（分析化学专业论文）以单分散树脂为基质的手性配体交换色谱固定相的合成与应用研究.pdf

摘要 手性分离是分离科学中一个引人注目的研究领域。在各种拆分方法中，以手性阎定相为基础 的高效液相色谱法是目前的主要拆分方法之一。在手性化合物的直接拆分中，手性同定相的制备 是手性色谱发展的前沿领域，也是手性色谱发展的关键和核心。在众多的手性固定相中，手性配 体交换色谱固定相是广泛使用的手性固定相之一。手性配体交换色谱同定相多以硅胶为基质制 备，但硅胶由于p h 应用范围窄，不可逆吸附强等缺点，在手性分离中受到一定限制，而以聚合 物为基质的色谱固定相p h 应用范围宽，不可逆吸附小是手性固定相的发展方向。 本文借鉴和改进前人的制备方法，以单分散亲水性聚合物微球为基质，将不同类型的手性选 择剂同定在聚合物基质上，作为配体交换色谱阈定相，将其用于手性化合物的拆分。本文工作分 以下五部分： 1 综述了高效液相色谱手性固定相，重点评述了配体交换色谱同定相的发展、分类、拆分 机理及影响拆分的因素，并简要阐述了本论文研究的内容及意义。 2 以单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯一甲基两烯酸7 _ , - - 醇双酯( p g m 肌d m a ) 树脂为载 体，以l 脯氨酸为手性配体，制备了一种新型l - 脯氨酸聚合物键合高效手性配体交换固定相i 。 在配体交换色谱模式下，对衍生和非衍生的1 4 种d l 氨基酸、1 种a 羟基酸和2 种氨基醇类药物 等手性化合物进行了很好的高效液相色谱拆分。且对d l - 氨基酸的拆分具有较高的拆分因子，最 好的分离因子口= 2 5 3 。并考察了流动相p h 值，金属离子浓度，流速及温度对手性分离的影响； 首次，在强碱性条件下( p h = 1 2 ) ，直接拆分了外消旋麻黄碱和异丙肾上腺素两种氨基醇类药物进 行了分离。 3 以改性后的单分散亲水性p g m 舭叫a 树脂为载体，以l 脯氨酸为手性配体，采用新的方 法制备了l 脯氨酸聚合物键合高效手性配体交换固定相i i 。并用于d l - 氨基酸的直接光学拆分， 考察了流动相p h 值，金属离子浓度，流速及温度等因素对d l 氨基酸对映体拆分影响。通过比 较l 脯氨酸聚合物键合高效手性配体交换i 司定相i 和l 脯氨酸聚合物键合高效手性配体交换固 定相i i 的键合量的不同，探讨了手性配体键合量度对d l 氨基酸对映体分离的影响。 4 以单分散亲水性p g m 肌嗍a 树脂为载体，以l 羟脯氨酸为手性配体，制备了一种新型。 羟脯氨酸聚合物键合高效手性配体交换固定相。在配体交换色谱模式下可对衍生和非衍生的d l - 氨基酸和a 习径基酸等9 种手性化合物进行了很好的高效液相色谱拆分，最好的分离因子a - - 2 8 6 。 同时考察了流动相p h 值，温度，流速和进样量对手性分离的影响。 5 以单分散亲水性p g m 觚d m a 树脂为载体，以l 异亮氨酸为手性配体，制备了一种新型l - 异亮氨酸聚合物键合高效手性配体交换同定相。在配体交换色谱模式下可对1 2 种d l - 氨基酸对 映体进行了很好的高效液相色谱拆分，最好的分离因子嘎- - 2 3 3 。同时考察了流动相p h 、流速及 柱温等色谱条件对d l - 氨基酸对映体拆分的影响。 关键词：配体交换色谱固定相，交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂，高效液相色谱，手性分离 a b s t r a c t e n a n t i o s e p a r a t o ni so n eo ft h ea t t r a c t i v er e s e a r c hf i e l d si ns e p a r a t i o ns c i e n c e 1 1 坞s e p a r a t i o nb y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) o nc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e s ( c s p s ) h a sb e e nr e c o g n i z e d a sam a j o ro n ea m o n ga l lk i n d so f c n a n t i o m e ri s o l a t i o na p p r o a c h s i nt h ed i r e c ts e p a r a t i o no fc h i r a l i t y , t h ep r e p a r a t i o no fc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ei st h ek e yo ft h es e p a r a t i o nm e t h o d c h i r a ll i g a n d - c