（特种经济动物饲养专业论文）家蚕胚胎发育相关基因的克隆、表达及功能研究.pdf

摘要 家蚕胚胎发育相关基因的克隆、表达及功能 研究 特种经济动物饲养专业博士研究生：柴春利 指导教师：鲁成教授 摘要 胚胎发育是生物学研究中最重要的基本问题之一，所有的多细胞生物都是由一个单细胞 受精卵发育而来。受精卵通过一系列的分裂和分化形成不同形态和功能的细胞，然后进 一步构建各种组织和器官，最后建成一个胚胎有机体。整个发育过程都是大量的基因按照一 定的时间、空间和次序表达的结果，其中许多调控机制在胚胎发育阶段就已经决定，因此， 研究胚胎发育调控机制对于阐明生物的生长、发育和起源进化具有重要意义。 昆虫是目前地球上最繁盛的物种类群，了解昆虫的生活方式，探讨它们怎样成功地在地 球的任何一个角落繁衍生存是一项非常重要的研究工作。家蚕是一种完全依靠人类饲养生存 的经济昆虫，是重要的模式昆虫之一，有非常重要的产业价值，并且有着很好的研究基础并 保持有大量的突变体及繁育系。对家蚕的胚胎发育相关基因进行研究，不仅可以加速人们对 家蚕胚胎发育调控机制的分子水平研究，也可以促进人们对其它昆虫胚胎发育机制的了解， 并可为昆虫分化多样性的分子机制研究提供线索。 借鉴模式生物果蝇中的先进研究成果，利用家蚕的全基因组序列、e s t 以及基因芯片数 据，我们对家蚕胚胎发育相关基因进行了生物信息学分析，同时采用克隆、表达，r t - p c r 、 免疫组织化学染色和r n a 干涉等技术对部分基因的结构、转录水平及蛋白质水平的时空表达 以及功能进行了分析和研究。获得的主要结果如下： 1 家蚕发育相关基因的生物信息学分析 基于序列的相似性，在家蚕基因组数据中检索参与果蝇胚胎发育调控级联的8 6 个重要基 因的同源基因，结果表明，除6 个母性基因在家蚕中没有找出同源基因外，其余基因在家蚕中 均存在同源基因，并且其中一部分具有相当高的相似性。这一结果表明参与胚胎发育调控级 联的大多数基因在家蚕和果蝇间较为保守。 利用果蝇及其它物种中已知的h o m e o d o m a i n 序列对家蚕基因组中的h o m e o b o x 同源基因进 两南大学博十学何论文 行了检索和分析，结果表明，家蚕中存在9 2 个h o m e o b o x 基因。所编码的h o m e o d o m a i n 蛋白 分属于2 1 个不同的家族和亚家族。大多数在其它物种中得到鉴定的h o m e o d o n m i n 家族在家蚕 中都存在，如a b d b ，a n t p ，l a b ，c a d , c u t , e l m ，e n ，e v e ，h 2 0 ，n k - 2 ，z f h ，p a r i e d ，s i x ，l i m ， p o u 1 o m s h 和t a l e 等。其中，有2 3 个基因所编码的h o m e o d o m a i n 蛋白属于p a r l e d 家族， 是基因数目最多的一个家族；有1 2 个基因所编码的h o m e o d o m a i n 蛋白属于a n t p 家族，为第 二大家族。同果蝇相比，家蚕中一些家族成员的数目有所增加，如果蝇的l a b 亚家族只有1 个基因成员，在家蚕中增加到了6 个；还有些有所减少，如家蚕l i m 和p o u 家族中的基因数 目分别减少了2 个和3 个。 生物信息学分析结果表明，参与果蝇胚胎发育调控的大部分基因在家蚕中都存在同源基 因，推测家蚕的胚胎发育调控机制同果蝇相似。而分析所鉴定的参与家蚕胚胎发育调控级联 的同源基因以及h o m e o b o x 同源基因为进一步的功能研究提供了可靠的数据和信息。以此为基 础，我们选择了部分基因进行克隆表达及功能研究，其中包括两个母性基因( v a s a 和m a g o n a s h i ) ，一群家蚕特异的h o m e o b o x 基因和一个同源异型基因“b d b ) 2 家蚕v a s a 基因的结构和m r n a 表达型研究 v a s am p n a 和v a s a 蛋白都是果蝇生殖质的主要成分，其同源基因已经在许多物种中得 到鉴定。利用家蚕的基因组数据和e s t 数据，我们对家蚕v a s a 基因的结构进行了分析。结果 表明，家蚕v a s a 基因由1 3 个外显子组成，在第二和第三外显子间插入了一个i l l a r i n c r 型转座 子，散布距离约1 0 k b ，同黑腹果蝇的 啪基因相比增加了6 个外显子，复杂度明显增加 r t - p c r 检测结果表明，家蚕w 基因在胚胎发育的各个时期均有表达，但在5 龄第3 天幼虫 中，只在生殖腺中特异性表达，在其它组织中不表达。这一结果进一步证实了前人的研究结 果，说明家蚕的 基因同其它物种 m 同源基因的功能相似，也是生殖系特异的成分之一 以 m 基因作为一个标志基因，我们合成地高辛标记的c d n a 探针，在探索中建立了家蚕的 胚胎及组织原位杂交技术体系。原位杂交结果表明，v o s a 基因在家蚕幼虫中只在生殖系来源 的细胞中表达，在其它的组织细胞( 如结缔组织) 中无表达 3 家蚕m a g on a s h i 基因的发育表达研究 m a g on a s h i 是一个进化中高度保守的基因，它所编码的m a g o 蛋白是f j c ( e x o n - e x o n i u n c t i o nc o m p l e x ) 复合体的成分之一，负责m r n a 从细胞核到细胞质中的运输过程，同时也 是n m d 途径( n o n s e n s e - m e d i a t e dm r n a d e c a y ) 的重要成分之一，参与剪接后m r n a 的质量 控制。我们克隆了家蚕的m a g on a s h i 基因，对其结构和时空表达模式进行了分析和检测。结 果表明，家蚕m a g on a s h i 基因由2 个外显子组成，编码区长度为4 4 1 b p ，编码1 4 6 个氨基酸。 对e s t 数据的分析结果表明在其5 端可能存在选择性剪接。