（生物化学与分子生物学专业论文）地衣芽孢杆菌dif序列的功能鉴定.pdf

摘要 摘要 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u si i c h e n i f o r m i s ) 是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一，被 广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。对地衣芽孢杆菌 基因组进行功能鉴定和遗传改造方面的研究已经成为热点，而建立一种有效的基因删除 技术是对该菌株进行遗传改良的基础。 x e r d f 系统是普遍存在于原核生物体内的一种位点特异性重组酶系统，d f 位点是 x e r 重组酶的识别序列。大肠杆菌砌r 跏序列和枯草芽孢杆菌d f b 。序列已经被成功用于 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌多基因的删除，而在地衣芽孢杆菌中运用x e r d f 重组酶系统 进行基因删除的研究还未见报道。 本研究在分析地衣芽孢杆菌基因组序列并获得与枯草芽孢杆菌撕。序列十分相似 的一段序列d i f b l i 的基础上，通过p c r 的方法将d i f m 序列引入庆大霉素抗性基因两侧， 并通过引物引入s m a i 位点。将带有d i f b l i 序列的庆大霉素抗性基因克隆入p m d l 9 t 载 体，构建了重组质粒p m d l 9 d g m 。运用p c r 的方法从丑l i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 染 色体中扩增出木糖异构酶的编码基因( 矗) ，将其克隆入p m d l 9 t 载体，构建重组质粒 p m d l 9 - x i 。用s m a i 酶切重组质粒p m d l 9 d g r n ，胶回收d 驴c a n d f 片段，将其克隆入 重组质粒p m d l 9 - x i 的s m a i 和s t u i 位点，构建重组质粒p m d l 9 - x i ：d j g m 。用e c o p d 酶切重组质粒p m d l 9 - x i ：d f 1 3 m 获得x i ：d f 1 3 m 片段，将其克隆入游离型载体p h y 3 0 0 p l k 的e c o r i 位点，构建重组质粒p h y - x i ：d j g m 。通过电击转化法将质粒p h y - x i ：d g r n 导入丑l i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 中，筛选获得了具有庆大霉素抗性的转化子。在转化 子的传代过程中，重组质粒的庆大霉素抗性基因在体内x e r d f 位点特异性重组系统的 介导下通过其侧翼的d f 位点进行同源重组而被准确删除。本研究确证了地衣芽孢杆菌 中d f 序列的功能，为地衣芽孢杆菌基因组在有限的抗生素抗性基因的介导下进行多基 因的删除提供了一种新的实验途径。 为了提高目的菌株的电转化效率，研究还对bl i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 的电转化 条件进行了优化。考察了不同的高渗溶液和电击电压等参数对转化率的影响，结果表明 较优的电转化条件为：生长培养基为l b + 0 5m o l l 山梨醇，复苏培养基为l b + 0 5m o l l 山梨醇+ 0 3 8m o l l 甘露醇，电击电压为1 8 0 0v ，最终的转化率为6 3c f u i t gd n a 。 关键词：地衣芽孢杆菌位点特异性重组x e r d f 重组系统 基因删除 a b s t r a c t b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts t r a i n sf o ri n d u s t r i a lb i o t e c h n o l o g i c a l p r o c e s s e s ，a n dw i d e l yu s e di n f i e l d ss u c ha sm e d i c i n e ，p l a n td i s e a s e s ，f o o d , f e e d ，a n d e n v i r o n m e n t as i m p l ea n de f f e c i e n tm e t h o df o rt h eg e n ed e l e t i o no fb a c i l l u sl i c h e n i f o ，打括i s f u n d a m e n t a lf o ri t sg e n e t i ci m p r o v e m e n t t h ex e r d fs y s t e mi sas i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o ns y s t e mw h i c hi s u b i q u i t o u si n p r o k a r y o t e s ，a n dt h ed