x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h i c ( c l e c ) s t a t i o n a r yp h a s eh a sb e e ni d e n t i f i e da sv e r s a t i l ea n du s e f u l c s pf o rt h e s e p a r a t i o no fe n a t i o m e r s m o s tc l e cs t a t i o n a r yp h a s e ss u p p o r t e db ys i l i c ag e l s i l i c a - b a s e dc h r o m a t o g r a p h ys u p p o r t sh a v e m a n yd i s a d v a n t a g e s ，s u c ha sb e i n gl e s ss t a b l eu n d e rh j i g hp hc o n d i t i o n sa n dh y d r o p h o b i cw i t hs t r o n g i r r e v e r s i b l ea d s o r p t i o n s ot h e ya r el i m i t e dt os o m ee x t e n di nc h i r a ls e p a r a t i o n o nt h eo t h e rh a n d ，t h e s y n t h e t i cp o l y m e rb e a d sa r es t a b l eo v e re n t i r er a n g eo fp ha n dh y d r o p h i l i cw i t hw e a ki r r e v e r s i b l e ， w h i c hm a k et h e mw e l ls u i t e df o rh i g h - p e r f o r m a n c el i g a n de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y b e c a u s ep o l y m e r i c s e p a r a t i o nm e d i a sp o s s e s sm a n ya d v a n t a g e o u s ，i nt h i st h e s i s ，c h i r a l l i g a n d - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s e st h a tc o n t a i nt h r e ed i f f e r e n tc h i r a ls e l e c t o r sa t t a c h e d t o m o n o d i s p c r s ep o l y ( g l y c i d y l m e t h a c r y l a t e - c o - e t h y l e n e d i m e t h a c r y l a t e ) b e a d s h a sb e e np r e p a r e d ， m e a n w h i l em 呵a r eu s e dt oc h i r a ls e p a r a t i o n t h i st h e s i si n c l u d e sf i v ep a r t sa sf o l l o w i n g ： 1 t h ei m p o r t a n c ea n dm e t h o d so fe n a n t i o s e p a r a t i o nf o rc h i r a lc o m p o u n d sh a v eb e e nr e v i e w e d s y s t e m a t i c a l l y i ti sg i v e ne m p h a s i st od e v e l o p m e n ta n dt y p e so fc l e cs t a t i o n a r yp h a s e e s p e c i a l l y , t h e i n f l u e n c e si nc n a n t i o s c p a r a t i o na n dm e c h a n i s mo fc h i r a lr e c o g n i t i o no fc l e cs t a t i o n a r yp h a s ea r c m a i n l yr e v i e w e di nd e t a i l a tt h es a m et i m e ，i tp r o v i d e d t h es i g n i f i c a n c ea n dp