r t - - p c r 检测和组织芯片数据分 析结果表明，家蚕m a g on a s h i 基因在胚胎、幼虫、蛹和蛾期都有表达，在5 龄第3 天幼虫的 各组织中也均有表达，但在生殖腺和丝腺中的表达量高丁：其它组织。我们制备了家蚕m a g o 摘要 蛋白的多克隆抗体，对m a g o 蛋白在生殖腺和丝腺中的表达分布进行了免疫组化检测结果 表明，家蚕m a g on a s h i 基因在生殖腺和丝腺的细胞核和细胞质中均有表达，且在生殖腺细胞 核中的表达强于细胞质中。推测家蚕m a g o 蛋白同果蝇中的同源体功能相似，是e i c 复合体 的重要成分，参与m r n a 的运输和定位。 4 家蚕h o x l 1 i k e c l u s t e r ( h l c ) 基因的鉴定及其结构和进化分析 在进行生物信息学分析的过程中，我们发现了s c a f f o l d 0 0 1 6 4 0 中存在家蚕特有的一串 h o m e o b o x 基因，呈串联重复状，在基因组注释中的编号分别为b m b 0 0 8 3 4 9 ，b m b 0 0 8 3 5 0 ， b m b 0 0 8 3 5 1 ，b m b 0 0 8 3 5 2 ，b m b 0 0 8 3 5 4 和b m b 0 0 8 3 5 5 这群基因的散布距离约为3 5 k b ，每个 基因编码h o m e o d o m a i n 结构域1 3 个不等，因为它们所编码的h o m e o d o m a i n 序列同脊椎动物 h o x 基因群蛋白的h o m e o d o m a i n 序列较为相似，所以将这群基因命名为h o x - l i k ec l u s t e r ( h l c ) 基因，并按照基因编号的顺序，将其中的每个基因分别命名为日珏。h l c - 2 ，h l c - 3 ， h l c - 4 。h i c - 5 和h l c - 6 除h l c - 5 基因的转录方向相反外，其它5 个基因的转录方向均相同。 除h l c - 6 h l c - 5 和h l c - 5 h l c 6 两段基因间区外，h l c 群基因的其余部分均得到了进一步的克 隆验证。结合早期的染色体原位杂交定位和新完成的家蚕基因组9 x 覆盖度的序列拼接结果， 我们分析发现这群基因位于家蚕第六染色体上传统h o x 群基因p r o b o s c i p e d i a ( p b ) 和z e r k n a l l t ( z e n ) 之间。家蚕h o x 基因群的这种特殊结构在其它物种中未见报道。 对家蚕、果蝇、按蚊、蜜蜂以及人中h o x 群基因的系统发生关系进行了分析。结果表明， 瑚c 群基因首先自己聚为一类，然后再同其它物种来源的z e n 基因聚在一起，最后和其它h o x 基因相聚。推测h l c 群基因起源于b m z e n 基因。 芯片数据分析及r t - p c r 检测结果表明，h l c - 6 基因在雌蛹的发育中有表达，在雌蛾中的 表达量达最高，但在雄蛹和雄蛾以及产后的卵中检测不到任何表达，表明这一基因是一个母 性基因 5 家蚕a b d o m i n a l - b “6 船) 基因的克隆、m r n a 表达型及功能研究 a b d b 基因决定昆虫腹部体节后部及末端的分化。早期研究表明a b d - b 基因在果蝇生殖腺 的发育中起重要作用，并且可以调控色素基因的表达，引起雌雄个体形态上的差异。根据生 物信息学分析结果，我们设计引物克隆了家蚕的a b d b 基因。对其在不同发育时期的表达进行 了检测，并合成r n a 双链探针，采用r n a i 技术对该基因的功能进行了深入研究。r t - p c r 检测结果表明，家蚕a b d b 基因在产卵后3 0 h 左右开始表达，并且表达量逐渐增强，在产卵后 7 d 表达量达到最高，而后逐渐降低。利用芯片数据对家蚕a b d b 基因在蛹、蛾发育时期的表达 进行分析，结果表明，该基因在整个蛹、蛾发育期均有表达，且在上簇后1 2 h 和上簇后7 d ， 在雌，雄个体之间的表达水平存在显著差异。取雌、雄蛹的生殖腺材料进一步对上簇后7 d a b d b 基因在雌、雄蛹中的表达差异进行了验证，结果同前面分析一致。推测a b d b 基因与雌、雄蛹 生殖腺的发育有关。 h l 两南大学博+ 学位论文 制备d i g 标记的a b d br n a 探针，以上簇两天的蛹输f 口管为材料进行原位杂交，结果表 明，a b d b 基因在输卵管腔内、卵间隙内有表达，特别是在输卵管的末端有高表达，但是在正 发育形成的卵中无表达。对家蚕胚胎期a b d b 基因的r n a i 研究结果表明，a b d b 基因在家蚕 胚胎发育中起重要作用，能够决定第l o 1 3 体节的特征。该基因的沉默可以引起原本不长腹 足的体节产生过剩附肢，并可以影响尾角和气门的发育突变表型的产生对探针浓度有一定 的剂量依赖性。对家蚕5 龄末期幼虫a b d b 基因的表达进行干涉研究，发现在a b d b 基因沉默 的情况下，蛹输卵管不能够正常生长伸长，未发育成熟的卵粒在输卵管的末端集聚，导致形 成畸形。未成熟卵中的卵母细胞和滋养细胞也发育异常，呈空泡状和碎片状。这一结果表明 a b d b 基因在家蚕蛹输卵管的发育中起重要作用。 