（基础兽医学专业论文）鲁西黄牛耳组织cDNA文库的构建及Tβ4基因的克隆与表达研究.pdf

摘要 鲁西黄牛是我国重要的濒危物种之一，构建鲁西黄牛的c d n a 文库对于鲁西黄牛 遗传资源的保存以及牛基因功能的研究具有重要意义。 本研究为构建鲁西黄牛c d n a 文库和胸腺肽b4 ( tb4 ) 基因的原核表达载体，首 先由实验室提供的鲁西黄牛耳缘组织成纤维细胞中提取总r n a ，采用s m a r t 伯技术成功 构建了鲁西黄牛耳组织c d n a 文库。所构建的鲁西黄牛耳组织e d n a 文库未扩增文库滴 度为2 8 8x1 0 6 p f u m l ，扩增后文库的滴度为1 3 3 1 0 mp f u m l 。从扩增文库中随机 挑取9 6 个克隆进行了p c r 电泳鉴定，结果表明重组率为9 2 7 ，插入片段平均大小 为1 o k b 。然后利用构建好的鲁西黄牛耳组织c d n a 文库，以噬菌体转化为质粒的方法 筛选出t1 34 基因，成功构建了tb4 基因的原核表达载体p g e x - 4 t - 1 - t1 34 ，并设置 诱导剂i p t g 的浓度梯度进行诱导表达，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测p g e x - 4 t 一1 - t1 34 融合蛋白的表达。结果显示，与对照组相比，实验组在3 2 k d 左右的位置出现t1 34 融合蛋白的表达带，表明tb4 基因在b l 2 1 菌中表达成功。本试验为进一步研究t1 3 4 基因的生物学功能奠定了基础。 关键词：鲁西黄牛：耳组织c d n a 文库；t1 34 基因；基因克隆；原核表达 c o n s t r u c t i o no fe a rt i s s u ec d n a l i b r a r yo f l u x iy e l l o wc a t t l e a n dt j 3 4g e n ec l o n i n ga n de x p r e s s i o n a b s t r a c t l u x iy e l l o wc a t t l ei so n eo fi m p o r t a n te n d a n g e r e ds p e c i e si nc h i n a , a n dt h e c o n s t r u c t i o no fe d n a l i b r a r yo fl u x iy e l l o wc a t t l ei sv e r yi m p o r t a n tt os a v et h eg e n e t i c r e s o u r c e 未a sw e l la st os t u d yt h eg e n ef u n c t i o n s t h et o t a lr a nw e r ee x t r a c t e df r o me a rf i b r o b l a s tc e l l so fl u x iy e l l o wc a t t l e ，a n dt h e e a rt i s s u ee d n al i b r a r yw e r ec o n s t r u c t e db yu s i n gs m a r t t mt e c h n i q u ei nt h i ss t u d y t h e i d e n t i f i c a t i o nr e s u l ts h o w e dt h a tt h ef i t e r so fu n a m p l i f i e da n d a m p l i f i e de d n al i b r a r yw e r e 2 8 8 x 1 0 6 p f u m la n d1 3 3 x 1 0 m p f a g m l r e s p e c f i v e l y 9 6c l o n e sw e r er a n d o m l ys e l e c t e d f r o mt h ea m p l i f i e dl i b r a r ya n da n a l y z e db yp c re l e c t r o p h o r e t i ca n a l y s i s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a t i o nr a t ew a s9 2 7 a n dt h ea v e r a g es i z eo fi n s e r tf r a g m e n t s w a s1 0 k b a n dt h e nt h y m o s i nb e t a4g e n ew a sc l o n e da n di t sp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r p g e x - 4 t 一1 t i m ，w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d t h