（药理学专业论文）cjunatf2二聚体在神经元凋亡中的作用.pdf

中山大学硕l 论文 c j u n a t f 2 一聚体枉神经元凋亡中的作用 c j u n a t f 2 二聚体在神经元凋亡中的作用 专业：药理学 硕士生：胡策 指导老师：黎明涛教授 摘要 神经元凋亡在神经系统发生、发育过程中发挥着重要作用，而且越来越多的 证据表明神经元凋亡是形成神经退行性疾病的机制之一。因此，阐明神经元凋亡 机制对于发现神经性疾病病因和明确治疗靶点有非常重要的意义。 小脑颗粒神经元( c g n s ) 是哺乳动物脑中丰富的中枢神经元。体外培养 c g n s 时，胞外2 5 m mk c i ( 高钾) 可使神经元处于去极化状态，维持小脑颗粒 神经元的分化、成熟和存活，而去血清、复极化浓度的k c l ( 5 m m ，低钾) 培养 基可诱导分化成熟的小脑颗粒神经元凋亡。由于小脑颗粒神经元来源丰富、体外 培养的同质性高，所以此凋亡模型已被广泛应用于中枢神经元凋亡机制的研究。 大量研究表明，j n k c j u n 通路的激活在神经元凋亡过程中发挥了重要作 用。低钾处理小脑颗粒神经元、撤n g f 处理的交感神经元、b 淀粉样蛋白处理大 脑皮质神经元等凋亡模型中，都已证明j n k 的活化是凋亡发生所必需的。c j u n 与a r f 2 作为i n k 重要的下游底物，其活性也伴随磷酸化水平的升高而升高，目前 的研究表明，c j u n 与a t f 2 可以形成转录因子二聚体作用于下游的靶基因。从而发 挥促凋亡作用。 c - j u n 作为a p l 蛋白家族需要与其它b z i p 结构蛋白形成二聚体才能发挥完整 的转录因子功能，而且一直以来围绕着凋亡下游的靶基因是什么，尤其是c - j u n 这个与凋亡关系比较密切的转录因子的靶基因是什么的问题是近几年国内外研 究的热点。然而在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中，c j u n 与a t f 2 是否形成了 二聚体并没有相关文献予以直接回答，而二者与凋亡之问的关系也没有明确的报 中山大学硕t 论文c - j u n a t f 2 二聚体在神经元凋亡中的作用 道。如果我们能证实在低钾诱导的c g n s 凋亡中，c j u n a t f 2 二聚体确实形成并 参与了凋亡进程，那么对于以c - j u n a t f 2 转录因子二聚体为出发点来寻找下游 靶基因具有重要的指导意义。 因此，本课题主要探讨以下几个问题： 1 在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，c j u n 与a t f 2 活性是否增加； 2 在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，c - j u n 与a t f 2 是否形成了二聚体； 3 c j u n 与a t f 2 二聚体的形成是否是神经元凋亡所必须的。 结果 1 低钾( 5 删k c l ) 诱导小脑颗粒神经元凋亡模型时c - j u n 与a t f 2 的活性变化 小脑颗粒神经元体外培养第7 天，分别用2 5 r a mk c i ( 2 5 k ) 或5 m mk c i ( 5 k ) 培养基处理0 5 、1 、2 、4 h 。收集蛋白后用w e s t e r nb l o t 方法检测发现， 低钾处理时，a t f 2 的6 9 与7 l 位苏氨酸磷酸化水平从o 5 h 开始增加，2 h 达到峰 值，然后逐渐下降，而a t f 2 的转录活性增强，是6 9 7 1 位苏氨酸磷酸化依赖的； 同时我们用c o u n 磷酸化抗体( s e r 7 3 ) 检测c - j u n 磷酸化水平的变化，发现c - j t m 磷酸化水平在低钾o 5 h 后同样显著增加，2 h 达到最高，c - j u ns e t 6 3 ，s e r 7 3 位点 的磷酸化同样能增加c - j u n 转录活性。这说明神经元凋亡时，c - j u n 与a r f 2 的磷 酸化水平增加，转录活性增加。 2 低钾( 5 嘣k c l ) 诱导小脑颗粒神经元凋亡模型时c - - j u n 与a t f 2 形成二聚体 c d u n 与a t f 2 同属于碱性一亮氨酸拉链( b a s i cl e u c i n ez i p p e r , b z i p ) 蛋白 成员，已有的研究表明，c j u n 与a t f 2 可以形成二聚体并且特异性与a t f c r e 序 列( t t a c c t c a 或t g a c g t c a ，下称a t f 序列) 结合。为此，我们用a t f 序列 为探针进行了e m s a 分析，以获得低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时c - j u n 与a t f 2 形成二聚体的证据。体外培养第7 天的神经元分别用2 5 k 、5 k 处理4 h ，然后收 集核蛋白，与t 3 2 p 标记的a t f 探针孵育后跑胶，干胶后放射自显影。发现a t f 探针与核蛋白形成复合物，并且此复合物在5k 处理增加。进一步超飘移实验 ( s u p e r s h i f i a s s a y ) 来证明复合物中的组分。探针核蛋白孵育时加入c - j u n 抗体，发 l i 中山大学硕 。论文c i u n a t f 2 二聚体存神经庀凋亡中的作用 现a t f 位点特异复合物明显减少，而在上方出现了一新条带( s u p e r s h i f t e db a n d ) ， 表明c j u n 为复合物组分之一。加入a t f 2 抗体后发现，特异条件减弱，显示a t f 2 抗体可干预特异复合物的形成，表明a t f 2 也存在蛋白复合物中。我们的结果显 示c - j u n 与a t f 2 都存在结合a t f 位点的蛋白质复合物中，强烈提示两者作互作 用形成复合体。 