（物理化学专业论文）毛细管电泳电化学发光检测单细胞中的谷胱甘肽.pdf

嬲毛细管电泳电化学发光检测单细胞中的谷胱甘肽摘要第一章首先对毛细管电泳的基本原理及其发展状况进行了简单介绍。然后就毛细管电泳应用于单细胞分析( 包括单细胞采样，单细胞分析检测方法，及单细胞溶膜等) 分别进行了叙述，并对电化学发光检测技术在毛细管电泳的应用以及电化学发光传感器的固定化及应用进行了介绍。第二章采用了毛细管电泳一电化学发光检测的方法对大鼠腹腔肥大细胞中的谷胱甘肽进行了检测，确定了检测的最佳实验条件为：发光试剂r u ( b p y ) 3 2 + 的浓度为4 0 0 x 1 0 一m o l l - 1 ，p h 值为7 5 ，浓度为5 0 0 x 1 0 m o l l - 1 的n a h 2 p 0 4 -n a e h p 0 4 缓冲液，分离电压为1 2k v ，检测电势为1 2v ( a g a g c l ) ；得到大鼠腹腔肥大细胞提取液中平均每个细胞的谷胱甘肽含量为1 8 7f r n o l 。第三章采用毛细管电泳电化学发光的方法对单个大鼠腹腔肥大细胞、单个人宫颈癌细胞( h e l a 细胞) 和b 淋巴细胞瘤细胞( r a m o s 细胞) 中的谷胱甘肽的含量进行了测定；得到单个肥大细胞中谷胱甘肽的含量为9 3 0 2 5 9f r a o l ，单个b 淋巴细胞瘤细胞( r a m o s 细胞) 中g s h 的含量为2 6 6 5f m o l ，单个人宫颈癌细胞( h e l a 细胞) 中谷胱甘肽的含量为2 4 3 5 7 2l k n o l ，与文献报道的相近。第四章探索将r u c o p y ) 3 2 + 固定在电极上的方法，最终通过c n t n a f i o n 将发光试剂联吡啶钉修饰在碳纤维簇微盘电极上，制成了发光信号强而稳定的微型电极，并进一步探讨了其在毛细管电泳中的应用。第五章制作了毛细管电泳电穿孔与单细胞进样器组合装置，初步探讨了细胞经过电穿孔衍生的脉冲影响。关键词：单细胞分析；毛细管电泳；电化学发光检测；谷胱甘肽i n t r o d u c e d i nt h ec h a p t e ri i ，w eu s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s - e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e( e c l ) t od e t e c tt h ec o n t e n to fg l u t a t h i o n ei nf a tp e r i t o n e a lm a s tc e l l sb a s e do nt r i s ( 2 ，2 b i p y r i d i n e ) r u t h e n i u m ( i i ) ( r u ( b p y ) 3 2 + ) w h i c hi st h ec o n c e n t r a t i o no f4 0 0x1 0 3m o l l 1 ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fs e p a r a t i o na n dd e t e c t i o na r e5 0 0 x 1 0 2t o o l l 1n a i - 1 2 p 0 4 - n a 2 h p 0 4 ( p h7 5 ) f o rt h eb u f f e rs o l u t i o n ，1 2k vf o rt h es e p a r a t i o nv o l t a g e ，1 0k va n d1 0sf o rt h ei n j e c t i o nv o l t a g ea n dt h ei n j e c t i o nt i m e ，a n d1 2v ( 惯a g a g c l ) f o rt h ed e t e c t i o np o t e n t i a l t h ea m o u n to fg l u t a t h i o n e ( g s h ) i ni n d i v i d u a lr a tp e r i t o n e a lm a s tc e l lo na v e r a g ei s1 8 7f m 0 1 i nt h ec h a p t e ri i i ，t h em e t h o do fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t he l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nw a su s e dt od e t e c tt h ec o n t e n to fg l u t a t h i o n ei ns i n g l ec e l l s t h ed e t e c t e dc o n t e n to fg l u t a t h i o n ei ni n d i v i d u a lr a tp e r i t o n e a lm a s tc e l l sw a sf r o m9 3 0t