u r p o s eo ft h et h e s i s 2 t h em o n o d i s p e r s ep g m a e d m ab e a d sw e r er e a c t e dw i t hl - p r o l i n e ( l - p r o ) t op r e p a r a t i o no f l - p r o l i n e - b o n d e dp l o y m e r i cc h i r a ll i g a n de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s ei t h ec l e c s t a t i o n a r yp h a s ec a np r o v i d ee f f i c i e n ts e p a r a t i o no f15e n a n t i o m c r so fd e r i v a t i z e da n du n d e r i v a t i z e d d , l - a m i n oa c i d sa n da - h y d r o x ya c i d sa n dt h eb e s tv a l u eo fc n a n t i o s e l e c t i v i t y ( a ) w a s2 5 3 t h e i n f l u e n c eo f t h em o b i l ep h a s ep h ，c o n c e t r a t i o no f c u ( i i ) ，f l o wr a t eo f e l u e n ta n dt e m p e r a t u r eo f c o l u m n o nt h er e s o l u t i o no fd i ，a m i n oa c i d sb yl i g a n de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw e r ei n v e s t i g a t e d ；i n p a r t i c u l a r , t w oa d r c n c r g i cd r u g sa r ed i r e c tc h i r a lr e s o l u t i o no nt h el - p r o l i n ec h i r a ls t a t i o n a r yp ：h a s eia t p h1 2 3 l - p r o l i n e - b o n d e dp l o y m e r i cc h i r a ll i g a n de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s e1 1w a s p r e p a r e db yt r e a t i n g t h em o n o d i s p e r s ep o l y ( g l y c i d y l m e t h a c r y l a t e - c o - c t h y l e n e d i m e t h a c r y l a t e ) w i t h e p i c h l o r o h y d r i na n dl - p r o l i n e ，a n da p p l i e df o rs e p a r a t i o no fs o m ed l - a m i n oa c i d s t h ei n f l u e n c eo ft h e m o b i l ep h a s ep h ，c o n c e t r a t i o no fc u ( i i ) ，f l o wr a t eo fe l u e n ta n dt e m p e r a t u r eo fc o l u m no nt h e r e s o l u t i o no fd l - a m i n oa c i d sb yl i g a n de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw e r ei n v e s t i g a t e d c o m p a r e dt w o l - p r o l i n ec h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ew i t hv a r i o u sb o n d i n ga m o u n t s ，t h ei n f l u e n c eo ft h eb o n d i n ga m o u n t s o nt h ee f f i c i e n c yo fr e s o l u t i o no fd l a m i n oa c i d sb yl i g a n d - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw e l eb r i e f l y d i s c u s s e d 4 an e wl - h y d r o x y p r o l m e - b o n d e dp l o y m e r i cc h i l a ll i g a n de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i c s t a t i o n a r yp h a s eb a s e do nt h em o n o d i s p e r s ep g m a e d m ab e a d sw a ss u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e d t h ec l e c m s t a t i o n a r yp h a s ec a np r o v i d ee f f i c i e n tc h i r a ls e p a r a t i o no f 9e n a n t i o m e r so fd e d v a t i z e da n d u n d e f i v a t i z e dd ，l a m i n oa c i d sa n dc t - h y d r o x ya c i d sb yl i g a n de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dt h eb e s t v a l u eo fe n a n t i o s e l e c t i v i t y ( a ) w a s2 8 6 t h ei n f l u e n c eo ft h em o b i l ep h a s ep h ，c o n c e n t r a t i o no fc u ( i i ) ， f l o wr a t eo fe l u e n ta n dt e m p e r a t u r eo fc o l u m n0 1 1t h er e s o l u t i o no f d l a m i n oa c i d sa n d h y d r o x ya c i d s w e r ei n v e s t i g a t e d 5 an e wl - i s o l e u c i n e - b o n d e dp l o y m c r i cc h i r a ll i g a n de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r y p h a s eb a s e do nt h em o n o d i s p e r s ep g m a e d m ab e a d sw a ss u c c e s s f u l l yp r e p a r e d t h ee n a n t i o m e r i c r e s o l u t i o n so f1 2d l a m i n oa c i d sw e r ea c h i e v e d0 1 1t h es y n t h e s i z e dc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ea n dt h eb e s t v a l u eo fe n a n t i o s e l e e t i v i t y ( a ) w a s2 3 3 t h ee f f e c t so ft h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ，s u c h 鹊p ha n d t e m p e r a t u r eo fc o l u m na n df l o wr a t eo fe l u e n t , 0 1 1t h ee n a n t i o m e r i cr e s o l u t i o no ft h ed l - a m i n oa c i d s w e r es t u d i e d k e y w o r d s ：c h i r a ls e l e c t o r , m o n o d i s p e r s ep o l y m e r i cb e a d s ，c h i r a ll i g a n d - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , c h i r a ls e p a r a t i o n i v 插图和附表清单 图1 1c d 结构图4 图1 - 2 典型手性冠醚的结构5 图1 3 两种典型p i r k l e 型手性固定相的分子结构6 图1 - 4d l 氨基酸对映体与l 脯氨酸聚合物键合配体交换i 吉j 定相形成的三元配合物模型8 图1 5 有机一无机杂化基质示意图1 4 图2 1 单分散树脂键合手性配体交换色谱固定相合成路线1 7 图2 2 四种d l 氨基酸对映体色谱分离图1 9 图2 3 流速对d l 苏氨酸拆分效果的影响2 0 图2 _ 4h a k l t 图2 l 图2 5c u 2 + 浓度对d l - 氨基酸拆分效果的影响2 2 图2 6e e p 对映体和异丙肾上腺素对映体n d 的色谱分离图2 3 表2 1d l 氨基酸和a 羟基酸的拆分效果。