（生物化学与分子生物学专业论文）sgt及其相关蛋白功能的研究.pdf

s g t 及其相关蛋白功能的研究 摘要 s g t ( s m a l lg l u t a r n i n e r i c ht e t r a t r i c o p e p t i d e r e p e a tt p r ) 克隆于1 9 9 8 年，由 3 1 3 个氨基酸组成，其c 末端有一段富含谷氨酰氨的序列，中间含有三个串联重 复的t p r 结构域。近年来的研究表明，s g t 能够与热休克蛋白家族的h s p 7 0 和 h s c 7 0 相互作用并调节其分子伴侣活性，而h s p 7 0 和h s c 7 0 的分子伴侣活性可以 拈抗热休克、血清饥饿、化疗药物等引起的细胞凋亡，不仅如此，c h i p 、t p r 2 、 s t r a p 这些含有t p r 结构域的蛋白均以不同的方式参与了细胞凋亡的过程。为了 弄清s g t 是否也参与了细胞凋亡的过程，我们首先建立了s g t 超表达的 s m m c 一7 7 2 1 稳转细胞株，用放线菌酮( c h x ) 处理稳转空载体的s m m c 7 7 2 1 和稳转s g t 的s m m c 7 7 2 1 细胞后，分别用p l 染色，a n n e x i n v 和p i 双染，d n a 片段化降解检测，凋亡小体分析，h o e c h e s t 染色观察均证实s g t 可以促进c h x 诱导的7 7 2 1 细胞凋亡，进步的研究表明这种促凋亡作用是c a s p a s e 依赖的， s g t 可以促进c a s p a s e 家族蛋白的活化并将其底物p a r p 裂解，进一步的免疫荧 光试验表明超表达s g t 可使部分p 5 3 定位到线粒体。为了进一步探讨s g t 的功 能我们应用酵母双杂交的方法以s g t 为诱饵筛选人胎肝c d n a 文库鉴定出p i a s 为它的一个新的结合蛋白，接下来用g s t - p u l ld o w n 、免疫共沉淀，以及激光共 聚焦的方法证实了二者在体内和体外均可相互作用。 d1 , 4 半乳糖基转移酶( g a i ti ) 是一个最早克隆的糖基转移酶，长期以来 被认为是一个管家基因，本实验室以前的工作表明g a l ti 是s g t 的一个相互作 用蛋白，e t s 转录因子家族的成员e i a f 可调控其基因的转录。本文研究了e t s 家族的另一成员e t s 一1 可否调控其转录。我们采用荧光素酶报告基因的方法证实 e t s 一1 可激活g a i ti 报告基因的表达，并具有量效关系。我们又采用突变分析法 确定g a tl 启动子2 1 5 至1 3 9 核苷酸区域存在一个e t s 1 的结合位点，进一步采 用染色质免疫沉淀试验以及电泳凝胶迁移率改变试验证实e t s 一1 能够与此区域 d n a 直接结合，从而确定e t s 一1 是调控p1 ，4 半乳糖基转移酶基因的个转录因子。 关键词：s g t 蛋白p 5 3 c a s p a s e 酵母双杂交系统p i a s l 蛋白d 1 ，4 一 半乳糖基转移酶1 e t s e t s l e 1 a f s t u d i e so ft h ef u n c t i o n so fs g ta n di t si n t e r a c t i o np r o t e i n s a b s t r a c t s g t ( s m a l lg l u t a m i n e r i c ht e r a t r i c o p e p t i d e r e p e a tt p r ) w a sc l o n e di n19 9 8 i t c o n s i s t so f313a m i n oa c i d sw i t hag l u t a m i n e r i c hs e q u e n c ei ni t sc a r b o x y lt e r m i n a l a n dt h r e et a n d o mt p r r e p e a t si nt h ec e n t e ro ft h ep o l y p e p t i d ec h a i n i t sr e p o r t e dt h a t s g ti n t e r a c t sw i t hh s p 7 0a n dh s c 7 0a n dr e g u l a t e st h e i rc h a p e r o na c t i v i t i e s ，w h i c h a n t a g o n i z ea g a i n s th e a ts h o c k ，s e r u md e p l e t i o na n dt h ea p o p t o s i si n d u c e db yd r u g s u s e di nc h e m i c a lt h e r a p i e s f u r t h e rm o r e m a n yt p rd o m a i n c o n t a i n i gp r o t e i n ss u c h