o2 5 9f m 0 1 t h ec o n t e n to fs i n g l ebl y m p h o m ac e l l s ( r a m o sc e l l ) i sf r o m2 6t o6 5f m o la n dt h ea m o u n to fs i n g l eh u m a nc e r v i c a lc a n c e rc e l l s ( h e l ac e l l )i sf r o m2 4 3t o5 7 2f r n 0 1 h lt h ec h a p t e ri v , s e v e r a lk i n d so fm e t h o d st of i xr u ( b p y ) 3 2 + o nt h ec a r b o nf i b e rm i c r o d i s kb u n d l ee l e c t r o d es u r f a c ew a sa t t e m p t e d ，i nt h ee n dw em a d et h em i c r o e l e c t r o d ew h i c hw a si m m o b i l i z e dr u ( b p y ) 3 2 + i nc a r b o nn a n o t u b e s ( c r 叮r )n a t i o nc o m p o s i t ef i l mo n t ot h ec a r b o nf i b e rm i c r o d i s kb u n d l ee l e c t r o d e i t se l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ew a ss t r o n ga n ds t a b i l i t y w es t u d i e di t sa p p l i c a t i o ni nc a p i l l a r yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sp r e l i m i n a r y i nt h ec h a p t e rvt h ed e v i c eo fs i n g l e c e l le l e c t r o p o r a t i o na p p a r a t u sw i t ht h es i n g l e - c e l le l e c t r o p o r a t i o ni n j e c t o rw a sm a d e t h ee f f e c to fe l e c t r i cp u l s ef o rt h ec e l lw a ss t u d i e di n i t i a l l yd u r i n gt h ep r o g r e s so fe l e c t r o p o r a t i o n k e yw o r d s ：s i n g l ec e l la n a l y s i s ；c a p i l l a r ye l e c t m p h o r c s i s ；e l e c t r o c h e m i c a ll u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n ；g l u t a t h i o n e目录第一章前言11 1 毛细管电泳的基本原理和发展状况11 1 1 毛细管电泳的发展历程11 1 2 毛细管电泳的进样技术21 1 3 毛细管电泳的检测技术31 1 4 毛细管电泳应用研究进展。41 2 单细胞分析41 2 1 单细胞迸样41 2 2 细胞溶膜61 2 3 单细胞分析的检测方法61 3 电化学发光传感器的固定化。71 3 1 溶胶凝胶法71 3 1 1 溶胶凝胶同定化方法的特点81 3 1 2 溶胶凝胶固定化方法在电化学发光传感器中的应用81 3 2n a f i o n 膜法81 3 3l - b ( l a n g m u i r b l o d g e t t ) 膜法91 3 4 自组装膜法( s e l f - a s s e m b l e d ) 91 4 毛细管电泳电化学发光技术展望l o参考文献1 1第二章毛细管电泳电化学发光检测大鼠腹腔肥大细胞中的谷胱甘肽1 72 1 弓i 言1 72 2 仪器与试剂1 82 2 1 仪器1 82 2 2 材料与试剂1 92 3 实验方法1 92 3 1 碳纤维簇微盘工作电极1 92 3 1 1 碳纤维簇微盘工作电极的制作1 92 3 1 2 碳纤维簇微盘工作电极的处理2 02 3 1 3 循环伏安法检测碳纤维簇微盘工作电极2 02 3 2 毛细管电泳电化学发光检测的方法2 12 3 3 大鼠腹腔肥大细胞分离及处理2 22 3 4 大鼠腹腔肥大细胞的计数2 32 4 结果与讨论2 42 4 1 谷胱甘肽的毛细管电泳电化学发光检测条件的选择2 42 4 1 1 缓冲液p h 值的影响2 42 4 1 2 缓冲液浓度的影响2 42 4 1 3 分离电压的影响2 52 4 1 4 检测电势的影响。