ep g e x 一4 t 一1 一t p 4f u s i o np r o t e i nw a s d e t e c t e db yu s i n gs d s p a g ef o l l o w i n gt h ei n d u c e de x p r e s s i o no fd i f f e r e n tg r a d i e m c o n c e n t r a t i o no fi p t g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o ns t r i po ft 肛f u s i o np r o t e i n w a sa p p e a r e da t3 2 k dc o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ，i n d i c a t e dt h et p 4g e n ew a se x p r e s s e di n b l 21 s u c c e s s f u l l y t h e r e f o r e ，t h e s ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sw o u l de s t a b l i s ht h ef o u n d a t i o n f o rf u r t h e rs t u d yo fb i o l o g i c a lf u n c t i o n so ftb4g e n e k e yw o r d s ：l u xi 1 i e l o wc a t tl e ；c d n al i b r a r yo fe a rt 捃s u e ；邛4 ；g e n ec l o n i n g ； p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n dir e c t e db y ：p r o f h a sis u r o n g a s s o c i a t ep r o f g u a nw e i j u n a p p l ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：z h a n g g a ( v e t e r i n a r ym e d i c i n e ) ( a n i m a ls c i e n c em a da n i m a lm e d i c i n e i n n e rm o n g o l i aa g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，h u h h o t 010 018 ，c h i n a ) 内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 蔓堡 日 期：监：五：受 我指 导师指导研究生学位论文的承诺 2 r _ 作的结果，并严格按照国家及学校有关学术道德规范的规定要求而 获得的研究结果如果违反，我必须接受按国家及学校有关规定的处 罚处理并承担相应导师连带责任。 指导教师签名：二季啦日期：j 垒写世 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手 论文作者签名： 章鱼 指导教师签名： 日 期： 2 2 ：臣：6 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 前言 1 1e d n a 文库的应用 基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。将某种生物的总d n a 用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到d n a 分子中，然后转移到适当的宿 主菌中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖，在制各的克隆数目达到可以把某 种生物的全部基因都包含在内时，也就构成了这个生物体的基因文库。它包括e d n a 文库和基因组文库。c d n a 是指在反转录酶的作用下，以m r n a 为模板形成互补的 d n a 。它在理论上代表生物体某一发育时期的所有可以表达的遗传信号。和基因组 文库比较的话，c d n a 文库有着以下优点：库小，容易筛选而且更能直接反映细胞特 征。它在表达基因的功能鉴定方面和研究具体哪种特定细胞中基因组的表达状态具有 特殊的优势。于是，它在个体发育和细胞分化、细胞衰老和凋亡、细胞周期调控以及 调控健康和疾病发生的分子机制等生命现象的研究中具有更广泛的应用价值。c d n a 文库是基因研究工作中最经常使用的基因文库1 2 1 。 二十世纪七十年代中期第一例c d n a 克隆出道以来，陆续涌现出了许多构建c d n a 文库的方法，并有了很大的提高和改进。构建c d n a 文库已经成为研究基因组功能学的 最基本手段之一。