（植物学专业论文）蓝猪耳受精过程中胚囊细胞微丝骨架的动态研究.pdf

摘要 细胞骨架是目前生物学研究的热点之一，近年来植物细胞骨架的研究已取得很大进展。对 于被子植物胚囊中的细胞骨架的研究进展却十分缓慢，主要是由于被子植物的胚囊外包有一层 珠被组织，不利于对其进行直接观察。但自然界中存在一类象蓝猪耳这样具有半裸露胚囊的植 物，蓝猪耳的这一特点使它在研究被子植物受精生物学方面具有其他植物所不具备的优势。利 用蓝猪耳的这种独特优势，我们研究了其胚囊中的微丝骨架在发育和受精过程中的动态变化。 通过对固定染色方法进行改进，我们成功地对蓝猪耳胚囊中的微丝骨架进行了标记，利用 c o n f o c o l 技术研究了其在发育和受精过程中的动态变化。在胚囊未完全细胞化之前，胚囊中的 微丝呈短柬状，在胚囊中呈不均匀分布，在靠近珠孔端有许多密集的微丝束。开花当天到开花 后2 d 。中央细胞中存在着以纵向分布为主的周质微丝网络，随着胚囊发育的成熟，微丝骨架逐 渐变粗、变密。授粉之后不久，中央细胞中的微丝开始出现片段化。花粉管进入胚囊后较短的 一个时期中，微丝的解聚现象更加明显，微丝变成一些点状结构，中央细胞中的微丝数量显著 减少。花粉管释放完其内含物以后，退化的助细胞的合点端出现荧光强度较高的肌动蛋白荧光 区，同时在其附近有一条肌动蛋白荧光带出现。受精完成以后，这条荧光带逐渐减弱，初生胚 乳细胞中的微丝骨架逐渐聚合，重新形成清晰的网络结构，而退化的助细胞中的肌动蛋白荧光 区会向周围扩散，在胚囊中重新形成一条肌动蛋白荧光带。受精完成后，初生胚乳核往合点端 迁移的过程中，胚乳细胞中的微丝骨架重新聚合，初生胚乳核的周围包被着浓密的微丝柬，同 时还有一些较长的微丝将初生胚乳核与胚囊的合点端相联系。卵细胞中的微丝骨架在授粉前后 有较大的变化，授粉前有许多极短的微丝束分布于卵细胞的表层；授粉后其内部的肌动蛋白荧光 强度明显减弱，表面有少量的微丝束分布，微丝骨架主要以肌动蛋白短片的形式存在。 在微丝骨架的研究中，用g f p - t a l i n 标记细胞中的微丝是近年来发展的一种薪技术，该技 术可以对活体细胞中微丝骨架的动态进行研究，而且不会影响细胞的正常形态和功能，是一种 较为理想的研究微丝骨架的方法。由于目前在蓝猪耳的研究中没有器官特异启动子的报道，我 们从拟南芥中克隆了两个在胚囊中表达较好的启动子a c t l l 和a t s e r k l ，并将它们分别与 g f p - t a l i n 嵌合基因相连，构建了植物表达载体，为进一步研究活体的蓝猪耳胚囊中的微丝骨架 在发育和受精过程中的动态与功能打下基础。 关键词：微丝骨架胚囊受精蓝猪耳 a b s t r a c t t h er e s e a l _ c ho nt h ec y t o s k e l e t o nh a sb e c o m eah o t s p o tf o rt h eb i o l o g i s t s ，a n di nr e c e n ty e a r s g r e a ta c h i e v e m e n t sh a v eb m a d ei nt h i sf i e l d e m b r y os a c sa r cu s u a l l ys u r r o u n d e db yl a y e r so f n u c e l l u s , i n t e g u m e n ta n do v a r yt i s s u e s t h i sp o s e sg r e a td i f f i c u l t yf o rt h ed i r e c to b s e r v a t i o no ft h e f e m a l eg a m e t o p h y t e h e n c e i n f o r m a t i o nc o n c e r n i n ga c 吐no r g a n i z a t i o na n dc h a n g e sd u r i n gd o u b l e f e r t i l i z a t i o ni ss c a r c e w h i l et h e r ei ss u c hak i n do fp l a n tw h i c hh a sas e m i - n a k e de m b r y os a c ，i ti sa e x c e l l e n tm a t e r i a lt o s t u d yt h em e c h a n i s mo ff e r t i l i z a t i o n i na n g i o s p e r mb e c a u s eo ft h ed i s t i n c t a d v a n t a g ei t o w n s w es t u d i e da c t i nd y n a m i c si nt h ee m b r y os a c so ft o r e n i af o u r n i e r id u r i n g d e v e l o p m e n ta n df e r t i l i z a t i o n b