f s i t ec o n s i s t so fas p e c i f i cs e q u e n c et h a tc a nb er e c o g n i z e db yt h ex e r r e c o m b i n a s e s h o w e v e rt h es u c c e s s f u la p p l i c a t i o no fe s c h e r i c h i ac o l id i r e c 0s e q u e n c ea n dt h e b s u b t i l i sd i 缸s e q u e n c ef o rm u l t i p l eg e n e sd i s r u p t i o ni ne c o l ia n db s u b t i l i s ，r e s p e c t i v e l y , t h ec h a r a c t e r i z a t i o na n df u n c t i o n a li d e t i f i c a t i o no fx e r d f s y s t e mf o rg e n e t i cm a n i p u l a t i o ni n b 1 i c h e n i f o r m i sh a sn o tb e e nr e p o r t e d i nt h i sp a p e r , 丑l i c h e n i f o r m i sd f b l i ，a 且s u b t i l i sd i f b s - h o m o l o gs e q u e n c e ，h a sb e e nc l o n e d a n di d e n t i f i e df l o r at h eg e n o m eo f 丑l i c h e n i f o r m i sa t c c14 5 8 0 t w or e c o m b i n a n tp l a s m i d s p m d 19 一d j g ma n dp m d19 - x iw e r ec o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gag e n t a m i c i nr e s i s t a n tg e n e f l a n k i n gd f a l is e q u e n c ea n di n s e r t i n gax y l o s ei s o m e r a s eg e n e0 0o b t a i n e db yp c ra m p l i f i e d f r o mb 1 i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0r e s p e c t i v e l y t h ef r a g m e n td f - g m - d f d i g e s t e db ys m a i f r o mp m d19 - d g mw a si n s e r t e di n t ot h es i t e so fs i n a ia n ds t u io fp m d19 - x i ，c o n s t r u c t e dt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d 19 - x i ：d j g m t h ef r a g m e n tx i ：枷d i g e s t e db ye c o r if r o m p m d 19 - x i 7 ：d j g ma n dt h e ns u b c l o n e di n t ot h es i t eo fe c o r lo fp h y 3 0 0p l kf m a l l y c o n s t r u c t e dt h eg e n ed e l e t i o np l a s m i dp h y - x i ：d j g r n t h ep l a s m i dp h y - x i ：蜘w a s t r a n s f o r m e di n t o b 1 i c h e n i f o r m i s a t c c l 4 5 8 0b ye l e c t r o p o r a t i o n m e t h o d f o l l o w i n g r e g e n e r a t i o no ft h et r a n s f o r m a n t s ，t h eg e n t a m i c i nr e s i s t a n tc a s s e t t ew a se f f i c i e n t l yr e m o v e d b yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nm e d i a t e dw i t ht h en a t i v ex e rr e c o m b i n a s e ，w h i c ha c t i n gt o r e s o l v et