2 62 4 1 5r u ( b p y ) 3 2 + 浓度的影响2 72 4 2 谷胱甘肽的线性范围和检测限2 82 4 3 重现性2 82 4 4 大鼠腹腔肥大细胞提取液中谷胱甘肽含量的检测2 92 4 4 1 定性2 92 4 4 2 定量及凹收率3 02 5 结论3 0参考文献3 1第三章单个细胞中谷胱甘肽含量的检测3 33 1 弓i 言3 33 2 实验部分3 33 2 1 实验仪器3 33 2 2 材料与试剂3 43 2 3 实验方法3 43 2 3 1 单个大鼠腹腔肥大细胞的提取。3 43 2 3 2 宫颈癌细胞( h e l a 细胞1 和b 淋巴瘤肿瘤细胞( r a m o s 细胞) 0 0 提取3 43 2 3 3 单细胞进样器的制作方法3 53 2 3 4 单个肥大细胞进样技术的改进3 53 2 3 5 单个细胞进样过程3 63 2 3 6 单细胞的溶膜3 63 3 结果与讨论3 73 3 1 单个大鼠腹腔肥大细胞中谷胱甘肽含量的测定。3 73 3 1 1 细胞活性。3 73 3 1 2 定1 生3 83 3 1 3 定量3 93 3 2 单个b 淋巴瘤肿瘤细胞( r a m o s 细胞) 中谷胱甘肽的测定。4 03 3 3 单个人宫颈癌细胞( h e l a 细胞) 中谷胱甘肽的测定4 13 4 结论4 2参考文献4 3第四章微型电化学发光固定化电极的制备4 54 1 引言4 54 2 仪器与试剂4 64 2 1 仪器1 64 2 2 材料与试剂4 64 3 实验方法4 64 3 1 碳纤维工作电极的制作4 64 3 2 碳纤维电极的处理4 64 3 3 循环伏安法检测碳纤维电极电化学性能4 64 3 4r u - a u n p s 修饰电极4 64 3 4 1 柠檬酸根保护的会纳米粒子的制备4 64 3 4 2r u ( b p y ) 3 2 + - 金纳米粒子( 记作r u - a u n p s ) 聚集体的形成4 74 3 4 3 修饰电极的制备。4 74 3 5 合成p s p 修饰碳纤维电极4 74 3 5 1 合j 戎p s p 4 74 3 5 2p s p c n t r u 修饰电极的制备4 84 3 6c 卜r r n a f i o n 复合膜修饰碳纤维电极4 84 4 结果与讨论4 84 4 1 固定化联吡啶钉的方法选择4 84 4 2 固定化联吡啶钉的电化学行为4 94 4 3 固定在c n t n a t i o n 复合膜中联吡啶钉的电化学发光行为5 04 4 4 微型电化学发光固定化电极在毛细管电泳中的应用展望5 24 5 结论5 2参考文献5 3第五章单细胞电穿孔与单细胞进样器组合装置的研制5 55 1 弓i f 言5 55 2 实验部分5 65 2 1 电穿孔与单细胞进样器组合装置的制作5 65 2 2 单细胞电穿孔装置5 8参考文献5 9结论。6 0致谢6 1攻读硕士学位期间发表的学术论文目录6 2声明6 3m青岛科技人学研究生学位论文第一章前言1 1 毛细管电泳的基本原理和发展状况毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是一种在电泳技术基础上发展起来的分离技术，是以毛细管( 一般内径为2 0 1 0 0 岬) 为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据检测样品组分的迁移速度和分配差异而实现分离的液相分离技术。由于其在电泳的过程中具有极好的散热性能，克服了由于加高压产生电介质离子流的焦耳热的影响，这样就可以在分离的过程中引入高压，全面提高分离的质量【1 1 。毛细管电泳集合了电泳和色谱的特点，具有分析对象广、自动、快速、微量、模式多、经济、高效、洁净等特点1 2 】。是分析科学中一个巨大的进展，可以用来分离有机分子、无机离子还有生物大分子等，在分析化学、环境化学、药品化学、食品化学和医学等诸多的领域都有广泛的应用前景。1 1 1 毛细管电泳的发展历程毛细管电泳最早来自1 9 6 0 年以前的毛细管等速电泳【3 1 ( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s c r r p ) ，现在一般认为1 9 6 0 年代中期的毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s c z e ) 是现在毛细管电泳技术的起点。1 9 6 7 年瑞典科学家h j e r t e n l 4 l 提出用直径为3衄的毛细管做自由溶液的区带电泳，构思巧妙，然由于操作麻烦，难以应用。直到1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 5 。7 1 正式提出了现代意义的毛细管电泳，使用毛细管分离，运用荧光检测器对多种组分实现了分离检测，标志着毛细管电泳正走向分析科学的舞台中央，自此以后毛细管研究更加深入，出现了分离效率更高，可以实现自动化操作，而且也有利于进行定性、定量分析的毛细管电泳凝胶电泳和等电聚焦电泳。1 9 8 4 年t e r a b e 将含十二烷基磺酸钠( s d s ) 的“胶束”引入毛细管电泳，开创了胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a r e l e c t r o k i n e t i c c a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y m e k c ) 8 1 。