（蔬菜学专业论文）番茄果实SPS反义表达载体的构建及遗传转化的研究.pdf

缩略词 a b b r e v i a t i o n 缩略词英文全名 中文全名 越a c i di n v e r t a s e 酸性转化酶 c bc a r b e n i c i l l i n d e p c e d t a i a a i b a k a n n a a n i o d p c r r i f r p m s p s s s t e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t ia c i d i n d o l e 3 a c e t i ca c i d i n d o l e - 3 一b u t y r i ca c i d k a n a m y c i n n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d n e u t r a li n v e r t a s e n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i f a m p i c i n r i b o n u c l e a s e r o t a t i o np e rm i n u t e s u c r o s ep h o s p h a t es y n t h a s e s u c r o s es y n t h a s e 秭s e d t ab l 】仟e r 羧苄青霉素 焦碳酸二乙酯 乙二胺四乙酸 吲哚乙酸 吲哚丁酸 i i o h 卡那霉素 萘乙酸 中性转化酶 新霉素磷酸转移酶 光密度 聚合酶链式反应 利福平 核糖核酸 每分钟转速 蔗糖磷酸合成酶 蔗糖合成酶 t r i s e d t a 缓冲液 z t z e a t i n 玉米素 m 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔躲雪胗粑帅期：砂矿_ 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 指导教师亲笔签名：，= 轻q 田 日期：弦， 日期：w 毋i 护 福建农林大学硕士学位论文 摘要 本研究通过构建番茄蔗糖磷酸合成酶反义表达载体，用农杆菌介导法转化番茄植 株，得到的主要研究结果如下： 1 将保存在p m d l 8 t 载体上的番茄蔗糖磷酸合成酶基因c d n a 片段用h i n ci i 和x b a i 进行双酶切，酶切产物经1 0 琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒回收约8 3 0b p 的片段，即目的基因t s p s 。经h i n e i i 、x b a i 酶切得到目的基因t s p s 片段和经x b a i 、 s m a i 酶切得到的质粒p r o k 3 用t 4 d n a 连接酶连接后，用热激法转化大肠杆菌d h 5 a ，转化得到的阳性菌落经p c r 扩增和酶切鉴定，都得到大小约为8 3 0b p 的片段， 与目的片段大小吻合，说明番茄蔗糖磷酸合成酶基因片段t s p s 已反向连接到植物表 达载体p r o k 3 上，构建了反义表达载体a n t i t s p s 。 2 通过番茄遗传转化体系的优化试验，确定番茄自交系中杂9 号的最佳分化培 养基为m s + z t 2 0m g l ，最佳生根培养基为1 2m s + i b a0 5m g l 。再生苗经过培养室 内炼苗一周左右直接定植田间，可以充分保证其成活率。 3 利用农杆菌介导法转化番茄子叶，共获得1 3 5 株番茄再生植株。用c t a b 法 分组提取叶片d n a 进行p c r 检测，有两组扩增到目的条带，大小为8 3 0b p 。然后分 别对这两组单株提d n a 鉴定共得到2 株转化植株，对这两棵转化苗进行 p c r - s o u t h e mb l o t 分析，扩增到的目的片段均有杂交信号，说明a n t i t s p s 基因已 经整合到番茄植株中，排除了假阳性的可能，且在番茄植株中的转化率为1 4 。 4 通过对转基因番茄成熟期果实糖酸组分及s p s 酶活性的测定可以看出，转基因 番茄果实酶活性显著下降，糖酸组分含量都较对照偏低，说明反义s p s 基因对蔗糖 代谢及积累具有调控作用。 