酶 过氧化物酶， 萘基醋酸酯酶酶活性) 这些相同的酶与脊椎动物的溶菌酶特性有关所以， 许多作者已经提出，组织黄细胞的色素体可能是溶菌酶的起i 原( c a n c i o e l a ，1 9 9 5 a ) 组织黄 细胞色素体对磷脂和酸性磷酸酶指示组织化学着色( v t ca n dm o r e , 1 9 9 9 ；p e e t m , 2 0 0 0 ) 其他的蚯蚓免疫细胞对酶的特性还没有进行广泛的研究：然而，这些细胞也包含酸性磷 酸酶( s t e i na n dc c 日p 町，1 9 7 8 ) 这些溶菌酶在蚯蚓的免疫机制中扮演一定的角色，它包含杀 菌的行为( m a r k s 甜a 1 ，1 9 8 1 ) 和伤口愈合( c o o p 口a n d r o c h , 1 9 9 2 ；v i l l ee t a 。1 9 9 5 ；c i l m t o v i c 甜 口1 9 9 9 ) 以r 移植捧斥过程( c o o p e r , 1 9 7 5 ) 。其他无脊椎动物细胞在它们的溶酶体中展示不同 的酸性水解酶活性，而溶酶体与抗病菌应答有关( c a s ie t 口l 。2 0 0 2 ) 在受感染的软体动物 中。血清酸性磷酸酶水平的提高负责消灭寄生虫曼氏血吸虫的孢子囊( c , r a n a t ha n dy o s h i n o , 1 9 8 3 ；c h e n ga n dd o u g h e r l y , 1 9 8 9 ) 蛤的血细胞中通过酵母细胞的诱导后就拥有永解酶和氧化 酶( c i m ae ta 。2 0 0 0 ) 。 蚯蚓( 赤子爱胜蚓) 的体液包含几种白细胞( 体腔细胞) 嗜碱性细胞，嗜酸性细胞，嗜中 性粒细胞以及组织黄细胞小的体腔细胞和体腔细胞溶解产物对瘤细胞k 5 6 2 有细胞毒作用 利用透射电子显微镜，通过免疫细胞化学的方法检测到一种溶解因子的表达。通过光学显微 镜方法，被一种鼠抗穿孔素单克隆抗体标记的大部分都是小体腔细胞( 2 0 ) 有许多小细胞 质颗粒的体腔细胞被标记的最多，而含有大溶酶体颗粒的细胞也被标记但不是很强烈不论 是在光学显微镜下还是电子显微镜下，组织黄细胞都没有抗体的结合细胞免疫功能涉及能 够消灭瘤细胞和外来抗原的胞溶细胞蚯蚓体腔细胞已经被证明能够杀死瘤细胞( s u z u k ia n d c o o p e r , 1 9 9 5 ；c o o p e rda l ，1 9 9 5 ；c o s s a r i z z ae ta 1 ，1 9 9 6 ；q u a g l i n od 口f ，1 9 9 6 ) 电子显微镜表明，有两种主要的细胞群：1 ) 能结合到靶细胞的小粒状细胞，如k 5 6 2 ； 接着细胞毒作用就在靶作用物结合位点与明显存在的细胞质颗粒相伴发生；2 ) 大的非颗粒 3 中国农业大学顾士学位论文第一章文献综述 噬菌细胞随后处理死细胞。杀死瘤细胞的体细胞间接细胞毒作用就如同脊椎动物自然杀伤性 细胞的细胞毒攻击人类和小鼠自然杀伤性细胞和细胞毒t 淋巴细胞的颗粒包含几种细胞毒 性因子，它们能通过直接的效应靶细胞相互作用杀死靶细胞蚯蚓体细胞效应物的细胞毒 作用很像自然杀伤性细胞脊椎动物细胞毒活性效应细胞同瘤细胞k 5 6 2 共同培养的电子显 微镜观察显示出穿孔紊调节活性( o u a # i n oda 1 ，1 9 9 6 ) 1 2 3 温度对蚯蚓体腔细胞的影响 冷血动物便于研究周围温度对一系列生理机能的影响，包括细胞水平的研究温带地区 的蚯蚓在春天和秋天时活性最强。