h et w od i r e c t l yr e p e a t e dd f s i t e st oas i n g l es i t e t h ef u n c t i o no ft h ed l f s e q u e n c ei nr l i c h e n i f o r m i sh a sb e e nc o n f i r m e d ，w h i c hm a ys u p p l yan e wm e t h o df o rt h ed e l e t i o no ft h e m u l t i p l eg e n e si n 最l i c h e n i f o r m i sg e n o m ew i t hl i m i t i e da n t i b i o t i cr e s i s t a n c eg e n e s t oi m p r o v et h ee l e c t r o - t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y , t h ee f f e c to fo s m o t i ca g e n t sa n d v o l t a g e o ne l e c t r o t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c yo f & l i c h e n i f o r m i sa t c c14 58 0w e r e i n v e s t i g a t e d w i t ht h eg r o w t hm e d i u ml bc o m p l e m e n t e d0 5m o l ls o r b i t 0 1 t h er e c o v e r y m e d i u ml bc o n t a i n i n g0 。5m o l ls o r b i t o la n d0 3 8m o l lm a n n i t o l ，t h ev o l t a g ew a s18 0 0v t h eo p t i m a lt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yo f6 3c f u j _ t gw a so b t a i n e d k e y w o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s , s i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o n , x e r d fr e c o m b i n a t i o n , g e n ed e l e t i o n u 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：日期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：么童 导师签名： 日 期： 第一章前言 第一章前言 1 1 地衣芽孢杆菌 1 1 1 地衣芽孢杆菌的一般生物学特性及其遗传背景 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 属于厚壁菌门( f i r m i c u t e s ) 的芽孢杆菌属 ( b a c i l l u s ) ，是一种革兰氏阳性细菌，杆长2 5 - 3 5 岬；杆宽0 8 1 5l a i n ，产生近中 生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。细胞形态和排列呈杆状、单生。无荚膜，无鞭毛，能运 动。细胞内无聚p 羟基丁酸盐( p h b ) 颗粒。最佳生长温度为3 5 + 1 ：p h 为7 0 左右。 在肉汤培养基上的菌落形态为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，培养2 4h 后菌 落直径约为3t o n i 。地衣芽孢杆菌可产生乙酰甲基甲醇，即v - p 反应为阳性，p h 5 4 ；接 触酶阳性，卵磷脂阳性，还原硝酸盐；在7 n a c i 和p h 5 _ 7 肉汤中生长良好，兼营性 厌氧生活；可分解葡萄糖、木糖和甘露醇产酸，但不能分解阿拉伯糖产酸；石蕊牛奶呈 还原胨化反应，能分解淀粉和酪素，能利用柠檬酸盐。 地衣芽孢杆菌a t c c l 4 5 8 0 基因组全序列己于2 0 0 4 年9 月测序完成，地衣芽孢杆菌 基因组包含4 2 2 2 5 9 7 个碱基对，g c 含量4 6 ，其基因总数为4 3 3 7 个，其中只有小部分 基因的功能已经明确或进行了部分鉴定，而大部分基因的详细功能还不清楚【1 】。 1 1 2 地衣芽孢杆菌的主要应用 地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一，在自然界分布非常广泛，是 土壤和植物微生态中的优势种群。它可产生多种抗生素，包括脂肽类、肽类、磷脂类、 多烯类、氨基酸类、核酸类物质，能对多种动、植物及人类病原菌起到很好的抑制作用， 而且地衣芽孢杆菌还具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性。