（水产养殖专业论文）鲮mrfs家族基因克隆与myf5因子的snps分析.pdf

书。 愀煳 上海海洋大学学位论文原创性声明。 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本 人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明 和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识 到本声明的法律结果由本人承担。 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借 阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文。 本学位论文属于 保密 口 不保密 r - i 学位论文作者签名： 日期：2 0 1 0 年0 6 月1 4 日 ，在年解密后适用本版权 指导教 日期：日 1 n n 4 上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注 李桂峰中山大学教授主席 ， 中国水产科学研究 喻达辉研究员委员 院南海水产研究所 中国水产科学研究 罗建仁研究员委员 院珠江水产研究所 中国水产科学研究 卢迈新研究员委员 院珠江水产研究所 中国水产科学研究 白俊杰研究员委员 院珠江水产研究所 中国水产科学研究 赵建研究实习员秘书 院珠江水产研究所 中国水产科学研究 答辩地点：答辩日期： 2 0 10 - 6 - 14 院珠江水产研究所 上海海洋大学硕士学位论文 鲮m r f s 家族基因克隆与缈行因子的s n p s 分析 摘要 鲮( c i r r h i n u sm o l i t o r e l l a ) 属鲤形目、鲤科、野鲮亚科、鲮属。俗称土 鲮鱼、鲮公、雪黔、花鲮。分布于珠江、闽江、韩江、海南岛、台湾岛、元江及 澜沧江水系，国外见于东南亚。鲮在珠江流域地区与草鱼，鲢，鳙合称四大家鱼， 是江河捕捞和池塘养殖的主要对象之一。 生肌调节因子m r f s 家族包括m y f s , m y o g , m y o d 和m y f 6 四成员，基本功能 是促进成肌细胞的增殖和分化，其中m y o o ，m y f 5 决定着肌卫星细胞是否能启动 成为具有成肌特性的肌肉干细胞，而m y o g 和m y f 6 则发挥着调节肌肉干细胞终末 分化为肌管肌纤维的功能。通过m r f s 家族基因的典型性的碱性b h l h 螺旋一环一 螺旋结构它们能够与e 蛋白形成二聚体，再与肌肉特异性基因如肌球蛋白轻链基 因和肌酸激酶等的上游调控序列e - b o x 结合，从而激活这些基因的表达。 本实验以珠江水珠江水系的东江，北江，西江3 个江段种群的野生鲮作为试 验对象，先克隆到m r f s 家族基因的c d n a 序列并进一步获得基因组序列，再利用 生物信息学方法，分析其基因结构，蛋白质结构、并预测基本生物学功能，通过 s s c p ( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o i y m o r p h i s m ，s s c p ) 的方法对鲮m y f 5 基因进行s n p s ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ) 检测，以获得与生长性状 相关的s n p s 位点，并对该位点的基因型在各江段种群中的遗传分布及群体遗传 结构进行研究，为鲮分子标记辅助育种奠定基础。同时构建了两种等位基因型的 p c d n a 3 1 ( 一) m y c h is b - m y f 5 真核表达载体，通过肌肉注射法注入鲮鱼部肌肉， 观察体内过量表达m y f 5 基因对鱼体胚后时期的肌肉促生长作用。还利用定量 - p c r 和免疫组化技术，鉴定不同水平的表达情况，分析野生型与突变型m y f 5 基 因对肌肉纤维生长的影响，为生肌调节因子m r f s 家族在鱼类肌肉生长发育过程 中的作用机制的研究奠定基础。 以下为实验主要内容： 1生肌调节因子m r f s 家族基因克隆：通过r t p c r 技术，g e n e - w a l k i n g 技术， 以及热不对称- p c r 技术克隆获得m r f s 家族基因各成员的c d n a 序列和基因序列。 获得 y f 5 基因序列为2 51 6 b p ，c d n a 序列1 11 5 b p ，o r f 框为7 2 3 b p ，有3 个外显 子和2 个内含子，编码2 3 9 个氨基酸残基组成的蛋白质分子：获得m y o d 基因序 列为1 5 9 6 b p 。c d n a 序列1 1 9 6 b p ，o r f 框为8 2 8 b p ，有3 个外显子和2 个内含子， 编码2 7 5 个氨基酸残基组成的蛋白质分子：获得m y o g 基因序列为2 5 9 5 b p ，c d n a i 上海海洋大学硕士学位论文 序列1 3 2 2 b p ，o r f 框为7 6 2 b p ，有3 个外显子和2 个内含子，编码2 5 3 个氨基酸 残基组成的蛋白质分子；获得m y f 6 基因序列为1 4 6 1 b p ，c d n a 序列7 6 5 b p ，o r f 框为7 6 2 b p ，有3 个外显子和2 个内含子，编码2 3 8 个氨基酸残基组成的蛋白质 分子；通过在线分子生物信息预测其蛋白质的一级结构，以及二级结构，并发现 在蛋白质空间结构上，都含有相同的b - h l h 结构。 2通过s s c p 的方法对鲮m y f 5 基因进行s n p s 检测，以获得与生长性状相关的 s n p s 位点： 用单链构向多态性s s c p 的方法分析了m y f 5 基因在珠江水系3 个不同江段鲮 中的遗传变异，分布及群体杂合性等群体遗传信息。