为了避免极端的温度，动物经常会在不同的土壤层中穿行 来利用天然的庇护所( p i z a b1 9 8 6 ) 应对低于冰点的策略基于生理上的适应，它们合成低 温防护物来防止组织间冰的形成( h o l m s t m pa n dp e t 目s e n , 1 9 9 7 ) 并通过油脂脂肪酸成分的变 化来调整细胞膜流体性( p e t e r s e na n dh o h n s t r u p , 2 0 0 0 ) 低温也影响蚯蚓的代谢( g u p p ya n dw i t h e r s , 1 9 9 9 ) ，如呼吸活性( u v a r o v , 1 9 9 8 ) 冷敏感 性是由季节决定的，很多实验已经研究温度对体腔细胞的影响，如它们的吞噬活性( s t e i na n d c o o p c r ，1 9 8 1 ；c o s s a r i z z a 甜口1 9 9 6 ) ，细胞毒性( c o s s a r i z z a 甜a 1 ，1 9 9 6 ) 以及氧气消耗( v a 把 a n dm o r e ，i o t a ) f i s c h e r 和m o l n & r 0 9 9 2 ) 的研究表明，冷应力导致黄色组织的改变并且这个 现象可能与蚯蚓适应环境条件有关行为性体温调节能够对低温或高温的短期暴露是有保护 的在细胞水平。热激蛋白在赤子爱胜蚓体腔细胞应对温度变化中起发挥作用( k u t e ke 以，2 0 0 1 ) 对于较长时间的温度变化，热适应会出现赤子爱胜蚓中发现这种现象：动物体 腔细胞在i o c 下适应一个周后在低的外界温度下比来自高温度适应个体的细胞更加有活性 ( s t a n h e w i c za n dp l y t y c z 1 9 9 8 ) 在冬季，蚯蚓能够在低于0 c 下生存，而这个温度在春天对 它们来说是致命的( k a s p n a k , 1 9 s 6 ) 在冬天，体腔细胞活性在低温时( 0 和1 0 c ) 比较高； 而在其他季节( 尤其是夏天) 其活性在2 2 最高，这说明细胞具有热适应性( a g a t ak u r e ka n d b a r b a r ap l y t y c z ，2 0 0 2 ) 1 3 蚯蚓生态毒理学研究概况 1 3 1 选择蚯蚓作为环境污染指示物的原因 很显然这是因为蚯蚓对土壤环境的重要性和认为它是土壤动物区系的代表类群。但根据 g r e i g - s m i t h ( 1 9 9 2 ) ，选择一种或一类生物作为环境的指示生物必须至少满足下面两个条件： 可以从一个常常是随机选择的种类所测定的适度范围得出一个统计性结论，也就是说可以 通过对一个物种较少个体数量的毒理测试来决定某种化学药品对整个土壤动物区系的安全 水平；试验动物应对毒素敏感，易暴露于毒素，同时便于迸行研究蚯蚓在壤中有机物 质的分解转化上具有重要作用，同时其活动可以改善土壤的结构，增强土壤的透气和摊水保 水功能。因此在土壤中保持健康的蚯蚓生态种群对于土壤环境的保护具有重要价值而从生 态学上来看，蚯蚓处于陆地生态食物链的底部，对大部分杀虫荆( e d w a r d sa n dt h o m p s o n ， 1 9 7 3 ) 和重金属( c a r t e r e ta l ，1 9 8 3 ；i r e l a n d , 1 9 8 3 ) 都具有富积作用这些被富积的化学物质可 能并不对蚯蚓造成严重的伤害，但却可能影响食物链中更高级的生物。同时蚯蚓对某些污染 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 物比许多其他土壤动物更为敏感，因此利用蚯蚓作为土壤环境的指示生物，可以提供一个保 护整个土壤动物区系的安全域值。此外蚯蚓体型较大，分布广泛，易于养殖，因此十分便利 于研究和监测工作的进行 1 3 2 蚯蚓生态毒理学研究方法 蚯蚓生态毒理学是指利用蚯蚓作为载体对可能造成土壤环境污染的化学物质进行测试， 并根据这些化学物质对蚯蚓的毒害程度来评价其可能对生态系统及其组分的危害程度。因 此，可以通过研究各种农用化学品对蚯蚓的毒性，来评价这些化学品对环境安全的影响关 于蚯蚓的生态毒理与环境安全指示研究试验方法可分为实验室急性毒性试验、真实生态系统 中的田间毒性试验、污染环境的生物检测和生理、细胞及分子等微观水平毒性指标检测等几 个方面。