关键词：家蚕胚胎发育母性基因同源异型基因 a b s t r a c t s t u d i e so nt h ee m b r y o n i c d e v e l o p m e n t r e l a t e dg e n e s i nt h es i l k w o r m ， b o m b y x m o r i p hd c a n d i d a t e ：c h a ic h u n l i s u p e r v i s o r ：p r o f l uc h e n g a b s t r a c t e m b r y o m cd e v e l o p m e n ti so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tb a s i cq u e s t i o n si nb i o l o g y a l lo ft h e m u l t i c e l l u l a ro r g a n i s m sa r ed e v e l o p e df r o mas i n g l ec e l l ，z y g o t e z y g o t ec l e a v a g e sa n dd i f f e r e n t i a t e s i n t oc e l l sw i t hd i f f e r e n tm o r p h o l o g y a n df u n c t i o n v a r i o u st i s s u e sa n do r g a n sa r es u b a q u e n f l yf o r m e d , c o n s q u e n f l yd e v e l o p sae m b r y o n i co r g a n i s m t h ew h o l ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n t a lc o u 鼬r e s u l t s f r o mt h eo r d i n a le x p r e s s i o no fal a r g en u m b e ro fg e n e sa c c o r d i n gt i m ea n ds p a c e m a n y d e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s m sh a v eb e e nd e t e r m i n e di nt h ee m b r y o m cs t a g e t h e r e f o r e ，s t u d yo nt h e r e g u l a t i v em e c h a n i s mo fe m b r y o m cd e v e l o p m e n ti si m p o r t a n tf o re l u c i d a t ep r i n c i p l e so fb i o l o g i c g r o w t h , d e v e l o p m e n ta n de v o l u t i o m i n s e c t sa r et h em o s tp i o s p e r o u sl i f ef o r mo i lt h ep l a n e tw i mw i d ed i s m b u t i o n i ti si n t e r e s t i n g a n di m p o r t a n tt oe x p l o r et h es e c r e th o wt h e yc a l ls u r v i v ea n dr e p r o d u c ea n y w h e r ea r o u n dt h ew o r l d s i l k w o r mi sa ni m p o r t a n te c o n o m i ci n s e c tw h i c hi sr a i s e di n d o o r s ，a l s oi so n eo ft h em o s tn o t e d m o d e li u s e c t sw i t h8 0 l i dr e s e a r c hb a s i sa n dn u m e r o u sm u t a n tl i n e sa n db r e e dl i n 髂t h e r e f o r e s t u d yo i ls i l k w o r me m b r y o m cd e v e l o p m e n t - r e l a t e dg e n e sc a nn o to n l ya c c e l e r a t er e s e a r c h e si n e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s mo fs i l k w o r ma t t h em o l e c u l a rl e v e l ，b u ta l s o p r o m o w u n d e r s t a n d i n g st od e v e l o p m e n t a lr e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fo t h e r sh m e c t sa n dp r o v i d ec l u e sf o r s t u d i e s d i v e r s i t yo f i n s e c t s l e a r n i n gf r o ma d v a n c e da c h i e v e m e n t si nd r o s o p h i l a ，w ep e r f o r m e dah o m o l o g ys e a r c ho n e m b r y o m cd e v e l o p m e n t r e l a t e dg e n e si nt h es i l k w o r mg e n o m eb yb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s t h e s t r u c t u r e ，m r n aa n dp r o t e i ns p a t i o - t e m p o r a le x p r e s s i o np