关键词：番茄；蔗糖磷酸合成酶基因：反义表达载体；遗传转化 番茄果实s is 反义表达载体的构建及遗传转化的研究 a b s t r a c t i nt h i sr e s e a r c ka n t i - t s p se x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e dt o t o m a t op l a n tv i aa g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，t h em a i nr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 t h ee x p e r i m e n t sd i g e s t e dt o m a t of r u i ts u c r o s ep h o s p h a t es y n t h a s eg e n ew h i c hw a s c l o n e dt op m d18 tv e c t o r 、析也d o u b l ee n z y m e sh i n ci ia n dx b a if r o m1 9k bl o n gt o 8 30 b pl o n g a n t i s e n s ee x p r e s s i o nv e c t o ro ft o m a t of r u i ts u c r o s ep h o s p h a t es y n t h a s eg e n e w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da f t e rl i n k i n gt h e8 3 0b pf r a g m e n ta n dp r o k 3v e c t o rw h i c h w a sd i g e s t e db yx b a ia n ds m a iu s i n gt 4 d n a l i g a s ee n z y m e s t h er e s u l ts h o w e dt h a t t s p ss u c c e s s f u l l yl i n k e dt op l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp r o k 3 2 t h ee x p e r i m e n tc o n c l u d e dt h a tt h eo p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o na n db u d d i f f e r e n t i a t i o nw a sm s + z t2 0m e d l + i a a0 5 m g l ，t h eo p t i m a lm e d i u mf o rr o o t i n d u c t i o na n ds o u n ds e e d l i n gw a g1 2m s + i b a0 5m g l ，t h eo p t i m a le x p l a n t sf o r t r a n s f o r m a t i o nw a sc o t y l e d o n i tw a st oa s s u r et h el i v e dr a t eo fr e g e n e r a t e dp l a n ta f t e r c u l t u r e da b o u t7d a y si nc u l t u r e dr o o ma n dt h e ng r o w e dt of i e l d 3 f o l l o w i n gr e g e n e r a t i o ns y s t e ma b o v e ，t o m a t oc o t y l e d o n sw e r et r a n s f o r m e dv i a a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o na n di3 5r e g e n e r a t i o nt o m a t op l a n t sw e r eo b t a i n e d d i s t i l l i n gt o m a t ol e a v e sd n ag r o u p i n gb yc t a bm e t h o da n du s i n gp c ra n a l y s i s ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt w og r o u p sh a d8 3 0b pl i n e s t h e nd i s t i l l i n gd n af r o mi d e n t i f i e d g r o u p ss e p a r a t e l