评价对象涉及到重金属、有机农药和一些持久性有机物( 如p a h s ) 等几大类化学污 染物 1 急性毒性试验法 严格地讲，急性毒性试验法并不是严格意义上的生态毒理学试验，但因其有一定的使用 价值而得到了重视与发展，特别是该方法能简单、快速地对化学品的生态毒性做出初步的判 断，鉴定出被测物质对蚯蚓有无明显的毒害作用，以避免错误的负面影响然而，对于那些 被测出在相应浓度上对蚯蚓有明显毒害作用的物质则应考虑进一步研究关于实验室急性毒 性试验方法，目前广为采用的有以下4 种方法滤纸接触法( c o n t a c t 坷t c rt c s t x o e c d 指导准 则n o 2 0 7 ) 这种方法是通过成体赤子爱胜蚓( 腑缸加以口) 在填充标准化滤纸的玻璃器 皿中与不同浓度的供试化学药品接触4 砧后测定其死亡率，并可通过统计学方法得出半致死 浓度( t , c s o ) 。人工土壤试验法缸衄d a ls o i ll c s i x o e c d 指导准则n o 2 叨通过将成熟的 赤子爱胜蚓置于含有不同浓度供试化学品的人工土壤中培养1 4d ，观察其行为和存活状况， 用统计学方法计算出半致死剂量( t d 5 0 ) 通常，人工土壤由1 0 的苔藓泥炭细土o h = 6 ) 、 2 0 的高岭粘土( 高岭土) 、6 9 的工业石英砂和1 的c a c 0 3 ( 化学纯) 组成人造土壤试 验法( a r ts o l lt c s t ) ( f a l w a r d s 1 9 8 4 ；a f n o r x 3 1 2 2 5 0 ) 这是用一种无定形水和改性的二氧化硅粉 r 商品名：l e v n i t c ) ，并在其中加入玻璃球以代替人工土壤的实验方法自然土壤试验法 ( n a t u r a ls o i l t e s l ) 即采用天然土壤为蚯蚓生活基质，其他与人工土壤相同的实验方法这种 方法对特定地区的环境安全评价具有重要意义。 2 田问试验法 蚯蚓的田问生态毒性试验法是指在实际的生态系统中直接测试某化学物质对蚯蚓种群 的生态毒性试验评价指标包括蚯蚓种类、数量和生物量等调查采样方法包括福尔马林法， 电激法、手采法等，或几种方法混合使用试验应具备以下几点：测试地点土壤中至少包 括6 种普通蚯翦f 。其数量最好在每平方米1 0 0 条以上；选择壤土为基质迸行试验，避免粘土 和砂土，因为前者可能使化学品凝结，而后者则不利于蚯蚓的生长；选择至少在5 年以上 未有用过化学品的土壤进行试验，并在实验前对土壤的化学品残留进行分析；每一浓度至 少应有4 个重复，每一样本最好为5 1 0 m 3 ；由于蚯蚓在春秋两季活动最强，因此建议试 验从春季开始。持续到秋季结柬，但对持久性化学品，实验时间应在2 年以上；测试化学 品在蚯蚓及土壤中的残留情况，以评估化学品在蚯蚓体的富集作用和对食物链的影响；可 5 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 一能的情况下，建议与标准化学品的毒性进行比较分析 3 生物标记法 生物标记法是指通过现代生物学实验手段，考察化学品或环境中化学残留物对蚯蚓的生 殖、呼吸、代谢、免疫等生理指标和细胞微观结构、酶活性、染色体、基因等细胞和分子指 标的影响，从而评价这些化学品的环境安全性这是一个新兴的热门研究领域，对蚯蚓生态 毒理学研究的深入发展及蚯蚓的环境安全指示具有重要意义一方面，由于其具备高度的敏 感性，可在进入环境中化学品未扰乱生态系统平衡前对这些化学品的毒性影响进行预警；另 一方面，它能够直接、精确的透视污染暴露引起的生物效应，特别是能特异性地检测到环境 中的致癌，致畸和致突变化合物的生物利用性 1 3 3 外源污染物对蚯蚓个体水平的影响 陆地生态毒理学中蚯蚓的重要性反映了它们作为生态系统工程师的公认地位( l a v e l l e ， 1 9 9 7 ) 蚯蚓标准化的急性( i s o l l 2 6 8 - 1 ，1 9 9 3 ) 与繁殖0 s o1 1 2 6 8 - 2 , 1 9 忉毒性试验已经被证明 是评估土壤污染物风险非常有用的工具这些试验通过死亡率、繁殖与其他亚致死点来对土 壤污染进行评价( 1 廖k k ca n dv a ng e s t e l ，1 9 9 s ) 这些试验提供了关于测试复合物对个体与种 群的毒性效应：然而，关于个体在它们的环境下对暴露于污染物到底如何反应，这些标准化 的试验没有提供这方面的信息蚯蚓，就像其他的土壤生物，可能会回避甚至污染最轻的土 壤，这也会影响生态系统的功能( s a