ym e l i o r a t i n gt h ef i x a t i o nm e t h ow es u c c e e d e di nl a b e l i n gt h ea c t i nc y t o s k e l e t o ni nt h ee m b r y o s a co ft o r e n i af o u r n i e r ia n ds t u d i e dt h ea c f i nd y n a m i c sd u r i n gd e v e l o p m e n ta n df e r t i l i z a t i o nb y c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y b e f o r et h ec o m p l e t i o no fc e l l u l a r i z a t i o n ，t h ea c t i nf i l a m e n t s d i s t r i b u t sa s y m m e l r i c a l l yi nt h ee m b r y os a cj u s ta ss h o r tb u n d l e s ；l o t so fa c t i nb u n d l e sa g g r e g a t e si n t h em i c r o p y l a rp a r to ft h ee m b r y os a c f r o ma n t h e s i st o2d a y sa f t e rf l o w e ro p e n i n g ，a c t i nf i l a m e n t s m a i n l yd i s t r i b u t e sl e n g t h w a y si nt h ep e r i p h e r yo ft h ec e n t r a lc e l l ，a n dt h e yb e c o m et h i c k e ra n dd e n s e r a st h ee m b r y os a cb e c a m em a t u r e t h ea c t i nf i l a m e n t si nt h ec e n t r a lc e l lb e c o m ef r a g m e n t e da f t e r p o l l i n a t i o n ，i tb e c o m e sm o r ee v i d e n ta f t e rt h ep o l l e nt u b ee n t e r st h ee m b r y os a c ，t h ea c t i nf i l a m e n t s f r a g m e n ti n t om a n yd o t sa n dt h eq u a n t i t yo ft h ea c t i nf i l a m e n t so b v i o u s l yd e c r e a s e a f t e rt h ep o l l e n t u b ed i s c h a r g e si t sc o n t e n t s ，af l u o r e s c e n ta c t i nr e g i o na p p e a r si nt h ec h a l a z a le n do ft h ed e g e n e r a t e d s y n e r g i d c o n c u r r e n t l y , a l la e t i nc o r o n aa l s oa p p e r sn e a rt h ed e g e n e r a t e ds y n e r g l d a f t e rf e r t i l i z a t i o n t h ec o r o n af a d e ，t h ea c t i nf i l a m e n t si nt h ee n d o s p e r m r e o r g a n i z ei n t oc l e a rn e t w o r k t h ef - a c t i ni nt h e d e g e n e r a t e ds y n e r g i ds p r e a d sa n df o r m san e wa c t i nc o r o l l a w h e ne n d o s p e r mn u c l e u sa l em o v i n gt o t h ec h a l a z a lp a r to ft h ee m b r y os a c ，t h ea c t i nf i l a m e n t si nt h ee n d o s p e r ma r e r e o r g a n i z i n g ；t h e e n d o s p e r mn u c l e u sa r es u r r o u n d e db yd e n s ea c t i nf i