因此，地衣芽孢杆菌被 广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。近年来，国内外 对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多，在医药、饲料加工、农药等行业，取得 了较好的研究成果。根据文献显示，关于地衣芽孢杆菌的专利有：用地衣芽孢杆菌生产 生物农药的方法；地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂；地衣芽孢杆菌t i 菌株的构建及 其粗酶提取物的发酵生产；利用基因突变技术改良地衣芽孢杆菌n c i b 8 0 6 1a 淀粉酶的 耐温性和耐酸性的性质等1 2 】。 1 1 2 1 地衣芽孢杆菌应用于医药研究 根据报道，地衣芽孢杆菌做为医药商品是以地衣芽孢杆菌无毒活体菌株制成的胶囊 及口服液等，主要用于治疗一些肠道疾病。翟少华【3 】将地衣芽孢杆菌和双歧杆菌的肠生 态制剂联合应用于患有荷h 2 2 腹水癌小鼠，进行了一系列的研究。研究中发现，对荷h 2 2 腹水癌小鼠进行化疗后，此种肠生态制剂与化疗药物同时使用，不仅对h 2 2 腹水癌细胞 具有杀伤和促进凋亡作用，还可延长荷瘤小鼠存活天数，提高了化疗的效果。此研究证 实了地衣芽孢杆菌和双歧杆菌的肠生态制剂的协同作用，并为将来的临床试验打下了基 础。 江南大学硕士学位论文 1 1 2 2 地衣芽孢杆菌用于农业病害研究 地衣芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，对一些植物病原菌有较好的抑制作用。因此， 将地衣芽孢杆菌的抗菌物质开发为生物农药，成为当前研究的热点。将地衣芽孢杆菌应 用于植物病害防治的研究，从2 0 世纪8 0 年代开始已经起步，目前国内外关于地衣芽孢杆 菌应用于植物病害防治的研究较多，多篇报道均指出地衣芽孢杆菌对植物的真菌性病害 有较好的抑制效果。方敦煌等【4 】分离出了对植物黑胫病菌有较好抑制效果的地衣芽孢杆 菌g p l 3 ，对该菌进行了生物测定和田间小区试验，并通过大田试验示范表明，地衣芽孢 杆菌g p l 3 的防效稳定保持在5 0 - - 6 0 。a h m e d 等”】通过试验发现，地衣芽孢杆菌可增 强能抑制辣椒根腐病的角素( s i g m a ) 活性，由此表明，地衣芽孢杆菌对某些药剂具有 一定增效作用，但是具体起增效作用的物质及其机理还有待进一步研究。 1 1 2 3 地衣芽孢杆菌用于饲料加工研究 目前国内外研究结果显示，地衣芽孢杆菌有很强的生命活力，具备产生多种酶的能 力，且具有耐高温、耐酸碱等特性，在饲料加工过程对其造成的损失较小。近年来，对 于地衣芽孢杆菌在饲料工业中的应用研究成果也有较多报道。周振峰 6 1 研究发现，在奶 牛饲料中添加地衣芽孢杆菌制剂可增强奶牛抵抗热应激的能力，并能起到防病、抗病的 作用。还有一些报道指出，地衣芽孢杆菌可以分泌高活性的胞外酶系，将水体中的有机 残余物迅速降解为无机物，能够有效地促进养殖水体的生态良性循环。因此，将地衣芽 孢杆菌做为鱼饲料添加剂，不仅可以促进鱼体的生长，而且有益于养殖水体的保护【7 j 。 1 1 2 4 地衣芽孢杆菌用于环境污染防治研究 丁海涮8 】等在拟除虫菊酯类农药残留降解菌筛选试验中发现，筛选获得的地衣芽孢 杆菌q w 5 所产生的特异性酶，能与氰戊菊酯羧酸酯键断裂的相应产物发生作用，加速其 降解。田间试验结果表明，q w s 菌对于田间拟除虫菊酯的残留，5 天内的降解率可达9 0 以上，效果好于实验室摇瓶培养降解拟除虫菊酯的效果。周鸣1 9 1 研究利用地衣芽孢杆菌 死菌体吸附废水中的铬离子，其研究结果与报道的同类研究相比发现，地衣芽孢杆菌死 菌体对铬离子具有更好的吸附效果，在优化的条件下，即温度为5 0 c ，溶液p h 值2 5 ， 菌体浓度lg l ，铬离子起始浓度3 0 0m g l ，摇床转速1 4 0r m i n ，吸附时间2h ，得到菌体 对铬离子的最大吸附量6 0 5m g g 。 1 1 3 地衣芽孢杆菌的应用前景 地衣芽孢杆菌在医药中的应用的研究较为成熟，已经形成了较完整的生产工艺。但 是在农作物病害防治、饲料加工、环境污染治理等方面的应用研究，还只是处于起步阶 段，具有相当广阔的发展空间。 把分子生物学技术应用于地衣芽孢杆菌的研究已经成为热点，目前对于地衣芽孢杆 菌基因组的认识还比较有限，其基因的克隆也很少【2 l 。据文献报道，所克隆的基因主要 是一些酶基因，如牛丹丹等从地衣芽孢杆菌中克隆了耐高温淀粉酶基因，马骏双等克 隆t 1 3 甘露聚糖酶基因，梁斌等克隆了角蛋白酶基因k e r b 等，而关于地衣芽孢杆菌其他 2 第一章前言 基因的克隆就更少了。克隆地衣芽孢杆菌的抗菌物质基因应用于抗病育种的研究，将成 为防治植物病害的另一条有效的途径。目前，虽然已经有地衣芽孢杆菌高产蛋白酶工程 菌的报道，但其稳定性较差，具体原因还有待进一步的研究。因此，对地衣芽孢杆菌基 因组进行功能鉴定和遗传改造方面的研究有着及其重要的意义。 传统的诱变及筛选是最常用的菌种遗传改造手段，但存在工作量大，效率低，遗传 稳定性差等缺点。