发现其编码区非常保守，仅 在外显子4 1 2 位点处发生突变c t 。对该位点进行基因型分析，结果表明：北 江段鲮中该位点符合h a r d y w e i n b e r g 平衡，而东江和西江段种群不符合 h a r d y w e i n b e r g 平衡，3 个江段种群总体上符合h a r d y - w e i n b e r g 平衡，存在较 大基因流，并以m y f 5 基因该位点的多态性分析表明，3 个种群未出现明显分化； 通过该位点的遗传结构分析表明：3 个江段种群杂合度都较高，中度信息含量 ( 胧及多态信息指数，即该位点有较好的变异性及遗传多态性。3 个江段种 群总体上该位点在不符合h a r d y w e i n b e r g 的情况下a a b b ，并由该位点群体杂 合性及中性分析表明该位点突变群体具体良好的多态性且不遵循中性选择模式， 说明b b 型个体受到自然选择。鲮m y f 5 基因的c 4 1 2 t 与其生长有相关性，可作为 候选基因标记，用于鲮生长相关分子标记辅助育种研究。 3 构建p c d n a 3 1 ( 一) m y c h i s b - m y f 5 表达载体重组子( 预实验结果) ： 根据获得的基因序列，设计引物，再通过r t p c r 获得两种型的o r f 。将野 生型和突变型m y f 5 基因的o r f 定向克隆至p c d n a 3 1 ( 一) m y c h i s b 载体。以鱼生 理盐水溶解重组子，分别在同一条鱼的两测注射。分别在0 h 、1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、 4 8 h 提取r n a 作表达在r n a 水平检测，分析两种表达载体重组子表达量及不同时 间段表达量的变化，3 0 天之后作免疫组化检测蛋白水平表达。r n a 水平检测表明 有明显提高m y f 5 基因表达量，免疫组化检测蛋白水平也表明外源载体在肌肉内 有表达。 关键词：鲮，m r f s ，s s c p l i 上海海洋大学硕士学位论文 c l o n eo fm u dc a r pm r f s f a m i l yg e n ea n ds n p sa n a l y s i so f a b s t r a c t s e v e r a lm o l e c u l a rm a r k e r sw e r eu s e di nm u d c a r pg e n e t i cd i v e r s i t yr e s e a r c h ；t h e r e i sn oc h o i c e n e s sm u dc a r p ( c i r r h i n u sm o l i t o r e l l a ) i np r e s e n tc u l t u r e t h r e ep a r to f p e a r lr i v e rd r a i n a g ew i l dm u dc a r p ( cm o l i t o r e l l a ) w e r es a m p l e da se x p e r i m e n t a t i o n f i s h ，a n dp c r - s s c p ( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) w a su s e dt o s c r e e n 蚴庐o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) d n as e q u e n c e ，e x p e c t i n gt of i n ds n p st h a t r e l a t i v et o g r o w t ha n d t r a i t m u d c a r p ( c i r r h i n u sm o l i t o r e l l a ) ，b e l o n g s t o c y p r i n i f o r m e s , c y p r i n i d a e ，c i r r h i n u sm o l i t o r e l l a ，d i s t r i b u t i n gi np e a r lr i v e r , m i n g r i v e r , h a nr i v e r , h a i n a nt a i w a na n ds o u t h e a s to fa s i a n i ti sa ni m p o r t a n tf i s h e r y p r o d u c t i o ni np e a r l - r i v e rd r a i n a g ea r e a m y f 5g e n e ( m y o g e n i cf a c t o r5 ) i sam e m b e ro f m r f sg e n ef a m i l y , w h i c hi n c l u d em y f 5 ，m y o g ，m y o da n dm y f 6 t h ep r i m a r y f u n c t i o no ft h eg e n ef a m i l yi sa d v a n c em y o b l a s tm u l t i p l i c a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n t h ef u n c t i o