r o f i l ea n df u n c t i o no f s e v e r a lh o m o l o g o u s g e n e sh a v eb e e na n a l y z e db yc l o n ea n de x p r e s s i o nt e c h n i q u e ，r t - p c r , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n d r n a it e c h n i q u e sb a s e do ng e n o m i cs e q u e n c e ，e s ta n dg e n ec h i pd a t ao fs i l k w o r m t h em a j o r v 西南大学博十学f ) ：论文 f i n d i n g sa l ea sf o l l o w s 1 b i o i n f o r m a t i e sa n a l y s i so f s i l k w o r md e v e l o p m e n t - r e l a t e dg e n e s a c c o r d i n gt os e q u e n c eh o m o l o g y , h o m o l o g o u sg e n e sf o r8 6g e n e sp a r t i c i p a t i n gi ne m b r y o n i c d e v e l o p m e n tg e n e t i ch i e r a r c h yo fd r o s a p h i l aw e r es e a r c h e di ns i l k w o r mg e n o m e i n c l u d i n g4 3 m a t e r n a lg e n e s ，1 2g a pg e n e s ，9p a i rr o l eg e n e s ，1 3s e g m e n tp o h r i t yg e n e sa n d9h o m e o f i cg e n e s r e s u l t ss h o wt h a ta l lb u t6m a t e r n a lg e n e sh a v et h eh o m o l o g u e si ns i l k w o r mg e n o m ea n ds o m eo f t h e mh a v eh i g hs i m i l a r i t y t h i sr e s u l ti m p l i e st h a tg e n e si n v o l v e di nd e v e l o p m e n t a lr e g u l a t i o na 坤 c o n s e r v a t i v eb e t w e e nd r o s a p h i l aa n ds i l k w o r m w es e a r c h e dh o m e o b o xh o m o l o g u e si ns i l k w o r mg e n o m eb yu t i l i z i n gk n o w nh o m e o d o m a i n s e q u e n c e sd i s c o v e r e di nd r o s a p h i l aa n do t h e rs p e c i e s r e s u l t ss h o wt h a tt h e r ea r e9 2h o m e o b o x g e n e se x i s ti ns i l k w o r mg e n o l l l ew h i c he n c o d e dd i f f e r e n th o m e o d o m a i np r o t e i n sb e l o n gt o2 1 d i f f e r e n tf a m i l i e sa n ds u b - f a m i l i e s m o s to ft h e s eh o m e o d o m a i np r o t e i n sf a m i l i e si no t h e rs p e c i e s a l s oe x i s t si ns i l k w o r m , s u c ha sa b d - b ，a i l l p ，l a b ，c a d , c u t , e l l l s ，e n ，e v e ，h 2 o ，n k - 2 ，z f h ， p a r i e d 。s i x ，l i m ，p o u ，f o ，m s ha n dt a l e a m o n gt h e s eg e n e s ，2 3g e n e sb e l o n gt op a r i e d f a m i l y , f o r m i n gt h el a r g e s tf a m i l y ；1 2g e n e sb e l o n gt oa n t pf a m i l y , t h es e c o n dl a r g e s tf a m i l y c o m p a r i n gw i t hd r o s a p h i l a t h e 枷m b e ro fm e m b e r si ns o mf a m i l i e si ns i l k w o r mv m e d , f o r e x a m p l e ，l a bf a m i l yh a do n l yo n em e m b e ri nd r o s a p h i l a , w h i l e6i ns i l k w o r m ；7a n d6m e m b e r si n