l a m e n t sa n dt h e r ea ms o m el o n ga c t i nf i l a m e n t s c o n n e c lt h ee n d o s p e r mn u c l e u sa n dt h ec h a l a z a lp a r to ft h ee m b r y os a c t h ea c t i nc y t e s k e l e t o ni nt h e e g gc e l lc h a n g e sg r e a t l ya f t e rp o l l i n a t i o n b e f o r ep o h i n a t i o nt h e r ea ml o t so fu l t r a s h o r ta c t i nb u n d l e s g a t h e ri nt h ec o r t e xo ft h ee g gc e l l a f t e rp o l l i n a t i o nt h ei n t e n s i t yo ff - a c t i nf l u o r e s c e n c ed e c r e a s e s g r e a t l y , t h e r ea r eo n l yaf e wa c l h lf i l a m e n t si nt h ec o r t e xo ft h ee g gc e l la n da c t i nc y t o s k e l e t o nm a i n l y o r g a n i z e si n t op a t c h e si nt h ec o r t e xo ft h ee g gc e l l l a b e l i n ga c t i nc y t o s k e l e t u nw i t hg f p - t a l i ni san e wt e c h n i q u ed e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s t h i s m e t h o dc a ns t u d yt h ea c t i nd y n a m i c si nl i v i n gc e l l sw i t h o u td o i n ga n yh a r mt ot h en o r m a ls h a p ea n d f u n c t i o no ft h ec e l l ，s oi ti sar a t h e rp e r f e c tm e t h o d s i n c et h e r ei sn oa n yr e p o r ta b o u to r g a ns p e c i f i c p r o m o t e r so ft o r e n i af o u r n i e r i ，w ec l o n e dt w op r o m o t e r sa c t l la n da t s e r k lw h i c hc a ne x p r e s s w e l li nt h ee m b r y os a co f a r a b i d o p s i s ，a n dc o n s t r u c t e dt h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sb yf u s i n gt h e m w i t ht h ec h i m e r i cg e n eg f p - t a l i n t h i sp r o v i d e sab a s i cw o r kf o rs t u d yt h ea c t i nd y n a m i c sa n d f u n c t i o n si nt h eh v l n ge m b r y os a c so ft o r e n i a f o u r n i e r id u r i n gd e v e l o p m e n ta n df e r t i l i z a t i o n k e y w o r d s ：a c t i nc y t o s k e l e t o n e m b r y os a c f e r t i l i z a t i o n t o r e n i a f o u r n i e r i j 】 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注靳致掰晦糖方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获掺攀囱_ 农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的尾惠对率研究所徽的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 匆君 时间： i 厂年钿加 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名彩 匆劳 互髟 时问： 矿年月加日 时间： 盯年月力日 中国农业大学硕士论文第一章文献综述 1 1 概述 第一章文献综述 微丝( m i c r o f i l a m e n t ) ，又称肌动蛋白纤维( a c t i nf i l a m e n t ) ，是指真核细胞中由肌动蛋白 ( a c t i n ) 组成，直径为7 r i m 的骨架纤维。