随着生物化学、细胞生物学、分子生物学和遗传工程的发展，能够定 向操纵遗传变化的基因删除技术成为菌种遗传改造中最具潜力的技术。 1 2 基因删除技术 基因删除技术是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，是利用基因 转移方法将外源d n a 序列导入目的细胞后，通过外源d n a 序列与目的细胞内染色体上 同源d n a 序列间的重组，外源d n a 定点整合入目的细胞基因组上某一确定的位点，或 对某一预先确定的目标位点进行定点突变，从而改变细胞遗传特性的方法i l0 。利用基因 删除技术可阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点而改变目的产物的产量或质量， 达到微生物育种的目的。作为一项新兴的技术，基因删除有着无可比拟的优点，其优势 在于能够以精确、高效、简单、快速的方式完成传统d n a 重组技术无法做到的复杂基因 操作。基因删除操作所适用的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞。基因删除技 术通过对生物活体遗传信息的定向修饰( 包括基因灭活、缺失突变、点突变引入、外源 基因定位引入和染色体组大片段删除等) ，并使修饰后的遗传信息能够在生物或体内稳 定遗传，表达突变后的性状，因而这项技术被用于研究基因功能等生命科学的重大课题， 也为相关的疾病治疗和新药筛选评价模型提供了新的技术手段。 1 2 1 基因删除技术的原理 同源重组是基因删除操作技术的分子生物学基础，d n a 同源重组在基因转化和遗传 的多样性中具有重要作用。从2 0 世纪6 0 代开始，研究者在真菌系统中对同源重组机制进 行了系统的研究，得到了多个同源重组模型，包括h o l l i d a y 模型、m e s e l s o n r a d d i n g 模型、 双链断裂修复模型、单链退火模型等。h o l l i d a y 模型1 1 】能够很好地解释高等的真核重组 和真菌中发现的基因转变现象；m e s e l s o n r a d d i n g 模型1 2 】是在h o l l i d a y 模型的基础上提出 的，它不仅可以解释交互重组现象，而且还可以较好地解释基因转变现象，因此被广泛 接受。s z o s t a k 等【l3 1 提出的双链断裂修复模型( d s b r ) 能更好地解释双链断裂可大大提 高同源重组效率的这一现象。l i n 等【1 4 】于1 9 8 4 年提出完全不同的单链退火模型( s s a ) ， 提供了理解同源重组机制的全新视角。此外，研究者还提出了一些其他的同源重组模型， 有研究显示，单链d n a 分子进入d n a 双螺旋主沟，能在同源区形成稳定的三链结构； 还有人提出r n a 介导的重组模型。多数研究结果表明，同源重组除可在d n a 分子间进行 外，还可在r n a 分子间或r n a 与d n a 分子间进行。随着研究的深入，对同源重组的机 制定会有更合理的解释，虽然同源重组的分子机制尚未完全阐明，但细胞内确实存在与 同源重组有关的酶系，如大肠杆菌中的r e c a 和r e c b c d 、t 4 噬菌体中的u v s 和哺乳动物 中的d m e l 、r a d 5l 、x r c c 2 和x r c c 3 等。 江南大学硕士学位论文 1 2 2 基因删除的操作步骤 基因删除的基本程序是：用p c r 技术扩增目的基因序列，在体外插入庆大霉素、四 环素等受体菌原先不具有的抗性标记使目的基因失活，再将失活的目的基因克隆至一环 状载体上，构建成基因删除质粒，选用适当的核酸内切酶切割使之线性化后，通过电转 化、显微注射等方法将该基因删除质粒转化入受体细胞内，以抗性标记筛选或进行目的 基因功能的失活检测获得阳性菌，再以p c r ，m u t l l e m 杂交等手段做进一步验证。 在了解微生物代谢途径相关基因的基础上，通过构建合适的删除载体，利用微生物 原有基因与构建的同源重组系统发生交换，进行代谢旁路的阻断，防止副产物或有毒产 物的形成，促进目的产物积累，从而达到调节代谢流及优化代谢途径的目的。基因删除 技术对删除载体的要求不高，不仅可用于原核细胞，也可用于真核细胞，用途较为广泛。 1 2 3 影响基因删除效率的因素 基因删除的效率是指可检测到的细胞中发生同源重组的细胞数与阳性转化子的细 胞总数之比，又称同源重组效率。基因删除效率在不同的研究报道中变动范围较大，其 波动性来自于较多的影响因素。 1 2 3 1 基因删除序列的影响 基因删除序列包括载体骨架、目标基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非 同源序列，其中同源序列是决定同源重组效率的关键因素。t h o m a s j g l c a p e c c h i 1 6 】研究表 明，当载体同源序列长度从4k b 增加至9k b 时，基因删除效率可提高1 0 倍，与此同时， 非同源重组效率可提高达4 0 倍。h a s t y 等【l 7 】研究发现，同源序列达一定长度后，继续增 加其长度对同源重组效率不产生显著影响。此外，载体上的非同源序列对重组效率也可 能产生一定的影响，片段插入的数目和位点可能与同源重组效率有关，但不是影响同源 重组效率的主要因素。 