1 9 表2 2 柱温对手性拆分效果的影响2 0 表2 - 3 流动相p h 值对d l - 氨基酸拆分的影响。2 l 图3 - 1 单分散树脂键合手性配体交换色谱固定相合成路线2 5 图3 2d l 氨基酸对映体的色谱分离图2 6 图3 3 流动相p h 值对d l 一谷氨酸和d l 一半胱氨酸拆分效果的影响。2 6 图3 _ 4 温度对d l - 半胱氨酸拆分效果的影响2 7 图3 - 5 流速对d l - 谷氨酸拆分效果的影响2 8 表3 1c u 2 + 浓度对d l 氨基酸拆分的影响。2 7 图4 1 单分散树脂键合手性配体交换色谱同定相合成路线_ 。3 l 图4 - 25 种d l - 氨基酸对映体色谱分离图3 2 图4 3 进样量对d i _ , - 丝氨酸拆分效果的影响3 3 图4 - 4 流速对d l 脯氨酸拆分效果的影响3 3 图4 5 温度对d l - 丝氨酸( a ) 和d l - 脯氨酸( b ) 拆分效果的影响。3 4 表4 - 1d l - 氨基酸和碟至基酸的拆分效果。3 2 表4 - 2 流动相p h 值对d l - 氨基酸拆分的影响。3 4 图5 1 单分散树脂键合l - 异亮氨酸手性配体交换色谱固定相合成路线3 7 图5 - 2l n k l t 图3 9 图5 3 流速对d l 缬氨酸拆分效果的影响3 9 表5 1d l - 氨基酸和拆分效果3 8 表5 - 2 柱温对手性拆分效果的影响3 8 表5 3 流动相p h 值对d l - 氨基酸拆分的影响4 0 v 1 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 研究生签名：鸟桂娟 时间： 2 d d 子年j 月7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位 论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 马槌蛹 时间： 2 0 09 年岁月7 日 一， v 。 导师签名嘭 时间： 2 占年岁月7 日 宁夏大学硕 j 学位论文第一章绪论 曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼吕曼曼曼。一。一i i _ i ii|ii i 鼍曼皇曼曼曼曼曼曼! 曼! 蔓曼鼍曼皇 第一章绪论 液相色谱手性同定相的合成以及对映体分离是近二十年来手性技术领域和色谱领域的一个 重要研究方向。本章对手性拆分技术、不同手性固定相发展应用研究以及对配体交换手性固定 相的研究发展作一综述。 i i 手性分离的重要意义 手性是人类赖以生存的自然界的本质属性之一。作为生命活动基础的生物大分子如蛋白质、 多糖、核酸都具有手性的特征( 天然的糖大多为d 构型，氨基酸为l 构型，蛋白质和d n a 的 螺旋构象又都是右旋的) 。具有光学活性的手性物质广泛存在于动植物体内，这种生物立体选择 和旋光物质的立体合成，是生物系统特有的本能。手性化合物的存在是自然界的一种普遍现象， 特别是在有机化学，生物化学，药物化学等领域【l j 。 随着医学工程和生命科学的发展，科学家己经认识到，手性化合物的对映异构体尽管它们 的物理和化学性质几乎完全相同，只有旋光性不同，但它们在生物体内的生理作用和药理作用 却存在很大的差异。例如用于治疗帕金森病的l 多巴，活性的成分是由l 广多巴通过体内脱羧作 用形成的非手性化合物多巴胺。由于多巴胺不能通过血脑屏障到达作用部位，必须服用前药l 多巴，再由酶作用将【广多巴脱羧，释放出药物的活性形态多巴胺。然而，多巴脱羧酶具有专一 性，只对l 多巴作用。因此，必须服用纯的l 多巴，否则，d 多巴可能会危险地积累在体内。 其他许多药物也有类似的性质，例如( s ) 天冬酰胺味苦，而( r ) 天冬酰胺则味甜；( s ) 香芹酮为 芫荽味，而( r ) 香芹酮则为留兰味；( s ) 普萘洛尔比( r ) 普萘洛尔的活性高9 8 倒2 j ；对于非甾体 类解热镇痛药，s 构型有生理活性，r 构型无生理活性或活性很低等等。使用外消旋药物可能 导致错误的药代行为和作用模式。在美国医药药物名称词典所列出的2 0 5 0 种药物中，大约有一 半药物分子至少包含一个手性中心，其中有4 0 0 多种药物以外消体或非对映异构体的形式服用。 限于分离测试技术上的困难，其大部分对映体的疗效及对哺乳动物的毒性、体内的吸收、代谢 等方面的差别还未被深入研究。