目前广泛用于研究某个特定发育阶段的基因表达情况，不同发育时 期的基因表达的变化，分离新的组织特异性基因以及克隆新型细胞因子等。在克隆和 表达方面c d n a 呈现出了最大方便，它不像基因组因含有内含子而不易表达。所以，我 们可以从c d n a 文库中筛选出需要的目的基因并可以直接进行该基因的真核原核表达。 c d n a 文库构建方法的成熟不仅能保护珍稀的濒危生物资源，还能为构建分子标记连镑 图谱提供所需要的探针。更为重要的是它能用在分离全长基因继而进行基因功能的影； 究。我们还能通过各种合适的手段从c d n a 文库中调取c d n a ，为获取目的基因进行基医 工程研究和对其进行功能与结构的研究带来极大的便利1 0 目前，构建一个高质量高标准的c d n a 文库依旧不是很容易的事情，对于c d n a 文库， 最理想的是使用多种筛选方法能从c d n a 文库中有效准确地分离鉴定出目的基因兰 然，构建c d n a 文库本身并不是最终的目的，利用这些文库才是最主要的目的。因此本 文将对c d n a 文库的应用做一简单综述。 1 1 1 分离已知的的基因 c d n a 文库与基因组文库相似的是在c d n a 文库中可以分离出特定的基因。它有库 小、容易筛选等优点，此外，因为c d n a 不存在内含子，故从c d n a 文库中分离出的基 因能直接在大肠杆菌等原核生物中进行表达，该优势便对进一步分析和制备生物产品 提供了极为便利的条件，而且，由于c d n a 的核苷酸顺序和其蛋白产物的氨基酸顺序 之间有着对应关系，对分离出的c d n a 进行测序后，能很轻易地推测出尊编码的蛋白 2 鲁西黄牛c d n a 文库构建及丁1 34 基因的克隆与表达研究 质的氨基酸顺序，这就为搞清基因及其产物的功能和结构开辟出了一条简单易行的通 道。 1 1 2 揭示某些诱导因素对基因表达的影响 某些外界的诱导因素，比如药物、激素、高温、金属离子和致癌物等等，都能引 发细胞、组织或机体的变化，而这些变化更多的是在基因表达水平上的。c d n a 文库的 构建和筛选便为找到这些变化提供了最为有效地方法。找到这些变化之后便可以从理 论上探知这些因素对细胞的影响和作用机制，并且可以通过差异杂交筛选将这些表达 受影响的基因分离出来作进一步深入的研究。相反的，也能从表达变化的程度上推测 出这些诱导因素的强弱程度，例药物的疗效、致癌物的毒性等等。 1 1 3 寻找决定生长、分化、癌变等过程的基因 研究对个体的生长发育、细胞分化、细胞恶变等重要过程中，往往需要从比较不 同组织之间、异常组织和同一组织间以及同一组织或细胞在不同发育阶段内基因表达 的差别入手。迄今为止，已经克隆出了很多和生长分化密切相关的基因，并且已经初 步揭晓了它们的作用，假如只是单一地分析这些基因的表达水平的变化倒也是可以 的，但是这种分析只能在已知的基因上，非常有局限性，并且生长分化过程它自身就 涉及多种基因变化，所以这种分析只能以偏概全。相比之下，从c d n a 文库里进行比较 就会是非常科学的、系统的选择。通过差异杂交筛选，不但能发现在表达上有着差异 的基因，还能对它们进行分离，继而和现存的基因数据库作比较，确定它的类别，也 许会发现新的基因亦或发现某一基因的新的功能。经过对分离出的基因的功能分析， 就可以找出决定性的基因。许多在细胞生长分化和恶变中起着重要作用的基因几乎都 是通过对c d n a 文库差异筛选后分离出来的，在一些方兴未艾的领域，比如抗癌基因的 分离，该方法依旧是最具可靠的途径之一。 1 1 4c d n a 文库在药学中的应用 基因全长c d n a 的克隆是解释分析其基因功能与结构的基础。大规模全长c d n a 的克 隆和表达是功能基因组学发展的新策略，为与疾病相关的基因和与优良性状相关的基 因的筛选提供了有力的研究手段，对新药开发和基因工程疫苗有着重要的意义- 。 在动物医药的领域中，在分子水平上研究病毒的作用机制有着非常重要的意义。 全长c d n a 的克隆则能为进一步研究其基因功能、病毒的致病机理和改造疫苗以及开发 新型疫苗积累资料，为入类将来控制狂犬病、口蹄疫、禽流感和羊腐蹄疫等等动物源 性疾病探讨有效的基因治疗法。通过包含末端序列的全长c d n a ，我们能够更加深入地 了解编码区以外的序列在病毒复制、蛋白翻译和加工、病毒包装、成熟以及释放中所 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 起到的作用，并有针对性地对目的基因进行改造以及修饰，然后结合病毒的逆向遗传 等技术更加深入地去了解病毒的作用机理，从而针对关键的调控位点有目的地设计抗 病毒药物。 如h u l s t 等5 1 为了阐明e o 蛋白的生物学功能和猪瘟病毒弱毒疫苗株c 株( c s f v ) 基因的致病机理，克隆了c s f v 基因的全长c d n a ，同时对其中所含的e o 基因进行突变， 获得了无e or n a s e 活性的病毒突变体，为研制猪瘟病毒药物奠定了扎实的基础。 1 9 5 4 年我国研制出了c s f v 的兔化弱毒疫苗株，为世界很多地区的控制猪瘟做出了 贡献。但由于我国对c s f v 分子水平的研究较晚起步，对于自然感染产生抗体以及疫苗 免疫产生抗体的区别缺乏强有力的证据，最终导致我国兔化弱毒疫苗在西欧很多国家 的推广受到了一定的限制。