l m i n e na n ds u l k a v a , 1 9 9 6 ；h u n d - r i n k ea n dw i e c h e r i n g , 2 0 0 1 ；h u n d r i n k ee t a l , 2 0 0 3 ) 因而，蚯蚓对污染物的行为反应能够显示对风险评估程序生 态相关的信息 当暴露于重金属有害浓度的时候，蚯蚓将不能发挥它们在壤中的重要作用( e d w a r d s a n db o m e n , 1 9 9 旬通过调节体内的重金属浓度以及从避免污染较重的土壤而进入污染较轻 的区域，蚯蚓能够减少重金属可能的毒性效应( d a i l i n g e r , 1 9 9 3 ；m a t h e ra n dc h r i s t e n s e n , 1 9 9 8 ) 蚯蚓能够感知各种系列的刺激物。这些反应主要在它们口前叶以及其他前部体节的化学受体 节形成，一部分在其他体节的结节( f a w a r d sa n db o h l e n , 1 9 9 6 ) 对化学药品敏锐的化学受体 以及较高扩散能力使得蚯蚓回避不利的栖息地。研究表明。赤子爱胜蚓和陆正蚓回避被特 定有机复合物，如苯菌灵和三硝基甲苯以及一些杀真菌剂和杀虫剂( y e a r d l e y e t a l ，1 9 9 6 ； s l i m a k , 1 9 9 7 ；r e i n e c k e e t a l ，2 0 0 2 ；h u m r i n k e 甜a l 。2 0 0 3 ；s c h a e f e r , 2 0 0 3 ) 因而，蚯蚓的回 避反应可能为评估污染土壤潜在有害性提供有力的灵敏性。尽管实验室中研究观察到蚯蚓趋 向于回避一些土壤中的一些有机物，然而关于蚯蚓回避重金属污染土壤的数据很少然而， 大田观察显示，重金属污染地区的蚯蚓很少或者根本就没有这可能是回避行为和扩散到污 染较轻地区的结果也有可能是土壤中致死金属的存在k k a i ie ta 1 ，2 0 0 4 b ) 。 在温带草原和落叶林地，蚯蚓无论是在生物量、还是在食用树叶方面都是无脊椎动物分 解者群落的优势物种英国的阿芬默斯，冶炼厂释放到空气中的镉，铜、铅和锌严重污染了 工厂附近的土壤( a o p k i n , 1 9 8 9 ) ，距厂房6 0 0 米处，土壤表面死亡的草的含铅量大于干重的 2 ，含锌量接近4 ，s p u r g e o ng a o p k i n ( 1 9 9 9 ) 对春夏秋冬四季的详细采样结果显示，在2 个距厂房最近的地点( o 6 k m ) ，完全没有蚯蚓，在较远的5 个地点( 3 蛐与对照比较，也显 著地减少。在距工厂最近的地方，物种丰富度( s p c c i c sr i c h n e s s ) 也最低，有些种类的蚯蚓， 6 中国农韭大学硕士学位论文第一章文献综述 i 如背暗流蝎 ( a p o r r e c t o d e ac a l i g i n o s a ) 和绿色异唇蚓c 4 l l o l o b o p h o r ac h l o r o t i c a ) 在离冶炼厂较 远的、相对干净的地方占优势，以相对各类组成所作的多元聚类分析将所研究的地域分成了 三类这类研究有力地证明，有机物质累积及伴随的对营养循环的破坏与具有分解作用的关 键无脊椎动物的消失有关 v a ns t r a a l ( 1 9 叻认为，将生理生态学( e c o p h y s j o l o g y ) 与多元统计分析结合起来，是 s o i l p a c s 的进一步发展和完善的方向在阿芬默斯，对地表移动的无脊椎动物的研究已经 采用了这种方法( r e a d e t a l ，1 9 9 8 ) ，使用主成分分析( p r i n c i p a lc o m p o n e n t sa n a l y s i s ) 和典型相 ， 关分析( c a n o n i c a lc o r r e s p o n d e n c ea n a l y s i s ) 发现，影响林地不同物种组成的主要因素是金属污 染的程度受金属污染的土壤中蚯蚓种群的减少，可能会引起不降解的树叶垃圾的堆积，正 常情况下。