no fm y o d , m y f 5g e n ei st oi n i t i a t et h ed i f f e r e n t i a t i o np r o c e s so ft h a t m u s c u l a rs a t e l l i t ec e l l st ob em u s c l ed e r i v e ds t e mc e l l a n dm y o g ，m y f 6g e n ew e r e t h o u g h tt ob ei n v o l v e di nr e g u l a t i n gt h ed i f f e r e n t i a t i o np r o c e s so fm u s c l ed e r i v e ds t e m c e l lt ob em y o t u b ea n dm u s c l ef i b e r s a l lo ft h o s ef u n c t i o n sw e r ei m p l e m e n t i n gb yt h e t y p i c a lb h l hs t r u c t u r eo fm r f sf a m i l y , w h i c hf o r md i m e r i cb yc o m b i n i n gw i t h e p r o t e i n t h e nk e yg e n ei sa c t i v a t e da n dp r e s s e db yt h ed i m e r i cr e c o g n i z eu p s t r e a m e - b o x m a n ys p e c i em r f sg e n eo rc d n a s u c h 舔m u sm u s c u l u s , b o st a u r u s , s u s s c r o f a , o v i sa m m o n , g a l l u sg a l l u s , d a n i or e r i o ，c y p r i n u sc a r p i o ，m i c r o p t e r u s s a l m o i d e ，o n c o r h y n c h u sm y k i s s 1m r f sc l o n e d ： m y f 5g e n ew a s c l o n e dw h i c hi n c l u d et h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n st h a tr e s p e c t i v e l y l e n g t hi s4 5 3 b p ，7 6 b p ，1 9 4 b pa n d1 3 il b p ，9 0 b p ( g e n e b a n ka c c e s s i o n ：g u 2 8 9 5 0 8 ) t h ee d n as e q u e n c eo fm y f 5g e n ew a so b t a i n e db yr t - p c r t h el e n g t ho ft h ee d n a i si10 4 b p ，a n d7 2 3b po r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) w a si d e n t i f i e d ，w h i c hs h a r e d9 3 6 h o m o l o g yw i t ht h a to fc y p r i n u sc a r p i o ，8 5 9 h o m o l o g yw i t hd a n i or e r h 9 i t e n c o d e sap e p t i d eo f2 4 0a m i n oa c i d sw h o s ec a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h ti s 2 6 2 8 8 3lk da n dt h e o r e t i c a li s o e l e c t r i ci s6 0 8 m y f 6g e n ew a sc l o n e dw h i c hi n c l u d e t h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n st h a tr e s p e c t i v e l y l e n g t hi s 5 0 7 b p ，9 4 b p ，116 b pa n d 1 7 1 b p ，5 2 5 b p t h ee d n as e q u e n c eo f m y f 6g e n ew a so b t a i n e db yr t - p c r a n d7 1 7 b p o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) w a si d e n t i f i e d ，w h i c hs h a r e d8 9 2 h o m o l o g yw i t hd a n i o m 上海海洋大学硕士学位论文 r e r i o i te n c o d e sap e p t i d eo f2 38a m i n oa c i d s m y o dg e n ew a sc l o n e dw h i c hi n cl u d e t h c e ee x o n sa n dt w oi n t r