国内学者们成功构建出了猪瘟病毒石门株、疫苗株以及野 春株( h c v 一3 9 ) 的全长c d n a ，尤其是c 一株全长c d n a 为开发具有生物活性的重组c s f v 标记疫苗奠定了扎实的基础，这些病毒株全长c d n a 的克隆为进一步研究病毒的复制机 理、致弱机制、毒力和决定因素、致病的机理、特异性诊断、基因产物的功能、宿主 的嗜性以及标记疫苗的生产和d n a 疫苗开发等方面的研究打下了坚实的基础。胡建和 等1 构建了中国猪瘟兔化弱毒全基因组c d n a 文库，还进一步构建了它的全长感染性 e d n a ，在分子水平上研究了c s f v 的复制机理、致弱机理、致病机理、毒力及其决定因 素以及基因产物的功能等提供了可靠的依据，并为其在分子水平上对c s f vc 株基因组 全长c d n a 进行操作、体外合成有感染型的r n a 奠定了基础。在以上的基础上，研究c s f v 的分子致病机理、基因产物的功能以及生物新产品的开发，对进一步扩大我国c s f vc 疫苗株在世界各地的推广和有效地预防猪瘟的发生具有重要的意义。 吴艳涛等 1 构建了鸡新城疫病毒( n d v ) 的c d n a 文库。对于新城疫病毒( n d v ) 的 大体结构和发病机理以及在免疫应答中的作用，国内外研究得都比较深入。但是对于 n d v 的其它结构成分的功能了解的并不多。不同的n d v 毒株具有不同的毒力，且差异很 大，它们编码的基因核苷酸序列也具有一定差异的。他们以我国标准n d v 强毒株f 4 8 e 8 的基因组r n a 为模板，构建了c d n a 文库。对从文库中筛选出结构基因，继而为研究n d v 的致病机理在分子水平上的发展打下了厚实的基础。 ： 因此，在以克隆和分析基因全长c d n a 序列为基础的分子生物学技术在开发新药物 与新基因工程疫苗的研究中凸显出了其广阔的前景。 1 1 5c d n a 文库在寄生原虫上的应用 从不同种类虫体的不同发育时期的c d n a 文库中找出特异性基因片段，是虫种鉴定 和种下分类的有效途径之一。近些年来，从经典c d n a 文库的基础上发展起来的标准化 c d n a 文库、染色体及其区域特异性c d n a 文库、减数c d n a 文库，这三种特殊的c d n a 文库 的构建方法采用不同的策略及方法富集特定的c d n a ，为克隆新基因提供了强有力的工 4 鲁西黄牛e d n a 文瘁构建及t 4 基因的克隆与表达研究 具，同时为原虫学研究开辟了一条新的路径。不过，将来仍旧需要有更好的办法来构 建原虫稀有基因的c d n a 文库。 在原虫学领域，因为原虫特异抗原基因的重组d n a 的克隆和表达技术的发展，构 建c d n a 文库作为从分子水平提供虫源抗原基因的手段，已经在获取诊断性与保护性抗 原和研究方面起了重要作用。随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的学者们开 始构建各种原虫的e d n a 文库，紧接着就有新基因与某种基因的新功能被发现，而且已 知基因的结构和功能也被进一步阐明。因此为寄生虫虫种的鉴定和分类研究与原虫病 的诊断和预防奠定了扎实的基础。目前，利用构建好的e d n a 文库筛选出寄生原虫重要 功能基因的研究，主要集中在危害比较严重的几种寄生原虫上，比如疟原虫、隐孢子 虫、鸡球虫等等n 1 。 1 1 6 c d n a 文库在基因芯片中的应用 近些年来，处于分子生物学发展前沿的尖端技术- d n a 芯片技术，其突出的特点是 微型化、自动化、集成化。在基因诊断领域显示出了良好的应用前景，并逐步形成一 项高通量的现代化的新诊断技术( 8 9 1 。 通过构建生物体不同生长时期、不同组织部位的c d n 众文库，结合d n a 芯片技术对 生物体的基因的时空表达进行研究，能发现不同生物体、不同阶段基因的表达情况。 随着终界条件的不断变化，由于生物体对环境条件的适应性，生物体内基因的表达情 况便会不断地发生着各种各样的变化。通过建立生物体不同生长阶段的e d n a 文库同时 结合基因芯片技术，便可及时了解基因的时空表达动态，发现且能克隆与生物体生长 亦或与疾病相关的重要基因，这已经在医学上成为发现疾病相关基因的重要手段之 一。目前微集阵列板可以容纳到两万个e d n a 探针，据估计，一个由1 0 万个不同e d n a 构成的微方阵可通过一次杂交对整个人类基因组的表达情况进行检测。s c h e n a 用热休 克作用与1 0 5 6 个c d n a 微集阵列和佛波酯处理的人类t 细胞的c d n a 进行杂交，结果一共 发现了四个新基因。杨传平等人利用基因芯片技术研究了n a h c o 胁迫下柽柳基因的表 达。将c y 3 与c y 5 两种荧光染料分别标记在对照的柽柳和n a h c 0 处理的c d n a 上，把这两 种荧光探针混合后与载有柽柳基因的高密度芯片进行杂交并且利用芯片扫描系统进 行了扫描，通过c y 3 和c y 5 信号强度比值的计算来研究其基因的差异表达，同时揭示了 柽柳的抗盐胁迫涉及的几种重要途径，并且获得了n a h c 0 胁迫前后柽柳基因的表达谱。 