近年由于液相色谱的固定相技术引入到毛细管电泳，发展了电色谱，进一步扩展了毛细管电泳的应用范围，伴随着毛细管电泳仪器的商业化，毛细管电泳将得到更加飞速的发展，应用到各个方面。毛细管电泳的分离模式：主要有毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳等如表1 1 ，现以新的分离模式和联用技术的发展最为突出，例如建立阵列毛细管电泳( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) ，芯片毛细管电泳( c h i pc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c c e ) ，亲和毛细管电泳技术( i m m u n o a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) ，非水毛细管电泳技术( n o n a q u e o u sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，n a c e ) ) ；国外业毛细管电泳电化学发光检测单细胞中的谷胱甘肽开始探索利用c e 对p c r 产物作d n a 单链构象多态性( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 分析筛查点突变。毛细管电泳技术迅速发展，成为色谱最活跃的领域之一【争1 1 1 。表1 - 1 毛细管电泳多种模式的分离机理与分离的化合物种类t a b l e1 - 1 s e p a r a t i o nm e c h a n i s m sa n dk i n d so fc o m p o u n d sw i t hc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s1 1 2 毛细管电泳的进样技术为了能够实现高效、快速的分离分析，毛细管电泳对进样也有严格的要求：一是进样时不能使区带扩张更加明显；二是进入的样品量必须小于1 0 0n l ，不然会造成过载。一般而言，毛细管进样区带的宽度大约为毛细管长度的1 2 。现阶段主要有流体力学方式和电动方式两种进样方式f 1 2 。1 3 j ：( 1 ) 流体力学进样方式，包括重力进样和压力进样。这种进样方式的优点是进2青岛科技人学研究生学位论文样量一般情况不会受到不同样品基质的影响。( 2 ) 电动进样方式，即加高压通过电渗和和电迁移进样分析，但由于不同的离子的迁移速度不同，会造成电动进样的歧视性，因此其重现性会比流体力学进样的方式差些。电动进样具有的明显优势就是简单，不需要增加附加装置。当无法进行流体进样的时候，就可以选择用电动进样的方式。1 1 3 毛细管电泳的检测技术毛细管电泳由于具有极小的毛细管内径通常为( 2 5 1 0 0 岬) 以及纳升级的进样量，因此对检测器的灵敏度提出了特别高的要求，与毛细管电泳联用的检测器必须有较小的检测体积和较高的灵敏度。检测技术是毛细管电泳发展的核心问题之一，毛细管电泳的性能与具有高灵敏度得检测密切相关。现已有许多检测器被成功地运用到了毛细管电泳技术当中，现在商品化的仪器中常用的检测器主要有紫外可见检测器【1 4 1 ，然而毛细管的短光程性严重限制了其检测的灵敏度；激光诱导荧光检测器虽然选择性好、灵敏度高，也仅是适合于具有荧光或易于进行荧光衍生的物质【1 5 l 。毛细管电泳质谱联用法的专属性强、灵敏度高，并且能提供分子的结构信息，是c e 非常理想的检测方法，但是其价格过于昂贵，而不能广泛地进行应用。c e 与电化学检测器联用既可以满足微量样品分析时需要的灵敏度要求，又具有良好的选择性，并且仪器造价相对低廉，易于普及【1 6 - 1 s 。毛细管电泳电化学发光( c e - e c l ) 检测具有灵敏度高、操作简单、分析速度快、分离效率高以及试剂消耗少等优点，现在已经发展成为十分重要的分析工具，被广泛地用于食品、临床和药物分析和环境等方面f 1 9 , 2 0 。其中以发光试剂三联吡啶钉的应用范围最为广范，其电化学发光有许多自身的特点【2 1 - 2 4 1 ：( 1 ) 在有还原剂和强氧化剂存在的条件下都可以产生电化学发光；因而具有了反应形式多样的特点；( 2 ) 发光可以在电极原位上产生，因而可以通过改变电极的电势来控制化学发光反应的引发、控制调节反应的速率和过程；( 3 ) 可以在反应过程中循环作用，并无实际消耗；而且具有发光效率高的特点，可以通过将其固定化制成传感器；( 4 ) 对被测物的电化控制可以获得更多的分析信息。目前以联吡啶钌以及它的衍生物的电化学发光已经被作为一种选择性好，灵敏度高的分析方法，已被广泛应用于烷基胺闻、草酸盐【2 6 1 、氨基酸l 2 7 1 、n a d h l 2 s 3 0 !及有机酸【3 1 l 的测定。