另外一个典型的例子就是发生在上个世纪六十年代引起整个欧 洲恐慌的“沙立度胺( t h a l i d o m i d e ) ：悲剧”。沙立度胺又称“反应停”，是外消旋的酰胺哌啶酮，用 于治疗孕妇呕吐，它的使用导致了上万名畸形婴儿的出生。研究发现，其( r ) 构型具有良好的 镇静作用而( s ) 构型却导致胎儿畸型1 3 j 。 鉴于有机分子的构型与其生物活性的特殊关系，有必要对手性化合物的各个异构体分别进 行考察，了解它们各自的的生理活性，以便达到高效、安全、无污染的用药目的。为此，许多 国家都先后规定，在申报手性药物时，必须对不同光学异构体的生理活性叙述清楚。1 9 9 2 年3 月，美国食品药物管理局作出手性药物指导原则：一个含手性因素的化学药物，必须说明其两 个对映体在体内不同的生理活性、药理作用和代谢过程，以及考虑单一对映体的问题【4 j 。 近年来，世界市场上手性药物的增长速度很快，据统计，目前所用的各类药物中，5 2 3 种 天然及半合成药中手性药有5 1 7 种，1 3 2 7 种全合成药中手性药有5 2 8 种，而这些手性药物中的 7 5 0 r - 9 0 是以外消旋体的形式在市场上销售1 5 】。正在开发的1 2 0 0 种药物中，有8 2 0 种是手性的， 其中6 1 2 种是以单一对映体在开发，占总数的5 l 。处于i f i i i 期临床试验的药物中，8 0 是单 宁夏人学硕 ? 学位论文第一章绪论 一对映体产品。据预测，到2 0 0 6 年世界上市的化学合成新约中约有6 0 为单一对映体药物t 6 1 。 然而，到目前为止，大部分对映体的疗效及药代动力学的差别还远朱被认识和深入研究，这迫 使科研人员不断地开发出更多的单一对映体的手性药物以满足临床试验及市场的需求。 综上所述，建立高专属性、高灵敏度、高分离度的对映体拆分和测定方法具有重要的理论 和实际意义，并且已成为当今科学领域中的研究前沿。 1 2 手性分离方法 对映体大多以外消旋体的形式存在，通常是理想或近理想的混合物，因此除了对偏振光所 呈现的性质不同之外，外消旋体和纯对映体应当具有相同的性质。为获得单一光学活性手性化 合物需要对外消旋体进行拆分【7 】。外消旋体的拆分主要分为五类，包括直接结晶拆分法、化学 拆分法、微生物或酶作用下的拆分、色谱拆分法和手性膜拆分法【8 1 。 1 2 1 结晶法 若外消旋体所形成的晶体是外消旋混合物，则可直接在其过饱和溶液中加入单一对映体品 种进行诱品得到该对映体。如苦杏仁酸( 羟基苯乙酸) 可以用这种方法得到单一对映体9 1 。 1 2 2 化学拆分法 通过化学反应的方法，用手性试剂将外消旋体中的两种对映体转化为非对映异构体，然后 利用非对映异构体之间的物理性质和化学性质都不同的原理进行分离，再将衍生物还原为纯对 映体。化学拆分法的操作方法是大多数化学工作者都比较熟悉，容易操作的，在许多情况是行 之有效的，因此，这种方法至今仍然是普遍采用的重要拆解方法1 1 0 】。 1 2 3 微生物或酶作用下的拆分 酶是生物化学反应的具有专一性的非对称催化剂。酶催化反应速率高，对底物和产物的专 一性强，并不一定要求有生物或活细胞的参与，反应产品分离提纯简单，而且酶催化反应都发 生在相对温和的条件下，没有设备腐蚀问题，生产安全性高。目前酶法拆分主要用于氨基酸的 大规模生产。 1 2 4 膜拆分法 又可分为液体膜拆分法和手性固体膜拆分法。前者基于选择性萃取，后者基于对映体间亲 和性的差异。从大量制备的角度看，膜法具有优势，但目前选择性和效率还比较差。 1 2 5 色谱拆分法 可分为气相色谱法和液相色谱法，气相色谱法仅适用于分子量低且对热稳定性好的化合物 2 宁夏大学硕f ：学位论文 第一章绪论 的分析：液相色谱法的适用范围大，且可用于制备分离。在液相色谱法【l l j 中，手性衍生化法( c h i r a l d e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t ，简称c d r ) 是外消旋体与手性衍生化试剂先反应后再用常规色谱法分离； 手性流动相( c h i r a lm o b i l ep h a s e s ，简称c m p ) 法是将手性试剂加入流动相中用常规色谱柱分离； 手性同定相( c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e s ，简称c s p ) 法是利用手性固定相直接拆分对映体，这种方法 在液相色谱中更具优势：可用于多种外消旋体的拆分：可以同时高收率地得到两种高旋光纯度 的对映体；可以拆分一些特殊的外消旋体( 如不能衍生化或易消旋的化合物，具有特殊手性结构 如螺旋或螺旋桨构象的化合物) ；可实现大量制备。 上述外消旋体拆分方法各有其特点和适用对象。