肌动蛋白是真核生物细胞中普遍存在的种重要的 蛋白质，相对分子量为4 3 k d ，肌动蛋白单体外观呈哑铃状。从酵母到动物细胞的肌动蛋白的 主要结构部分是高度保守的，各种生物的氨基酸同源性高达7 0 1 0 0 ，尤其是结合其必要因 子和单体蛋白构成纤丝时相互之间的界面更为保守。在哺乳动物和鸟类细胞中至少已分离到 6 种肌动蛋白，4 种为a 肌动蛋白，另两种为b 肌动蛋白和y 肌动蛋白，见于所有肌肉细胞和 非肌肉细胞胞质中。不同类型的肌肉细胞的a 肌动蛋白分子一级结构仅相差4 6 个氨基酸残 基，p 肌动蛋白或y 肌动蛋白与横纹肌肌动蛋白相差约2 5 个氨基酸残基。显然这些肌动蛋白 基因是从同一个祖先基因进化而来。 微丝也具有极性，这是由于构成微丝的肌动蛋白单体具有极性，装配时呈头尾相接。微丝 在结构上的极性对行使其功能是必要的。肌动蛋白可以在体外装配成微丝，其结构与细胞中分 离的微丝相同，可以通过聚台一解聚纯化微丝。在体内，有些微丝是永久性的结构，如肌肉的 细丝及肠上皮细胞微绒毛中的轴心微丝等；有些是暂时性的结构，如胞质分裂环中的微丝。在 大多数非肌细胞中，微丝是一种动态结构，持续进行装配和解聚。微丝的组装与解聚与细胞的 许多功能活动相关，如维持细胞形状、参与细胞分裂、细胞及细胞器的运动定位、胞质流动和 顶端生长等( 徐是雄，1 9 9 6 ) 。近年来的研究表明，微丝骨架参与细胞信号转导过程，它的动 态及功能受到细胞信号途径的调节。 1 2 微丝骨架调节花粉管的生长 对于开花植物来说对生殖的调控是一个非常关键的过程，其间涉及到花粉管和柱头间的一 系列复杂的相互作用。花粉落到柱头上后，开始吸水、萌发，然后在引导组织中定向生长带 着精细胞准确地进入胚珠的珠孔，进而完成受精。花粉管是顶端生长的细胞，而且现在已经清 楚地知道有功能的微丝骨架是花粉的萌发和花粉管的生长的先决条件。这一过程涉及到许多细 胞骨架的组分及与其相关的组分，如微丝结合蛋白。 目前的研究已经表明在生长的花粉管中有- - - + 主要的截然不同的f - a c t j n 区域( m i l l e r e t 口，。 1 9 9 6 ；k o s te t a l ，1 9 9 8 ；g i b b o ne t a l ，1 9 9 9 ；g e i t m a n ne t a l ，2 0 0 0 ；f u e t a l ，2 0 0 1 ) 。在极顶端区域缺少 大的f - a c t i n 这一现象是非常明显的，这一区域经常被称作为“肌动蛋白自由带”( a c t mf r e e z e ) 。 而亚顶端是一个包含着高度动态的f - a c t i n 的区域，有时被称为“肌动蛋白短束”( s a b ) ( f ue t 口f ， 2 0 0 1 ) 。在近顶端区域存在着i 扫f - a c t i n 组成的密集网，它们常常是以环形、项圈或者篮子状捧列。 用g f p - t a l i n 标记活的花粉管细胞中的微丝，其成像显示这两个区域包含着大量的动态的肌动蛋白 纤丝，它们随着花耢管的生长表现出与之相对应的空间上的短暂的振荡f f ue t 口，2 0 0 1 ) ，在这一 区域的下方，存在着更长更稳定的f - a c t i n ，它们充满着整个花粉管的细胞质。这些微丝束通常是 中国农业大学硕士论文 第一章文献综述 以径向或者螺旋状存在于花粉管中。 通过几项药理学方面的研究已经表明，花粉管中的不同的f - a c t i n 可能起着独立的功能，在 某些情况下起着重叠的功能。f - a c t i n 被认为在依赖于肌球蛋白的细胞器的运送中提供一个充当“轨 道”( t r a c k ) 的细胞骨架，从而使细胞质环流将分泌小泡运输到生长的花粉管的顶端( h e p l e r e t a l ， 2 0 0 1 ) 。目前已经证明在花粉管顶端区域的s a b f a c t i n 纤丝在控制花粉管生长的过程中起决定性 作用。此外，肌动蛋白聚合的状态在这一过程中也起着关键性作用( g i b b o ne t a l ，1 9 9 9 ；f ue t a 1 ，2 0 0 1 ；v i d a l ie t a l ，2 0 0 1 ) 。非常值得一提的是，经过低水平的肌动蛋白解聚剂处理后花粉管的 顶端生长受到抑制，而细胞质环流则基本上未受影响( g i b b o ne t 口l ，1 9 9 9 ；v i d a l ie la 1 ，2 0 0 1 ) 。肌动 蛋白的聚合在花粉管的顶端生长中是必需的，即使是对这一过程的非常小的破坏也可以导致顶端 生长受到比较强烈的抑制，对花粉管中的f - a c t i n 水平的直接量化支持这一观点( g i b b o ne t a l ， 1 9 9 9 ) 。 