y , t w oo ft h e mh a dt h ea i m e dl i n e s o u t h e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e t w op l a n t sh a db l o ts i g n a l i tw a ss a i dt h a ta n t i - t s p sg e n ew a si n t e g r a t e di n t ot o m a t o g e n o m ea n dt r a n s f o r m e dr a t ew a s1 4 4 t h ee x p e r i m e n t sa b o u ts p sa c t i v e ，s u g a ra n da c i dc o n t e n t si ng e n e t i ct o m a t os h o w e d d r a m a t i c a l l yl o w e rt h a nc k ，i ti n d i c a t e dt h a ts u c r o s em e t a b o l i z e da n da c c u m u l a t e dw e r e i n f l u e n c e db ya n t i t s p s k e yw o r d s ：t o m a t o ；s p sg e n e ；a n t i s e n s ee x p r e s s i o nv e c t o r , g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 2 福建农林大学硕士学位论文 、前言 1 果实中糖的积累与糖代谢酶的研究 蔗糖是高等植物光合作用的主要产物，碳运输的主要形式，“厍”代谢的主要基 质。蔗糖也是许多果实中糖积累的主要形式，果实品质形成的重要因子。与蔗糖代谢 和积累密切相关的酶主要有转化酶( i n v e r t a s e ，- - f r u c t o s i d a s e ，i n v ) 、蔗糖磷酸合成 酶( s u c r o s ep h o s p h a t es y n t h a s e ，s p s ) 和蔗糖合成酶( s u c r o s es y n t h a s e ，s s ) ，这三种 酶在糖代谢中分别催化下列反应： f r u t o 辩辱p 十u d p - g s p s s u c r o s e 6 - p + u d p s u c r o s e + u d p _ u d p - g + f r u c _ l ：o _ s e s u c r o s e 手h ：o 立qg i u c o 繇+ f r u c t o s e 转化酶( i v r ) 为分解蔗糖的酶，根据其最适蝉值，分为酸性转化酶( a c i di n v e r t a s e ， 越) 、中性或碱性转化酶( n e u t r a li n v e r t a s e ，n i ) ，a i 的最适p h 值在3 o 5 0 ，可分为 可溶性的和不溶性的或细胞壁束缚的两种，前者分布在液泡中或细胞自由空间，后者 存在于细胞间隙并结合在细胞壁上d - 2 1 。m 的最适p h 值在7 0 左右，大多认为是一 种胞质酶，也可分为可溶性的和不溶性的两种，前者分布于细胞质中，后者存在于细 胞壁上d - - s 1 。蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 是一种可溶性酶，活性最适p h 值约为7 0 ，存在于 细胞质中。蔗糖合成酶( s s ) 是一种存在于细胞质中的可溶性酶，有些不溶性的附 着在细胞膜上，蔗糖合成方向最适p h 值在8 0 - 9 5 ，蔗糖裂解方向最适p h 值在 5 5 “5 。 果实内糖的积累和组成受s p s 、i n v 和s s 三种酶的调控。番茄果实糖代谢的主 要特征包括四个紧密联系的耗能性循环嘲。第一个循环是细胞质中蔗糖快速、持续的 降解和再合成。第二个循环是蔗糖在液泡中的水解，受酸性转化酶调控，大部分的己 糖被隔离到液泡中，但也有一些被重新用于合成细胞质中的蔗糖。这两个相反的反应 形成了第二个循环，其功能是提高在这两个区域中糖的储存效率，同时也证明了酸性 转化酶的生理功能是促进己糖的形成。第三个循环是质外体中卸载的蔗糖被质外体转 化酶水解。第四个循环是淀粉在造粉体中的持续迅速合成和降解。总之，在这四个循 环中蔗糖和己糖的交互转变控制着果实中糖的含量和组成。研究嫁接西瓜果实发育过 程中蔗糖代谢及相关酶调控的研究表明，在果实发育过程中，嫁接西瓜幼果组织转化 酶( i n v ) 活性降低，蔗糖合酶( s s ) 活性上升，从而导致果实中蔗糖含量的降低。 