（原子与分子物理专业论文）激光共振拉曼光谱在番茄红素检测中的应用.pdf

摘要 番茄红素是一种功能性的天然色素，具有多种生物活性。目前，对其光谱检测 方面的研究较少。本文采用激光共振拉曼光谱技术对被测样品中的番茄红素进行 检测。 本文首先计算出番茄红素的最大吸收峰在4 9 0 n m 附近，并用紫外一可见分光 光度计测出番茄红素在不同有机溶剂中的吸收光谱，测定其在4 5 0 - - 5 5 0 n m 附近有 较强吸收峰，同时分析了番茄红素的结构。根据理论分析及实验测定的结果，首 次采用波长为5 3 2 n m 的半导体泵浦固体激光器对样品进行激光共振拉曼光谱的检 测，并对人体皮肤进行在体检测，检测结果达到预期目标。 实验结果表明：激光共振拉曼光谱测量对番茄红素的检测不仅准确度高，灵敏 性强，而且还可以用于在体测量。 关键词：光谱检测激光共振拉曼散射番茄红素类胡萝b 素在体检测 a b s t r a c t a sak i n do fn a t u r a lf u n c t i o n a lc o l o r , l y c o p e n eh a sv a r i o u sb i o l c l g i e a la c t i v i t i e s a t p r e s e n t , s t u d i e so nt h es p c c m 皿o fl y c o p e n ea l en o tm u c h t h i sa r t i c l eu s e st h e t e c h n i q u e so fl a s e rr e s o n a n c er a m a ns p e c t r u mt om a k el e s to nt h el y c o p e n ei nt h e s p e c i m e n s t h i sa r t i c l ef n s tg i v e st h ef a c tt h a tt h em a xa b s o r p t i o np e a ko fl y c o p e n ei sa ta b o u t 4 9 0 r a mt h r o u g hc a l c u l a t i o na n dt h e nm a k e so u tt h ed i f f e r e n ta b s o r p t i o ns p e c t r ao f l y c o p e n ei nd i f f e r e n to r g a n i cs o l u t i o n sb yu v ss h o w i n gt h a ti th a ss t r o n ga b s o r p t i o n p e a k sa r o u n d4 5 0t o5 5 0 r i ma n da tt h es a m et i m e ，m a k e sa n a l y s i so nt h es t r u c t u r eo f l y c o p e n e a c c o r d i n gt o t h e o r e t i c a l a n a l y s i sa n d t h er e s u l t so fe x p e r i m e n t s ，l a s e r r e s o n a n c er a m a ns p e c t r u mt e s t sa r em a r i eo nt h es p e c i m e n sw i t has e m i c o n d u c t o r p u m p e ds o l i d s t a t e l a s e ro ft h ew a v el e n g t ho f5 3 2 n mf o rt h ef i r s tt i m e ；a n dat e s ti s m a d ea sah u m a ns k i nt e s ti nv i v oo f w h i c ht h er e s u r sa r ea se x p e c t e d t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n ts h o wt h a tt h et e s to nl y c o p e n eb yl a s e r s o n a n c e r a m a as p e c t r u mh a st h em e r i t so fh i g hp r e c i s i o na n ds t r o n gs e n s i t i v i t ya n da l s ot h e a v a i l a b i l i t yo f t e s t si nv i v o k e yw o r d s ：s p e c t r u m t e s tr e s o n a n c er a m a ns c a t t e r i n gc a r o t e n o i d s l y c o p e n e t e