3 小分子干扰c - j u n 或a t f 2 对小脑颗粒神经元凋亡和存活的干预作用 体外培养第5 天的小脑颗粒神经元，用钙磷沉淀法共转染s h c j u n - a ，s h c j u n - b 或空质粒b s u 6 ，p e g f p 质粒共转染用于标记转染成功的细胞。4 8 h 后，换成 2 5 k 、5 k 模型。1 2 h 后h o e c h s t3 3 2 5 8 ( 5 g m 1 ) 进行染色显示细胞核形态用于计 数凋亡细胞( 细胞核固缩或细胞核碎裂) ，g f p 阳性细胞数计为总数，计算凋亡 率。结果显示干扰c - j u n 表达后神经元凋亡率大大下降，同样的沉默a t f 2 也具 有保护性干预作用。 4 p 1 2 x j u n 2d e c o y 质粒对小脑颗粒神经元凋亡和存活的干预作用 体外培养第5 天的小脑颗粒神经元，用钙磷沉淀法共转染p 1 2 x j u n 2 ，p 1 2 u n 2 m u t 或空质粒p m d ，p e g f p 质粒共转染用于标记转染成功的细胞。3 6 h 后， 换成2 5 k 、5 k 模型。1 2 h 后h o e c h s t3 3 2 5 8 ( 5u g m 1 ) 进行染色显示细胞核形态用 于计数凋亡细胞( 细胞核固缩或细胞核碎裂) ，g f p 阳性细胞数计为总数，计算 凋亡率。结果显示p 1 2 x j u n 2 组显著的降低5 k 下的神经元凋亡率，说明p 1 2 y - j u n 2 d e c o y 质粒能有效的保护低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。 结论： 1 在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，c j u n 与a t f 2 转录活性增加 2 转录因子c j u n 与a t f 2 在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中形成了二聚体 3 c j u n 与a t f 2 二聚体是低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡所必须的 j i i 中山大学硕 ：论文c - j u n a t f 2 矗二聚体臼种绎亡凋亡中的作h j t h ea c t i o no fc - j u n a t f 2o nn e u r o n a l a p o p t o s i s m a j o r ：p h a r m a c o l o g y p o s t g r a d u a t e ：h uc e s u p e r v i s o r ：p r o f l im i n g t a o a b s t r a c t n e u r o n a la p o p t o s i sp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nd e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e n t i a t i o no f b r a i n a l s oe v i d e n c e sa r ei n c r e a s i n gt h a ta p o p t o s i si so n eo fm e c h a n i s m st h a tl e a dt o n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s t h e r e f o r e ，t oe l u c i d a t et h em e c h a n i s mo f n e u r o n a l a p o p t o s i sw i l lp r o v i d eag r e a th e l pt of i n dt h ep a t h o l o g i c a lc a u s eo fn e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s e sa n dt h et a r g e to f t r e a t i n g c e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n s ( c g n s ) a x et h em o s ta b u n d a n tc e n t r a ln e u r o n a l p o p u l a t i o ni nt h em a m m a l i a nb r a i n h j 曲l e v e l so fe x t r a - c e l l u l a rk 十g u nm i m i c e l e c t r o a c t i v i t yi nb o d yt oe n s u r ep r o p e rd e v e l o p m e n ta n ds u r v i v a lo f c g n si nc u l t u r e w h e ns w i t c h e df r o mac u l t u r em e d i u mc o n t a i n i n gh i g hp o t a s s i u m ( 2 5 m m ) t oo n e c o n t a i n i n gl o wp o t a s s i u m0 h y s i o l o g i c a lc o n c e n t r a t i o n , 5 m m ) ，d i f f e r e n t i a t e dg r a n u l e n e u r o n sw i l ld e g e n e r a t ea n du n d e r g oa p o p t o s i s d u et oa b u n d a n tn u m