3毛细管电泳电化学发光检测单细胞中的谷胱甘肽1 1 4 毛细管电泳应用研究进展毛细管电泳相比较与其他的经典电泳技术，不仅具有高效液相色谱及高压电泳等优点，而且具有其突出特点：( 1 ) 具有耗样少，因此可成为微小体积蛋白质样品的快速制备与分离；( 2 ) 分离效率高，分析速度快，分辨率高；( 3 ) 具有重新性好，灵敏度高的特点；( 4 ) 操作模式多，通用性广；c e 具有丰富的分离模式，能实现非水和水的分离，能够对付大小不同的样品分子( 从离子到细胞) ，能覆盖大范围的等电点( p i = 1 1 2 ) 等。鉴于毛细管电泳技术具有的这些特点，因此可以用于检测多种样品，如血浆、体液、尿样、脑脊液、红细胞、血清【3 2 j 或组织及其动物活体的检测实验，而且可以分离分析多种组分，如糖类糖蛋白、核酸核苷酸、蛋白质多肽氨基酣3 3 , 3 4 、碱氨基酸、微量元素、酶、小的生物活性分子等进行快速分析，以及d n a 合成中产物纯度测定以及d n a 序列的分析等，也可用于碱性的药物分子及它们的代谢产物【3 5 l 、有机离子有机酸、单细胞、病毒、药物与细胞的相互作用的分析。自人类基因组计划提出以来，d n a 的快速测定一直就是研究的热门课题，应用的高速测序方法主要有两大类：一种是基于d n a 芯片技术或d n a 杂交的探针阵列；另一种方法就是c e 。正是c e 的测序方法成功的解决了基因组计划中高速测序的问题，毛细管阵列c e 测序商品仪器，已经取代传统的平板凝胶电泳测序系统，用于常规的测序工作，伴随着c e 技术和检测技术的进一步发展应用，其必将在未来的生命分析中扮演重要的角色。1 2 单细胞分析1 2 1 单细胞进样目前已经应用的细胞取样方法【蚓主要分为单个全细胞溶解进样、单个全细胞进样以及单个细胞的细胞质进样，具体如下：( 1 ) 单细胞溶解进样将单细胞分离提取后，放置在微型管中离心，然后将上部液体转移到另外的微型容器中，向其中加入试剂进行衍生，接着移取部分样品放入到毛细管中，开始进行分离检测。此种进样方法可以准确地移到1n l 的样品。具有溶解细胞时反应完全，内标或衍生试剂与检测的试样充分混合，使检测样品的衍生反应完全，检测的误差较小等优点；然而不足的地方是检测样品被稀释后，就不能进行单个细胞的全进样，使得该方法的检出限较差，而且只能用于体积较大的细胞。鉴于其操作较复杂，目4青岛科技人学研究生学位论文前已很少应用。( 2 ) 单个全细胞的进样目前在毛细管电泳进行单细胞分析的过程中，大多采用的进样方法就是单个细胞的全进样，将得到的单个细胞，通过流体动力学或者电动方法将细胞引入到分离的毛细管中，并且在毛细管中进行溶胞，然后通过电泳进行分离检验。一般采用1 0 2 5岬内径的毛细管进行分离检测。j i i l 等1 3 7 ，3 8 】直接采用电动迁移的方式在毛细管中引入单个细胞，即在有一定的细胞数目的条件下，利用细胞自己在溶液的漂浮和移动，在细胞漂移靠近管口的时侯，电动迁移使细胞进入到毛细管中，此过程一般不超过2m i n 。k r y l o v 等 3 9 l 设计制造了一个具有多功能的细胞进样器，该进样装置结构透明，对毛细管不用进行蚀刻处理，将分离用的毛细管竖直放在检测的细胞上，通过在显微镜的观察下，采用压力或者电动迁移的方式引入细胞。使用s d s 进行细胞溶膜，而且可以在进完单个细胞后，对毛细管进行自动清洗。( 3 ) 细胞质的活体进样单细胞细胞质的取样，可以直接应用于单细胞分析。美国宾州大学的e w i n g 研究小组提出三种形式：其中一种，将毛细管的尖端拉制成直径几微米，装入缓冲液将其作为微进样器，然后控制微进样使其准确地插入到神经细胞内，接着将电泳管的正极插入到微进样器中，启动高压进行电迁移进样【加】；其二，使用外径大约为几十微米的双微管进样器。微管的管尖使用碳纤维进行密封，在其内插入铂丝进行导电，当将其插入到细胞后，采用电动迁移的方法从另一管中移入要分析检验的细胞质样品n d 0 4 1 , 4 2 】；其三，将5 岬内径的毛细管的进样端的外径用氢氟酸进行蚀刻到大约6 1 0l u n ，在显微镜的观察下，直接插入到多巴胺或5 羟色胺的神经细胞体内，采使用电动迁移的方式，将一部分细胞质移动到毛细管内，开始进行电泳分离。进样的体积大约为5 0 8 3p l ，其中最小的进样量可以达到2 7 0f l t 4 3 j 。但由于细胞得直径很小，微型进样器尖端不容易准确地插入到细胞中去，该进样法报道主要用于对蜗牛的巨大神经细胞进行分析，对人体的血红细胞活体或者哺乳动物的神经细胞分析尚无报道。( 单细胞连续进样伴随着单细胞分析的深入发展，对单细胞的分析提出了快速、高效、简洁的新要求。从一次只能进样一个细胞发展到可以单个细胞的连续进样测定。近年来其主要研究有：k r y l o v 研究小组 3 9 1 设计了自动化透明进样器。可以直接将毛细管的进样端垂直接触细胞悬浮液，使用电子计时器控制进样时间，采用压力和电迁移进样方式使单个细胞进入毛细管中。此装置具有可以将s d s 引入和对毛细管清洗的功能，使细胞5毛细管电泳电化学发光检测单细胞中的谷胱甘肽进样、溶胞等实现自动化，提高了单细胞的进样效率。b i r a n 删设计了高密度的细胞芯片，在芯片的上面有着几千个直径5 岬的阵列微室，而且每个微室只能容纳一个细胞。将单个细胞进行编号后，随机分散到每个微室中去，然后倒置荧光显微镜得c c d 系统，根据荧光信号来对单细胞进行快速分析。1 2 2 细胞溶膜当细胞被引入到毛细管后，需要对其进行溶膜以便使细胞中的组分得以释放，才能在毛细管中进行分离检测。