a sc h mt p r 2a n ds t r a pp l a yi m p o r t a n tr o l e si n c e l la p o p t o s i sw i t hd i f f e r e n t m e c h a n i s m s t oc l a r i f yw h e t h e rs g t p a r t i c i p a t e si nt h ep r o g r e s so fc e l la p o p t o s i s ，w e f i r s tc o n s t r u c t e dt h es m m c 7 7 2 1e e l l l i n e ss t a b l ye x p r e s s i n gs g t s m m c 一7 7 2 1c e l l s a n dt h es t a b l et r a n s f e c t e dc e l l sw e r et r e a t e dw i t hc h x ，f o l l o w e db yp is t a i n i n g ， a n n e x i nva n dp ic o s t a i n i n g ，d n af r a g m e n t a t i o nt e s t ，a n dh o e c h e s t3 3 2 5 8s t a i n i n g ， a p o p t o s i sb o d i e sa s s a y , l tw a sf o u n di na l lt h ee x p e r i m e n t st h a ts g tp r o m o t e dt h e a p o p t o s i so f7 7 2 1c e l l si n d u c e db yc h x ，a n di t sr o l ei nt h er e g u l a t i o no fa p o p t o s i s w a sc a s p a s e d e p e n d e n t s g tp o t e n t i a t e dt h ea c t i v i t yo fc a s p a s e sa n df a c i l i t a t e dt h e c l e a v a g eo fp a r eas u b s t r a t eo fc a s p a s e 3 o v e r e x p r e s s i o no fs g t1 e dt o t h e 1 0 c a l i z a t i o no fm o r ep 5 3o nm i t o c h o n d r i at h a nc o n t r 0 1g r o u p t of u r t h e ri n v e s t i g a t e t h ef u n c t i o no fs g tp r o t e i n w es c r e e n e dt h ec d n al i b r a r yo f h u m a nf e t a l l i v e ru s i n g s g ta st h eb a i ti ny e a s tt w o h y b r i ds y s t e m p i a s1w a si d e n t i f i e da san e wi n t e r a c t i n g p a r t n e ro fs g t , a n dt h e i ri n t e r a c t i o n si nv i t r oa n di nv i v 0w e r ec o n f i r m e db yg s t - p u l l d o w n ，c o i m m u n o p r e c i p r a t i o na n dc o n f o c a la s s a y s p - 1 ，4 - g a l a c t o s y l t r a n s f e r a s e1 ( g a i ti ) i st h ef i r s tc l o n e dg l y c o s y l t r a n s f e r a s e i t h a db e e nr e g a r d e da sah o u s e k e e p i n gg e n ef o ral o n gt i m e i no u rp r e v i o u s i n v e s t i g a t i o n ，i tw a sf o u n dt h a tg a t 1w a sa ni n t r a c t i o np r o t e i no fs g t a n de i a f o n e o ft h ee t sf a m i l ym e m b e r sc o u l dr e g u l a ti t se x p r e s s i o n i nt h i sp a p e r , w ei n v e s t i g a t e d w h e t h e re t s 1 a n o t h e