s ti nv i v o 长春理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，激光共振拉曼光谱在番茄红素检测 中的应用是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文 中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 年一月一日 长春理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、博士学位论文版 权使用规定”，同意长春理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编学位论文。 作者签名： 年一月一日 指导导师签名：年一月一日 1 1 拉曼光谱概述 第一章绪论 拉曼光谱作为研究物质结构一个强有力的工具，已经有近8 0 年的历史了。它 是一种散射光谱，由印度科学家拉曼( c v r a m a n ) 于1 9 2 8 年在研究苯【1 1 ( 另一种 说法为c c h 液体1 2 j ) 的散射光谱时发现的，因此称为拉曼散射。同时期苏联物理 学家g s l a n d s b e r g 和l 1 m a n d c l e s t a m 在研究石英晶体的散射光谱时，独立地发现 了这种散射现象。后来，布拉瑟克在拉曼理论上做了很多工作。他们发现在散射 光谱的激发线两侧各存在一条谱线，在低频一侧的波长为v o a v ( v o 为激发线的 频率，v 为该谱线与v n 的频差) ，称之为斯托克斯线。在激发线高频一侧的线，其 频率为v 0 4 - a v ，称之为反斯托克斯线。激发线处的散射谱线则称之为瑞利线( 见图 1 n 。 斯托克斯线瑞利线反斯托克斯线 v v o v v 图1 1 拉曼光谱示意圈 由于拉曼信号比较微弱，发 展受到了很大的限制，直到1 9 6 0 年，激光出现以后，由于激光具 有高亮度，单色性好和高度偏振 性等优点，拉曼光谱的研究工作 才出现崭新的局面。激光拉曼光。 谱的研究对象从液态扩展到固态 ( 晶体和粉末) 和气态，样品的 用量从过去十几毫克下降到毫 克，甚至微克的数量级。实验样 品制作也非常简化，不稳定的和 贵重的样品可以安放在原包装瓶内直接测试。并可实现高( 或低) 温测试，有色 样品测试。水是拉曼光谱实验中一种良好的溶剂，因为它的拉曼散射很弱，而水 在红外光谱区却有着很强的吸收。随着商品激光器的稳定性越来越好，功率越来 越高，激光拉曼光谱的发展空间也会越来越广阔。1 9 6 1 年e j w o o d b u r y 和w k n g 把硝基苯放入红宝石激光器的共振腔内作克尔盒调q 实验时，首先发现了受激拉 曼效应，开扩了非线性拉曼散射的新领域。以后，科学家进行了大量的数据，发 现了一些新的非线性拉曼效应。1 9 6 2 年r w t e r h u n e 发现了相干反斯托克斯效应。 1 9 6 3 年b e s t o i c h e f f 首先发现了逆拉曼效应。1 9 6 5 年t l w t e r h u n e 首先观察到超 拉曼散射现象以及拉曼诱导克尔效应【i 】。随着激光脉冲时间的缩短，激光功率的提 高，微弱信号检测技术的提高和计算机的应用，使激光拉曼光谱分析测试技术在 许多领域取得了很大的进展。目前，拉曼光谱已经广泛应用于材料、化工、石油、 高分子、生物、环保、地质等领域。 就分析测试而言，拉曼光谱和红外光谱相配合使用可以更加全面地研究分子 的振动状态，提供更多的分子结构方面的信息 3 】。但它们的发生机制是不一样的。 红外光谱是研究红外光通过样品后被吸收的情况，拉曼光谱则是研究在垂直或其 他方向上分子对单色光的散射。拉曼效应产生于入射光子与分子振动能级的能量 交换。在许多情况下，拉曼频率位移的程度正好相当于红外吸收频率。因此，红 外测量能够得到的信息同样也出现在拉曼光谱中【4 】。但是红外吸收的分子振动是分 子振动时偶极矩变化的振动；而有拉曼散射的分子振动则是分子振动时有极化率 的变化。一般讲，极性基团红外吸收明显：非极性基团的拉曼散射谱带较为强烈。 一般来说，具有高的电子云密度或高度的局部对称性，如c = c 、s s 、c s 等， 有较强的拉曼活性。凡具有对称中心的分子，若红外吸收是活性的，则拉曼散射 是非活性的；反之亦然。我们所研究的化合物，一般情况下是不具中心称的，很 多基团常常同时有红外活性和拉曼活性。 与红外光谱相比，拉曼光谱具有下列优点： 1 、一些在红外光谱中为弱吸收或强度变化的谱带，在拉曼光谱中可能为强谱 带，从而有利于这些基团的检出。 2 、拉曼光谱低波数方向的测定范围宽( 常规测量范围为4 f f - - 4 0 0 0 c m 1 ) ，有 利于提供重原子的振动信息。 3 、对于结构的变化，拉曼光谱有可能比红外光谱更敏感。 4 、水对于红外辐射几乎是完全不透明的，但对可见光只有很弱的吸收。这使 得拉曼光谱( 采用可见光光源时) 特别适合于研究水溶液体系。 5 、拉曼光谱的谱峰一般都比较尖锐，重叠很少发生，因而能较好地分辨振动 频率。 6 、固态样品无需制备，直接测定。