1 3 微丝骨架在根毛伸长中的功能 根毛是高度延伸的垂赢突出根表面的表皮细胞。根毛的主要功能是从土壤中吸收水分和营 养物质。根毛的生长分为两个阶段：先是在分化着的根表皮细胞上形成一个突出的部分；然后 这个突出的部分延伸成根毛。最近研究表明根毛的延伸是依赖f a c t i n 的，在微丝解聚剂的存在 下，突出部分仍能正常形成，但会抑制突出部分的延伸。根毛生长的行为与花粉管极为类似， 也有胞质环流和c a 2 + 浓度梯度，微丝的解聚剂将抑制根毛的伸长( m i u e re ta 1 ，1 9 9 9 ；s t a i g e re t a 1 ，1 9 9 4 ；v a l s t e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在根毛中，胞质环流好似被逆转的喷泉，粗的沿纵向分布的微丝 束穿过根毛液泡的周质，并分出很多细的微丝束延伸至胞质更为浓密的靠近顶端的区域，此区 域的微丝完全是纵向分布的聚合的微丝，顶部的微丝束不仅可将小泡运输到小泡富集的区域 而且还能作为顶端小泡分布的一个缓冲器和阻止其他器官进入顶端的一个筛子，根毛顶端生长 需要一个晟小量的成柬的微丝( d e r u i j t e r e t a l ，1 9 9 9 ) 。 1 4 微丝骨架在细胞伸长中的作用 植物细胞的伸长依赖于聚合态微丝，t h i m a n n 等( 1 9 9 2 ) 的研究表明用细胞松弛素d ( ) 处理使微丝解聚后，燕麦胚芽鞘细胞的伸长降低了5 0 ，f - a c t i n 将细胞的伸长和调节与高等植 物形态建成的刺激联系起来，它们又同光敏素密切相关。例如胚芽鞘对生长素的反应和向重力 性在突变体“l 钠* y a n g ”中消失，这种现象与c d 处理的结果是一致的( w a n g e t a l ，1 9 9 8 ；w a l l e r e l a l ，2 0 0 0 ) 。b a l u s k a 等( 2 0 0 1 ) 的研究进一步证明了细胞的伸长是依赖于f - a c t i n 的。拟南芥种子 的萌发到胚后期的生长一直置于含l a t - b 的培养基中，结果幼苗的形态建成是正常的，但幼苗 表现出极为明显的矮化型，下胚轴和叶柄都比对照短，同时下胚轴略微膨大，在黑暗中，予叶 有一定的生长。以上表型与许多矮型的突变体的表型是相似的。l a t b 的处理使拟南芥表现出 了明显的矮化性状，主要是抑制细胞伸长的结果，经测定发现下胚轴细胞比对照下降了8 0 ( s a l c h e r te ta 1 ，1 9 9 8 ：c h e n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 关于植物细胞伸长是依赖于f - a c t i n 的机制，现在有如下推测：高尔基体囊泡的产生、运 2 输，及外排过程是依赖于f - a c t i n 的；另外，基于植物细胞中微丝骨架能调控离子通道的活性 ( s a a n g e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 5 保卫细胞中的微丝骨架 植物可以通过叶子表面的气孔进行气体交换，气孔的开闭会影响植物的蒸腾、光合、呼吸等 生理过程。保卫细胞内存在着复杂的信号转导网络，这复杂的信号网络是通过甥b 些信号组分联系 在一起的还是一个未解的谜微丝骨架可能是一个候选组分它参与了保卫细胞的多种信号转 导 1 9 9 0 年，c h o 和w i c k 首次在发育的保卫细胞中观察了微丝的分布，他们发现在哑铃型的 保卫细胞的胞质区域有大量的沿细胞长轴分布的微丝，在靠近质膜的周质区域也观察到了网状 的微丝骨架，自此随着微丝骨架标记方法的日渐成熟，人们又在蚕豆( k i me ta 1 ，1 9 9 5 ) ，鸭趾 草f c l e a r e t n f ，1 9 9 8 ) ，拟南芥( k o s t e t a l ，1 9 9 8 ) ，蓝猪耳( 齐一伯等，2 0 0 4 ) 等高等植物的保卫 细胞中观察到了微丝骨架的存在。在不同信号分子的作用下，保卫细胞中的微丝骨架的结构是 不同的。a b a 处理气孔3 m i q 后，就会引起保卫细胞微丝骨架的解聚，随着气孔开度的下降， 保卫细胞微丝骨架解聚程度加剧，当气孔达到关闭的状态时保卫细胞中的微丝骨架又重新聚 合。c a 2 + 对微丝骨架的影响与a b a 作用是相似的( h w a n g e t a l ，2 0 0 1 ) ，黑暗诱导气孔关闭时也 能诱导保卫细胞微丝骨架的解聚( k i me ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 在诱导气孔开放的因子的作用下，同样作为诱导气孔开放的因子却对微丝的结构有着不同 的影响。f c 是一种真菌毒素它能明显的促进气孔开放，也能促进保卫细胞微丝骨架的解聚( e u n e ta 1 。2 0 0 0 ) ，低渗溶液的处理能促进保卫细胞体积的增大和气孔的开放，也能诱导保卫细胞微 丝骨架的解聚( l i ue t a l ，1 9 9 8 ) ；但在光照和高的湿度诱导的气孔开放时，保卫细胞的微丝骨架 却呈聚合态分布( e u n “a 1 ，1 9 9 7 ) ，这种分布与微丝骨架解聚剂能明显的促进光照诱导的气孔 开放，微丝骨架稳定剂能极大的抑制光照诱导的气孔开放的药理学实验结果是相矛盾的。