结晶法可直接进行结晶机械分离，但此法 生产效率低，只适用于极少数产品；化学拆分利用手性试剂与两种对映体形成复合物的热力学 和动力学、反应能力、反应速度、物理性质不同进行合成或拆分，需要手性试剂，工艺复杂， 成本高，环境污染严重但已有工业应用，在合成中，由于有的手性催化剂含有重金属，在医药 上应用受一定限制；微生物或酶作用下的拆分的反应参数必须精确控制，如温度、p h 值、离子 强度等，这些参数的变化范围较小，一旦变化幅度超过它们的允许值，将会引起酶或微生物的 活性丧失；手性色谱拆分法尤其是液相色谱法拆分快速，产物纯度高，探索时问短，适用范围 较大，可用于制备拆分。在新药研究过程中，以可以承受的成本，在尽可能短的时间内制备出 一定数量的高纯度手性物，已成为新药研究开发竞争的重要策略，在现有的手性物制备方法中， 只有手性色谱法能较好地满足此需要，故手性色谱法已成为新药研究、开发的首选的制备方法。 1 3 手性固定相的分类 近年来手性色谱技术己获得很大的发展。其中，高效色谱法用于手性拆分自七十年代末以 来取得很大进展，已成为手性拆分技术的主流。在液相色谱法中，手性衍生化( c d r ) 法是外消 旋体与手性衍生化试剂反应后，再用常规色谱法分离；手性流动相( c m p ) 法是将手性试剂加入 到流动相中，再用常规色谱柱分离。这两种方法在将对映体分离后都需将手性试剂除去，才能 得到单一对映体，制备高纯度的手性物受到一定的限制。手性同定相( c s p ) 法是利用手性识别特 点的固定相直接对非消旋体进行拆分，应用范围较广，操作简单，是目前手性物质研究开发的 重要方法 1 2 】。在其发展过程中，研制新的手性固定相成为该领域的核心，每一次新的手性固定 相的出现都对液相色谱手性拆分技术的发展起到不可估量的推动作用。 手性固定相可以根据其化学类型分类为：( 1 ) 配体交换手性固定相；( 2 ) 环糊精类手性固定相； ( 3 ) 手性聚合物固定相；( 4 ) 冠醚手性固定相：( 5 ) 大环抗生素手性固定相：( 6 ) p i r k l e 型手性固定 相；( 7 ) 蛋白质手性固定相。 1 3 1 环糊精类手性固定相 环糊精( c d ) 是由芽孢杆菌或环糊精转糖基酶作用于淀粉而产生的一种白色结晶状化合物， 此类化合物通常是由扣1 2 个d 吡喃葡萄糖单元以口1 ，4 糖营键以椅式构象构成的环状低聚糖 1 3 1 。 3 宁夏大学硕f ：学位论文第一章绪论 表1 1不同环糊韬的结构和性质 b 图i 1 c d 结构图 已商品化的c d 有三种弘c d 、pc d 、丫c d ，其分子中分别含有6 ，7 ，8 个葡萄糖单元。 c d 分子在空间上呈现一桶型孔穴结构( 见图1 1 ) ，孔穴的开口处由极性的羟基包围，但孔穴本 身呈疏水性。c d 孔穴的大小与含有葡萄糖单元的数目有直接的关系，只有当被研究物空穴型 手性固定相是一类将手性空穴配体键合到基质表面形成的固定相，由此在配体和手性溶质问产 生客体一受体相互作用，这个作用决定了对映体的拆分效果。环糊精手性吲定相的拆分机理主 要基于包含型配合过程，这一机理表示分子的非极性部分被吸引到非极性空穴中。因此，在使 用这类固定相拆分对映体时，首先要考虑的是被分离的对映体分子与手性空穴的匹配性。溶质 的分子大小正好使非极性部分进入孔穴，极性基团与边缘的羟基产生较强的作用时才能被拆分。 一般认为，a - c d 可以包合含有一个苯基的化合物( 或萘基在分子终端的物质) ；p c d 可包合 含有萘基( 或多取代苯基) 的化合物；而丫c d 则适合于含有多个环的化合物( 如甾族化合物) ( 见 表1 1 ) 。鉴于大多数手性物质的结构特点，pc d 的应用最为广泛。通过c d 端口的衍生化不 仅可以改变c d 的亲水性，而且对c d 孔穴的形状也有很大的影响。这些结构及性质的改变也 扩大了c d 的应用范围。 近些年来在c d 键合( 或涂敷) 手性固定相方面的研究相对较多。1 9 8 3 年，f u j i m u r a 首先通 过乙二胺链把c d 键合到硅胶上，用于芳香族化合物位置异构体的分剐，但是通过这种方法 合成的固定相不很稳定，而且合成方法相对也比较复杂。根据含氮c d 键合固定相的缺点，1 9 8 5 4 宁夏大学硕l j 学位论文第一章绪论 皇曼曼曼曼曼曼 _i i 1 皇曼鼍曼 年a r m s t r o n g 等5 j 合成r 不含氮、硫链的环糊精手性吲定相，c d 分子通过6 - 1 2 个间隔原子 与硅胶相连，具有很好的稳定性和很好的手性识别能力，可在反相色谱条件下分离多种类型的 对映异构体。在此基础上，许多衍生化的c d 键合相不断被开发出来，极大地拓宽c d 键合 相的使用范围【l 纠丌。与未衍生的c d 键合相相比，衍生化的c d 键合相增加了新的作用位点 ( 7 m 键作用，氢键作用等) ，所以不仅可以在反相条件下使用，而且可在正相条件下对手性化合 物进行识别和分离。 1 3 2 手性聚合物手性固定相 此类手性固定相包括两类不同来源的聚合物。一类是天然的多糖衍生物，包括纤维素和直 链淀粉。另一类是合成的高分子化合物。 纤维素和直链淀粉可以直接或经衍生后用作h p l c 的手性同定相。纤维素和直链淀粉是 d 葡萄糖以b 1 ，4 糖键或昏l ，4 糖键相连而形成的线型聚合物，由于葡萄糖单元的手性，每个聚 合物链均具有沿着纤维素主链存在的一个螺旋形的沟槽。