1 2 3 2 外源d n a 导入方式的影响 目前，外源d n a 导入目的细胞的方式主要有显微注射法、电穿孔法、原生质体转化 法和原生质体融合等。不同的导入方法对同源重组效率有明显影响，各种方法均有优缺 点。如电穿孔法步骤简单、人为因素少；原生质体再生体系具有容易摄取外源遗传物质 的优点等。但是，从效率上讲，显微注射法的同源重组效率最高，可达1 0 0 。所以，应 该根据具体的实验选择不同的d n a 导入方式。 1 2 3 3 目的基因的影响 在早期缺陷型标记基因的研究中，发现整合标记基因的同源重组效率与它在基因组 中的插入位置有关，说明基因组中的不同区域对同源重组过程产生了影响。t h o m a s 等【l 8 】 在小鼠e s 细胞h p r t 基因的定点突变中，以基因顺序的不同部分作为目的突变区域时，结 果发现同源重组效率有明显差异，说明基因结构顺序对同源重组效率有影响。一般认为， 转录活性基因有利于同源重组，而目标基因拷贝数的增加并不能提高同源重组效率。 4 第一章前言 1 2 3 4 调控元件的影响 目前，转基因的整合具有位置效应这一说法己被公认，由于受整合位点周围染色质 翼区的影响，因而在许多情况下影响到表达水平和组织特异性表达，5 端的启动子和增 强子，3 端的终止子都对转基因的整合产生作用，这也是某些删除载体选择组织特异性 启动子的原因。外源转基因的有效表达还取决于其是否有内含子，因为内含子中存在的 转录调控元件可影响m r n a 的剪接和启动子于内含子间的调节反应，另外，内含子可能 含有能开放染色体功能域的一些序列，也可能通过影响核质成分、位置等来提高转基因 表达。此外，核基质附着区( n u l c l e a rm a t r i xa t t a c h m e n tr e g i o n ，m a r ) 和主要控制区 ( d o m i n a n tc o n t r o lr e g i o n ，d o r ) 均具有特异的位置独立性表达，m a r 元件被置于1 3 珠蛋i 刍d n a 结构域的界限区，具有转录激活作用，在转w a 基因的试验中，m a r 与w a p 共整合，建立的五个转基因鼠系中，四个鼠系表明有正确的定位表达对转基因动物来说， 如果构建的基因中有d o r ，可使转基因适宜表达，目前d o r 区被置于c d 2 基因的5 端， 使之在t 细胞中定位表达，在疾病治疗中有重要意义【l9 】。因此，利用靶位点全套的调控 元件来实现目的基因的特异性表达，可将外源基因整合到特定位点，从而真正实现基因 删除的时空性。 此外，目的基因插入片段大小，载体d n a 是否线形化等也是影响基因删除效率的因 素。 1 2 4 基因删除的策略 基因删除过程中，基因删除质粒的设计及构建是非常重要的。同时，在载体构建的 过程中要建立合理、可靠的筛选方法。抗生素抗性基因通常做为选择性标记基因用以筛 选目的菌株染色体上发生同源重组的重组子【2 0 】。但是随着对目的菌株基因组的进一步重 组改造，存在于菌株染色体上的抗性基因增多，这样会对后续的基因操作产生一定的限 制。因此，构建基因删除质粒时需考虑在删除目的菌染色体上目标基因的同时，实现对 目的菌进行多次遗传操作的过程中，同一抗性标记基因可重复使用。常用的抗性标记基 因见表1 1 。 表1 1 常用的抗生素及它们的作用模式 t a b 1 1c o m m o n l yu s e da n t i b i o t i c sa n dt h em o d e so fa c t i o n 目前，国内外基因删除技术主要是通过位点特异性的同源重组来实现对目标基因的 江南大学硕士学位论文 删除，即事先在体外用限制酶酶切、连接等方式将同源臂克隆到质粒载体上，并将两端 连有位点特异性重组酶( s i t e s p e c i f i cr e c o m b i l l a s e ，s s r ) 识别序列的抗性基因插入两个 同源臂之间，得到基因删除质粒。通过转化将基因删除质粒转入目的菌中，删除序列与 目的菌染色体发生同源重组，再经过位点特异性重组酶对d n a 的特定序列( t a r g e ts i t e s ) 进行准确切割和重新连接，从而将抗性基因从目的菌染色体中删除掉【2 们。目前己发现的 此类重组酶系统( s s r s t a r g e ts i t e s ) 有很多种，已经得到应用的有c r e l o x p 系统p 、 f l p 职丁系统【3 l j 、刚船系统【3 2 1 和x e 蜥统【2 0 】等。上述4 类位点特异性重组系统的特点 见表1 2 。 表1 2 四类位点特异性重组系统的特点 t a b 1 - 2c h a r a c t e r so fs i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a s es y s t e m s 1 2 4 1c r e l o x p 位点特异性重组酶系统介导的基因删除 目前，c r e l o x p 系统是所有重组酶系统中用得最广、最完善的转化系统。