rm e m b e ro fe t sf a m i l yc o u l d r e g u l a t e i t s e x p r e s s i o n c o t r a n s f e c t i o no fg a l tip r o m o t e r l u c i f o r a s er e p o t t e ra n de t s 一1e x p r e s s i o np l a s m i d i n c r e a s e dt h e1 u e i f e r a s er e p o r t e ra c t i v i t yi nad o s ed e p e n d e n tm a n n e r b yd e l e t i o n a n a l y s i s w ei d e n t i f i e dar e g i o nb e t w e e nn u c l e o t i d e 2 15 13 9i ng a l tip r o m o t e r w h i c hw a sc r i t i c a lf o rr e s d o n s i v e n e s st oe t s 一1 s i t es p e c i f i cm u t a g e n e s i sr e v e a l e dt h i s r e g i o nc o n t a i n e da ne t sb i n d i n gs i t ef 2 0 5 一2 0 0 ) w h i c hw a sn e c e s s a r yf o rg a l ti a c t i v a t i o n w ec o n f i r m e dt h a te t s 一1c o u db i n dt oa n da c t i v a t eg a l tip r o m o t e rb v e m s aa n dc h r o m a t i n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t h e s ed a t as u g g e s tt h a te t s 1i sa t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o ro fg a l tr k e yw o r d s ：s g t p 5 3 c a s p a s e y e a s tt w oh y b r i ds y s t e m p i a s l g a t ii e t s e t s l e 1 a 2 第一部分s g t 蛋白促凋亡作用的研究 前言 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) ，又称程序性细胞死i ? 2 ( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) ，是有 核细胞的一种进化保守的基本特征，是由基因控制的复杂的细胞自杀机制，与细 胞增殖一起维持生物体正常生长发育及组织自稳。细胞凋亡的标志性形态学 特征是细胞皱缩，细胞膜出泡，染色质固缩，凋亡小体的形成等【”。 s g t 【s m a l lg l u t a m i n e - r i c ht e t r a t r i c o p e p t i d er e p e a t ( t p r ) c o n t a i n i n gp r o t e i n 蛋白也被称作病毒蛋白u 结合蛋白( u b i n d i n gp r o t e i n ) ，克隆于1 9 9 8 年，是两 个研究小组分别以细小病毒的n s l ( n o n s t r u c t u r a lp r o t e i n1 ) 和人类免疫缺陷病 毒一1 ( h i v - 1 ) 的病毒蛋白u ( v p u ) 为诱饵蛋白进行酵母双杂交时筛查到的蛋白质 p 4 j 。其特征为在分子的中部含有三个被称为t p r ( t e t r a t r i c op e p t i d er e p e a t ) 的结 构域( f i g 1 ) 。t p r 结构域是一个含有3 4 个氨基酸的片段，在进化过程中从细菌 钊人类都有广泛存在，从低等的酵母到人，s g t 的进化保守性很强 i 。人和鼠的 s g t 同源性更高，人的s g t 含有3 1 3 个氨基酸，鼠的含有3 1 4 个氨基酸，两者 的氨基酸序列有9 1 是相同的，尤其是t p r 结构域部分的相似性最高 5 1 。迄今 为止已发现5 0 多种蛋白质含有t p r 结构域，含有t p r 的蛋白没有某种特定的 生物活性，而是广泛参与细胞内各种生物过程，包括细胞周期的调控、蛋白激酶 的抑制、转录调控、线粒体及过氧化物酶体蛋白的转运、神经传导以及蛋白质泛 素化过程等【0 1 。 q o n a1 2 s h h1 5 牲n a1 9 2 a a f i g 1 s t r u c t u r eo fs g tp r o t e i nd o m a i n 最早发现s g t 可与h i v - 1 病毒的v p u 蛋白以及g a g 蛋白结合，调节h i v - 1 病毒颗粒的正确形成和释放【。