对映体进入沟中，主要通过吸引和包 合作用实现对映异构体的拆分。 纤维素三苯基氨基甲酸酯( c t p c ) 、纤维素- - ( 3 ，5 二甲苯基氨基甲酸酯) 、淀粉三( 3 ，5 二甲苯 基氨基甲酸酯) 等都是今年来h p l c 研究较多的一类纤维素衍生物。 此类固定相的优越之处在于：良好的稳定性，制备简单，适用于多种手性药物的拆分，尤 其是含芳香环药物的拆分：对醇、酸、酮、酯、含p 或s 的药物或手性中间体均有良好的手性 识别能力。 1 3 3 冠醚手性固定相 冠醚类化合物是本身具有手性的低聚糖，具有亲水性内腔和亲脂性的外壳结构，能够和一 些金属离子形成包容性络合物，常用的冠醚是“1 8 一冠6 ”，结构见图1 2 。冠醚类手性固定相主 要用于一些含有能够质子化的伯胺官能团的手性化合物分离，尤其是氨基酸及其衍生物对映体 的拆分。为了与冠醚发生配合作用氨基必须处于质子化状态，因此，利片j 冠醚类手性固定相进 行拆分时，一般都使用酸性流动相。 r r r 吟 oo oo l 图1 2 典型手性冠醚的结构 5 宁夏人学硕十学位论文第一章绪论 曼皇! ! ! 皇曼! 曼曼曼曼! 曼曼mm mm m m m m m ； m m m m i 曼曼曼蔓曼舅曼 l j 4 大环抗生素手性固定相 1 9 9 4 年a r m s 打o n g 首次使用大环抗生素万古霉素( v a n c o m y c i n ) 、利福霉素( r i f a m y c i nb ) 和 硫链丝菌素( t h i o s t r e p t o n ) 作为手性选择剂，将其键合于硅胶上制成了手性固定相，在正相和反 相模式下拆分了一系列光学异构体【l 引，开辟了手性分离科学领域一个新的研究热点。自此以后， 短短几年的时间，大环抗生素已成功应用于薄层色谱( t c l ) 、毛细管电泳( c e ) 、毛细管电色谱 ( c e c ) ，用来分离各类光学异构体，分离机理的研究也逐步深入【1 9 捌。此类固定相具有通用性 强、柱容量高、柱性能稳定等优点，已成为当前最具应用潜力的手性同定相之一。 1 3 5p i r k l e 型手性固定相 这一类固定相是把具有手性活性的单链分子通过酰胺键连接到氨丙基硅胶基质上所生成的 手性固定相，如图1 3 所示为两种最常用的p i r l d e 型手性同定相的分子结构。离子型键合和共 价键合到氨丙基硅胶的n - 3 ，5 二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸。p i r l d e 2 1 - 2 3 1 等人广泛地研究了这一类 手性固定相拆分对映体的机理，对这一类手性闶定相的创立和发展作出了非常重要的贡献，因 此以p i r l d e 命名这一类手性固定相。 h i 南h s o 一：c 丫i 一、- 一一n ，2 、目 h p h e 。一争一邮丫日 o h p h 图1 3 两种典型p i r l d e 型手性固定相的分子结构 1 3 6 蛋白质手性固定相 n 0 2 n o 2 蛋白质是手性大分子化合物，具有独特的一级、二级和三级结构特征，是对映异构体的天 然识别体，手性识别过程中，三级结构的疏水性口袋、沟槽或通道以及极性基团间的相互作用， 使手性化合物形成了非对映异构体而实现拆分。 目前，用于制备h p l c 手性固定相的蛋白质按来源可以分为：白蛋白类( a l b u m i n ) ，如人血 清白蛋白( h a s ) 、牛血清白蛋白( b s a ) ；糖蛋白类( g l y c o p r o t c i n ) ，如泓酸性糖蛋白( a - a g p ) 、卵 黏蛋o ( o v m ) 、抗生物素蛋白( a v i d i n ) 、核黄素结合蛋白( r m p ) ；酶类，如纤维素二糖水解酶 ( c b h ) 、胰蛋白酶( t r y p s i n ) 、q 胰凝乳蛋白酶( e - c h y m o t r p s i n ) 、胃蛋白酶( p e p s i n ) 、溶菌酶( l y s o z y m e ) 及淀粉葡萄糖酶( a m y l o g l u c o s i d a s e ) 等。 2 0 世纪7 0 年代，s w c w a r t h 和d o h e r t y 首先将b s a 键合到琼脂糖上，制成h p l c 手性固定 相，成功拆分了d l - 色氨酸【2 4 】。 由于蛋白质本身固有的性质，使其对操作条件要求较为苛刻，如高的柱温、有机溶剂、盐 浓度、过低或过高的p h 都会破坏蛋白质手性固定相。虽然蛋白质手性固定相有许多不足，但 6 & 丫 丫 e 宁夏大学硕十学位论文 第一章绪论 它拆分化合物范围广，效果好，得到了j “泛应用。由于蛋白质分子本身具有较大的体积，载样 量较小，柱容量较低，很少用于制备拆分。 1 3 7 配体交换手性固定相 由d a v a n k o v 等人于2 0 世纪7 0 年代早期发展起来的手性配体交换色谱法( c h i r a l l i g a n d - c x c h a