因此 对于诱导气孔开放的因子的作用下保卫细胞微丝骨架的结构还有待于进一步的研究。 微丝骨架能迅速的响应各种因子而发生聚合和解聚的动态变化，说明细胞微丝骨架可能是作 为一种信号分子的调节物而存在，微丝拮抗剂都能影响气孔的运动，进一步证实了上述推测。细 胞松弛素d ( c d ) 能完全解聚微丝骨架，鬼笔环肽( p h a l l i o d i n ) 能促进微丝骨架的聚合并能抑制 微丝骨架的解聚，即使在诱导微丝骨架解聚的因子如a b a 等的作用下。c d 能促进白光、自然光 周期、1 a a 等诱导的气孔开放，也能促进a b a 诱导的气孔关闭，即便气孑l 处于不易关闭的环境下， 如介质中c 0 2 浓度较低和k + 浓度较高时；而p h a l l i o d i n 的作用却完全相反，它能抑制白光和自然光 周期下气孔的开放，也能抑伟i j a b a 诱导的气孔关闭，甚至能延缓f c 诱导的气孔开放( e u n 甜 a 1 ，1 9 9 7 ；h u a n g 甜a 1 ，2 0 0 0 ；黄荣峰等，1 9 9 7 ) 。因此推测在气孔启闭运动中，保卫细胞微丝骨架 聚合和解聚的动态变化参与了气孔运动的调控，而不是气孔运动的结果不同刺激诱导气孔开放 时，微丝骨架有聚合和解聚两种不同的结构，这进一步证实微丝骨架参与了气孔运动的调控微 丝骨架的解聚能促进气孔的运动，无论是开放还是关闭，而聚合态的微丝只能抑制气孔的运动 微丝骨架动态变化位于气孔运动的上游，是气孔快速应答各种刺激的一个调节因子。 3 1 。6 胚囊中的微丝骨架及其在发育和受精过程中的作用 1 6 1 胚囊的微丝骨架 被子植物成熟胚囊的形成及以后的受精和胚胎发育都涉及到核的分裂和移动、细胞壁的形 成和许多细胞质内含物的重组。已知细胞骨架在其他形态发生中参与了这些过程( d e r k s e n 以 口，1 9 9 0 ) ，因此它在胚囊发育中也必定起重要的作用。在植物细胞中微管参与建立和维持细 胞极性，如细胞分裂、细胞器移动、核的定位和固定、核分裂、细胞形状的决定和细胞壁的形 成( d e r k s e ne t a l ，1 9 9 0 ) 。而胚囊中的微管和微丝可能与细胞器的移动和营养的运输有关。在 蓝猪耳胚囊的珠孔端发现有大量的微丝分布，它们的组成也像帽状。有意义的是，这个帽状的 微丝结构在开花前2 d 出现，而在花粉管进入到胚囊时消失。因此推测丝状器附近的这些微丝可 能与分泌和花粉管进入有关( f ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。另一方面对活体的烟草中央细胞的观察，发 现了细胞器沿着细胞质索很活跃的移动，显示了与细胞骨架有关。 微丝作为细胞骨架的结构成分是主要产生动力的成分，它在细胞质流的产生，细胞的生长， 细胞器的移动和细胞板的形成中起着重要的作用( s t a i g e ra n ds c l d w a ，1 9 8 7 ) 。微丝在胚囊发育 中的行为和作用报道很少。在拟南芥中，雌性生殖细胞中的微丝可能参与细胞质的活动，包括 细胞器的定位。在助细胞、合子及二核的胚囊中都有纵向分布的微丝，这些微丝可能对细胞质 环流有重要作用。f - a c t i n 在二核和四核胚囊的两极的积累，推测对纲胞形状有影响。核周的微 丝有助于核的移动( w e b ba n dg u n n i n g ，1 9 9 4 ) 。 1 6 2 雌性生殖单位的微丝骨架在受精过程中的动态变化 在受精过程中雌性生殖细胞的细胞骨架发生很大的变化，这些变化在一些双子叶和单子叶 植物，包括自花丹 加l r a l5 mk a cf 冰上放置2 0 r a i n ) ( 5 ) 4 0 0 0 r p m ( 尖底甩平离心管) 离心2 5 m i l l ( 6 ) 取上清( 用纱布过滤) ( 7 ) 加4 r a l 异丙醇混匀，室温放置2 0 r a i n ，4 0 0 0 r p m 离心2 0 r a i n ( 8 ) 弃上清，收集沉淀。 ( 9 ) 加入0 7 m l 灭菌水溶解d n a ( 1 0 ) 加入7 0 q u l 酚仿( 酚：氯仿：异戊醇= 2 5 ；2 4 ：1 ) ，抽提一次。 ( 1 1 ) 吸上清，再加入等体积的氯仿( 氯仿：异戊醇= 2 4 ：1 ) 抽提一次。 ( 1 2 ) 加等体积的异丙醇，混匀，沉淀3 0 m i n 。1 2 0 0 0 9 离心1 5 r a i n 。 ( 1 3 ) 弃上清，加7 5 乙醇洗涤一次，超静台吹干。 ( 1 4 ) 加入5 0 一1 0 0 1 水溶解，再加入1 _ l i r n a s e a3 7 保温3 0 r a i n 。 ( 1 5 ) 取少许d n a ，琼脂糖电泳检测提取情况，其余d n a 样品保存在2 0 备用。 