大肠杆菌 p 1 噬菌体c r e 基因的3 8 5k d a 产物( 该产物是一种重组酶，r e c o m b i n a s e ) 能识别并催化l o x p 位点间的重组；l o x p 位点含3 4b p ，包括被8b p 间隔的两个1 3b p 反向重复，每个反向重复 及其临近的4b p 构成一个c r e 蛋白的结合区链间的交换可发生在间隔区的6b p 之间，一旦 c r e 重组酶介导的d n a 剪切作用发生便产生一个突出的5 末端。该间隔区是非对称性的， 这种非对称性决定了l o x p 位点具有方向性，从而最终决定了重组的拓扑学结果：非连锁 分子间的重组能够形成共整合分子；同一分子内同向的两个l o x p 位点间的d n a 会由于重 组的发生而被切除，而反向重复l o x p 位点间的重组则导致d n a 倒位。在应用该系统时就 需要首先向目的系统中引入l o x p 序列，然后通过一定的途径激活c r e 重组酶的活性，以实 现在l o x p 位点的特异整合或重组。这一方法的应用一般分为两步：一，通过置换型载体 进行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因，并在其两侧引入两个同向排列的 l o x p 位点；二，通过c r e 重组酶介导的l o x p 位点特异重组，切除位于两个l o x p 位点间的所 有序列从而达到目标基因不同的修饰。起初将c r e 基因与一些激素受体的激素结合域基 因相融合，转化宿主之后，就能得到受特定物质诱导的激素结合域基因的特异删除，如 图1 1 所示。c r e l o x p 系统可以在微生物、哺乳动物、高等植物等细胞中实现特定d n a 片段的基因删除。b e r g h l l a 等1 3 3 1 人在生肌细胞中成功地实现了对u 3 区插入了，o 妒位点的 整个s v 4 0 前病毒的特异性切离，其效率高于9 0 。甄伟掣3 4 】人利用c r e l o x p 系统在转基 因烟草中成功删除外源质粒中的基因g u s ，表明c r e l o x p 重组系统在转基因烟草中能精 确高效地介导转基因的删除。 6 第一章前言 譬 霉2掌 a d _ = 1 = = = 工= = ) i 亏乏三i 云云云磊创外薄用除质麓 + 共转化 bn c = 亡= = = 卜叶= = 工= = = 【= 加台c r e 基因的奠体 一 伢e 一 叠1 _ c l 卜亡= 工= = = 亡= 刊i 基因捌酴后的序列 图1 1c r e l o x p 位点特异性重组酶系统介导的基因删除 f i g 1 1c r e l o x ps i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a s es y s t e mu s e df o rg e n ed e l e t i o n 1 2 4 2f l p f r t 位_ 点特异性重组酶系统介导的基因删除 f l p f r 繇统是创建最早的位点特异性系统，该系统来自酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 2 岬环质粒，f l p 是2p a n 环质粒编码的特异性重组酶。有功能的凡尸基因为 一段3 4b p 的d n a 序列，结构与l o x p 相似，所不同的是野生型的凡尸基因在3 4b p 的d n a 序列侧翼还有一段1 3b p 的反向重复序列，该序列可以增强f l p 介导的重组反应，在体外 它可以影响重组过程中的切口形成和链交换。1 9 8 9 年，c r e g g 和m a d d e n 3 5 1 克隆了酵母的 r f l 重组酶所作用的位点职眩间的a r g 基因，将心矿- f r t 结构引入酵母中，经筛选得到 t a r g + 转化株，然后二次转化导入f l p 重组酶，又获得t a r g 。的转化子，从而证明了重 组事件的发生。之后，大量的工作表明，该重组系统在果蝇、哺乳动物细胞、玉米、水 稻等多种动植物中都是有效的。2 0 0 6 年，单晓呋【3 6 1 等利用包括含有豫啦点的植物表达 载体p c a m b i a l 3 0 0 - b e t a 移口西加和含有由热诱导启动子却启动凡尸重组酶基因的植 物表达载体p c a m b i a l 3 0 0 h s p 一凡尸h p t 。通过二次转化的方式将二者先后转入烟草植 株，热激处理后，热诱导型启动子h s p 调控的重组酶咒尸基因的表达催化位于选择标记基 因a l s 两侧同向职难点间的重组反应，有效地删除了选择标记基因a l s 。4 1 的经热激处 理的二次转化植株发生了选择标记基因的删除，表明该系统在获得无选择标记基因的转 基因植株中有很好的应用价值。 1 2 4 3p , r s 位点特异性重组酶系统介导的基因删除 r r s 系统来源于接合酵母( z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i i ) 环形质粒p s r l ，包括重组酶 r 和2 个重组酶识别位点胚。船是一段3 1b p i 拘d n a 序列，由2 个1 2b p 的反向重复序列和1 个7b p 的不对称间隔序列组成。在重组酶r 的作用下，特异位点船发生同源重组，切除2 个尺s 位点间的标记基因。1 9 9 5 年，o n o u c h i 等【3 7 1 用含r 重组酶基因的转化植株与含标记 基因( 位于r 啦点间) 的植株进行有性杂交，获得了无选择标记基因而只含报告基因的 拟南芥转基因植株。 