l i ma n dp o uf a m i l yi nd r o s a p h i l a ，r e s p e c t i v e l y , w h i l e5a n d3i ns i l k w o r mc o r r e s p o n d i n gf a m i l y , r e s p e c t i v e l y f r o mt h ea b o v e ，m o s to fh o m o l o g u e so fg e n e sw h i c hp a r t i c i p a t ei nc a s c a d er e g u l a t i o nd u r i n g t h ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n to fd r o s a p h i l ac a nb ef o u n di ns i l k w o r m , i n f e r r i n gt h a tt h e r ew a sa s i m i l a rm e c h a n i s mi nt h e i re m b r y o n i cd e v e l o p m e n t i tp r o v i d e sar e l i a b l eb a s i sf o rf - l l r t h e rf u n c t i o n a l r e s e a r c h m e mo f s i l k w o r mg e n e s b a s e da nt h ew o r k ，2m a t e r n a lg e n e si ，a s aa n dm a g on a s h i , ag r o u p o fs i l k w o r ms p e c i f i ch o m e o b o xg e n e sa n do n eh o m e o t i cg e n ea b d bw e t 口c l o n e d , a n dt h e f t e x p r e s s i o np a t t e r na n df u n c t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d 2 s t r u c t u r ea n de x p r e s s i o np a t t e r no f s i l k w o r mv a s ag e n e b o t hv a s am r n aa n dv a s ap r o t e i na r ei m p o r t a n tc o m p o n e n t si nt h e g e r mp l a s mo f d r o s a p h i l a ，a n di t sh o m o l o g o u sg e n e sh a v eb e e ni d e n t i f i e di nm a n yo t h e rs p e c i e si n c l u d i n g s i l k w o r m w ea n a l y z e dt h es t r u c t u r eo fs i l k w o r mv a s ag e n ew i t hs i l k w o r mg e n o m ea n de s td a t a t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts i l k w o r mp a p ag e n ec o n s i s t so f1 3e x t r o n sw i t hd i s t r i b u t i o nd i s t a n c eo f a b o u t1 0k b am a r i n e r - l i k et r a n a p o s o nw a sf o u n db e t w e e nt h es e c o n da n dt h et h i r de x t r o r l c o m p a r e dw i t l ld r o s a p h i l av a s ag e n e t h en u m b e ro fe x l l o i l si ns i l k w o r mv a s ag e n ei sg r e a t l y i n c r e a s e df r o m7t o1 3w h i c hi n d i c a t eah i g h e rc o m p l e x i t yi nt h es i l k w o r mv a 5 ag e r m r e s u l t so f v i a b s t r a c i r t - p c rs b o w e st h a ts i l k w o r mv a c a 黜i se x p r e s s e dt h r o u g h 船e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t , w h i l e o n l yi nt h eg o n a do fd a y3o ft h ef i f t hi n s t a r , n o td e t e c t e di no t h e rt i s s u e s t h er e s u l ta l s of l l r t h e r p r o v e dt h er e s u l t so f p r e v i o n ss t l l d i 嚣ot h e r e f o r e , s i l k w o r mw 站4g e n ei so n eo f t h eg e r ml i n e 印e c i 五c g e l e sj u s tl i k