3 3 4p c r 方法 在2 0 蛳l 薄壁管中依次加入以下成分： d n r p ( 1 0 m m o l , l ) 1 蛆 l o b u f f e r5 l t l 引物1 ( 1 0 u m ) 2 0 1 x l 引物2 ( 1 0 u m ) 2 0 p - 1 模板d n a ( 拟南芥基因组d n a ) 2 0 v - 1 p f up o l y m e r a s e 0 5 v q 灭菌双蒸水u pt o5 0 蛆 将各种成分混匀后进行p c r ，p c r 反应程序根据片段大小而定。 3 3 5p c r 产物的回收及酶切 将8 管p c r 产物( 每管5 哳1 ) 合到一起，用等体积的苯酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 混合液抽提后，再加入1 1 0 体积的n a a c ( 3 m ) ，2 倍体积的无水乙醇沉淀；沉淀最终溶于7 q u l 水中。将回收到的p c r 产物进行双酶切，体系如下： 回收的p c r 产物 b u 恐r b s a 酶1 酶2 3 5 “l 5 埘 5 儿l 2 0 1 2 儿l 3 7 过夜酶切。 3 3 6k l e n o w 大片段补平 在构建爿塔嘲：g f p - t a l i n 植物表达载体时，需要先进行h i n d m 单酶切，再用l d e n o w 大 片段补平，体系如下： 1 0 x b u f f e r5 l o n t r ( 2 s m i ) 2 e l l 酶切后的质粒d n a1 5 # l k l e n o wf r a g m e n t1 雎l 灭菌双蒸水u pt o5 0 1 x l 3 t c 保温1 b ，再6 5 c 加热5 m i n 终止反应。 中国农业大学硕士论文第三章拟南芥胚囊表达启动子的克隆及表达载体的构建 3 3 7 表达载体向农杆菌中的转化 接根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 于3 m l 的y e b 液体培养基( 含1 2 5 m g l s m ) 中，2 8 c 摇培过夜。 将3 m l 过夜培养物加入到1 0 0 m 的y e b 液体培养基中，2 8 c 摇培至o d 6 0 0 为o 5 ，5 0 0 0 r p m 离 心5 分钟。加1 0 m l0 1 5 m o l l 的n a c i 溶液重悬农杆菌细胞，s 0 0 0 w m 离心5 分钟。加l m l 预 冷的2 0 m m c a c l 2 重悬细胞，按2 0 0 , 1 分装。取一管，加入l u g 纯化好的表达载体质粒d n a ， 冰浴3 0 分钟。液氮中速冻1 分钟，3 7 c 热击5 分钟，然后加入l m l y e b 培养基2 8 缓慢摇动 4 小时。1 0 0 0 r p m 离心3 0 秒。吸弃上清，加入1 0 q u l y e b 培养基重悬菌体，涂布于y e b ( 1 2 5 m g l s m + 1 0 0 m g l k a n ) 圃体培养基上。2 8 暗培养4 8 小时。 挑取单苗落接种于含1 2 5 m g l s m ，1 0 0 m g l k a n 的3 m i y e b 液体培养基中，2 8 ( 2 摇培过夜， 将菌液准备用于进行p c r 鉴定。 3 3 8 农杆菌阳性克隆的p e r 鉴定 在2 5 , 1 反应体系中以0 s u l 的农杆菌液( 0 d 为0 5 左右) 为模板，分别加入1 0 z l 正向引 物、1 毗l 负向引物、0 5 # 1 d n t p ( 1 0 r e t o o l l ) 、2 5 , u 1 1 0 x b u f f e r 、0 5 , 1 t a q 酶( s o , 1 ) 、1 蛳l 水， 混匀后进行扩增反应。反应参数为：9 4 c 预变性5 m i n ；9 4 c 变性l m i n ，6 0 5 c 退火1 r a i n ，7 2 c 延伸3 r a i n ( 3 0 个循环) ；7 2 c 延伸1 0 m i n 。取8 a 制样，电泳检测。 3 4 实验结果 3 4 1a t s e r k l 和a c t l l 启动子的克隆： 3 4 1 1a t s e r k l 启动子的克隆 ( 1 ) 引物设计 根据参考文献( h e c h te ta l ，2 0 0 1 ) 中设计的引物，我们设计引物将这段2 2 k b p 左右的序 列全部克隆出来。在原上游引物的5 端上引入h i n d 位点( 阴影部分) ，在原下游引物的5 端上引入x b a l 位点( 阴影部分) ，以便于构建植物表达载体。 上游引物：5 a g ca a g c r ra t ga a aa t aa a ga g tc c at c ca c c a c at g g3 ， 下游引物：5 c g c t c t a t 3 a1 a a g t t t g t c a g a t r t c c a a g a t a c r a g g3 ， ( 2 ) p c r 扩增a t s e r k l 启动子 以拟南芥的基因组d n a 为模板，p c r 反应条件如下： 9 4 预变性5 m i n ； 9 4 变性l m i n ， 6 0 退火l m i n ， 7 2 延伸3 。