因此，嫁接引起的西瓜果实中i n v 、s s 活性的变化可能是导致嫁接西瓜糖分变化的 主要原因。刘慧英等 7 1 人在研究砧木对小型早熟西瓜果实糖代谢及相关酶活性的影 响，试验中发现，4 种嫁接西瓜果实发育早期，果实中以分解酶类为主，糖分积累低； 3 番茄果实s p s 反义表达载体的构建及遗传转化的研究 发育后期以合成酶类为主，糖分积累多。m c c o l l u m 等【8 】研究甜瓜果实发育中的糖积 累与酶活性变化发现，果实发育前期，即花后2 4 天左右，果糖和葡萄糖是主要的成 分，可溶性酸性转化酶( s a d 的活性一直很高。开花2 4 天后蔗糖开始积累，在成 熟果实中成为糖的主要的存在形式。同时伴随着s a i 的急剧下降，甚至在成熟果实 中几乎检测不到其活性。但蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 活性逐渐提高。如下图所示： f i n v e r t a 既卜黜 矿玎 s u c r 0 2 e - 6 - p s p s s t a c h y os e h 2 0 h 2 0 a t p a d p s e r g e 对番茄研究表明：番茄果实蔗糖的积累与酸性转化酶的大幅度下降是紧密 相关的，而与蔗糖合成酶的关系不大。对转化酶的免疫生物学检测证明，在积累蔗糖 果实中低水平的转化酶是归因于转化酶蛋白含量低而不是存在转化酶抑制作用蔗糖 积累型番茄和己糖积累型番茄在3 种酶组成上唯一明显的区别是前者缺乏舭活性。 4 福建农林大学硕士学位论文 王永章等【9 】对红富士苹果果实生长发育过程中的糖积累和糖代谢相关酶活性的变 化规律表明：发育前期，可溶性酸性转化酶和细胞壁结合酸性转化酶活性与此阶段果 实中可溶性糖的积累量成显著的负相关；发育后期，蔗糖合成酶与蔗糖的积累水平成 显著的正相关【协1 1 】。由此认为，红富士苹果果实中蔗糖代谢可能主要受酸性转化酶和 蔗糖合成酶的调控。m o r i g u c h i 等在梨中发现，高蔗糖品种的日本梨c h o j u r o 比 低蔗糖品种的中国梨( 鸭梨) 具有更高的s s 和s p s 活性，c h o j u r o 成熟期间蔗糖 积累与s s 和s p s 活性增加同时发生，而中国梨( 鸭梨) 中s s 和s p s 活性在成熟期 间没有增加，酸性i v r 活性则随成熟而下降【l 引。桃的蔗糖水解酶活性( 不溶性酸性 r 、可溶性酸性w r 、中性r 和s s ) 在幼果期较高，随着果实的发育蔗糖开始 积累而迅速下降，糖的贮存并不伴随着s s 和s p s 的升高。因此桃中蔗糖至少部分是 直接由运输进入的【1 3 - 1 5 1 。d a r n e l l 等在越橘果实中发现可溶性酸w r 活性与果实蔗糖 浓度呈负相关，果实内蔗糖浓度与s s 、s p s 没有明显的相关性l l 引。林德波等【1 7 】研究 不同基因型的甘蔗叶片的结果表明，叶片中酸性磷酸酶以及中性转化酶活性与甘蔗蔗 糖含糖量的高低呈显著正相关，酸性转化酶活性则与此相反。多元回归分析进一步证 实蔗糖分高低与前期酸性磷酸酶、淀粉酶、转化酶活性关系密切，而成熟期除了酸性 磷酸酶起主要作用外，转化酶是影响甘蔗蔗糖分的关键酶。王惠聪等【l8 】研究荔枝果 实发现，不同的糖代谢酶活性决定了糖组分的不同，积累蔗糖为主的品种具有高的 s s 和s p s 活性，而转化酶活性低；以积累还原糖为主的品种的s s 和s p s 活性较低， 而转化酶活性较高。大量研究表明：甜瓜含糖量的高低主要决定于果实发育后期蔗糖 磷酸合成酶活性的提高程度和酸性转化酶活性的下降幅度u 9 - 2 0 。这主要是由于这两种 酶在蔗糖代谢中的作用决定的，幼果期s s 、i v r 蔗糖分解酶活性较高具有重要的生理 意义。因为，幼果期处于细胞分裂、分化高峰期，需要构建各种细胞器，细胞壁和细 胞质成分。高的蔗糖分解酶活力有利于将输入的蔗糖迅速分解生成单糖和u d p g 供 合成淀粉、纤维素、半纤维素和各种细胞成分，以及供呼吸消耗，为旺盛的生理活动 提供能量，而果实成熟期蔗糖分解酶活力降低有利于果实积累蔗糖。 2根癌农杆菌介导的转化机理 植物基因的遗传转化是指将外源d n a 通过载体、媒体或其他物理、化学方法导 入植物细胞并得到整合和表达的过程。实现这一转化的途径称之为转化系统。外源 d n a 通过载体介导实现其转化的系统称之为基因载体转化系统。目前已经建立了十 余种基因转化方法，按转化系统的原理进行分类，可以分为三大转化系统类型：( 1 ) 以质粒d n a 等为载体的转化系统。( 2 ) 不用任何载体，通过物理化学方法直接将外源 基因导入受体细胞的直接转化系统。( 3 ) 以植物自身的生殖系统种质细胞，如花粉粒 或其它细胞等为媒体的转化系统。