新近发现人的s g t 能够与t g 邛超家族的新成员 m y o s t a t i n 的n 术端发生相互作用，推测s g t 在调节m y o s t a t i n 的分泌和激活中 起作用n 另有研究发现s g t 能够与生仨乏激素受体的泛索依赖的内吞模序( u b e m o t i f ) 目结合，估计可能是通过与泛素竞争结合u b e 模序，调节泛素系统对q 长 激素受体的降解瞄j 。此外，德国一研究小组发现人的s g t 与细胞分裂有关，s g t 的表达被抑制后细胞周期发生改变，细胞增殖减慢，不能完成细胞分裂p 1 。目前 研究最多的是s g t 可与热休克蛋白h s p 7 0 ( h e a ts h o c k p r o t e i n7 0 ) 及h s c 7 0 f h e a t s h o c kc o g n a t e p r o t e i n7 0 ) 榧f 作用发挥共伴侣的功能m ”，1 2 ，”】。s g t 能够抑制热休 克蛋白分子伴侣功能，可能作为负调控因子参与了细胞内蛋白折叠的过程。例如， 在模拟人的b 一淀粉样物形成的秀丽线虫的实验模型中，s g t 的线虫类似物下调 h s p 7 0 的分子伴侣功能，用s g t 的r n a i 抑制s g t 的线虫类似物的表达则可有 助于增强细胞内d 一淀粉样物的代谢，降低其对细胞的毒性【 。然而在神经元的突 触小泡的表面的h s c 7 0 、s g t 和c s p ( c y s t e i n es t r i n gp r o t e i n ) 的三元复合体中s g t 能够激活h s c 7 0 的a t p 酶活性，增强h s c 7 0 的分子伴侣功能，以利于囊泡介导的 神经元信号转导【l “。本实验室的研究发现s g t 能够与b 1 ，4 半乳糖基转移酶1 ( g a l ti ) 相互作用，降低g a i ti 酶活性【1 3 1 。 大量的研究表明热休克蛋白h s p 7 0 和h s c 7 0 具有抗凋亡的作用，可以拮抗 热休克、血清饥饿、活性氧、化疗药物等引起的细胞凋亡，并且这种作用依赖于 其分子伴侣的功能。不仅如此，一些含有t p r 结构域的蛋白质，例如c h i p 、 t p r 2 、s t r a p f i “1 7 j8 】等，均可以不同的方式参与细胞凋亡的进程。此外，本实验 室以往的研究也表明g a i t i 能增强s m m c 一7 7 2 1 肝癌细胞对放线菌酮诱导细胞凋 亡的敏感性【l 。这些证据提示s g t 与细胞凋亡也有一定的关联。因此，本文对 s g t 与细胞凋亡的关系进行了研究，发现在s m m c 7 7 2 1 细胞中超表达s g t 蛋 白能够促进放线菌酮诱导的细胞凋亡，这种凋亡是c a s p a s e 和p 5 3 蛋白依赖性的。 材料和方法 材料 1 w i z a r dp l u s m i n i p r e p s d n a p u r i f i c a t i o ns y s t e m 购自华舜公司。限制性内 切酶购自n b e 公司。p r o b e s tt a q 酶购自t a k a r a 公司。l i p o f e c t a m i n e r e a g e n t l ) l l j 自 i n v i t r o g e n 公司。t r i z o l 为g i b c o 产品。n y l o n 膜( n + ) ，c c _ 3 2 p a t p 购白a r n e r s h a m 公司。随机引物探针标记试剂盒购1 刍p r o m e g a 公司。焦磷酸二乙酯( d e p c ) 、b 一 巯基乙醇为f l u k a 产品。十二烷基肌氨酸钠( s l s ) ，十二烷基磺酸钠( s d s ) 为 a m e s c o 产品。x 光胶片为柯达公司生产。a n t i p 5 3 抗体，抗鼠f i t c 抗体购自s a n t a c r u z e 公司。a n t i - - p a r p 抗体，a n t i b a x 抗体购自o n c o g e n e 公司。m i t o t r a c k e rp r o b e 染料购1 9 m o l e c u l a r p r o b e s 公司。抗鼠辣根过氧化物酶二抗i g g 及抗兔辣根过氧化 物酶二抗i g g 购自于a m e r s h a m 。e c l 发光剂和p v d f 膜购自a m e r s h a m 公司。 r p m i 一1 6 4 0 培养基、质粒抽提试剂盒，g 4 1 8 、p m s f 、h o e c h s t3 3 2 5 8 、c y c l o h e x i m i d e 购自s i g m a 公司。a n n e x i n v 试剂盒购自b d 公司。z v a d f m k 购自r & d 公司。 4 s m m c 7 7 2 l 细胞购自中科院上海细胞所。p c d n a 3 s m m c 一7 7 2 1 稳转株位为本实 验室所建。