4 0 ”( 3 0 个循环) 7 2 延伸1 0 r a i n p c r 产物经1 琼脂糖凝胶电泳分离，如图3 3 中的条带2 。 2 2 3 4 1 2a c t l l 启动子的克隆 ( 1 ) 引物设计 根据a c t l l 基因在拟南芥染色体上的位置( a t 3 9 1 2 1 1 0 ) 及参考文献( h u a n g ，1 9 9 7 ) 中设 计的引物，我们设计引物将这段全长约2 5 k b p 的序列全部克隆出来。在下游引物的5 引入 b a m h l 位点( 阴影部分) ，以便于构建植物表达载体。 上游引物：5 g c ga a g c 兀t g a i g a o g t g c 从g c a a a c g g3 下游引物：5 c cg g a t c ca c c t t a a c c a q t c c g g i t c c a t t g3 ( 2 ) a c t i j 启动子的p c r 扩增 以拟南芥基因组d n a 为模板，反应条件如下： 9 4 c 预变性5 r a i n ： 9 4 变性l m i n ， 6 0 退火l m i n 。 7 2 延伸4 m i n ( 3 0 个循环) 7 2 延伸l o m i n p c r 产物经1 琼脂糖凝胶电泳分离，如图3 - 3 中的条带3 。 3 4 2 表达载体的构建 3 4 。2 1a t s e r k i ：g f p - t a 妇表达载体的构建 p b l l 2 1 质粒是一个带有g f p - - t a l i n 嵌合基因的植物表达载体，驱动g f p - - t a l i n 表达 的是c a m v 3 5 s 组成型表达启动子，质粒图谱( 见图2 - 1 ) 。由于在a t s e r k l 启动子序列中 含有h i n di l l 位点，不能直接用h i n di i 和x b a l 双酶切去除c a m v 3 5 s ，而是先用h i n di i i 酶 切，再用k l e n o w 大片断补平，然后用x b a l 酶切并回收大片段。在克隆a t s e r k l 启动子时， 下游引物引入x b a l 位点，对p c r 产物进行x b a l 单切并回收。然后将这两个只有一端为粘 末端的片断用t 4 d n a 连接酶连接即完成了a t s e r k l ：g f p - t a l i n 构建。将得到的a t s e r k i ： g f p - t a l i n 克隆测序，并用h i n di i i 酶切鉴定，得到了预期的一条1 9 k b p 左右的小片段( 见 图3 4 ) 。 图3 - 3 图中2 蔓j a t s e r k l 电泳条带，3y i a c t l l 电泳条带。 2 3 3 4 2 2a t s e r k l 一聃s 表达载体的构建 以质粒a t s e r k l ：g f p - - m l i n 为模板进行p c r ，设计引物时，在上游引物的5 端上引入 p s t i 位点，在下游引物的5 端上引入e o r l 位点。对p c r 产物用p s f l 和e c o r i 进行双酶切并回 收。对载体1 3 9 1 进行p s t l 和e c o r i 双酶切然后回收大片断。将回收得到的这两个片段连接， 即完成了a t s e r k l 一g i l s 植物表达载体的构建。对构建好的a t s e r k i - - g u s 分别用p s t i 、h i n di i i 双切鉴定，得到了预期的一条1 9 k b p 左右的小片段( 图3 - 5 ) 。 图3 4 圈中2 为a t s e r k l ：g f p t a l l n 用h i n di i i 酶切后的电溶条带。 图”图中2 为a c t l l 一g u s 用p s t l 和b a m h i 双切 后的电诛条带；国中3 为a t s e r i o - - g u s 用p s t i 和 h i n di i i 双切后的电泳条带。 3 4 2 2 a c t l l - - g u s 表达载体的构建 以拟南芥基因组d n a 做模板进行p c r ，设计引物时，在下游引物的5 端上引入b a m h l 位点。对p c r 产物用p s t l 和b a m h l 进行双酶切并回收。对载体1 3 9 1 进行p s t l 和b a m h l 双酶切， 然后回收大片断。将回收得到的这两个片段连接，即完成了a c r l l - - g u s 植物表达载体的构建。 对构建好的a c t l l g i l s 分别用p s t l 和b a m h l 双切鉴定，得到了预期的一条1 9 k b p 左右的小 片段( 图3 5 ) 。 3 4 2 3a c t l lfg f p - t a l i n 表达载体的构建 ( 1 ) 将g f p - t a l i n 序列导入空载体1 3 8 0 a 引物设计 根据已知的g f p - m l i n 序列( 1 4 0 0 b p 左右) 设计如下引物，并在上游引物和下游引物的5 端加上b a m h l 和h i n d i i i 的限制性酶切位点。 1 上访 引物：5