目前，细胞溶膜的方式主要有两类1 4 5 1 ( 1 ) 化学方法：用非生理溶液溶膜；由于不同的细胞对外界的环境变化( 如离子强度，p h 值等) 的承受能力不同。有的细胞当其所处环境的p h 值或离子强度稍有变化，细胞即会溶膜。对于蜗牛神经细胞、鼠的交感神经细胞、红血球细胞等，只需常用缓冲液即可使其溶膜。有些细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞等它们在常用的缓冲液中是很难溶膜的，因此需要加入一些化学试剂才能使其破膜，常用的化学试剂主要有毛地黄皂苷、十二烷基硫酸钠( s d s ) 、强碱( j t l l n a o h ) 等。( 2 ) 物理方法：超声溶膜、电场溶膜等。x u e 等f 蛔对单个淋巴细胞中的乳酸脱氢酶进行分析时，采用了一个特斯拉线圈，然后利用线圈诱导产生一个外部电场加在淋巴细胞细胞膜上，当细胞膜的电位超过了大约2 0 0m v 以上的时侯，细胞就会破裂。z h a n g 等1 4 7 1 采用超声溶膜的方法对单个结肠癌细胞株( h t 2 9 ) 细胞进行了分析。1 2 3 单细胞分析的检测方法单细胞体积很小而且其内组分的含量更加少，一般都在f m o l 至z m o l 的范围内，这就要求用于毛细管电泳的检测器至少能检测到f r n o l 级，可以说检测器是进行单细胞毛细管电泳分析方法的关键。目前c e 检测器的种类很多，如紫外检测器【4 8 1 、电化学检测器【4 9 1 、放射化学检测器【5 们、激光诱导荧光检测器( u f ) 【5 1 。5 2 1 、电化学发光检测器【5 3 1 、质谱检测剁5 4 】等。e w i n g 研究组【5 5 】最早采用毛细管电泳安培检测了单个细胞，而且进行了系统的研究工作。他们利用c z e 离柱式的安培法首次对池塘蜗牛神经细胞( 直径2 0 0 岬)的细胞质实施了检测。并且采用了1 0 岬的碳纤维电极和1 2 7l x r n 内径的毛细管柱，通过进样器取样蜗牛神经细胞的细胞质，然后通过电泳进行分离进行安培检测。当e w i i l g 等1 5 6 1 在应用单个全细胞进样毛细管电泳安培技术检测单个p c o m e u s多巴胺神经细胞的时侯，发现当溶解细胞的时间变短后，会产生迁移时间不同的两6青岛科技大学研究生学位论文个多巴胺峰，在细胞的培养液中加入利血平( 一种泡囊破坏剂) 对细胞进行培育一段时间后，在对单细胞进行细胞进样，只得到了一个多巴胺的峰。因此推断出多巴胺是贮存在不同的多巴胺泡囊中。h u a n g 等【5 7 ，5 8 1 重新设计制造了一个装置，通过重力流的驱动作用，对单个大鼠嗜铬神经癌细胞( p c i 2 ) 弓i 入定位，在另一通道处导入尼古丁刺激剂，采用碳纤维微电极对单个p c i 2 细胞神经递质的多巴胺量子释放进行了实时监测。f a n g 小组【5 9 1 应用了十字型的毛细管电泳芯片采用激光诱导荧光的检测方法对单个人血红细胞中的谷胱甘肽进行了检测，将细胞进行n d a 柱外衍生，将单个细胞进样，待细胞进入贴壁后，利用电场使其溶膜，对其进行电泳的分离和检测。翁前锋【印l 采用毛细管区带电泳柱端安培检测的方法分别对单个大鼠肥大细胞中的组胺，单个人血液淋巴细胞中的氨基酸，单个小鼠腹腔巨噬细胞中的氨基酸进行了测定。孙雪梅【6 1 】采用毛细管区带电泳检柱端安培法对单个人血红细胞中的葡萄糖每磷酸脱氢酶，和单个大鼠骨髓成纤维细胞和大鼠胚胎肝细胞中的同功碱性磷酸酶进行了分析。最近孙雪梅等【6 2 】采用毛细管区带电泳电化学发光的方法检测了单个大鼠肝细胞中抗坏血酸的含量。1 3 电化学发光传感器的固定化电化学发光传感器的固定化是指将各种电化学发光活性分子固定在工作电极上，并采用各种方法对其进行修饰，提高它们的选择性和实用性。固定化技术的发展是提高传感器性能的关键因素之一，也是世界各国竞相进行研究和探索的目标。经过了几十年的不断研究、探索，到现在为止己经建立了多种不同的固定化方法，并得到实现i 珏6 7 1 。主要的方法有四大类：溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 法，n a t i o n 膜法，l - b ( l a n g m u i r - b l o d g e t t ) 膜法和自组装( s a ) 膜法。1 3 1 溶胶凝胶法溶胶凝胶法( s 0 1 g e lm e t h o d ) 是化学材料制备的新兴方法。即金属或半金属醇盐在水、互溶剂( 通常为醇) 和催化剂( 酸或碱) 的存在下，达到饱和条件而发生水解和缩聚反应，生成溶胶( s 0 1 ) ，经过蒸发、干燥转变成为凝胶( g e l ) 的方法。将固定物包埋于溶胶凝胶中，然后经过陈化、室温干燥就可以得到固凝胶。因溶胶凝胶具有良好的物理刚性、化学稳定性、生物相容性、以及光透性等，可以应用在生物材料的固定化、电化学、光学等方面。d v o r a k 等i 碣】首先将该方法成功得运用到固相e c l 上。以四甲氧基硅烷为前驱7毛细管电泳电化学发光检测单细胞中的谷胱甘肽体，乙醇为互溶剂，在盐酸催化的条件下将r u ( b p y ) 3 2 + 包埋在制备的溶胶中，并且用得到的溶胶修饰p t 和i t o 电极。陈曦等【6 9 1 采用有机改性溶胶凝胶技术，以二甲基二甲氧基硅烷和四甲氧基硅烷为前驱体包埋聚p s s ，通过离子交换的方式成功得将联吡啶钉固定在玻碳电极的表面上。