c d n a 芯片技术是以定量的方式同时监测大量基因相对表达的强有力的新方法。它已经 成功地用于同时检测一千多个基因的表达，例如测定人类癌基因和病毒样品的基因表 达水平，还有酵母和植物等等。 生物技术发展迅速，寻找新基因和构建c d n a 文库的技术也在不断地更新提高，正 朝着经济准确、快速简便的方向发展。c d n a 文库的构建已经成为目前基因工程捞作秘 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 分子生物学研究的基础。在经典c d n a 文库的基础上，研究者可根据自己的实际情况， 选择合适的技术，才能达到自己预期的目的n 盯。 1 2 胸腺肽b4 ( tb4 ) 基因研究概述 t 2 1 胸腺肽研究概述 胸腺肽是胸腺组织上皮细胞分泌的多肽激素。1 9 6 1 年，继a r c h e r 和m i l l e r 分 别在家兔和小鼠中发现了胸腺对于淋巴细胞的分化、成熟和免疫活性的获得具有重要 的作用后，许多学者相继从猪、小牛等血清或胸腺中分离得到胸腺肽混合物。胸腺肽 主要作用于t 细胞t 5 1 ，先让其分化增殖成为效应t 细胞，然后诱导细胞免疫反应， 有恢复细胞免疫功能的作用盯。 胸腺肽是一种免疫调节剂，它可以通过很多种途径作用到免疫系统来调节机体免 疫功能的相对平衡汹1 ，在机体的神经内分泌系统、生殖系统、免疫系统中起到非常 重要的调节作用。胸腺肽可以提高机体对细菌病毒感染的抵抗力、协调内分泌、改善 机体的免疫状况1 3 1 。它已被用于多种疾病的辅助治疗，治疗效果明显，在饲料中添 加还可起到促生长作用。它所包含的各种多肽都具有一定的药效，其中一些已经被用 于疾病的治疗。临床试验证实，胸腺肽用于自身免疫疾病的治疗是一种行之有效的治 疗手段豫。 胸腺肽是一类较早应用的免疫性药物，它的药理作用可大致概括为以下几个方 面：一、增强巨噬细胞的吞噬能力和抗原提呈的功能。二、提高白细胞介素一6 的产 生水平。三、促进和诱导胸腺依赖性t 淋巴细胞的分化和成熟。胸腺肽在早期可促进 胸腺内的骨髓干细胞转化为淋巴细胞，并在后期协助干细胞分化成抑制性t 细胞、辅 助性t 细胞、核杀伤性t 细胞等不同的功能亚群t 1 4 1 。这是胸腺肽最基本的调节作用。 四、提高白细胞介素一2 的产生水平并且增加其受体表达水平和受体的亲和力。五、 在肿瘤坏死因子q 不存在或存在的条件下，胸腺肽ql 可促进骨髓来源的树突状细 胞的成熟、分化并且增强其功能1 2 4 1 。 胸腺肽制剂己被广泛地应用于临床。现在胸腺肽主要作用于治疗：自身免疫性疾 病，如类风湿关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮；非小细胞肺癌、恶性黑素瘤、 肝癌、胃癌等恶性肿瘤；乙肝、丙肝等感染性疾病；还可用于肺结核上呼吸道感染、 皮肤病，过敏性紫癜等疾病的治疗 2 t - 秘i 。 g o l d e n 在1 9 7 2 年从小牛的胸腺分离出了胸腺肽组分5 ( t f 5 ) ，它包含有4 0 多种 多肽成分。根据这些多肽在等电聚焦泳分析图谱上的位置划分为q 、0 、y 三个区： q 区p i 5 ，5 6 区 7 ，7 t lx1 0 7p f u l g 的插入载体。 ( 2 ) 取3 支0 5 m l 的灭菌离心管，按下表加样。轻柔地混合样品，应避免产生气 泡，稍作离心后使样品沉到管底。 ( 3 ) 1 6 下连接过夜。 ( 4 ) 分别做入噬菌体的包装。 ( 5 ) n 定每个包装后文库的滴度。从上面三个连接的重组反应中将获得1 - 2 x1 0 6 单克隆。未扩增的文库在4 下可以保存2 周。 ( 6 ) 如果获得的克隆数少予卜2 1 0 6 ，需重复上面的连接操作，并检查样品的 浓度体积还有c d n a 的用量。 ( 7 ) 为增加该文库的稳定性，首次重组子包装后应该马上进行扩增。扩增后的 文库在4 保存6 - 7 个月，加入7 的d m s 0 在- 8 0 能保存一年以上。 内蒙古农业大学硕士学位论文 13 2 2 2 7 入噬菌体的包装 ( 1 ) 从- 8 0 的冰箱中取出包装蛋白。 ( 2 ) 用手温快速解冻，直到包装蛋白开始融解。 ( 3 ) 立即加) k 4 1 1 l 的连接产物。 ( 4 ) 用枪温和混匀要避免产生气泡，然后稍作离一瞄使所有成分处于管底。 ( 5 ) p c r 仪中2 2 ，2 h r 。 ( 6 ) 在管中加入5 0 0 9 ls mb u f f e r 。 ( 7 ) 。再加) 2 0 9 l 氯仿，并温和混匀。 ( 8 ) 得到的未扩增文库可以进行未扩增文库滴度的测定或是在4 c 保存1 个月。 2 2 2 8 未扩增文库滴度的测定 ( 1 ) 钓菌，在不加抗生素的琼脂平板上涂板，3 7 过夜培养。 ( 2 ) 挑取单克隆，在l b 液体培养基( 含0 2 m a l r o s e ，1 0 m mm g s 0 4 ) 中培养。 ( 3 ) 3 7 ，1 6 0 r p m ，摇4 6 h r ，使细菌o d 枷 1 o 。 ( 4 ) 室温离心1 0 m i n ， 1 5 0 0 r p m 。 ( 5 ) 用较少的1 0 m mm g s 0 4 温和地重悬细胞。 ( 6 ) 用1 0 m mm g s 0 4 调o d 枷的值为0 5 。 ( 7 ) 用s mb u f f e r 按l ：2 0 与1 ：1 0 的比例稀释包装产物。 ( 8 ) 吸取稀释后的包装产物1 “l 加到2 0 0 “lo d 枷为0 5 的菌液中。 ( 9 ) 将包装产物和菌液的混合物在3 7 中1 5 m i n 。 ( 1 0 ) 然后加入3 m ll bt o pa g a r 同时立即倒入已备好的l ba g a rp l a t e s 中。 ( 1 1 ) 孵育过夜3 7 。 ( 1 2 ) 数噬菌斑，计算未扩增文库的滴度。 p f u m l = ( 噬菌斑数稀释倍数x1 0 3 ) 铺板的稀释噬菌体体积( g l ) 2 2 2 9 未扩增文库重组率及平均插入片段长度的测定 ( 1 ) 将噬菌斑挑入9 6 个p c r 管中。 。 ( 2 ) 每管加入3 5 “l 的s mb u f f e r ，并充分吹打混合。 ( 3 ) 按下列体系进行p c r 1 0 b u f f e r 2 5 9 l 引物 1 5 1 t l d n t p 2 9 l t a q 酶0 1 5 9 l 模板l “l 1 4 鲁西黄牛c d n a 文库构建及t 多4 基因的克隆与表达研究 d d h 2 0 总体积 1 7 8 5 p l 2 5 p l 反应条件是： 9 4 5 m i n 3 3 个循环： 9 4 5s e c 5 5 4 0 s e c 7 2 i m i n 2 0 s e c ( 4 ) 1 琼脂糖凝胶电泳检测片段长度。 ( 5 ) 根据电泳结果计算重组率和片段平均长度。 2 2 2 10 文库的扩增 准备1 5 0 m m 的平板2 0 个。 ( 1 ) 从v c s 2 5 7 - f 作平板上挑取单克隆，接种于1 5 m ll b m g s 0 4 麦芽糖液体培 养基试管中。1 4 0r p m3 7 ，培养过夜，直到o d 鳓到2 0 ，离，l , 5 m i n ，5 0 0 0r p m m i n ， 弃掉上清夜，用7 5 m l1 0m mm g s 0 4 悬浮沉淀。 ( 2 ) 预热好足够的1 0 0 毫米的l b m g s 0 4 平板。 ( 3 ) 准备2 0 个5m l 的离心管，加入5 0 0 u l 的过夜菌与足够能形成6 7 x 1 0 4 个噬菌 斑的稀释包装样。 ( 4 ) 3 7 水浴锅中1 5 m i n 。 ( 5 ) 每管j j l l 4 5m l 融解的l b m g s 0 4 软性顶层琼脂糖。 ( 6 ) 快速混匀后铺至i j l b m g s 0 4 平板上。 ( 7 ) 将平板在合适的温度上冷却十分钟后将顶层琼脂糖硬化。将平板倒置于3 7 培养6 - 1 8 d 、时，直到噬菌斑相互接触。 ( 8 ) 每个平板上加入1 2 m l 的l l a m b d ad i l u t i o nb u f f e r ，4 c 冰箱里过夜。 ( 9 ) 然后在水平摇床上将平板以5 0 r p m 的速度适温培养1h r 。 ( 1 0 ) 将入噬菌体的裂解液装入消毒的烧杯中，这鄙是综合的扩增文库溶解物。 ( 1 1 ) 清洗噬菌体溶解物。 a 将噬菌体溶解物倒入5 0m l 的灭菌离心管中。 b 加入1 0 m l 的氯仿。 c 拧紧盖，充分混匀2 m i n 。 d 离心1 0 m i n ，7 0 0 0r p m 的转速，把上清夜转移到另一管灭菌的塑料离心管，盖 紧管盖，4 下保存。 内蒙古农业大学硕士学位论文 15 ( 1 2 ) 对扩增文库的滴度进行测定。 ( 1 3 ) 扩增文库在4 下能保存6 个月，若要长期保存，要以每管l m l 分装后 加入d m s 0 到终浓度7 ，- 7 0 弋2 下保存，要尽量避免反复冻融。 2 2 2 1 1 扩增文库滴度的测定 ( 1 ) 从v c s 2 5 7 t 作平板上挑取单克隆，接种于2 0 m ll b m g s 0 4 麦芽糖液体培 养基试管中。1 4 0r p m3 7 ，培养过夜，直到o d 鼬到2 0 ，离一t 二, 5 m i n ，5 0 0 0r p m m i n ， 弃掉上清夜，用7 5 m l1 0m mm g s 0 4 悬浮沉淀。 ( 2 ) 预热好足够的9 0 毫米的l b m g s 0 4 平板。 ( 3 ) 用l l a m b d ad il u t i o nb u f f e r 以l - 1 0 0 0 0 的比例稀释文库。 ( 4 ) 准备四支试管按下表加样 ( 5 ) 水浴，3 7 1 5 m i n 。 ( 6 ) 每支离心管加入3m l 融解的l b m g s 0 4 顶层琼脂糖。 ( 7 ) 快速颠倒混合，然后迅速铺到已3 7 。c 预热好的l b m g s 0 4 平板上同时迅 速铺匀。 ( 8 ) 在合适的温度里将平板冷却十分钟，将顶层琼脂糖硬化。 ( 9 ) 3 7 培养箱中将平板倒置培养6 - 7 小时。 ( 1 0 ) 计算滴度( p f u m l ) p f u m l = ( 噬菌斑数x 稀释倍数1 0 3 g l ( 1 1 ) 成功扩增的文库滴度应该达到l 1 0 m p f u m l 2 3 试验结果 2 3 1 总r n a 的提取 从鲁西黄牛而缘组织成纤维细胞中提取总r n a ，经紫外分光光度计测定， a 2 6 0 a 2 8 0 = 1 9 5 ，浓度为3 3 9 9 p l ，经甲醛变性电泳检测，可清晰地观察到1 8 s 和2 8 sr r n a 鲁西黄牛c d n a 文库构建噩t04 基因的克隆与表选研究 两条明亮的带其中2 8 s ：1 8 s 约为2 ：1 。因此，所提取的总r n a 质量符合要求，如图2 所示。 | 1 固2 鲁西黄牛n * 维细总m 睦变* # 脂# 腔自* f i g2f a l d e h y d c m 瑚g 衅。雠# lelephofisol把tb i r n a f r o m o rl | j x i y e l l o w ( 驯e 23 2c d n a 文库的构建 用3 9 l 总r n a 经反转录后台成第一条链，经l d p c r 合成取链c d n a ( 如图3 ) 。 双链c d n a 混合物再经过蛋白酶k 的消化、s f ii 酶切、c h r o m as p i n4 0 0 层析柱分离 后，收集c d n a 片段大于5 0 0 b p 的组份( 如图4 ) ，用于连接。设置不同的对照组让 t r i p i e x 2s f iia r m s 和洲a 片段连接起来，在1 6 下连接过夜。根据g i g a p a c l 柙 i i ip l u s 一7p a c k a g i n ge x t r a c t 操作试剂盒进行连接产物的包装。 田3 西冀牛l d 呻诉扩增产枸璃t 黻自泳 h 9 3g d d 喇哪t n e 斑时l d 帆叩， 随d l 胜i y e l l o w o d t l e 内蒙古农业大学硕士学位论文 目4 m 鲁i 黄牛m a 柱* 镕 f i 9 4f r 咖b d s ”m 6 1 删e d n a f r o m l 删y e l l o w ( j u k 23 3e d n a 文库的检测 经过检测，鲁西黄牛耳缘组织成纤维细胞e d n a 未扩增文库的滴度为28 8 x 1 0 6 p f l d m l 。文库经扩增后的滴度为1 3 3 x 1 0 ”p f u m l 。随机挑取9 6 个噬菌斑进行p c r ，用 1 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，有7 个为空( 片段长度小于3 0 0 b p 或呈现弥散带) ， 阳性为8 9 个重组率为9 27 ，平均插入片段长度为10 k b 如图5 所示。 目5 鲁日* + c d r a 镕 h n 十p 橙自a f i 9 5 g c ic k 咖口h o r 口i so f p c r 删l f b o f r a n d o mc l 肌ao f l “y j y c i i o w c m l c 24 讨论 要想构建好一个高质量的c d n a 文库，首先必须获得高质量的r n a ，这是至关 重要的。衡量m r n a 质量高低的标准主要有看以下两方面：一是看总p 矿矛降解。 1 8 鲁西黄牛e d n a 文库构建及t b4 基因的克隆与表达研究 为了能够获得高质量的m r n a ，必须采取以下有效的措施。比如使用r n a 酶抑制剂， 焦碳酸二乙酯( d e p c ) ，避免r n a 酶污染，在实验操作过程中采取严格消毒和防止 污染的措施。如果在琼脂糖凝胶电泳上表现为清晰的1 8 s 和2 8 s 两条带，而且2 8 s ： 1 8 s 为2 ：l ，则可以认为该总r n a 的完整性得到了保证。二是看r n a 有无污染。提 取的m r n a 在紫外分光光度计检测，如果a 2 s ( g a 2 8 0 的比值在1 9 0 2 1 0 时，则可认为 r n a 的质量较纯，如果a 2 6 0 a 2 8 0 不在上述范围内，即可说明有较多的蛋白质污染。 本试验从鲁西黄牛的成纤维细胞中提取了总r n a ，在1 琼脂糖凝胶电泳上1 8 s 和2 8 s 两条带清晰，其中2 8 s 1 8 s 约为2 1 ，再经过紫外分光光度计检测a 2 6 0 a 2 的比值， 结果为1 9 5 ，说明本实验提取的r n a 质量很好。 本研究首次成功构建了鲁西黄牛耳缘组织成纤维细胞的全长c d n a 文库，其技术 特点是： ： ( 1 ) 采用了c l o n t e c h 公司的s m a r t 技术，本技术对接头引物和反转录酶都进行 了优化，能有效地去掉不带多聚a 尾的基因组d n a 和r n a ，当反转录进行到m r n a 的5 末 端时，反转录酶s u p e rs c r i p ti i 所具有的“模板跳跃”功能能把一个特定的s m a r ti v 寡核苷酸接头添 j h 至u m r n a 的5 末端，让逆转录酶跳开并继续转录到接头的末端，因 为这种跳跃经常发生在真核生物的帽子结构内，所以只有包含s m a r ti i 寡核苷酸接头 的模板和全长m r n a 才能在l d - p c r 反应中被扩增出来，于是简化了r n a 的纯化过程，并 确保高质量全长c d n a 的获得，同时提高了文库中所含全长e d n a 的比例。 ( 2 ) 在合成c d n a 的第二条链的时候，极为关键的是p e r 扩增的循环数。循环次 数的控制对基因在文库中拷贝数的分布非常重要。适当的循环次数不但能防止低拷贝 数基因的丢缺，还能有效避免高拷贝基因的过分放大。循环次数太少的话易引起c d n a 产量过低。循环次数过多则容易产生非特异性的p c r 产物，也会增多模糊拖带的出现， 而且极易出现许多小分子量的条带( 1 0 0b p ) 。本研究在合成双链e d n a 时，通过设置 不同的对照组，最终确定双链c d n a 合成的最佳循环数是2 1 个。 ( 3 ) 利用c h r o m as p i n4 0 0 层析柱分离c d n a 片段的时候，必须保证所使用的层析 柱的内容物在室温下完全混合均匀，要尽量避免产生气泡，还要充分利用过柱缓冲液 排除掉柱子内的基质间的气泡，不能使基质过于干燥。层析柱的保存和使用必须严格 按照要求在室温下进行，要是在4 保存，在室温下使用，则很容易生成气泡，从于 是干扰分离效果。分离结束后，要进行琼脂糖凝胶电泳检测分离的效果，跑电泳的时 间绝不能超过1 5m i n ，不然条带会变得无法辨认清楚。还有，必须保证文库的高滴度， 还要保证分级分离后的e d n a 浓度，通常是1 0 0 2 0 0n g g l ，e d n a 浓度太高、太低，都会 降低构建文库的质量。 ( 4 ) 本试验在构建文库中，连接步骤使用的是磷酸化的入t r i p l e x 2 载体，有效 阻止了载体的自身连接并且在试验过程中e d n a 的3 和57 端都加入了不对称的s f ii 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 9 b 和s f iia 的酶切位点，运用s f ii 酶切后经过层析柱的分级分离，e d n a 就能直接连 上用s f ii 消化的入t r i p l e x 2 载体。因为天t r i p l e x 2 载体含有不对称的s f ii 酶切位点， 它能减少引物连接而直接进行克隆。因为s f ii 酶切位点在生物体中比较稀少，所以 在s f ii 酶消化之后的e d n a 依旧可以保持完整。除此之外，入t r i p l e x 2 载体还能产生 高滴度的文库，并且进行重组体的蓝白斑筛选、插入片段的调节表达，以方便于从噬 菌体到质粒载体的亚克隆。在每一个插入到入t r i p l e x 2 的e d n a 都能在所有三个阅读框 中得到表达等诸多优点，于是给e d n a 测序和其他研究带来了许多的便利。 ( 5 ) 美国c l o n t e c h 公司关于良好基因文库的质量标准为原始文库的重组子数 目为5 1 0 5 - 5 1 0 3 ，重组率大于9 0 ，插入e d n a 片段不小于0 3 k b ，平均大于l k b 。 我们所构建的c d n a 文库未扩增文库的滴度为2 8 8 1 0 6 ，文库扩增后的滴度为 1 3 3 1 0 伸p f u m l ，平均插入片段长度为1 o k b ，根据以上标准达到了一个优良文库 构建的要求。 3 试验二tb4 基因的克隆与表达 3 1 试验材料 3 1 1 构建好的鲁西黄牛e d n a 文库 3 1 2 主要仪器设备 p h 0 3 0 a 型培养箱( 上海) ；恒温培养振荡器( 上海) ；电动移液器( 德国) ；p c r 扩增仪( 德国b i o m t e r a ) ；d l c j - 2 n 高性能无菌实验台( 哈尔滨) ：h h s 一2 1 - 4 水浴锅( 上 海) ；颇尔超纯水器( 德国p a l l ) ；电泳仪及电泳槽( 北京六一厂) ：凝胶自动成像分 析系统( 国产) ；- 8 0 低温冰箱( 美国) ；s i g m a l - 1 5 k 型低温离心机( 德国) ；d h g - 9 2 0 3 a 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海) 3 1 3 主要试剂 t 4d n a l i g a s e 购自p r o m e g a 公司；大肠杆菌d h 5 a 、m a r k e r 2 0 0 0 、lk b d n a l a d d e r m a r k e r 、d n a 胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自t i a n g e n 公司：b a m hi 、x h o i 内切核酸酶购自n e b 公司；p g e m - te a s y 全长3 0 1 5 b p ，氨苄青霉素抗性、卡那霉素 购自p r o m e g a 公司：t a k a r ae xt a q 购自t a k a r a 公司；卡那霉素抗性，购于c l o n t e c h 公司 过硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ) ( s i g m a ) ；丙烯酰胺( a c r ) ( n o v o n ) ； l i p o f e c t a m i