ei t so r t h o l o g o u sg e n ei no t h e rs p e c i 嚣b yt a k i n gt h ed i g - h b e l e d p r o b e sa sa m a r k e r , w ep e r f o r m e di ns i t uh y b r i d i z a t i o n so re m b r y o e sa n dg o n a d so fs i l k w o r m i np u r p o s eo f e s t a b l i s h i n g ns i t uh y b r i d i z a t i o nt e c h n i c a ls y s t e n l t h ef i n d i n g ss h o w e dt h a ts i l k w o r my a s ag e n e e x p r e s s e do n l yi nt h ec e l l so r i g m a t e df r o mg e r ml i n ea n d1 1 0e x p r e s s i o n sw e r d e t e c t e di no t h e r t i s s u e s ( f o re x a m p l e ，c o r m e c t i v e6 s s u e ) 3 d e v e l o p m e n t a le x p r e s s i o no f s i l k w o r mm a g on a s h ig e n e m a g on a s h ii sah i g h l yc o n s e r v e dg e n ed u r i n ge v o l u t i o n m _ a g o t h ep r o t e i ni te n c o d e d , i s 咄 o f t h ec o n - q o o n e n t so f e j c ( e x o n - e x o n j u n c t i o nc o m p l e x ) c o m p l e x , r e s p o n s i b l e f o r t r a n s p o r t a t i o n a n d l o c a l i z a t i o no fm r n a sf r o mn u c l e a rt oc y t o p l a s ma n di ti sa l s oo n eo ft h em e m b e r si nn m d ( n o n s e n s e - m e d i a t e dm r n ad e c a y ) p a t h w a y w ec l o n e dt h es i l k w o r mm a g on a s h ih o m o l o g o u sg e n e ， a n dd e t e c t e di t st e m p o r a la n ds p a c i a le x p r e s s i o np a t t e r ni ns i l k w o r mo m l n y o sa n dt i s s u e sf r o ml a r v a o f3 do ff i f t hi n s t a r t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts i l k w o r mm a g on a a h ic o n s i s t e do f2e x 廿0 n s w i t h c o d i n g g i o n4 4 1 b pi nl e n g t hc o d i n gf o r1 4 6a l - l l i n oa c i d s a n a l y s i so fe s tr e v e a l e dt h e r ea r e p r o b a b l ea l t e r n a t i v es p l i c e sa ti t s5 e n d r t - p c rd e t e c t i o na n da n a l y s i so fg e r mc h i pd a t as h o w e d t h a ts i l k w o r mm a g on a s h ig e n ee x p r e s s e di na l lt h es t a g e sd e t e c t e dd u r i n gs i l k w o r md e v e l o p m e n t , i n c l u d i n ge m b r y o ，l a r v a , p u p aa n dm o t h h o w e v e r , h i g h e re x p r e s s i o nc o u l db ev i s u a l i z e di ng o n a d s a n ds i l kg l a n dc o m p a i r e dw i t ho t h e rt i s s u e s n ”e x p r e s s i o no f s i l k w o r mm a g on a s h ig e n ci ng o n a d s a n ds i l kg l a n dw a se x a m i n e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yu s i n gm _ a g op o l y c l o n a l a n t i b o d y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ts i l k w o r mm a g on a s h ie x p r e s s e di nb o t ht i s s u e s i ng o n a d s 。