o n st h a tr e s p e c t i v e l yl e n g t hi s5 0 9 b p ，7 8 b p ，2 38 b pa n d 14 6 b p ，15 4 b p a n d8 2 8 b po r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) w a si d e n t i f i e d ，w h i c hs h a r e d w h i c hs h a r e d9 5 7 h o m o l o g yw i t ht h a to fc y p r i n u sc a r p i o ，9 2 h o m o l o g yw i t h d a n i or e r i o i te n c o d e sap e p t i d eo f2 7 5 a m i n oa c i d s m y o gg e n ew a sc l o n e dw h i c h i n c l u d et h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n st h a tr e s p e c t i v e l yl e n g t hi s6 5 4 b p ，10 6 b p ，119 b p a n di14 8 b p ，12 3 b p ，a n d7 6 2 b po r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) w a si d e n t i f i e d ，w h i c h s h a r e d8 4 h o m o l o g yw i t hd a n i oe e r i e i te n c o d e sap e p t i d eo f2 5 4a m i n oa c i d s a l l o ft h ea as e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e yh a v et h et y p i c a lt r a i tb - h l hs t r u c t u r e o fm r ff a m il y c o m p a r e dw i t ht h eo r f , t h eb o u n d a r i e so fe x o n sa n di n t r o n sa r e c o n f i r m e d ，a l lf o l l o w i n gt og t - a gr u l e 2m u dc a r pg e n o m ed n aw a se x t r a c t e df r o mf l e s hm u s c l eo ft h r e ep a r to fp e a r l r i v e rd r a i n a g ew i l dm u d c a r p ，a n da n a l y z e db yp c r - s s c p ： t h ep o p u l a t i o ng e n e t i ci n f o r m a t i o na b o u tg e n e t i cd i s t r i b u t i o n ，v a r i a t i o na n d h e t e r o z y g o s i t yo fm y f 5g e n ew a sa n a l y z e du s i n gp c r - s s c pi nt h r e ep a r to ft h ep e a r l r i v e r t h eo n l yo n em u t a t i o nc ta tb a s ep o s i t i o n412o ft h ew h o l ec d sw a sf o u n d a m o n gi n d i v i d u a l si nw h o l eg r o u p t h r o u g hf u r t h e ra n a l y z eo f t h ep o s i t i o n ，i tc o u l d b ei n f e r r e dt h a tt h eg e n o t y p e sd i s t r i b u t i o no fm y f 5i nt h r e ep a r t so ft h ep e a r lr i v e r w e r en o ti na c c o r d a n c ew i t ht h eh a r d y w e i n b e r ge q u i l i b r i u me x c e p tt h en o r t ho ft h e p e a r lr i v e rs u b g r o u p ，a n dn o ti na c c o r d a n c ew i t ht h eh a r d y - w e i n b e r ge q u i l i b r i u mi n w h o l eg r o u p a l lo ft h et h r e eg r o u p sh a v eh i g hh e t e r o z y g o s i t ya n dm o d e r a t ep i c ， w h i c hi n d i c a t et h a tt h em u t a t i o ni sh i g hd e g r e ei nt h eg r o u p sa n df i n eg e n e t i cd i v e r s i t y f