这些树叶垃圾被蚯蚓迅速转化成粪便，供微生物更快速的降解，而使营养物质返 回到土壤中供新的植物生长。但由于受到金属污染，营养物质被滞留在死亡的树叶中 1 3 4 外源污染物对蚯蚓细胞免疫的影响 近几年来，污染土壤的评估主要是基于化学分析和致死或者繁殖测试活体生物需要一 种敏感的、亚致死生物标记物来对评价毒性，并能指示环境受到的不同影响免疫系统可被 当作各种化学物的靶器官越来越多的研究表明，环境污染物链够对人类以及野生动植物产 生负面的影响暴露于环境免疫毒素的人群免疫力会下降而容易感染疾病在野生动植物物 种中，研究的重点是因病毒而大量死亡的海洋哺乳动物免疫情况个别化学物对免疫功能产 生负面影响的可能性已经利用啮齿动物进行了广泛的研究，对有毒物作用的机制进行了评估 并且注意到自体免疫的疾病。许多种环境污染物在调节免疫功能中都发挥作用，包括重金属、 苯、五氯苯酚以及杀虫剂等( v o s ，1 9 7 7 ；f a i r b r o t h e r , 1 9 9 3 ) 尽管这样的研究提供了造成危险 以及机制的数据，但是通过这些研究来推断环境污染物混合体对遗传多样性种群的影响是很 难的。另外，免疫活性重叠的功能与相互补偿的机制、神经内分泌以及繁殖因素的复杂性， 那么建立功能改变与对疾病抗性变化之间的直接联系就变得更加困难。同脊椎动物复杂的免 疫系统相反，无脊椎动物相对简单的免疫系统使得其成为监测环境污染物影响的一重敏感而 可用的方法 蚯蚓的细胞免疫主要包括吞噬作用和包囊作用；体液免疫则是以非特异性免疫为主蚯 蚓细胞免疫防御反应主要包括噬菌作用和包被作$ ( l a u l a nda 1 ，1 9 8 8 ；b i l e je t 口l ，1 9 9 0 ；b i l e j e t a l ，1 9 9 1 ；v e t v i c k a d 以1 9 9 3 ) 或其他的炎症反应( s t e i na n d c o o p e r , 1 9 8 3 ；c o o p e r , 1 9 8 6 ) 以 及适应性细胞免疫防御反应吞噬作用是动物界最古老的防御机制，并且这一机制经常与氧 化代谢有关，只有具有高氧化能力的自由基的产生才可以有效地破坏吞入的微生物。其过程 大致包括3 个过程：1 ) 识别异物并将其吸附在细胞表面；2 ) 摄入细胞；3 ) 排出或细胞内 消化，细胞与异物共生或细胞崩解各种微生物，包括病毒、细菌、真菌以及原生动物等，都 可以被蚯蚓体内的吞噬细胞所吞噬。只有在抗原物质比吞噬细胞大时，才能发生包囊作用 包囊作用是用来保护蚯蚓免遭寄生虫侵害的有效途径之一蚯蚓对大的、不能吞噬的外源物 质的防御作用通常是通过体腔内形成褐色体来完成的。所谓的褐色体是由于体细胞对进入的 外源细胞( 如细菌、簇虫、外来片段) 或修饰的“自身结构”的聚集作用形成的，并且在褐 色体中发现了脂褐质和黑色素。受到挑战的无脊椎动物系统影响吞噬作用、包埋作用、凝集 7 中国农业大学顾士学位论文第一章文献综述 作用、调理作用、凝结作用和溶解作用，它们都可以用来指示环境污染物对蚯蚓的影响，其 中污染物对其吞噬作用的影响研究最多。 免疫系统易受外源化学物的损害，主要表现在免疫器官的不健全甚至死亡然而。在这 之前，免疫系统的一些成分经常已经发生显著的变化，这些成分可被用作免疫毒性的早期指 示者或用作生物标志物( f o u m i e r “a l ，2 0 0 0 a , b ；b r o u s s e a u d a l ，1 9 9 7 a , ”细胞防御主要包 括自由体腔细胞、吞噬细胞与白细胞的活性有关蚯蚓免疫系统细胞与体液产物已经进行了 详细论述( c o o p e r a n d r o c h ，1 9 9 3 ) 到目前为止，蚯蚓免疫系统如何能够被用作污染指示物 的技术已经进行了探索( c h e ne t a l ，1 9 9 1 ；e a s o n e t a l ，1 9 9 9 ；e y a m b e e t a l ，1 9 9 1 ；f i t z p a t r i c k e t a 1 ，1 9 9 0 ) 应激反应与免疫系统的深