b e r sa n dh i g h h o m o g e n e i t y ，c e r e b e l l a xg r a n u l en e u r o n sh a v eb e c o m ea ne x c e l l e n tm o d e lt os t u d yt h e m e c h a n i s m su n d e r l y i n ga p o p t o s i si nt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m a g r e a tn u m b e ro f s t u d i e sh a v es u g g e s t e dt h a tt h ea c t i v a t i o no f j n k c j u np a t h w a y m a yb eaf u n d a m e n t a ls t e pi nt h ei n d u c t i o no fn e u r o n a la p o p t o s i s i n c l u d i n g s y m p a t h e t i cn e u r o n sd e p r i v e do f n g f , c g n sd e p r i v e do f p o t a s s i u m , c o r t i c a ln e u r o n s e x p o s e dt oa m y l o i d bp r o t e i na n ds p i n a lc o r di n j u r yt r i g g e r e db yt r a u m a t h ea c t i v i t y o fc - j u no ra t f 2w h i c hi se s s e n t i a ls u b s t r a t eo fj n ki si n c r e a s e db yp h o s p h o r y l a t e d 中山大学硕士论文c j u i l ，a t f 2 二聚体在神经元凋亡中的作用 p r o t e i nl e v e l n o w , t h es t u d yh a sd e m o n s t r a t e dt h a tc - j u na n da t f 2c a l l f o r m h e t e r o d i m e rw h i c ha c t i v a t et a r g e tg e n e ，s u b s e q u e n t l yi n d u c e dn e u r o n a la p o p t o s i s h o w e v e r , t h ea c t i v i t ya n dm o d a l i t yo fc - j u na n da t f 2o nc e r e b e l l a rg r a n u l e n e u r o n s ( c o n s ) a p o p t o s i si n d u c e db yp o t a s s i u md e p r i v a t i o n , t h e r er r en or e p o r t a n s w e r e dd i r e c t l y o u rr e s e a r c hf o c u s e do nt h ef o l l o w i n gp o i n t s ： 1 w h e t h e ra c t i v i t yo f c j u no r a t f 2i si n c r e a s e di nc o n sa p o p t o s i s 2 t bd e t e r m i n et h ed i m e r i z a t i o no f a r f 2a n dc - j u n 3 t h er o l eo f d i m e r i z a t i o ni nc g n sa p o p t o s i s r e s u l t s 1 t h ea e a v 姆o fe - j u na n da t f 2i n c r e a s e dd u r i n gc g n sa p o p t o s i si n d u c e db y p o t a s s i u md e p r i v a t i o n t od e t e r m i n ew h e t h e rp o t a s s i u mw i t h d r a w a le v o k e st h ea c t i v a t i o no fc - j u na n d a t f 2 ，d i v 7n e u r o n sw e r es w i t c h e dt o2 5 ko r5 km e d i u mf o rv a r i o u st i m e ( o 5 ，124 h r ) ，a n dt h e np r o c e s s e df o rw e s t e r nb l o tw i t ha n t i b o d i e st op h o s p h o - j n k , p h o s p h o - a t f 2 ，p h o s p h o c - j u n , a n dt u b u l i n r e s u l t ss h o w e d t h a tt h el e v e lo f p h o s p h o r y l a t e da t f 2s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d a t2 h ra f t e r p o t a s s i u mw i t h d r a w a l s i m i l a r l y , p o t a s s i u mw i t h d r