由于玻璃对可见光的吸收弱，因此用拉曼 光谱可直接测定装于玻璃容器中的样品【5 】。 在这里，我们要特别区分拉曼效应和荧光之间的不同点。荧光的产生，首先 是物质分子吸收了光量子加，从基态跃迁到振动的激发态。然后，受激原子或分 子返回到基态时，把能量作为荧光重新发射出来。而拉曼光谱则不同。处于振动 基态的分子，吸收了入射光子的能量厅，跃迁到一个假设的激发态帆+ v 0 ，这 激发态事实上并不存在于散射物质的分子中。当分子从这假设的激发态跃迁到振 动的激发态时，放出能量帆。一h v ，产生斯托克斯线。同样处于激发态的分子吸 收入射的光子，跃迁到假设的激发态帆+ ，当分子从这假设的激发态跃迁到振 2 动的基态时，放出的能量为 + 舢。由此可见，拉曼光谱与荧光机理完全不一 样。而且荧光光谱只限于被原子或分子所吸收的一些频率所激发，而拉曼光谱则 可以被任意频率所激发。图1 2 为拉曼光谱与荧光光谱的激发能级团。荧光光谱线 的强度与激发线是同一个数量级，而拉曼线的强度比激发线的强度弱向个数量级， 这些荧光光谱与拉曼散射的不同之处i ”。 斯 电子基态 拉曼跃迁 荧光光谱 克斯线反斯托克斯线 图1 2 拉曼光谱和荧光光谱能级图 1 2 激光拉曼光谱的应用 1 2 i 用于生物医学的研究 象嚣夏扩 刮 芦3 闾 ；i v = o 稗数 一、生物大分子的研究 生物大分子中，蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质，研究它们的 结构、构象等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。拉曼光谱 在测量d n a 水溶液时，几乎不受水的干扰，故在d n a 研究中非常直接和有效。t m i u r a 等用拉曼谱研究了端粒d n a 的溶液二级结构和核苷构像，发现单链和双链端粒d n a 都显示了结构的多态性，其b 型d n a 中双螺旋是不均匀的。s e r b a n 等对超螺旋 和线性质粒的拉曼谱进行了比较。发现它们的拉曼谱差异虽然较小，但明显骨架 构象不完全一致”1 。s c h a d h a 等用紫外共振拉曼光谱技术( u v r r s ) 研究比较了细 菌、细菌细胞壁、核糖体等的谱线，并分析了它们之间拉曼峰的起源”1 。 二、药物成份检验 利用在线拉曼光谱的方法，跟踪阿司匹林合成反应过程的实验，直接观测到 反应过程中体系的拉曼光谱随时间的变化“。钱晓凡等利用显微共振拉曼技术对三 种常见青霉素类药物作了测试和分析，得到拉曼散射谱，发现不同类青霉素的拉 曼谱线有明显区别，可以用来鉴别药物。， 三、类胡萝h 素的检测 类胡萝h 素广泛的存在于动、植物体内，是生物学上非常重要的化合物，它 富含抗氧化剂，大量实验和临床数据表明，它可以延缓皮肤衰老、抗辐射、降低 多种疾病的发病率，并可降低眼部与年龄相关的黄斑变性和各种心血管疾病的发 病率。因此对人体中类胡萝h 素含量的测定对某些疾病的早期预防无疑有重要的 意义。 1 2 2 用于碳纳米管结构研究 目前对单壁碳纳米管结构性能和应用的研究很多，而共振拉曼散射光谱是研 究碳纳米管的有力手段之一，对于了解其结构及物理内涵具有重要作用。r a o 等人 “”在5 1 4 5 n m 到1 3 2 0 n m 不同波长的激光激发下，观察到拉曼散射峰的共振增强 效应和某些拉曼模的频率随激发能量变化而有明显位移。p i m e n t a 等人“2 1 观察了不 同激发能量下的单层碳纳米管( d o = 1 3 7 n m ) 的共振拉曼散射光谱中的r b m 和g m ( 正 切带) 。实验结果与理论上认为的r b m 的频率与碳纳米管直径相关性是一致的。 b r a 霄n 等人“”对不同激光激发能量1 4 9 e v e ，2 1 9 e v 下的单层碳纳米管 的斯托克斯和反斯托克斯光谱进行比较，发现在给定的激发能量下，相应的斯托 克斯和反斯托克斯散射过程中的g m 的形状不同。 1 2 3 用于无机物和金属配合物的研究 n a k a s h i m a 也利用拉曼散射研究t s i c 晶体内部结构的缺陷1 。p r a b a k a r 利用 c 出正n 。t e 多晶体所表现拉曼光谱的性质，分析c d o 。z n 。t e 多晶体薄膜的结构，拉 曼散射实验表明薄膜的表面被t e 腐蚀并且被氧化，其测试结果与x p s 检铡结果相 一致帕。 1 2 4 其它方面的研究 一、珠宝鉴定的应用 显微共振拉曼光谱测量的样品可以小到2 帅的量级特别适用于宝石中细小包 裹体的测量，由此可以提供宝石是人工合成还是天然的等信息，同时可以作到无 损检测。祖恩东等人1 1 6 】技术鉴定宝玉石，与传统宝玉石鉴定法相比，速度更快， 准确性更高，得出属于物质深层次的信息。 二、公安法学中的应用 云南工业大学的张鹏翔、赵金涛在室温环境下，利用显微拉曼技术对衣领 上的泥土水印、镰刀上的痕迹物、枪击后的残留物进行了测试和分析，得到了痕 迹物质的拉曼散射谱拉曼谱的分析，对这些物质给予了认证。 1 3 拉曼散射技术 一、傅立叶拉曼光谱技术 傅立叶变换拉曼光谱是上世纪9 0 年代发展起来的新技术，采用傅立叶变换技 术对信号进行收集，多次累加来提高信噪比，并用近红外激光照射样品，大大减 弱了荧光背景。