目前，番茄的转基因技术主要采用根癌农杆菌介导 的转化方法。该方法具有操作方便、费用低廉、可插入外源基因片段大、不易发生重 排、拷贝数低且符合孟德尔遗传规律等优点陋圳。 5 番茄果实s p s 反义表达载体的构建及遗传转化的研究 2 1根癌农杆菌介导的基本原理 自2 0 世纪7 0 年代末提出农杆菌属介导产生转基因植物以来，已相继有很多农作物 和园艺植物被农杆菌成功转化，在一些发达国家已有大量种植的转基因经济作物如玉 米、小麦、大豆、棉花、马铃薯、番茄等。从1 9 8 6 年m c c o r m i c k 等汹1 人首次报道获得 番茄转基因完整植株以来，番茄遗传转化得到了不断发展。1 9 9 4 年世界上第一例商品化 生产的转基因作物一一转基因延熟番茄f 1 a v r - - s a v r w i 南美国c 2 l l g e n e 公司培育成功并获 准进入市场。目前在植物遗传转化中应用的主要是根癌农杆菌，1 9 9 0 年，s c h a e w e n 等 首次将酵母转化酶基因s u c 2 正义拷贝导入烟草和拟南芥获得转基因植株，随后许多人也 从事类似的研究。 农杆菌共培养法最早是由m a r t o n 等以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改 进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用t 王质粒系统，将农杆菌与植 物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、茎段等共同培养的一种转化方法。具体的方法如下： 合适外植体的选择( 子叶或下胚轴等) 及再生系统的建立 i ( 抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择) i 叶盘预培养( 2 天、非必须) l 农杆菌侵染( 2 0m i n 左右) l 共培养( 2 3 天) 推迟筛选或筛选( 培养基中加入抑菌抗生素和选择抗生素) l 愈伤组织及不定芽的形成 l 诱导生根 l 试管苗的驯化移栽 l 分子生物学检测 l 转基因植株的获得 利用农杆菌进行细胞转化的优点在于，农杆菌在双子叶植物中有较广的宿主范 围：可以精确的把两个边界序列之间的d n a 导入植物细胞，并且导入的基因在大多 6 福建农林大学硕士学位论文 数情况下是单拷贝整合到植物细胞核的基因组中，从而遗传给后代；利用面质粒转 化基因时，允许插入t - d n a 中的外源基因片段较大，可达5 0k b 。缺点是用现有的转 化方法，大多数的单子叶植物上还很难获得植株，而且还受菌株特异性、宿主基因型 特异性等因素所制约。 2 2根癌农杆菌的结构特点及转移机理 一种土壤细菌，称为农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) ，它能诱导植物伤口形成 冠瘿瘤( c r o w n g a l l ) ，细菌的致瘤能力来源于细菌的一个额外染色体，即质粒( p l a s m i d ) ， 称t i 质粒。n 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状d n a 分子，约有2 0 0 - 一2 5 0k b 大小。在病原菌致病过程中，其中n 质粒上的一小段d n a 分子( 约为质粒d n a l 7 左右，2 5k b ) 能够插入到寄主细胞染色体d n a 上，他们把 这段能被整合到细胞d n a 中去的t i 质粒片段称为转d n a ( t r a n s f e r - d n a ，t - d n a ) 各种不同类型的t i 质粒都具有若干个不同区域：t o d n a 区、致病区( v i rr e g i o n ) 、质 粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点其中以t o d n a 区和致病区( v i r r e g i o n ) 在植物转化中最为重要。 t - d n a 是农杆菌侵染植物细胞时，从t i 质粒上导入植物细胞的一段d n a ，故称 之为转移d n a ( t o d n a ) 。t - d n a 两端各有一段2 5b p 的重复序列( 分别称为左边界 序列l b 和右边界序列r b ) 。1 - d n a 携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有 关的基因。t - d n a 的右端序列对t - d n a 转移到植物细胞内具有重要意义。