a w a la l s oi n c r e a s e dj n ka n dc - j u np h o s p h o r y l a t i o n t h i s i n d i c a t e dt h a tt h ep h o s p h o r y l a t i o nl e v e la n da c t i v i t yo f c j u na n da t f 2i n c r e a s e d 2 d i m e r i z a t i o no f a t f 2a n dc - j u ni nc g n a p o p t o s i s c - j u na n da t f 2 ，m e m b e ro fb z i pf a m i l yp r o t e i n s ，i t sr e p o r t e dt h a td i m m e ro f c _ j u n a t f 2p r e f e r e dt ob i n d i n gt oa t fs i t e ( t t a c a t c a ) t od e t e r m i n ew h e t h e r a t f 2a n dc j u nf o r m sad i m e r , e m s ae x p e r i m e n t s 、他f p e r f o r m e du s i n ge n d - l a b e l e d p r o b e sc o n t a i n i n gt h ec o n s e n s u sa t fs i t e ( t t a c c t c a ) n u c l e a re x t r a c t sw e r e p r e p a r e df r o mc o n sp l a c e di n2 5ko r5kf o r4h r p o t a s s i u md e p r i v a t i o nm a r k e d l y i n c r e a s e dt h ei n t e n s i t yo fac o m p l e x ，s u g g e s t i n gt h a tt h ec o m p l e xf o r m e ds p e c i f i c a l l y w i t ha t fs i t ea n di n c r e a s e di nc g n a p o p t o s i s n e x t ，w ee x a m i n e dt h ec o m p o s i t i o no f v 中山大学硕 ：论文c 1 u n a t f 2 二聚体在神经元凋产中的作用 t h ed n a - p r o t e i nc o m p l e xb ys u p e r s h i f ia s s a y b yt h ea d d i t i o no fc - j u na n t i b o d y , a s t r o n gs u p e r - s h i f t e db a n d 、析t l lc o n c o m i t a n tr e d u c t i o no ft h es p e c i f i cc o m p l e xw a s p r o d u c e d ，i n d i c a t i n gc - j u ni sac o m p o n e n to ft h ec o m p l e x w h i l ea d d i n ga t f 2 a n t i b o d y , ar e d u c t i o no f t h es p e c i f i cc o m p l e xw a sa l s od e t e c t e d , s u g g e s t i n gt h a ta t f 2 a n t i b o d ys t r o n g l yc o m p e t e st h ec o m p l e xf o rb i n d i n gt ot h el a b e l e d - p r o b e sa n dt h e c o m p l e xa l s oc o n t a i n s 气t f 2 t h ee m s a r e s u l t si n d i c a t e dt h a ta t f 2a n dc - j u na r e i n c l u d e di nt h ec o m p l e x 3 k n o c k d o w no fc j u no ra t f 2p r e v e n tc g n sf r o ma p o p t o s i si n d u c e db y p o t a s s i u mw i t h d r a w a l t od e t e r m i n ew h e t h e rt h ed i m e ri se s s e n t i a lf o rn e u r o n a la p o p t o s i s ，w ek n o c k e d d o w nc j a no ra t f 2t oi n t e r f e r ew i t ht h ef o r m a t i o no fd i m e r sa n de x a m i n e dt h e i r e f f e c t so np o t a s s i u md e p r i v a t i o n i n d u c e da p o p t o s i s s m a l lh a i r r i i nr n a s ，s h c - j u nw a s d e s i g n e d t os i l e n c et h e c - j u ne x p r e s s i o n a f t e r4 8h rt r a n s f e c t i o n , c o n