对溶胶凝胶材料中含烷基的硅氧烷进行有机改性后，减少了可聚合的羟基，改变了膜的极性，可以不需要加入t r i t o nx - 1 0 0 ( 主要用于防止在干燥过程中膜的破裂) ，大大缩短膜制备时间。1 3 1 1 溶胶一凝胶固定化方法的特点溶胶凝胶法具有明显的优点：( 1 ) 本身的荧光低，光透性强，有利于吸光和荧光的测量；( 2 ) 制备工艺简单；( 3 ) 化学、热力学、光学及机械稳定性好；( 4 ) 可与多种无机、有机试剂相容：( 5 ) 物理化学性质如化学组成、孔径、导电性、成型形状、机械强度以及亲水性等易于控制；( 6 ) 可适用于固定任何类生物组分，保持蛋白质表面微观结构的方向均一性和整体性。目前，溶胶一凝胶技术成为应用最广泛的固定化方法之一，己用到几乎所有类型的光学生物传感器中，包括吸收光、化学发光、室温磷光、荧光等体系。1 3 1 2 溶胶一凝胶固定化方法在电化学发光传感器中的应用目前溶胶凝胶技术已广泛应用于电化学发光传感器的设计。d v o r a k 等【6 8 1 最早采用溶胶凝胶的技术固定联吡啶钌在s i 0 2 凝胶膜内，研究了联吡啶钌的光化学活性和电化学。董绍俊等嗍将发光试剂固定于e a s t m a n a q 5 5 d s i 复合膜中制成了电化学发光传感器，该传感器具有高的稳定性和选择性，已成功的用于草酸盐、氯丙嗪、三丙胺的测定。c o n i n s o n 等【7 1 】将还原剂、超微电极和联吡啶钌一起包埋在凝胶载体中，制作成全固态结构的电化学发光系统，为束缚在环境中分子的扩散行为和被包埋试剂与硅基体间的表面相互作用的评价提供了新方法。朱国逸等【7 2 】首先提出s 0 1 g e l 碳糊电极，利用该技术将修饰的g o d 的石墨粉固定在硅酸盐网状结构中，结合l u m i n 0 1 h 2 0 2 电化学发光( e c l ) 体系制成葡萄糖光纤电化学发光的生物传感器。1 3 2n a t i o n 膜法n a t i o n 是一种含电离基团的全氟化碳聚合物，是常用的制备电极薄膜的高分子材料，具有优良的机械强度、化学稳定性和离子传输功能，在电分析化学中的应用8青岛科技大学研究生学位论文较为广泛。b a r d 等【7 3 】首次将n a t i o n 固定在电极的表面，利用n a t i o n 与r u ( b p y ) 3 2 + 之间的静电作用，使发光试剂固定修饰在电极的表面，并且研究了固定化发光试剂的电化学发光行为。n i e m a n t 7 4 l 等采用r u ( b p y ) 3 2 * n a t i o n 膜制成了电化学发光传感器流动体系中的n a d h 、草酸、烷基胺进行了测定，并研究了环境温度、p h 值、离子强度等对发光强度的影响。n a t i o n 膜修饰的电极有一个普遍存在的问题即是：其长期稳定性不好。将此制备的修饰电极放到缓冲液中，一天后再对其进行检测，其响应值会下降8 5 7 4 1 。通过研究结果发现不是r u ( b p y ) 3 2 + 进入到溶液中，而可能是因为r u ( b p y ) 3 2 + 进入n a t i o n膜的疏水端，造成其和电极失去接触，部分地阻止了电荷的传输。而且n a t i o n 膜会在有机溶剂中溶解，因此其制成的e c l 传感器一般很难与其他的分离方式相连用，此外n a t i o n 对分析物的传质速度慢，而且膜材料本身的一些疏水微环境也会对发光反应产生负面的影响，这些都使n a t i o n 7 5 】膜在r u ( b p y ) 3 2 + 固相e c l 中的应用受到一定的限制。1 3 3l - b ( l a n g m u i r - b l o d g e t t ) 膜法l a n g m u i r - b l o d g e u 膜( 简称l b 膜) 最早是由l a n g m u i r 及其学a 三b l o d g e t t 提出的【7 6 l ；是一种可以进行人为控制的特殊吸附方法，具体是将具有脂肪链疏水基团的双亲分子溶解于挥发性的溶剂中，通过控制表面压，溶质分子在气液界面之间形成二维排列有序的单分子膜，即l a n g r n u i r 膜( l 膜) 。l b 膜修饰电极的表面一般只有一个或几个单分子层，因此其电子或物质在膜内容易传输；而且由于修饰分子的排列紧密，也可以产生很好的电催化作用【明，它提供了一种以很少的试剂得到高灵敏度电致化学发光的方法。但是由于l b 膜仅在电极表面进行物理吸附，其制备的e c l 传感器稳定性差，而且l b 膜也易于被有机溶剂破坏，这些缺点和不足也限制了l b 技术在固相e c l 中的使用。1 3 4 自组装膜法( s e l f - a s s e m b l e d )自组装膜法( s a ) 是一种基于分子的自组装作用，在固体的表面上自动形成高度有序单分子层的方法。与l b 膜法相比，s a 膜的形成更加简单易行，并且膜的稳定性好【7 8 1 。目前报道有多种类型的自组装膜：二硫化物和硫化物在金、银和铜表面；醇和胺在铂表面；有机硅烷在羟基化的表面等。其中报道有在联吡啶钌分子上接上一个长链硫醇，并进行自组装形成的单层修饰膜已应用在电化学发光传感器中。