u r t h e r m o r e ，t h e r ei so b v i o u sd i f f e r e n t i a lb e t w e e no b s e r v e dv a l u e sa n de x p e c t e d v a l u e st h a ti n d i c a t et h ee v o l u t i o ni sd i s c o r dw i t ht h e o r yo fn e u t r a ls e l e c t i o n i nw h o l e o ft h ep e a r lr i v e ra ，ba l l e l ei st h a tn o ti na c c o r d a n c ew i t ht h eh a r d y w e i n b e r g e q u i l i b r i u m ，h i g hd e g r e em u t a t i o n ，f i n eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dd i s c o r dw i t ht h e o r yo f n e u t r a ls e l e c t i o n t h en u m b e ro fa at y p ei sm o r et h a nb bt y p ee v i d e n t l y , t h e c o n c l u s i o nt h a tb bt y p ei n d i v i d u a lh a v eb e e ns e l e c t e dc a nb em a d e c o n s e q u e n t l y , t h e s n p sc a nb eu s e di nt h eb r e e d i n gp r o c e s s ，a v o i d i n gt h eb bt y p ea sp a r e n t s f r o mt h e m o l e c u l a rl e v e l ，t os p e c u l a t e ，p h o s p h o r y l a t i o ns w i t c hs i t ec h a n g e do rd i s a p p e a r e d b e c a u s eo ft h em u t a t i o n ，r e s u l ti nd e c l i n ei nt h ei n d i v i d u a i i i f ef o r c e t h i si si nt h e n e e do ff u r t h e re x p e r i m e n t s 3t h em y f 5o r fw a sc l o n e di n t op c d n a 3 1 ( - ) m y c h i s bp l a s m i dt oc o n s t r u c tt h e e u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sd i s s o l v e di n 0 6 8 n a c i ，i n j e c t e di n t ob l a c km u s c u l a r , t h es a m ep o s i t i o no ft h eo t h e rs i d ew a si n j e c t e d u s i n gt h en o n - r e c o m b i n a n tp l a s m i da sa c o n t r 0 1 r e a lt i m e - p c ra n dh i s t o c h e m i c a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x o g e n o u sg e n em y f s ：m y c h i sw a sl o c a l l yt r a n s c r i b e da n d t r a n s l a t e di nv i v oi nt h ee x p e r i m e n t a ls i d eb u tn or e s u l t sd e t e c t e do nt h ec o n t r o ls i d e i v 上海海洋大学硕士学位论文 i n j e c t e dw i t ht h ep c d n a 3 1 ( - ) m y e h i s bp l a s m i d k e yw o r d s ：m u dc a r p ，m r f s ，s s c p v ， 上海海洋大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 目录v i 前言1 1 野生鲮鱼分布与养殖现状介绍1 2 分子辅助育种中常用的分子标记1 3 国内外关于与生长相关的功能基因的研究现状4 4 鱼类骨骼肌的发生与成肌调节因子m r f s 6 5 国内外关于与生长相关基因s n p s 技术的研究现状7 6 国内外在水产方面关于s n p s 的研究进展8 第一章鲮鱼生肌调节因子( m r f s ) 家族基因c d n a 序列及基因序列的克隆与分析 1 ( ) 1 材料与方法：1 0 1 1 实验材料1 0 1 2 主要试剂及引物合成1 0 1 3 基因组d n a 与总r n a 提取1 2 1 4r t - p c r 与p c r 扩增1 3 1 5p c r 扩增产物的克隆和测序1 3 1 6 生物信息学分析序列分析1 4 2 结果与分析1 