sw e r e s u b j e c t e d t o2 5 k5 kt r e a t m e n tf o r4 h ra n ds u b s e q u e n ti n m a u n o s t a i n i n gw e r e p e r f o r m e dt oa s s e s st h ee f f i c i e n c yo ft h ec - j a ns h r n a si nk n o c k d o w no ft h ei n d u c e d c - j u ni nn e u r o n s t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tc - j u ns h r n a sc a ne f f i c i e n t l yk n o c k d o w n c - j u ni n d u c e db yp o t a s s i u mw i t h d r a w a li nc o n s n e x tw ea s s e s s e dt h ee f f e c to ft h e s h r n a so np o t a s s i u md e p r i v a t i o n - e v o k e da p o p t o s i s s h c - j u ns i g n i f i c a n t l yp r o t e c t e d c o n sf r o ma p o p t o s i s i na d d i t i o n , s h a t t 2a l s oe f f i c i e n t l yp r o t e c t e dc g n sf r o m a p o p t o s i s t h e s er e s u l ti n d i c a t e dt h a tk n o c k d o w no fa t f 2a n dc - j u nc a l lp r e v e n t c o n sa p o p t o s i si n d u c e db yp o t a s s i u md e p r i v a t i o n 4 p 1 2 j u n 2p l a s m i dp r e v e n tc g n sf r o ma p o p t o s i si n d u c e db yp o t a s s i u m w i t h d r a w a l d i v 5c g n sw e r et r a n s f e c t e dw i t hp 1 2 j u r d ，p 1 2 v j u n 2 - m u to re m p t yp m dv e c t o r , p e g f p w h i c hm a r kt h es u c c e s s f u l l yt r a n s f e c t e dc e l l sw a sc o - t r a n s f e c t e d 3 6 h rl a t e r , n e u r o n sw e r ep l a c e di n2 5 ko r5 km e d i u mf o r1 2 h r t r a n s f e c t i o no f t h en e u r o n sw i t h p 1 2 u r dr e d u c e dt h ea m o u n to fa p o p t o s i so f5 kf r o m4 5 t o1 8 t h e s ed a t a s u g g e s t e dt h a tp 1 2 j u n 2c a np r e v e n tc o n sf r o ma p o p t o s i si n d u c e db yp o t a s s i u m w i t h d m w a l v i 中山大学硕士论文 c - j u n a t f 2 二聚体在神经元凋亡中的作用 c o n c l u s i o n ： 1 a c t i v i t yo f c - j u no ra t f 2i si n c r e a s e di nc g n sa p o p t o s i s 2 a t f 2a n dc - j u nf o r mh e t e r o d i m e rd u r i n gc g n sa p o p t o s i s 3 d i m e r i z a t i o no fa t f 2a n dc - j u ni sn e c e s s a r yf o rc g na p o p t o s i si n d u c e db y p o t a s s i u md e p r i v a t i o n 中山大学硕 论交 c j u “a t f 2 一聚体枉神经凡凋亡中的作用 第一章前言 随着人口老年化及世界人口平均寿命的逐年增加，神经系统退行性疾病如帕 金森病( p a r k i n s o n sd i s e a s e 。p d ) 和老年性痴呆症( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 发病 率也迅速上升。严重影响老年人的生活质量，并带来一系列医疗和社会问题。目 前对于该类疾病还没安全有效的治疗药物，因此研究探索新的发病机理， 寻找 新的药物靶点，具有重大的基础医学和临床意义。 由于神经元凋亡而引起神经元丢失是神经退行性疾病如帕金森病和老年性 痴呆症的主要病理特征 4 ，5 ，6 】。神经元凋亡的发生取决于抗神经元凋亡通路信号 和促神经元凋亡通路信号之间的平衡。阐明神经元凋亡的信号转导和基因调控机 制，有利于我们揭示神经退行性疾病发生的本质并寻找、确立药物靶点，从而进 一步达到有效防治神经退行性疾病的目的。 