p g e f p 质粒、小牛血清购自中科院上海生物制品研究所。其余试剂均 为进口分装或国产分析纯。 2 仪器 p c r 仪：p e 公司。 相差显微镜：n i k o n 公司 倒置荧光显微镜：n i k o n 公司。 d n a 、r n a 电泳槽购自于华美公司。 紫外交联仪为b i o - - r a d 产品。 细胞培养箱为f o r m as c i e n t i f i c 公司产品。 杂交炉为b i o m e t r a 公司产品。 蛋白电泳装置为a m e r s h a mp h a r m a c i a 公司产品。 半干转移装置为b i o m e t r a 公司产品。 凝胶成像装置：上海复闩公司。 方法 一、质粒构建 1 多聚酶链反应( p c r ) 扩增目的c d n a 片断： 1 1 引物： ( 1 ) p c d n a 3 - s g r s g t ls e n s ee e o ri5 g a t g a a t t c a t g g a c a a c a a g a a g c g c c s g t la n t i s e n s ex h oi5 g a t c t c g a g t c a c t c c t g c t g g t c g t c ( 2 ) p d s - r e d l c i s g t s g t 2s e n s ex h o5 c g c t c g a g a a a t g g a c a a c a a g a a g c g c c s g t 2a n t i s e n s eb a m h l5 c g g g a t c c c t c c t g c t g g t c g t c g t t g 2 ) 模板：人胎肝c d n a 文库( g t b c ob r l ) 3 1p c r 反应体系： 模板 1 j t l 10 x b u f f e r 5 9 l 上游引物( o 3 3 9 9 p 1 )1 l 下游引物( o3 3 ；t g 卜1 )1 l 1 d n t p ( 1 0 x ) 5 ；t l h 2 0 3 6 1 - t l 5 旦! q b 盟 四酶! 丛l ( 2 女) 5 0 9 l p c r 循环条件为9 5 。c4 0 s ，5 5 。c4 0 s ，7 2 。c1 5m i n ，共3 0 个循环，最后7 2 。c 延伸1 0 m i n 2 胶回收 1 琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒纯化回收片段( 参照p r o t o c 0 1 ) ，割下含 目的片段的琼脂糖凝胶块，放入1 5 m le p p e n d o r f 管中。按照每1 0 0 m g 琼脂糖 加入3 0 0 9 ls 1 液的比例加入s 1 液，5 5 。c 水浴1 0 分钟，使琼脂糖完全溶解， 每隔2 分钟颠倒混匀一次。再加入1 3 体积的异丙醇，混匀，5 5 。c 水浴1 分 钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱中，静置1 分钟，1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 9 离心1 5 秒，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱中加入4 5 0 9 l w 1 液，静置1 分钟，1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 9 离心1 5 秒，倒掉收集管中的液体，再将 吸附柱放入同一收集管中。重复一次。将吸附柱放入一干净的i 5 m le p p e n d o r f 管中，在吸附柱中央加入3 0 9 lt i 液，静置1 分钟后，1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 9 离心1 分钟。将1 5 m l e p p e n d o r f 管( 含目的片段) 贮存于一2 0 。c 备用。 3 酶切 p e d n a 3 一s g t ：p c r 产物e c o ri + x h oi 双酶切，p e d n a 3e c o ri + x h oi 双 酶切。p d s r e d l c 1 s g t ：p c r 产物x h ohb a m h l 双酶切，p d s r e d l c 1 x h o 卜 b a m h l 双酶切。分别用2 0 微升酶反应体积，3 7 。c 消化6 h r ，并进行d n a 琼 脂糖电泳。胶回收所需酶切片段。 2 0 山反应体系如下： d n a ( 02 2 9 9 9 1 ) 7 0 9 l 10 x 酶切缓冲液 2 0 9 l 限制性内切酶( 1 0 - 2 0 u 9 1 ) 1 0 9 l d d h 2 0 1 0 0 w l 4 连接 按下列体系，在1 6 。c 连接l h r 。 