t h e r ei sas t r o n g e r s i g n a li nn u c l e a rt h a nc y t o p l a s m i ti si m p l i e dt h a tt h es i l k w o r mm a g oj u s ta si t sh o m o l o g u ei n d r o s a p h i l a ，i so n eo ft h ei m p o r t a n tc o m p o n e n to ff _ d cc o t 坤l e x ，a n di nc h a r g i n go fw a n s p o r t a t i o n a n dl o c a t i o no f m r n a 4 i d e n t i f i c a t i o no f h o x l - l i k ec l u s t e r ( h i e ) g e n e sa n di t sp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s d u r i n gt h ep r e v i o u sa n a l y s i s ，w ef o u n dac l u s t e ro fs i l k w o r ms p e c i f i ch o m e o b o xg e n e sw h i c h a p p e a r e da st a n d e md u p l i c a t i o n si ns e a f f o l d 0 0 1 6 4 0 g e n ei d sf o re a c ho ft h e ma r cb m b 0 0 8 3 4 9 ， b m b 0 0 8 3 5 0 ，b m b 0 0 8 3 5 1 ，b m b 0 0 8 3 5 2 ，b m b 0 0 8 3 5 4a n db m b 0 0 8 3 5 5 ，r e s p e c t i v e l y t h e i r d i s t r i b u t i o nd i s t a n c ei sa b o u t3 5 k b ，a n de a c ho ft h e mw a sp r e d i c t e dt oe n c o d e1 - 3h o m e o d o m a i n s b e c a u s eo ft h es i m i l a r i t yw i mh o m e o d o m a i ns e q u e n c e so fm a m m a lh o x p r o t e i n s w ec a r e dt h i s c l u s t e r g e n e s a s h o x - l i k ec l u s t e r ( h l c ) a n de a c h o f t h e m w a s n a m e d h l c - 1 ，h l c - 2 ，h l c - 3 ，h l c - 4 ， h l c - 5a n dh l c - 6 , r e s p e c t i v e l y a l lo f t h eh l cg e n e sh a dt h es a m et r a n s c r i p t i o nd i r e c t i o ne x c e p th c - 5 v 【i 两南大学博十学位论文 a l m o s ta l lt h es e q u e n c e so fh l cg e n e s 、v e 托f u r t h e rv a l i d a t e dv i ac l o n i n ga n ds e q u e n c i n ge x c e p t2 g a p sb e t w 嘲h l c - 4a n dh l c - 5 , h l c - 5a n dh i c - 6 c o m b i n i n gw i t ht h ep r e v i o u sf i s hr e s u l t sa n d t h e n e wf i n i s h e ds i l k w o r mg e n o m es e q u e n c e ( 9 xc o v e r a g e ) w ef o u n dt h eh l cg e n e sw e r el o c a t e do nt h e 6 出c b “珊0 9 咖帕eb e t w e e nt r a d i t i o n a lh o xg e n e sp r o b o s c i p e d i a ( p b ) a n dz e r k n a l l t ( z e n ) i ti sn e v e r r e p o r t e di no t h e rs p e c i e sf o rs u c has p e c i a ls t r u c t u r eo fh o xg e n e sl i k es i l k w o r m w ed e d u c et h e r e m i g h tb eal a r g eg a pe x i s t i n gb e n v 咖h o xg e n el a b i a l ( 1 a b ) a n dp b t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so fh o xc l u s t e rg e n e sf r o ms i l k w o r m , f r u i t f l y , m o s q u i f i o ， h o n e y b e ea n dh u m a nw c l ga n a