c - j u n 氨基端激酶( j n k 又称应激活化蛋白激酶，s a p k ) 信号通路属于丝裂 原激活蛋白激酶( m a p k ) 通路【7 】，是细胞凋亡的主要信号转导途径之一并与神 经退行性疾病关系密切。i n k 信号通路可被细胞外多种刺激通过 m a p k k k - m a p k k m a p k ( j n k ) 所激活i s 1 1 1 。活化的j n k 可以磷酸化转录 因子c j u n6 3 位和7 3 位丝氨酸，增高其转录活性【1 2 】，转录因子c - j u n 属于亮氨 酸拉链家族成员，它可通过生成同二聚体或与其他成员异二聚体复合物的形式和 许多基因启动子特异性序列相结合，促进基因的表达和蛋白质的合成。 a t f 2 ( a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o n f a c t o r2 ) ，也称作c r e - b p l ( c a m pr e s p o n s e e l e m e n t b i n d i n gp r o t e i n1 ) 【1 3 】，属于碱性一亮氨酸拉链( b a s i cr e g i o nl e u c i n ez i p p e r , b z i p ) 蛋白家族成员。a t f 2 在体内的分布非常广泛，在脑中的表达最高 1 4 ；1 5 】。 a t f 2 分子含有三个重要的结构域，即c - 末端的碱性域( b a s i cr e g i o n ) 、亮氨酸拉 链域( 1 e u c i n ez i p p e rd o m a i n ) ，两者合称为b - z i p 域，以及n - 末端的转录激活域 ( t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o nd o m a i n , t a d ) ，其中6 9 和7 1 位苏氨酸对于a t f 2 的转 录活性是必需的。 a t f 2 的转录活性是由t a d 区6 9 和7 l 位苏氨酸的磷酸化状态所决定的。 在非磷酸化状态下，a t f 2 分子的n f 末端与b z i p 区相互结合形成一个环状结构， 从而抑制a t f 2 的t a d 功能 1 9 】，即分子内抑制效应( i n t r a m o l e c u l a r i n h i b i t i o n ) 。 中山大学硕士论文 c o j u n a t f 2 二聚体在神经元凋亡中的作用 在受到紫外线照射【1 8 ；2 0 】、化疗药物【2 0 】、环境应激或腺病毒蛋白e 1 a 1 6 ；1 7 ；2 1 ；2 2 】 作用时，j n k 的磷酸化水平增加，磷酸化的j n k 与a t f 2 结合，可以解除a t f 2 的分子内抑制作用并使a t f 2 的6 9 和7 1 位苏氨酸发生磷酸化，从而增强其转录 活性。另外，e 1 a 和辅助激活子c b p 也可以和a t f 2 的b - z i p 区结合，解除分子 内抑制作用使n 末端暴露 2 3 ；2 4 ，可以接受磷酸化修饰。如果把6 9 和7 1 位的 苏氨酸( t h r ) 突变为丙氨酸( 舢a ) ，a t f 2 的转录活性即消失 2 0 - 2 8 ，表明6 9 和7 1 位的苏氨酸对于a t f 2 的转录活性是必需的。a t f 2 的转录功能与c - j u n 密切相关， 它可以与c j u n 结合形成异二聚体复合物与靶基因启动予上的t r e ( 5 t g a c a t c a - 3 或5 - t t a c c t c a 3 ) 位点结合 1 6 ，1 7 ，1 8 ，2 0 】。 大量研究表明，j n k 的激活在神经元凋亡过程中发挥了重要作用 2 9 ；3 0 1 。低 钾处理小脑颗粒神经元【3 1 】、撤n g f 处理的交感神经元 3 2 ；3 3 、p 淀粉样蛋白处 理大脑皮质神经元 3 4 3 6 或m p p + m p t p 诱导黑质神经元凋亡模型中 3 7 1 ，都已 证明f l q k 的活化是凋亡发生所必需的。而a t f 2 和c 4 u n 都是i n k 的底物，j n k 可以分别磷酸化c j u n6 3 位和7 3 位丝氨酸，以及a t f 2 的6 9 和7 l 位苏氨酸， 增加c - j u n 和a t f 2 转录活性。 然而在低钾处理小脑颗粒神经元诱导的凋亡模型中，c j u n 与a t f 2 的活性 变化如何，是否形成了二聚体并没有相关文献予以直接回答，而二者与凋亡之间 的关系也没有明确的报道。因此本课题主要探讨以下几个问题： 1 在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，c j u n 与a t f 2 活性是否增加； 2 在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，c - j a n 与a t f 2 是否形成了二聚体； 3 c j u n 与a r f 2 二聚体的形成是否是神经元凋亡所必须的。 2 中山大学硕l ：论支c - j u r f f a t f 2 一：聚体在种经元凋产中的作用 1 实验材料 第二章实验方法与试剂 1 1 动物 出生7 - 8 天的清洁级s p r a g u e - d a w l e y ( s d ) 乳鼠，体重1 5 2 0g ，雌雄兼用， 由中山大学北校区实验动物中心提供。 1 2 试剂 1 2 1 细胞培养试剂 b a s a lm e d i u me a g l e 培养基( b m e ) ，1 6 4 0 培养基，胎牛血清( f b s ) ，青 链霉素( p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n , p s ) ，谷氨酰胺( g l u t a m i n e ) 均为g i b e ob r l 产品。