保留t - d n a 两端的末端序列，然后用一段外源d n a 插入或直接取代野生型t - d n a 的部分基因 可以使植物细胞的致瘤基因除去，从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力。设计出 具有非致瘤性的所谓卸甲载体( d i s a r m e dv e c t o r ) ，把我们所需的外源目的基因引入这 种载体，就可以较容易地得到这种目的基因的完整转基因植株1 2 7 j 。 v k 区段上的基因与t - d n a 从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基 因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区，又叫致病区。v t r 区段总长度大约3 5 k b ，由7 个互补群组成，分别命名为h r a 、h r b 、v i r c 、v i r d 、v i r e 、v i r g 和所厦 致病区中各个位点的表达情况可以分为两种：一种是组成性表达，即在无植物诱导分 子存在下依然保持一定的表达水平；另一种是植物诱导性表达，即这些基因的表达必 须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表 达。 v i r a 是属于第一种情况的位点，班r b 、h r c ，h r d 和h r e 是属于第二种情况的 位点。研究发现，乙酰丁香酮及羟基乙酰丁香酮等可作为信号分子刺激t - d n a 的转 移。v t r 区中各个基因之间都是相互联系相互影响的，缺一不可。当v i r 基因与t - d n a 分别位于两个不同的复制子上时，即v i a 区与t - d n a 区分割开来以后，v i r 基因仍 然能够为t - d n a 提供转移功能( 这个特性对植物遗传转化非常重要) 。 t o d n a 的转移与整合需要协基因( v i r a 、v i r b 、h r g 、v i r c 、v i r d 和v i r e ) 编码产 7 番茄果实5 ：船反义表达载体的构建及遗传转化的研究 物的参与。除了这些t i 质粒编码的基因之外，还已鉴定出一些位于根瘤土壤杆菌染 色体d n a 上的基因，同样也参与了t - d n a 转移作用。t i 质粒分子受到信号分子的 激活作用之后，v i r d 基因编码的一种核酸内切酶，先在t - d n a 的r b 序列中的第3 和第4 碱基之间切开一个单链缺口，随后在t - d n a 同一条链的l b 序列中切出第二 个单链缺口。于是t - d n a 便以单链形式释放出来，并在r b 序列的引导下定向地从 根瘤土壤杆菌细胞转移到寄主植物细胞。当单链的，t - d n a 转移到植物细胞之后，在 有关的植物细胞酶体系的催化作用下，便会合成出互补链形成双链形式的t - d n a 分 子。在_ 系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合是一种非正常重组。 2 3影响农杆菌介导植物遗传转化的因素 影响农杆菌介导植物遗传转化的因素主要有植物基因型、转化受体、是否预培养、 菌液浓度和侵染时间。 转化频率与植物基因型具有很大关系，即使在转化频率比较高的植物中( 如马铃薯、 烟草、拟南芥等) 也有很大的基因型依赖性。这主要是由于不同基因型对农杆菌的敏感 程度不同引起的，就象农杆菌对单子叶植物不能侵染或很难侵染一样。张赛群啪1 研究发 现不同品种间转化频率有很大差别，实验中品种a 5 7 的转化率高达1 1 7 0 ，而a 1 0 的转 化率仅为1 1 0 。 转化受体通常来自于植物的原生质体及外植体组织。外植体组织包括子叶、子叶柄、 下胚轴、茎段。大量的组织培养实验证明，外植体的再生能力与其基因型有着直接关系。 来源于植物的不同外植体及同一外植体的不同发育阶段对农杆菌的侵染具有不同的敏 感性。番茄的遗传转化中大多选用子叶、下胚轴，在不同实验体系中不同外植体组织的 再生频率不同。张建民实验发现，番茄的叶盘转化率不如茎段的转化率，实验中，后者是 前者的3 4 倍。在转化过程中，供试植物材料的位置和生理状态非常重要，为了提高转化 率应选幼嫩的无菌苗或再生植株为宜，这些再生植株以株高6 , - - 8c m 为宜。而王慧中嘲 用番茄下胚轴和子叶进行遗传转化时发现，子叶的转化率比下胚轴高，子叶的转化率为 3 5 2 4 ，下胚轴为3 3 6 7 。另外外植体的大小与同一外植体的不同培养方式对番茄的遗 传转化也有影响。贺竹梅等人发现番茄子叶片切割子叶所产生的外植体用作转化受体 最好，将该外植体与农杆菌侵染后采用垂直插入培养和平卧培养两种不同的放置方式， 结果垂直插入方式的切口变褐、收缩、无愈伤组织发生和芽分化的能力；而平卧培养方 式下，大部分切口仍保持新鲜，并有部分切口上开始产生愈伤组织。 