从此，f t r a m a n 在化学、生物学和生物医学样品的非破坏结构分 析方面显示出了巨大的生命力。王志国“”采用近红外傅立叶变换拉曼光谱技术直 接、准确、快速、无损对2 7 种染色纤维样品进行了检验，同时得到了它们的本底 纤维和染料的拉曼谱图。然后利用计算机谱图处理程序进行拉曼差谱处理，获得 了染色纤维上染料的拉曼谱图，由此能够实现对纤维上染料的鉴定。f t r a m a n 光 谱技术还应用在测定家兔体液中的葡萄糖含量“”、亚麻油的组分1 、碳酸钙的固 相分析o ”以及共聚物扭1 、金属有机化合物的结构研究等。 二、激光共振拉曼光谱技术 激光共振拉曼光谱产生激光频率与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合 时，这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度可达到正常拉曼谱带的1 0 1 - 1 0 。倍。 与正常拉曼光谱相比，共振拉曼光谱灵敏度高，可用于低浓度和微量样品检测， 特别适用于生物大分子样品检测，可不加处理得到人体体液的拉曼谱图。激光共 振拉曼光谱在低浓度样品的检测中发挥着重要作用。结合表面增强技术，灵敏度 已达到单分子检测1 。 三、表面增强拉曼光谱技术 当某些分子被吸附到金、银或铜的粗糙化表面时，其拉曼信号都会出现显著 增强，增强因子达到1 0 1 1 0 7 倍，这种现象被称为表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ) 效应，简称s e r s 。由于s e r s 具有很高的灵敏度，能 检测吸附在金属表面的单分子层和亚单分子层的分子，又能给出表面分子的结构 信息，因此它被认为是一种很好的表面研究技术。 四、共焦显微拉曼光谱技术 在光谱本质上，共焦显微拉曼光谱仪与普通的激光拉曼光谱仪没有区别，只 是在光路中引进了共焦显微镜，从而消除来自样品的离焦区域的杂散光，形成空 间滤波，保证了探测器到达的散射光是激光采样焦点薄层微区的信号，可在电化 学体系的电极表面行为和电极溶液截面等方面研究中，获得真实的分子水平的信 思。 五、高温拉曼光谱技术 为了能揭示熔体的微观结丰句，高温下的物理化学反应，诸如在冶金熔体、地 质反应及晶体生长过程，测试必须在高温下进行，这样既能得到反应物和产物的 结构信息，还可获取反应中间体及其变化过程的信息。而在高温下测定拉曼光谱 则需专门的技术。主要问题在于温度愈高，背景的热辐射愈强烈，因而需对仪器 装置作必要的改造。现在研制成功的显微高温拉曼光谱仪具有所需样品量少，升 温速率快，空间分辨率高( 精度1 2 研) ，可选气体保护，操作和测定简便等特 点。宏观高温拉曼光谱仪具有极高的信噪比，可完全消除杂散光的干扰；同时， 样品可程序控温。目前，高温拉曼光谱技术己应用于晶体生长、冶金熔渣、地质 岩浆等物质的高温结构研究，揭示物质分子结构的主要手段之一。 六、固体光声拉曼技术 光声拉曼技术是通过光声方法来直接探测样品中因相干拉曼过程而存储能量 的一种非线性光存储技术。光声拉曼信号正比于固体介质三阶拉曼极化率的虚部， 与非共振拉曼极化率无关，因而完全避免了非共振拉曼散射的影响，并且克服了 传统的光学法受瑞利散射、布里渊散射干扰的缺点，具有高灵敏度( 能探测到 1 0 。c m l 的拉曼系数) 、高分辨率和基本上没有光学背景等优点o “。在气体、液体样 品的检测分析中获得了理想的效果瞄1 。由于不象相干斯托克斯拉曼过程那样有比 较严格的相位匹配角要求，因而它也很适合用于研究固体介质特性1 。 1 4 番茄红素的研究意义及国内外发展现状 类胡萝h 素是自然界中广泛存在的天然色素，如水果、蔬菜、花朵、树叶、 种子和软体植物、青苔地衣以及高级的生物体，在自然界中已发现超过6 0 0 种的 天然类胡萝h 素。它包括线状或具环的胡萝h 素( c a r o t e n e s ) 及它们的氧化衍生 物叶黄素( x a n t h o p h y l l s ) ”“，它们由8 个类异戊二烯单位组成”1 一些类胡萝 h 素被合成为食品着色剂，如b 一胡萝卜素、a 一胡萝卜素，番茄红素、玉米黄 质；有些则可作为维生素a 和某些激素的前体物质和膜流动性的稳定荆哺1 。现代 生物医学及流行病学研究表明：类胡萝h 素的功能不仅仅限于生物赋色、光合作 用中的沟通利用、光损伤保护等，它们对人类和动物具有重要的保健防病功能， 如清除自由基、免疫调节、防治眼病、抑制肿瘤或抗癌等汹】。类胡萝卜素独特的 链式结构，并含有大量的c - c 键和c - - c 键，比较容易引起分子极化率的变化，因 此较适合用激光拉曼光谱法进行检测。图1 4 为几种主要的类胡萝h 素。 6 ：7 t 7 、“。7 、7 4 ”、7 1 7 。“丫7 詈，f 争此时，可把( 2 1 3 ) 的t 看作为f 斗o 。，于是从数学上看： -o勺 姆鼍学= 私丘枷 联丘一e ) 为万函数，因此 ：毕帆j 2 等弛圳 ( 2 1 4 ) w 0 表示单位时白j 内，系统由本征状态a 到本征状态c 的跃迁几率。