每2 0 “l 反应体系如下： 载体d n a ( o1 2 g d 1 ) 2 0 i t l 插入d n a ( 0 1 2 “g 1 )1 0 0 “】 1 0 x r 4 连接缓冲液2 0 u 1 t 4 d n a 连接酶( 1 0 u 9 1 ) 1 5 2 o u l d d h 2 0 4 5 4 0 p 1 5 大肠杆菌ec o l i d h 5 感受态细胞的制备( c a c l 2 方法) 1 ) 挑取l b 固体培养基上生长的e c o l i 单菌落，接种于2 0m ll b 液体培养基 中，3 7 。c 恒温，2 2 0 r p m 振荡培养过夜( 约1 2 1 4 h r ) 。 2 ) 取o5 m l 新鲜培养菌液，接于5 0 m ll b ，3 7 。c 振荡培养至o d 6 0 0 = o 2 0 3 ( 2 h r ) 。 3 ) 收集菌液，离心5 0 0 0r p m x 5m i n ，4 。c ；沉淀物重悬于预冷的2 0m l1 0 0 m m c a c l 2 冰浴2 0 m i n 。 4 ) 离一t l , 5 0 0 0r p m x 5m i n ，4 。c ，弃上清。 5 ) 加预冷的1 2m l1 0 0m mc a c l 2 吹打重悬沉淀，继续冰浴3 h r 后即为感受态 细胞，可立即转化。 6 ) 亦町用等体积预冷的无菌1 0 甘油一1 0 0m mc a c l 2 重悬( 4 ) 中沉淀的感受 态细胞，分装1 0 0 2 0 0f d 管，保存于，8 0 。c 各用( 6 个月左右) 。 6 质粒转化 将反应完成连接反应混合物转化ec o l i t o p l 0 感受态细胞( c a c l 2 方法) 。 1 ) 取2 0 微升连接反应混合物，混合于1 0 0 2 0 0 p , 1 感受念细胞，冰浴4 5m i n 一2h r 。 2 ) 4 2 。c 热休克2m i n ，迅速转移至冰浴。 3 1 加入5 0 0 9 l 新鲜l b 培养液，于3 7 。c 缓摇孵育4 5m i n 。 4 ) 将转化的细胞涂御l b 固体培养板( 含有选择性抗生素，如氨苄青霉素， 卡那霉素) ，3 7 。c 倒置培养至单菌落出现。 7 质粒提取鉴定 挑耿3 4 个生长在含有a m p 的l b n 体培养板上的单克隆菌落，接种于2 0m l 含 a m p 的l b 液体培养基中，3 7 。c 恒温，2 5 0r p m 振荡培养过夜约1 2 1 4 h 用碱裂解 法少量制备细菌质粒d n a 。 1 ) 挑取l b 固体培养基上生长的e c o l i 单菌落，接种于2 0 m ll b 液体培养基 中，3 7 0 c 恒温，2 5 0r p m 振荡培养过夜( 约1 2 - 1 4 h r ) 。 2 ) 取1 ，5m l 新鲜过夜菌，室温离心8 0 0 0r p m x lm i n ，尽弃，卜清。 3 ) 将沉淀细菌振荡悬浮于1 0 0 a l 溶液i 。 ( 溶液i ：5 0 m m 葡萄糖：2 5 r a mt r i s c 1 ；1 0 r a me d t a ，p h 8 0 ) a 2 0 mt r i s - c 1 p h 8 0 6 2 5 m l b o 4 me d t a p h 8 0 1 25 0 m l ：萤莹擅 4 ：z 3 q g d d d h 2 0 5 0 0 m l 4 ) 加2 0 0 p , 1 新鲜配制的溶液i i ，倒置数次混匀。 ( 溶液l i ：0 2m n a o h ；1 s d s ) a 1 0 m n a o h b s d s o 1 m 1 0 5 m 1 c d d h 2 04 4 m l 5 ) 加入1 5 0 p l 预冷的溶液i l l ，振荡混匀：离心1 2 0 0 0r p m x 5m i n ，4 。c ，弃沉淀。 ( 溶液i i i ：k a c 缓冲液，3 0 m k + 5 0 m a c 。) a 5 mk a c 3 0 0 0 m l b 冰乙酸 5 75 m l ed d h 2 0 1 4 25 m l 6 ) 上清加入4 5 0 p 1 的苯酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，振荡混匀，离心1 2 0 0 0 r p m 5r a i n ，4 0 c 。 7 ) 取上层水相，加0 9m l 预冷无水乙醇，一2 0 。c 静置2 h r 以上，离心1 2 0 0 0 r p m x l 5m i n 4 。c 。 8 ) 将沉淀d n a 用7 0 乙醇洗一次，3 7 。c 烘箱或超净台干燥d n a 。 9 ) 沉淀d n a 重溶于2 0 p lt e 缓冲液( 含r n a s c1 0 2 0 9 9 ) ，3 7 。c 水浴1 - 2 h r 后 进一步酶切分析或保存于一2 0 。c 。 ( t e 缓冲液：1 0 m mt r i s c 1 ；l n c me d t a ) a t r i s b e d t a n a 2 2h 2 0 c d d m 2 0 1 2 1 9 o 3 7 9 8 0 0 0 m 1 堕卫盥旦q 舅世i 至逝盂 ed dh e o 1 0 0 0 0 m l 酶切鉴定含有阳性片段的质粒d n a ，将相应的ec o l it o p l o 细胞保种，保存于 一7 0 。