s a g i v 掣7 9 l 首次发现和研究了在固液界面上，物质自然地“自组”成高度有序单分子层的方法。o b e n g 等 8 0 l 首次利用分子自组装法将联吡啶钌修饰到金电极和1 t o9毛细管电泳电化学发光检测单细胞中的谷胱甘肽电极上，考察了其在草酸溶液中的电化学发光。f o r s t e r 等【8 l j 人把r u ( b p y ) 2 ( p v p ) 1 0 2 +和d n a 共组装在厚1 0n m 的膜中用以修饰热解石墨电极，该电极能用于检测d n a的化学损伤。董绍俊等【8 2 斟】人成功将自组装技术固定r u ( b p y ) 3 2 + 运用于分析化学中。自组装膜修饰电极在碱性、酸性和有机介质中，比用l b 膜进行修饰的电极稳定，但是在施加扫描电压的时候其稳定性不好，特别当电极在正电位进行扫描的时侯，自组装膜容易从电极的表面脱落下来，这些也进一步限制了自组装技术在e c l传感器中的实际应用。1 4 毛细管电泳电化学发光技术展望毛细管电泳作为一种分离技术，已经得到了很广泛的应用，将其与e c l 联用充分则充分发挥了毛细管的高分离效率和电化学发光具有的选择性强、灵敏度高、线性范围宽等优点，将会大大提高分析和检测的应用。伴随着生命科学技术地迅猛发展，而且今后人们将从疾病的治疗向疾病的预防转变，再加上计算机和软件的飞速发展，微型化已经成为一种趋势，希望快捷检测的方法并制备微小分析仪器，可以应用到普通的社区和个人，提高人们的生活质量，成为推动生命科学发展的力量，带给人们更多健康的保障，更好地推动人类和社会的发展。如果能通过e c l 固定化的方法，制作灵敏度更高的电化学发光的超微电极，将使其美好愿望得以实现。本论文希望能够充分利用毛细管电泳与电化学发光联用的方法检测组成生命的基本单位一细胞中的谷胱甘肽进行检测；并希望能够制造更加灵敏的e c l 固定化电极使其能够应用于毛细管电泳和微流控芯片等痕量的检测；并希望能够全细胞进样检测胞内更多的生物活性物质。1 0青岛科技人学研究生学位论文参考文献林炳承，毛细管电泳导论【m 】，北京科学出版社，1 9 9 6 ：1 4陈义，毛细管电泳技术及应用【m 】，北京化学丁业出版社，2 0 0 6 ：1 - 7e v e r a e r t sem ，v e r h e g g e nt - ，i s o t a c h o p h o r e s i s ，e l e c t r o p h o r e t i ca n a l y s i si nc a p i l l a r i e s j ，j c h r o m a t o g r 八1 9 7 0 ，5 3 ：3 1 5 3 2 8h j e r t e ns ，f r e ez o n ee l e c t r o p h o r e s i s 川c h r o m a t o g r r e v ，1 9 6 7 ，9 ：1 2 2 - 1 2 9j o n g e n s o nj w ，l u k a c 8kd ，z o n ed e e t r o p h o r e s i si no p e n - t u b u l a rg l a s sc a p i l l a r i e s j ，a n a l c h e m ，1 9 8 1 ，5 3 ：1 2 9 8 - 1 3 0 2j o n g e n s o nj w ，l u k a e 8kd ，f r e e - z o n ee l e c t r o p h o r e s i si ng l a s sc a p i l l a r i e s 川，c l i n c h e m ，1 9 8 1 ，2 7 ：1 5 5 1 - 1 5 5 3j o n g e n s o nj w ，l u k a c skd ，c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s 【j 】s c i e n c e ，1 9 8 3 ，2 2 2 ：2 2 2 2 2 6d uy ，l ib l ，w e ih ，e t a l ，m d t i f u n c t i o n a ll a b e l - f r e ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rb a s e do na ni n t e g r a t e da p t a m e r j ，a n a l c h e m ，2 0 0 8 ，8 0 ：5 1 1 0 - 5 1 1 7徐祖民，毛细管电泳芯片研究进展，黔两南民族师范高等专科学校学报【j 】，2 0 0 9 ，4 ：1 1 8 1 2 1c a r m e nc ，l e f ts ，e s t h et ，e t a l ，m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dc a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h yf o rs e l e c t i v ed e t e r m i n a t i o no ft h i a b e n d a z o l ei nc i t r u ss a m p l e s j l