显见，它与常 见的处理结果相似。其中日可取与p 有关的形式： p = 尸( o + 1 ) + p ( 2 + 其中一1 与线性拉曼有关，2 与非线性拉曼有关，p 也就是上面提到的电偶 极矩。 ， 此外，设散射前分子的本征能级的能量为巳，散射后分子的本征能级的能量 为乞，入射光子的能量为饥，散射光子的能量为l i n ，。从( 2 1 4 ) 式看，只有当e = e o 时，万函数才不为0 ，也就是在t 很大时，丘一e = 0 ，亦即系统的能量守恒。于 是： e e o = ( e o + b y ) - ( e o + 所o ) = v 一【所o + ( 巳一乞) 】 按整个光子场与散射分子整个体系应遵守能量守恒，那么 疋一g a = 0 枷一【m + ( 巳一) 】= o 细= 而+ ( 乞一瓦) = 矗( v o a v ) 当乞一乞 0 时，v = v o + a v 表示反斯托克斯线。当乞一 o 时，p = v o 一加表 示斯托克斯线。以上用数学表示了拉曼散射的量子过程。 2 3 激光共振拉曼光谱技术 2 3 1 激光共振拉曼光谱基本原理 当激发光频率和分子内某一结构或基团的电子能级吸收频率相同时，则对应 这一结构或基团振动能级跃迁的拉曼散射强度可提高1 0 3 1 0 6 倍，这就是共振拉 曼效应( r e s o n a n c er a l t l r ne f f e c t ) 。当激发光频率远离其电子能级的吸收频率时， 即正常散射的情况，这种散射谱带的强度可能是很弱的。随着激发光频率逐渐接 近于电子最大吸收，共振拉曼谱带的强度逐渐增强。当激发光频率和电子吸收最 大的频率一致对，有最大的散射强度。普通拉曼及傅星时变换拉曼光谱需要较强 的激光光源。而共振拉曼光谱只需几毫瓦功率的光源即可。在测量共振拉曼光谱 时，受共振激发的振动模式仅与被激发的电子发色团有关，因而共振拉曼光谱被 大大的简化了。由于共振拉曼散射技术具有很高的灵敏度，因而对于研究在很稀 的溶液中的生物生色基团提供了一个较好的检测方法。 假定一个分子的电子振动态为m ，此分子受一频率为v 0 的平面偏振光照射。 按量子力学处理相当于些分子系统受微扰，分子跃迁到另一振动态片，同时散射出 频率为v o + ( v 栅= 一) 的光波。散射光在整个4 ，r 立体角的强度为 。= 务讹岷) 4 p a 。1 2 ( 2 1 5 ) 这里c 为光速；五为频率为的入射光的强度；p = z ，y ，z 为散射光的方向 6 分量；盯2 工，弘z 为入射光场在各方向的分量；。为散射张量p ，盯分量。按色散 理论，0 a m 向h 跃迁的极化张量的第户，口矩阵元( ，- 为 c 2 爿警+ 等警 汜 厅为普朗克常数；，为分子各种电子激发态及其振动转动能级( 称为中间态) ( 埘一) ，( m 一) 。等为相应的跃迁矩的振幅，例如( m j ) 。，可表示为： ( 0 ) 。，= 以m ，t m g 图2 3 电子振动跃能级图 = 皱( 参纠钟( 9 ( 2 1 7 ) 和为电子振动波函 数：为电偶矩运算子的第p 分量。，为振动态的能级差 n 的频率。因为存在各电子能级和 振动能级，因此需引入二个脚 标，令肌= g i ，g 为电子态的基 态，f 为其振动态。同样， ，= 矾以= ，如图2 3 ，电子 振动态函数可写为： g ( f ，q ) 为g 态的电子波函数：吖( q ) 为电子基态的第f 个振动态的波函数； f 及q 分别代表电子和核的。这样( 2 1 6 ) 可写成： c m 。= 去甄訾+ 华 汜 ( 2 1 7 ) 式可写成： ( m ，) 。= ( 以巾：) m ，( 巳? ) d f 姆 ( 2 1 9 ) 对( 2 1 9 ) 式对电子坐标积分，得： ( m ，) 用删= 且：) 。( m ，( q ) ) 即( ? ) d q ( 2 2 0 ) 其中 ( q ) 。，= 朋，q 嘶 ( 2 2 1 ) 肘( g ) 为以核坐标表示的电子跃迁矩，由散射理论习惯，用核位移展开 材，( 。的泰勒级数。 m 。= 噬，+ 丸( q ) 叫， ( 2 2 2 ) ( 2 2 3 ) 是由第一级微扰理论推导的。其中式( 2 2 2 ) 中的总和号是到态s 所有激发 电子跃迁矩。( 2 2 3 ) 式中的总和号则对所有正常模求和，q 是第a 个正常模的位 移，蛭是第口个正常模每单位位移的微扰能蛾= 霹一p 为共振分母。等式( 2 2 0 ) 交为： ( ) ，= ( m ，) ：。( e v l ) + 圮( 蠼) 。1 ( m ，) ：，( e l o o l ) 2 以 对其它的跃迁矩，可以假设波函数为实数。对所有p ，( m ，) ：= ( m ，z ，于 是第一级辱似( 口一) ，。可写为三项： ( j m 2 a + b + c ( 2 2 5 ) 其中爿2 涮去+ 去j + ( m ，柚工协f 砷川叫 b 毛善【去垮惫+ m 枷兄( 咖) ( 吨f ) x ( m 。以m ，蔓，( g t e v ) ( e v 蚓莎) c = 去善( 去库惫+ 枷蹦州( 圳啪) ( m ，) ：，( m ，“l 删) ( e v i 0 0 1 ) 从上式可以看出，当v o 接近或等于。时，k 。