c 。 用于细胞转染的质粒，以鉴定正确的菌种，接种于l b 液体培养基增菌扩增 质粒后，, 喟s i g m a 公司的质粒抽提试剂盒进行质粒纯化制各。 二、细胞培养和稳定转染细胞株建立 s m m c 一7 7 2 1 肝癌细胞以含1 0 灭活小牛血清，青霉素( 1 0 0 u m i ) 和链霉素 ( 1 0 0 1 t g m 1 ) 的r p m i 一1 6 4 0 培养液在3 7 。c ，5 c 0 2 条件下培养。 1 - s m m c 一7 7 2 1 细胞于7 5 c m 2 培养瓶常规培养，待细胞培养至5 0 8 0 密度，即 可用于转染。 2 转染试剂：a 试剂：4 g d n a + 3 0 0 9 l 无血清无双抗的r p m i 1 6 4 0 培养基。 b 试剂：2 0 1 x ll i p o f e c t a m i n e 试剂+ 3 0 0 “1 无血清无双抗的r p m i 1 6 4 0 培养撼。 3 - 将a 试剂和b 试剂小心混匀，室温静置1 5 4 5 r a i n ，以形成d n a 脂质体复合物。 4 弃去培养瓶中培液，用2 - 5 m l 无血清无顾抗的r p m f - 1 6 4 0 培养基洗细胞两次。 5 在d n a 一脂质体复合物中加入2 4 m l 无血清无双抗的r p m i 1 6 4 0 培养基，小 心混匀，加入培养瓶中。3 7 。c ，5 c 0 2 培养5 h r 。再加入含2 0 血清的 r p m i 1 6 4 0 培养基，3 7 。c ，5 c 0 2 培养2 4 h r 。更换新鲜培养液( 1 0 新生牛血 清，双抗，r p m i - 1 6 4 0 ) ，培养2 4 h r 。换含o 4 r r l m lg 4 1 8 的d m e m 培养液继续 培养。 6 经1 4 2 1 天培养，挑选n e o m y c i n 抗性的细胞克隆，用吸管小心将其吸出，移 至2 4 孔培养板中扩大培养。待其长满后，用o 2 5 胰酶消化，并转入7 5 c m 2 培养瓶中培养。待n o r t h e r n 鉴定。 三、n o r t h e r nb l o t 鉴定s g tm r n a 的表达 1 细胞总r n a 的提取：取单层长满的细胞加入l m lt r i z o l 试剂，室温放置 1 0 1 5 r a i n ，加入o 2 m l 三氯甲烷，剧烈振荡后置室温5 m i n ，4 。c ，1 2 0 0 0 9 离 心1 5 r a i n ，上清加入o ，5 m l 异丙醇，室温沉淀1 5 - 3 0 m i n ，4 。c ，1 2 0 0 0 9 再离 心1 5 r a i n ，沉淀用7 0 乙醇洗涤后，干燥并用适量d e p c 水溶解，7 0 。c 存放 备用。 2 r n a 甲醛变性凝胶电泳和转膜：1 0 r n a 电泳缓冲液：o 2 m o l lp o 。3 。， 5 0 m m o l l 乙酸钠，1 0 m m o l l e d t a ，p h 7 0 ( 1 0 0 0 m l 中含n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 4 3 6 9 9 ，n a h 2 p 0 4 2 h 2 01 2 1 7 9 ，n a a c4 1 0 9 ，e d t a n a 2 。2 h 2 03 7 2 9 ) ， 高压消毒。 2 0 x s s c 转膜液( p h 7 0 ) ：3 m o l l n a c l ，o 3 m o l l 柠檬酸三钠，高压消毒。 变性胶制备：琼脂糖1 9 ，1 0 r n a 电泳缓冲液1 0 m l ，3 7 甲醛1 8 m l ，d e p c 处 理水7 2 m l 。 r n a 样品处理：r n a5 0 9 9 ，d e p c 处理水1 3 t x l ，1 0 xr n a 电泳缓冲液 4 9 l ，1 0 0 甲酰胺2 0 p 1 ，3 7 n 醛7 9 l ，6 5 。c 变性1 5 m i n ，加o 4 溴酚兰载样缓 冲液2 3 邮和适量澳乙啶( e b ) 。 电泳：电泳缓冲液为1 r n a 电泳缓冲液，加样前将凝胶预电泳1 0 r a i n ，加 样后于6 0 伏电泳3 h ，电泳结束后，取下凝胶，紫外灯下 观察。 转膜：凝胶用2 0 x s s c 缓冲液浸泡三次，每次1 5 r a i n 。将凝胶置铺有滤纸的 平台上，滤纸的两端浸于2 0 x s s c 缓冲液中，胶的四周边缘贴上p a r a f i l m 膜， 防止短路，凝胶上覆盖和胶同样大小的n y l o n 膜，赶尽气泡，再在膜的上方 置两层w h a t m a n n3 m 滤纸，其上方置约1 0 c m 厚的吸水纸，用玻璃平板盖压， 上黄5 0 0 9 左右的重物，室温转移1 8 2 4 h ，并不断更换湿的纸巾。转移结束 后，取下n y l o n 膜，在u v 灯下用铅笔标上1 8 s 和2 8 s 带的位置，将n y l o n 膜正面( 有r n a 而) 向上，i j 、，崮定( 1 5 0 0 k j ，l m i n ) ，固定好的膜置4 。