多聚赖氨酸( p o l y - l l y s i n e ) ，胰蛋白酶( t r y p s i n ) ，脱氧核糖核酸酶 ( d e o x y r i b o n u c l e a s e ，d n a s e ) ，胰酶抑制剂( t r y p s i ni n h i b i t o r ) ，右旋葡萄糖 ( d - g l u c o s e ) ，氯化钾( p o t a s s i u mc h l o r i d e ，k c i ) ，硫酸镁( m a g n e s i u ms u l f a t e ， m g s 0 4 ) ，阿糖胞苷( a r a b i n o s y l c y t o s i n , a r a - c ) ，牛血清白蛋白( b o v i n es e r u m a l b u m i n , b s a ) 等均为s i g m a 公司产品。 1 2 2w e s t e r nb l o t 试剂 t e m e d 、过磷酸铵( a m m o m i u mp e r s u l f a t e ，a p s ) 为g i b c o 公司产品。溴酚兰 ( b r o m p h e n o lb l u e ) 、十二羟硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，s d s ) 、二硫苏糖醇 ( d i t h i o t h r e i t o l ，d t t ) 、甘油( g l y c e r 0 1 ) 、甘氨酸( g l y c i n e ) 、t r i s 等均为s i g m a 公 司产品。丙烯酰胺二丙烯酰胺( a c r y l a m i d e b i s a c r y l a m i d e3 0 ) 、脱脂奶 ( n o n - f a t m i l k ) 购自b i o r a d 公司。t w e e n - 2 0 为f l u k a 公司产品。甲醇( m e t h a n 0 1 ) 为f i s h e r 公司产品。p v d f 膜( p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e ) 和e c l 均为a m e r s h a m 公司 产品。 中山大学硕t - 论文c - j u n a t f 2 二聚体在神经元凋亡中的作用 1 2 3 质粒 c - j u n ( 1 6 0 0 + 1 7 0 ) 一l u c 质粒由t h i e lg 教授( 德国，汉堡，s a a r l a n d 大学) 惠赠。p c m v - r l 质粒购于p r o m e g a 公司。b s u 6 载体由c r e e n w d 教授( 美国， 南佛罗里达大学医学院) 惠赠。 1 2 4 核蛋白提取试剂 蔗糖、t r i s 、k c i ，n a c l 、e d t a 、e g t a 、d t t 、g l y c e r o l 、s p e r m i d i n e 、p m s f 、 l e u p e p t i n 、p e p s t a t i n 、a p r o t i n i n 、b e n z a m i d i n e 、n a f 、n a 3 v 0 4 均购自s i g m a 公司。 透析管( s l i d e - a l y z e r ，1 0 ，0 0 0m w c o ) 购自p i e r c e 公司。d o u n c e ( t i g h t ) 匀 浆器购自w h e a t o n 公司。 1 2 5 探针与同位素 旷3 2 p i a t p ( 3 0 0 0c i m m o la t1 0c i m 1 ) 购自p e r k i n e l m e r 公司，t 4p n k 与寡 核苷酸探针纯化试剂盒购自p r o m e g a 公司，寡核苷酸探针在上海生工公司合成， 序列如下： a p l ：5 - c g cr r g a r ga c tc a g c c gg a a 3 5 t t cc g gc t ga g tc g tc a ac , - c g - 3 j u n l t r e ： 5 - a g c t g g g g t g a c a t c a t g g c r g a t c - 3 5 - g a tc c cc 蛆g a tg t ca c c c c ag c t - 3 j u i l 2 t r e ：5 - a g c1 a gc a t1 a cc t c a t cc c ga r c - 3 5 g a tc g gg a tg a gg 1 a a t gc t ag c t - 3 。 1 2 6 抗体 磷酸化j n k ( t h r l 8 3 t y r l 8 5 1 、j n k 、磷酸化c j u n ( s e r 7 3 ) 和t u b u l i n 抗体 均购于s i g m a 公司，c j u n 抗体购于b d 公司；m o u s e h r p 、r a b b i t - h r p 二抗购 于a m e r s h a m 公司；用于e m s a 的a t f 2 和c - j u n 浓缩抗体均购自s a n t ac r u z 公 司，n o r m a lr a b b i t i g g 购自s i g m a 公司。 4 中山大学硕 。论文g - j u n a t f 2 二聚体订神绎冗凋亡中的作用 1 2 7 其他 钙磷转染试剂盒、d u a l l u c i f e r a s er e p o r t e ra s s a ys y s t e m 购自p r o m e g a 公司； 脂质体转染试剂盒购自i n v i t r o g e m 质粒操作所需试剂均购自q u i a g e n 公司。 1 3 其它实验材料与仪器 6 孔和2 4 孔培养板，各种规格培养皿均为美国c o m i n g 公司产品；c h a m b e r s l i d e 购于l a b t