，一一0 那么式子的值交得 非常大。即当激发光的能量接近或等于散射分子的某个电子吸收带的能量t 一，时， 拉曼谱线强度会显著增加，当。 v o 时，则为正常拉曼效应。 因此，共振拉曼效应是由于激发光频率落在散射分子某一电子吸收带之内而 产生的。因为电子吸收带往往比较宽，因此按激发光频率与电子吸收带的相对位 置分为预共振拉曼效应( p r e r e ) 。严格共振拉曼效应( r r e ) 和过共振拉曼效应 ( p o s t r e ) 。见图2 4 当激发光频率进入吸收带内。但未落在吸收线半宽度内时， 称之为预共振拉曼效应。当激发光频率落在物质某一电子吸收带的半宽度内时。 产生的拉曼效应，称之为严格共振拉曼效应；同理，超过了电子吸收带的半宽度， 并达到了电子吸收带的另一边时，称为过共振拉曼效应。 v 图2 4共振区域 共振拉曼光谱的特点是某些拉曼线强度显著增大，可增到1 0 6 倍，同一分子各 种拉曼线强度增加不同；倍频与组频强度显著增加普通拉曼光谱中倍频或组频 强度约为基频的1 ，而有些物质的共振拉曼光谱中，倍频可以接近基频的强度； 可以观察到1 5 次泛频：退偏度出现异常值，p 值可以无限大。 2 3 2 激光共振拉曼散射光谱实验技术 激光共振拉曼光谱的实验技术，原则上和普通拉曼光谱的技术相同，设备是 基本一致的，但也有它比较特殊的地方。 一、光源 ( 1 ) 要求光源的波长可调，至少在化合物的电子吸收光谱区的长波部分可调 谐，即在可见和近紫外光谱区( 2 0 0 - - 8 0 0 h m ) 可调谐，以方便选择任意的激发频率， 观察到共振拉曼散射。但可调谐激光器价格比较昂贵，要想达到普及的程度还需 要时激光技术的进一步发展。 ( 2 ) 激发光源的谱线宽度要尽可能窄，对转动共振拉曼光谱，激发源的谱线 要很好的单色性，并且输出频率要稳定。 ( 3 ) 激发光要尽可能强，并要有高度的会聚性，这样可减少样品对散射光的 吸收损耗。 ( 4 ) 光谱分析器( 包括单色器和接收器) 灵敏度和分辨率要高。 二、样品和照明 气体、液体和固体样品都能产生共振拉曼光谱，不同的样品有不同的处理。 对气体状态的拉曼介质，在低气压下，直至一个大气压为止，通常都是存放于硬 玻璃或石英玻璃容器中，窗口的形状多为圆柱形或矩形，容积大小约为一至一千 毫升左右。对于液体拉曼样品，把激光束聚焦入拉曼池，聚焦透镜的焦距应该选 择足够长，约为4 至l o 厘米左右，这样可减少热透镜效应。对于固体样品，假如 是单晶，一般可不用拉曼池，样品线度几个毫米便够了。 三、单色器和探测系统 共振拉曼光谱和通常拉曼光谱所使用的单色器一样，用双、三光栅单色器， 甚至四光栅单色器以代替棱镜单色器。用光子计数器或电子脉冲计数器探测。这 是因为共振拉曼的强度虽然较高，但也并不是很容易观察得到的，因而要灵敏的 探测器。 第三章番茄红素的吸收光谱检测 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的。从化学键性质来 分析，与电子光谱有关的主要是三种电子：形成单键的o 电子；形成双键的n 电 子：未共有电子或称非键电子，一般指分子中的氧、氮、硫和卤素等杂原予外层 的孤电子对，表示为n 电子。目前常用分子轨道法来处理分子中价电子所处的状 态。在n 分子轨道中，能量低的称为“成键轨道，常用“表示，能量高的称为 反键轨道，用“表示。n 电子从基态向激发态跃迁，称为n n 。跃迁，常用n 一 + 表示。 3 1 准备工作及紫外一可见分光光度计 一、计算番茄红素最大吸收峰 链状共轭多烯中，随着共轭双键数目的增多，一跃迁所需的能量减小， 吸收峰就往长波长方向移动，强度也增大。 四烯以上的共轭多烯，其五。可按照费赛尔( f i e s e r ) 和肯恩( k u h n ) 所提出 的公式进行计算“。 五m - - 1 1 4 + 5 m + n ( 4 8 0 1 7 n ) - 1 6 5 r ( 环内) 一1 0 r ( 环外) 式中影一取代烷基数； 疗一共轭双键数： r ( 环内卜一含环内双键的环数； 尺( 环外卜一含环外双键的环数。 对于番茄红素： k 基本值1 1 4 n m 朋r - 8 + 4 0 r i m 疗= 1 3+ 3 3 6 7 n m r ( 环内) = o 0 r i m r(环外)=o地鲤 k 计算值4 9 0 7 r i m 二、实验准备工作 1 、实验材料： 石油醚、四氢呋喃、丙酮、乙醇、甲苯、二甲苯、四氯化碳等均为国产分析 纯：b 一胡萝h 素( 含量9 5 ，天津市光复精细化工研究所) ：番茄红素( 含量1 0 ， 武汉远城科技有限公司) 2 1 2 、实验仪器： 紫外一可见分光光度计由光源、单色器、样品室、检测器、显示装置组成。 s h i m a d z u ( 日本岛津) 公司生产的u v v i ss p e c t r o p h o t o m e t e r ( 紫外一可见分 光光度计) ，仪器结构如图3 1 所示。 