c 保 存备用。 3 探针+ 制备：用e c o rl + x h oi 双酶切p c d n a 3 - s g t 质粒后电泳凹收s g t 片 段作为探针。 4 探针标记：取模板d n a2 p l ( 5 0 1 0 0 n g ) 最9 5 。c 水浴变性5 m i n ，采用随机 引物法进行标记，反应体系如下： 模板d n a d n t p 混合液( 含等量d g t p ，d t tp ，d c t p ) b s a 5 x b u f f e r h 2 0 k l e n o we n z y m e ( 2 u 9 1 ) 一3 2 p d a t p 室温反应1 h ，加入前9 5 。c 水浴变性5 r a i n 。 5 杂交： 杂交液：0 2 m 磷酸缓冲液，p h 7 2 ，含l m me d t a ，1 ( w v ) b s a ，7 ( w v ) s d s ，1 5 甲酰胺。 洗膜液：4 0 m m 磷酸缓冲液，p h 7 2 ，含有l m me d t a ，l ( w v ) s d s 。 去除探针液：1 0 m m o l l t r i s c 1 ，l m m o l le d t a ，p h 7 2 ，0 1 ( w v ) s d s 。 将n y l o n 膜放入杂交管中，膜反面紧贴杂交管壁，加入8 m l 杂交液，6 5 。c 预 杂交3 h ，倒掉预杂交液，加入3 m l 杂交液和9 5 。c 变性5 r a i n 的标记探针，6 5 。c 杂交1 6 h 。杂交完成后，倒掉杂交液，用洗膜液6 5 。c 洗膜3 - 5 次，每次3 0 m i n ， 一7 0 。c 压片。 从尼龙膜上去除探针：将杂交后的尼龙膜浸入洗涤液中，煮沸t o m i n ，于室 温将尼龙膜干燥，真空存放或用于再次杂交。 四、流式细胞仪检测细胞凋亡 p c d n a 3 s m m c 一7 7 2 1 细胞和p c d n a 3 s g t s m m c 一7 7 2 1 细胞分别用终浓 度为5 u m ic h x 处理0 时间，1 2 小时和2 4 小时后将各自的悬浮细胞以及黏附 细胞收集在一起，细胞碘化丙啶( p i ) 染色及流式细胞仪( f c m ) 测定按我室已发表 的方法进行。细胞o 2 5 胰酶消化后用p b s 洗涤，离心去上清，7 5 酒精固定 过夜。加1 0 m mp b s ( p h 7 4 ) 洗涤后，用l t f i t o nx 一1 0 0 处理1 0 m i n ，然后 o 1 m g m l r n a 酶3 7 。c 消化1 0 m i n ，最后用2 0 p g m l 碘化丙啶( p i ) 染色，f c m 测定。 五、a n n e x i n v 和p i 双染色 a n n e x i n v b i n d i n g b u f f e r ：1 0 r a m h e p e s n a o h p h 7 4 ，1 4 0 r a m n a c l ，2 5 r a m 叫叫耻刈叫 2 2 c a c l 2 尼龙膜过滤后使用。 p c d n a 3 s m m c 7 7 2 1 稳转的对照细胞和p c d n a 3 s g t s m m c 7 7 2 1 稳转细 胞分别用5 u g m lc h x 处理0 时涮和1 2 小时后将悬浮细胞以及黏附细胞1 0 0 0 r p m 离心后收集在一起。将所收集的细胞用1x p b s 缓冲液洗两次后，将细胞：悬浮于 a n n e x i nv b i n d i n gb u f f e r 中，在1 9 5 u l 约含1 0 6 个细胞的悬液中加入5 u la n n e x i n v - f i t c ( 异硫氰酸荧光素标记的a n n e x i nv ) ，避光孵育1 0 分钟，再用1 x p b s 缓 冲液洗两次。然后再以1 9 0 u la n n e x i nvb i n d i n gb u f f e r 悬浮细胞，加入1 0 u lp i ( 2 0 9 9 m 1 ) 混匀后，用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。报告图的左下四分之 一的点图代表活细胞，右下四分之一代表早期凋亡的细胞，右上四分之一代表晚 期凋亡的细胞( f i g ，6 a ) ，用c e l l q u e s t 软件计算各亚群在总体中所占的百分比。 六、d n a 片段化检测( d n a 梯) 1 试剂及配制 ( 1 ) 细胞裂解液：1 0 m m t r i s - h c l ，p h 8 0 ，1 0 m m n a c l ，l o m m e d t a ，1 0 0 u g m l 蛋白 酶k ，i s d s 。 ( 2 ) 水饱和的酚、氯仿、异丙醇、冷无水乙醇。 ( 3 ) 3 m 乙酸钠：4 0 8 1 9n a a c l 3h 2 0 ，溶于8 0 0 m l 蒸馏水，用冰醋酸调节p h 至 5 2 ，然后用蒸馏水定容到1 0 0 0 m l 。 f 4 ) 1 0 m g m l r n a 酶( 无d n a 酶活性) 。 ( 5 ) t e 缓冲液：0