4 2 1 提取的d n a ，r n a 如图：1 4 2 2m r f s 家族基因p c r 扩增结果：c d n a 序列及推测的从序列1 5 2 3 各家族成员的碱性螺旋一环一螺旋( b a s i ch e l i x - l o o p - h e li x ，b h l h ) 结构 2 ( ) 2 4m r f s 家族基因克隆结果：2 l 3 讨论2 1 第二章鲮k t y f 5 基因的s n p s 分析2 2 1 材料与方法2 2 1 1 材料2 2 1 2d n a 的提取2 2 1 3 引物合成与p c r 扩增2 2 v i 上海海洋大学硕士学位论文 1 4p c r - s s c p 分析2 2 1 5 统计分析2 3 2 结果与分析2 3 2 1p c r - s s c p 结果分析2 4 2 2 该位点在不同江段鲮的基因型和基因频率统计以及遗传变异结果2 4 3 讨论2 6 第三章m y f 5 真核表达载体的构建及其在鱼体中的表达初步分析( 预实验) 2 8 1 实验材料2 8 1 1 实验鱼2 8 1 2 克隆质粒和菌株2 8 1 3 引物和酶2 8 1 4 试剂盒一2 8 1 5 免疫组化试剂2 8 2 实验方法2 8 2 1 重组子m y f 5 基因的改造2 8 2 2 重组质粒的构建2 9 2 3 转化子的筛选与鉴定3 0 2 4p c d n a 3 1 ( 一) m y c h i s b m y f 5 在鱼体内的表达检测3 0 3 实验结果3 2 3 1p c d n a 3 1 ( 一) m y c h i s b - m y f 5 重组质粒的构建3 2 3 2r n a 水平表达的变化初步结果：3 3 3 3 免疫组化实验检测翻译水平的表达3 4 4 讨论3 4 4 1 真核表达载体p c d n a 3 1 ( 一) m y c h i s 的选择3 4 4 2 外源质料直接注射法与基因表达3 4 展望：3 5 1 过量表达外源m y f 5 基因对肌纤维直径和密度的影响3 5 2 野生型和突变型外源m y f 5 基因在体内表达对肌纤维的影响3 5 全文总结3 6 附录1 中英方对照缩略词表( a b b r e v i a t i o n s ) 4 3 附录2p c d n a 3 1 ( 一) m y c h i s b 载体图4 5 附录3 常用试剂与缓冲液的配制4 6 在读期间取得成果4 8 v u 上海海洋大学硕士学位论文 1 上- 一 刖昌 1 野生鲮鱼分布与养殖现状介绍 鲮( c i r r m n u sm o l i t o r e l l a ) 属鲤形目、鲤科、野鲮亚科、鲮属。俗称： 土鲮鱼、鲮公、雪鲶、花鲮。英文名：m u dc a r p 。分布于珠江、闽江、韩江、海 南岛、台湾岛、元江及澜沧江水系，国外见于东南亚。以着生藻类为主要食料， 常以其下颌的角质边缘在水底岩石等物体上刮取食物，亦食一些浮游动物和高等 植物的碎屑和水底腐植物质。性成熟为2 冬龄，生殖期较长，从3 月开始，可延 至8 、9 月。鲮鱼在珠江流域地区与草鱼、鲢、鳙合称四大家鱼，是江河捕捞和 池塘养殖的主要对象之一，鲮鱼的产量约产该地区淡水渔业的产量的1 3 。目 前我国的鲮鱼是由野生种家养驯化而成的，缺少定向选育，加上多年来不注重亲 本留种需遵守的操作规程，鲮鱼种质的质量急剧下降，主要表现在，性成熟年龄 提前、生长速度下降、饵料转化效率低、对环境不利影响和疾病的抵抗力下降， 己严重制约我国鲮鱼养殖业稳定、健康和可持续发展。因此，培育出生长速度快、 抗寒能力强、性状优良的鲮鱼品系是我国水产养殖的当务之急。优良的品种对水 产养殖业起着十分重要的作用，是养殖业的重要基础。我国近几十年来先后培育 出一系列的优良品种。这些优良品种先后被列入国家重点推广计划，大量应用于 生产，取得了十分显著的经济效益和社会效益。但与发达国家水产养殖业相比， 我国水产良种的复盖率还很低，不能满足社会发展的需要。目前，常规育种方法 主要还是依据表型进行选择。但是，由于鱼类的表型性状易受外界条件的干扰， 常常不能真实地反映基因型，因而造成常规育种周期长、工作量大、效率低、预 见性差。 2 分子辅助育种中常用的分子标记 在随着分子生物学的发展，遗传标记己逐渐从形态标记、细胞标记扩展到生 化、分子水平标记和d n a 标记。d n a 标记是继形态标记、生化标记等之后一种新 的遗传标记，它是指能反映生物个体或群体间基因组中某种序列差异特征的d n a 片段。 目前应用较为广泛的分子标记包括：限制性内切酶酶切片段的长度多态性 ( r f l p ) 、随机扩增d n a 多态性( r a p d ) 、微卫星d n a ( s s r ) 、d n a 指纹印迹( d a f ) 、 扩增片段长度多态性( a f l p ) 、单核苷酸多态性( s n p s ) 等。 ( 1 )随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p li f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，简称r a p d ) r a p d 技术自1 9 9 0 年w i l lj a m s 等心一1 提出以来，在动物、植物、微生物种属 鉴定，亲缘关系的划分，多态性分析及遗传图谱的构建中得到广泛应用。由于 上海海洋大学硕士学位论文 r a p d 技术不需要先获得生物基因本身特异的核苷酸序列，所以适合在还处于起 步阶段的鱼类分子生物学领域应用。如郑光明h 5 1 等利用随机扩增片段长度多态 性d n a ( 1 泔d ) 对珠江流域不同江段鲮进行了初步的遗传研究。获得在珠江流域 鲮多态性偏小的结论。