图3 1 单光束紫外一可见分光光度计图片与结构示意图 型号：u vm i n i1 2 4 0 ： 测量范围：2 0 0 - 1 1 0 0 r i m ： 显示波长：0 1 n m 步 带宽：5 r i m 波长准确度：1 0 a m 波长重现性：0 3 n m 测光方式：单光束 杂散光：0 0 5 以下 测定方式：a b $ ( 光密度) 光源：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强 度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可自动校正，自动调节最高灵敏度。 紫外区( 2 0 0 4 0 0 n m )氘灯( 插座型) 可见光区( 4 0 0 11 0 0 n m )2 0 瓦碘钨灯 单色器：相差校正型凹面测耀全息光栅。 样品室： 样品室放置各种类型的吸收池( 比色皿) 和相应的池架附件。本实验采用的 是玻璃比色皿。 检测器：硅光电二极管。 结果显示记录系统： 本实验的记录装置为微型计算机，操作系统为w i n d o w sx p ，数据接收软件为 “n e wu vd a t em a n a g e r ”。 3 2 番茄红素的可见吸收光谱 利用分光光度法测量了番茄红素分别在石油醚、四氢呋喃、丙酮、乙醇、甲 苯、二甲苯、四氯化碳这七种有机溶剂中的可见吸收光谱，如图3 2 图3 8 所 示，其吸收峰值数据汇总于表4 一l 中。 2 。o 3 0 0 4 0 05 0 0 账( r i m ) 图3 2 番茄红索( 实线) 、b - 胡萝h 素( 虚线) 与石油醚混合溶液的吸收光谱 8 6 4 2 0 8 6 4 2 o 2 ” 协 化 佃 心 掣粥皋 型 鍪 芸 3 0 03 5 04 0 04 5 05 0 0 5 5 06 0 0g 6 0 7 0 0 波k ( n m ) 图3 , 3 番茄红索( 实线) 、口一胡萝h 素( 虚线) 与四氢呋喃混合溶液的可见吸收光谱 佗 仙 啦 1r 6 14 1 2 纠 1 r o 聱0 8 芸 0 6 1 ：1 3 0 4 0 2 0 0 0 2 4 5 05 0 05 5 06 0 0 波长( n m ) 图3 4 番茄红索( 实线) 、b 一胡萝h 素( 虚线) 与丙酮混合溶液的可见吸收光谱 o 7 0 6 o 5 o 4 o 3 o 2 0 1 o o o 1 3 5 04 0 04 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 06 5 0 波长( n m ) 型整安m 酗3 5 番茄红紊( 实线) 、俨一胡萝 素( 虚线) 与乙醇混合溶液的可见吸收光谱 o o 3 5 04 0 04 5 05 0 05 5 06 0 06 5 0 波长t n m ) 圈3 6 番茄红素( 实线) 、b 一胡萝h 索( 虚线) 与甲苯混合溶液的可见吸收光谱 型翟簧s日 1 3 12 1 1 10 o - 9 0 8 o 7 0 6 o ，5 o 4 0 3 0 2 o 1 o o o 1 3 0 03 5 0 4 0 04 5 0 5 0 05 5 0 6 0 0 6 5 0 7 波长( n m ) 图3 7 番茄红素( 实线) 、卜胡萝h 素( 虚线) 与二甲苯混合溶液的可见吸收光谱 型稆芸 1 2 10 型0 8 莉 芸0 6 ( i ) 0 4 0 2 0 0 3 0 0 3 5 04 0 04 5 05 0 05 5 06 0 0 波长( n m ) 图3 8 币茄红索( 实线) 、b 一胡箩h 素( 虚线) 与四氧化碳混合溶液的可见吸收光谱 表4 - 1裔茄红素与卜胡萝h 素在不同有机溶剂中的吸收峰 3 3 测量结果分析 用常规的分光光度法测量番茄红素和b 一胡萝h 素的紫外一可见吸收光谱，类 胡萝h 素吸收光谱的最重要特征是可见区的主吸收带，通过测量可得到如下结论： ( 1 ) 番茄红素在不同有机溶剂中的最大吸收峰介于4 7 t y - 4 8 4 n m 之间，它由 分子的发色团所决定的。实际测量的最大吸收峰值比预测峰值4 9 0 h m 有所偏小， 考虑到根据经验公式计算出的最大吸收峰通常比实测结果要稍大这情况。以及 以上测量数据是番茄红素溶于不同有机溶剂后的测量结果，其测量最大峰值在一 定范围内波动属于正常情况。因此。可认为得利分光光度法测量番茄红素的吸收 谱所得的以上数据基本上是比较准确、可靠的。只有番茄红素溶于四氢呋喃的吸 收峰值数据与文献差异较大，因在同等条件下测量的其它峰值数据与文献记录吻 合较好。经反复测试后，本人认为文献记录可能存在闽题。 ( 2 ) 吸收强度，由光密度( a b s o r b a n c e ) 表示。它与实测样品在不同有机 溶剂中的浓度有关，可以给定量分析提供基础。园本文重点研究激光共振拉曼光 谱在番茄红素研究中的应用，测量其可见吸收光谱也旨在寻找其最大吸收峰，以 便找出合适的拉曼光谱的激发光源，因此对番茄红素在各种有机溶剂中的浓度并 没有进行标准的测量。但其浓度对吸收强度的影响是比较明显的，此方面已经有 多篇文献进行论述。 ( 3 ) 许多类胡萝卜素的吸收光谱并不是单一的谱带，而表现出三个左右明显 的吸收峰。这些光谱的精细结构由不同类胡萝h 素分子的振动能量所决定的。由 于番茄红素( 包括其它类胡萝p 素) 吸收光谱的位置、形状及精细结构表达了其 发色团结构的信息，所以，这些光谱特征的描述是非常有用而且重要的。 ( 4 ) 决定类胡萝h 素光谱性质的结构特征是共轭双键的发色团。随着这一发 色团碳链长度的增加，成键n 电子变得更容易被激发到激发态能级，而产生跃迁 所需的能量也比较小，所以分子光谱会红移。由于在分子结构上番茄红素的分子 链要长于b 一胡萝卜素，同时c = c 双键数目增加了2 个。因此，在相同有机溶剂中 的番茄红素最大吸收波长明显向着长波长方向移动。这两种结构类似的类胡萝h 素吸收峰相差3 0 n m 左右，因此有利于选择适当的激发光源，开展激光共振拉曼光 谱的测量研究。 ( 5 ) 单独的紫外一可见光谱仅提供了分子中发色团的结构信息。并不足以对 整个类胡萝卜分子的结构作特征性描述。此外，分光光度计对类胡萝卜素的测量 要求也比较高： 被测样品的纯度要比较高，一般来讲，样品都是要经过提纯后才能使用； 测量结果只对单一的样品有效，若被测样品中含有多种类胡萝h 素( 如结 构比较相近的番茄红素和d 一胡萝f 素) ，分光光度法很难就其中单一成分迸 行测量； 在实际样品的检测过程中，被测样品却会常常含有多种类胡萝h 素，如水 果、蔬菜或其它植物，以及人体，常规的分光光度法也很难进行在体、在线 的实时检测分析。 因此，单独依靠类胡萝h 素的紫外可见光谱，对其分子进行鉴定是不可能 的。一般来讲，类胡萝卜素分子中的绝大部分取代基并不影响其光谱。必须考虑 引入其它的检测方式，本文所采用的激光共振拉曼光谱是一种有着诸多优点的检 测技术，与紫外一可见光谱相结合，能更准确的完成对番茄红素样品的检测。 第四章番茄红素的激光共振拉曼光谱检测 4 1 准备工作及拉曼光谱检测仪器 拉曼光谱仪器主要包括四个部分：光源、外光路系统、单色系统和探测记录 系统。 实验材料：石油醚、四氢呋喃、丙酮、乙醇、二甲苯、四氯化碳均为国产分 析纯：b 一胡萝h 素( 含量9 5 ，天津市光复精细化工研究所) ；番茄红素( 含量 l0 9 6 ，天律一方科技有限公司) 实验仪器：天津港东公司生产的l r s - i i 型激光拉曼荧光光谱仪。仪器结构 如图3 9 所示： 图3 9 激光拉曼荧光光谱仪结构示意图 其它参数及性能指标： 单色仪：d f = 1 5 5 光栅：1 2 0 0 m m ，闪耀波长5 0 0 r 伸 狭缝：0 3 m m 接收单元：光电倍增管( 日产r 6 2 4 9 ，倍增管电源d - 1 5 0 0 v ) 单光子计数器：积分时间0 - 3 0 分钟，最大计数为1 0 一、光源 激光是一种高度单色光源，它的谱线宽度十分狭小。窄的激发线大大改善了 拉曼光谱的频率、强度和轮廓的测量精度；激光的单色亮度高，大大缩短了拉曼 光谱的摄谱时问；激光的单色性好，可避免荧光影响。本实验采用的是半导体泵 浦倍频n d ：w o 激光器，该激光器输出的激光为偏振光，输出波长为5 3 2 r n ，输出 功率约为4 0 m w 。 二、外光路系统 外光路系统主要由激发光源( 半导体泵浦周体激光器) 五维可调样品支架s ， 偏振组件p l 和p ：以及聚光透镜c 和c ：等组成( 见图3 1 0 ) 。 f s a c 2 p 2 r ju u l 二 恤 () c i i - - - 1 p l 、 i 激光器 r 图3 1 0 外光路系统示意图 激光器射出的激光束被反射镜r 反射后，照射到样品上。为了得到较强的激 发光，采用一聚光镜c ，使激光聚焦，使在样品容器的中央部位形成激光的束腰。 为了增强效果，在容器的另一侧放一凹面反射镜觇。m 2 可使样品在该侧的散射光返 回，最后由聚光镜c ：把散射光会聚到单色仪的入射狭缝上。 三、单色仪 单色仪就是分光系统，高分辨率、低杂散光单色系统是拉曼光谱仪的核心部 分。它的主要作用是把拉曼散射光分光并减弱杂散光。 四、探测系统 拉曼散射是一种极微弱的光，其强度小于入射光强的1 0 1 ，比光电倍增管本身 的热噪声水平还低。用通常的直流检测方法已经不能把这种淹没在噪声中的信号 提取出来了。 单光子计数器是利用弱光下光电倍增管输出的电流信号自然离散的特征，采 用脉冲高度甄别和数字计数技术将淹没在背景噪声中的弱光信号提取出来。与锁 定放大器等模拟检测技术相比，它基本消除了光电倍增管高压直流漏电和各倍增 极热噪声的影响，提高了信噪比；受光电倍增管漂移、系统增益变化的影响较小： 它输出的是脉冲信号，不用经过a d 转换，可直接送到计算机处理。 在非弱光测量时，通常是测量光电倍增管的阳极电阻上的电压。测得的信号 或电压是连续信号。当弱光照射到光阴极时，每个入射光子以一定的概率( 即量 子效率) 使光阴极发射一个电子。这个光电子经倍增系统的倍增最后在阳极回路 中形成一个电流脉冲，通过负载电阻形成一个电压脉冲，这个脉冲称为单光子脉 冲。除光电子脉冲外。还有各倍增极的热发射电子在阳极回路中形成的热发射噪 声脉冲。热电子受倍增的次数比光电子少，因而它在阳极上形成的脉冲幅度较低。 此外还有光阴极的热发射形成的脉冲。噪声脉冲和光电子脉冲的幅度分布如图 3 1 l 所示。脉冲幅度较小的主要是热发射噪声信号，而光阴极发射的电子( 包括 光电子和热发射电子) 形成的脉冲幅度较大，出现“单光子电子峰”。用脉冲幅度 甄别