7 江南大学硕士学位论文 12 44x e r d 雅点特异性重组酶系统介导的基因删除 虽然上述的c r e l o x p 、f l p f r t 和r r s 三种位点特异性重组酶系统已经得到广泛的 应用，但是这些方法都存在着一定的局限性，即细菌本身并不含有上述位点特异性的重 组酶，所以必须将位点特异性重组酶基因和基因删除质粒共转化入目的菌中，才能实现 对选择性标记基因的删除。所以在完善这些系统应用的同时，应探讨重组酶家族中其它 成员的开发与应用，以期能够更简单，更有效地对基因组进行遗传修饰。 x e r d f 位点特异性重组酶系统，其优势在于x e r 重组酶是普遍存在于细菌中的一种 位点特异性重组酶，故不再需要向目的菌中转化外源的位点特异性重组酶基因，从而大 大简化了基因操作。x e r 重组酶能专一性的识别一段2 8b 口大小的面，位点。因而，在抗性 基因两侧各连接一个枷值点，随基因删除质粒转化至目的菌中，体内的x e r 重组酶特异 性的识别四位点，准确删除连有删值点的抗性基因及其侧翼的西地点，如图1 2 ，2 0 0 6 年，b l o o r 等1 2 0 1 构建含耐位点的基因删除质粒p t o p o - d i 佗a t ，线性化后导入目的菌点_ c o l id h i ，通过x e r d i f 位点特异性重组酶成功删除了其染色体上的r n s b b j g k 园。k a t h e r i n e 等i j ”将此方法应用到枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 中，将且s u b t i l i sj h 6 4 2 染色体上彻 基因成功删除。 基因删i 嘹序列 囊色体 垫争 p c r 产物或线性化质粒进行转化 i 卜一矿一鱼! 鲴 一旦_ j 同源懿 _ _ 硼雹审嘲畛 i 抗性筛选 堑- _ 童亘亘唾 一型 圈嘲p l x 。位点特异性重组 删除翅疆啊 - 可 墨 图1 2 x e r ，由重组系统删除袭色体上目标基因和选择性标记基因 f i gi - 2 d e l e t i o n o f a t a r g e tc h r o m o m 目g e n ea n d t h er e s i s t a n c e g e n e b y x e r d i f r e c o m b i n a t i o ns y s t e m 1 3 本论文的立题依据和研究内容 基于位点特异性同源重组的基因删除技术，是现在微生物菌种改良中亟需获得的一 项新技术。对一个特定微生物基因组的多基因、多位点的高效删除已经成为当前研究的 热点。多基因、多位点的高效基因删除技术已在酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中 实现，但是在工业应用上有重要地位的地衣芽孢杆菌中还没有建立。本课题研究所采用 的x e r d 鼯统是普遍存在于原核生物体内的一种位点特异性重组酶系统，删位点是x e r 重组酶的识别序列，两个d 位点发生同源重组，删除连有由位点的选择性标记基因及其 第一章前言 侧翼的d i f c l 点。删除掉的选择性标记基因不会留在染色体上，因而可以重复使用，避免 了传统基因删除方法的局限性。大肠杆菌d i r e 序列和枯草芽孢杆菌a l i a ；序列已经被成功 用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌多基因的删除。本课题在地衣芽孢杆菌丑l i c h e n i f o r m i s a t c c l 4 5 8 0 中利用x e r d f 重组系统进行基因删除的可行性，研究地衣芽孢杆菌中瓣列 的功能性，为地衣芽孢杆菌基因组在有限的抗生素抗性基因的介导下进行多基因的删除 提供一条新的实验途径。本课题主要研究以下几方面的内容： 1 将目的菌丑l i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 全基因组与枯草芽孢杆菌蛳。序列比对，推 断出可能的地衣芽孢杆菌班，) 芋列，并构建含地衣芽孢杆菌可能的幽，) 芋列的基因删除质 粒，用于验证地衣芽孢杆菌中却c 7 芋列的功能； 2 将基因删除质粒电击转化目的菌丑l i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 ，利用获得的阳性 转化子，验证在丑l i c h e n i f o r m & a t c c l 4 5 8 0 q u 利用x e r d f 重组系统进行基因删除的可行 性。 9 江南大学硕士学位论文 第二章材料和方法 2 1 材料 2 1 1 茵株和质粒 e s c h e r c h i ac o l ij m l 0 9 ，丑l i c h e n i f c i 删括a t c c l 4 5 8 0 由江南大学中国高校工业微生 物资源和信息中心( h t t p ：c i c i m c u j i a n g n a n e d u o n ) 提供。游离型载体p h y 3 0 0p l k 由 本实验室保藏。p m d l 9 t 载体购自宝生物公司，用于基因的亚克隆。重组质粒 p s