由于进行r a p d 分析时可用引物数量很大，故利用一系列 随机引物可以使检测区几乎覆盖整个基因组。此方法简便易行，需要样品量少， 对模板d n a 质量要求不高；其缺陷：几乎所有的r a p d 都是显性遗传，无法区分 等位基因的纯合性与杂合性；由于扩增极为灵敏，易受外源及污染d n a 的干扰、 重复性较差，不利于不同研究者或不同实验室的结果进行比较。 ( 2 )序列特异性扩增区( s e q u e n c e - - c h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ，s c a r ) s c a r 标记是在r a p d 技术基础上发展起来的呻1 。s c a r 标记是将目标r a p d 片段进 行克隆并对其末端测序，根据r a p d 片段两端序列设计特异引物，对基因d n a 片 段再进行p c r 特异扩增，把与原r a p d 片段相对应的单一位点鉴别出来。s c a r 标 记是共显性遗传，待检d n a 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。s c a r 标 记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。 ( 3 ) 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 是1 9 9 3 年荷兰科学家z b a e a u 和v o s 发展起来的一种检测d n a 多态性的新方法 引。a f l p 是r f l p 与p c r 相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解 基因组d n a 产生不同大小的d n a 片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接， 作为扩增反应的模板d n a ，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在 接头互补链的基础上添加i - 3 个选择性核苷酸作引物对模板d n a 基因再进行 选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的d n a 扩增片段，根据扩增 片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基 序列、限制性内切酶识别序列、引物3 端的选择碱基序列( i - 1 0b p ) 。接头与 接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该技术的独特之处在于所用的 专用引物可在知道d n a 信息的前提下就可对酶切片段进行p c r 扩增。为使酶切 浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切 点数较少，因而a f l p 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。a f l p 结合 了r f l p 和r a p d 两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。 缺点是操作较为繁琐，对基因组的覆盖率不够理想，对模板反应迟钝，谱带可能 发生错配与缺失；a f l p 标记为显性标记，不能区分纯合子与杂合子；聚丙烯酰 胺电泳胶片段的回收较麻烦，而且受专利保护，它的技术费用昂贵，对d n a 的 纯度和内切酶的质量要求很高。尽管a f l p 技术诞生时间较短，但可称之为分子 标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。 ( 4 ) 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， 上海海洋大学硕士学位论文 简称r f l p ) r f l p 是最早的一种分子遗传标记，1 9 8 0 年由b o s t e i n 砷1 等首先提出，其原理是 限制性内切酶能识别d n a 分子中特定的核苷酸序列，并将基因组中的d n a 分子降解 成许多长短不一的酶切片段，经电泳、印迹后再与d n a 探针杂交并放射自显影， 便可检测至u r f l p 的存在。其优点是共显性标记，可以区别纯合子和杂合子；里孟 德尔遗传且不受环境的影响、稳定性强重复性好。缺点是对d n a 的量要求大、检 测步骤复杂、工作量大、成本高、多态检出率低，只能检出内切酶识别位点的变 异，提供的信息量有限；放射性标记使其应用受到一定的限制。 ( 5 ) d n a 扩增指纹( d n aa m p l i f i c a t i o nf i n g e r p r i n t i n g ，d a f ) d a f 是1 9 9 1 年c a e t a n o - a n o l l e s 等开展的一种基因组分析策略n 。它是利用 非常短的随机引物( 7 - 8 b p ，甚至5 b p ) 对不同模板d n a 的酶链式扩增，采用高 分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色检测d n a 的多态性，引物比r a p d 更短， ， 因而扩增产物更多，可用于病毒、细菌、真菌、植物和动物基因组d n a 指纹分析， d a f 结合了r f l p 的可靠性与p c r 的高效性和r a p d 简洁性与方便性，又比r a p d 更稳定，获得的指纹更丰富；与a f l p 、s s r 等相比技术更简单，不需要放射性自 显影和昂贵的试剂盒，同样具有高分辨率，因此利用