关于外植体在转化前进行预培养的效果，许多研究结果不同。是否需要预培养、预 培养多长时间，要根据不同植物、不同外植体而确定m 删。有的植物如烟草，豇豆叶片， 不需预培养，预培养与未经预培养的转化率一样。番茄的叶片转化需2 d 预培养啪1 。张 赛群嘲实验发现，同一品种的番茄经过预培养后的转化再生频率比未经过预培养的高， 实验所用品种a 2 1 的外植体经预培养进行转化的平均再生频率为5 7 0 ，而对照的平均 8 福建农林大学硕士学位论文 再生频率为4 8 0 。 菌液浓度和侵染时间是影响转化效率的重要因素之一。菌液浓度对不同植物的外植 体而言有一定差异1 。对农杆菌敏感的植物，因其易产生过敏反应而导致外植体切口处 褐化，因此宜采用较低的o d 值和较短的浸泡时间。如果外植体在菌液中浸泡时间太长， 常因农杆菌毒害缺氧而软腐；而浸泡时间太短尚未接种到伤口面，在其培养时无农杆菌 生长，不能转化哪! 。关于侵染时间，不同的学者采用不同的侵染时间，从3 0s 到3 0m i n 都有，这可能因为品种问存在差异。张建民将子叶与农杆菌侵染时间仅为3 0s ，而张秀 海啪3 采用3 0m i n 的侵染，程英豪瞰1 等采用3m i n 的侵染，叶志彪等3 采用1 5m i n 。总之， 一般不超过3 0m i n ，掌握外植体在菌液中浸泡的时间，有助于减少后继培养中可能造成 的污染，并可减轻细菌对植物细胞的毒害作用。 3 s p s 的生物学功能及应用 3 1 s p s 的基本性质及生物学功能 s p s 在植物体的光合组织( 主要是叶片) 和非光合组织( 果实、贮藏块根、块茎等) 中广泛存在，是一种可溶性酶，它在植物体内的含量低，不到可溶性蛋白的0 1 ， 而且稳定性差。s p s 催化的化学反应过程是u d p g + f 6 一p ( 6 磷酸果糖) 一g 6 p ( 6 磷酸 葡萄糖) + u d p , g 6 p 通常是由磷酸蔗糖磷酸脂酶( s p p ) 迅速降解为蔗糖和磷酸根离 子，而s p s 和s p p 是以复合体的形式存在植物体内，因此s p s 催化蔗糖生成实际上 是不可逆的【3 6 - 3 7 1 。s p s 对催化底物u d p g 和f 6 p 的k m 值分别是3 0 和2 0m m o l l ， 其活性除了受g 6 p 和p i 的异构调节外，还受到光调节及渗透调节。s p s 可以被 g 6 p 、遮光处理、水分胁迫激活，而被p i 、光照、高水分抑带l j 3 8 - 3 9 】。 s p s 在1 9 5 5 年由l e l o i r 首次在小麦胚芽中检测到；1 9 5 9 年在萌发的小麦和1 9 6 9 年在水稻种子也发现其存在【4 0 4 1 1 。9 0 年代初在菠菜和玉米中纯化了s p s ，由分子量1 1 7 - - 1 3 8k d 的亚基构成，为二聚体或四聚体，存在于植物光合组织( 主要是叶片) 及非光合组织中( 果实、贮藏块根、块茎等) 。目前国内外研究者已经成功地将s p s 基 因从玉米、菠菜、甜菜、柑桔、苹果、甘蔗、水稻、甜瓜等作物中克隆出来。随着研 究材料范围的扩大和深入，发现在c 4 植物中s p s 几乎主要分布在叶肉细胞，维管柬 鞘细胞中的s p s 是叶片的5 3 5 。而c 3 植物由于其维管束鞘不如c 4 植物的发达， 且不含叶绿体，其周围的叶肉细胞排列疏松，所以s p s 全部分布在叶肉细胞内。近 几年来，s p s 一直是许多学者研究果实糖代谢、品质形成、光合产物代谢运输的热点， 不仅从植物生理生化方面得到系统的研究，而且在分子生物学领域也取得一定成就。 3 2s p s 在蔗糖代谢中的作用 糖是果实重要的品质指标之一，果实积累的糖分主要为果糖、葡萄糖、蔗糖， 9 番茄果实s i s 反义表达载体的构建及遗传转化的研究 它们是果实品质成分和风味物质如维生素、色素和芳香物质等合成的基础材料，而果 实品质在很大程度上取决于果实内所含糖的种类和数量【4 2 j 。s p s 在蔗糖积累型库组织 中具有非常重要的作用，许多果实成熟过程中蔗糖积累与s p s 活性的升高密切相关， 并且协同i v r 控制蔗糖长途运输与库组织蔗糖代谢 4 3 1 。 s p s 是合成蔗糖的关键酶之一，d o e h l e r t 和h u b e r 对大豆研究均表明，s p s 是 影响大豆叶片中蔗糖合成的关键酶，而李永庚等m j 也发现s p s 在小麦旗叶光合产物 向蔗糖的转化过程中也起关键性的调节作用。s p s 决定蔗糖的积累，对提高果实含糖 量起着重要作用【4 5 4 6 1 。研究表明，蔗糖代谢相关酶的综合作用即蔗糖代谢相关酶的净 活性是影响果实糖积累的重要因子之一【4 7 制j 。刚采收的果实具有较高的，n i 、s s 活性，随着果实进入软化后熟阶段，淀粉迅速水解，s p s 活性增加，蔗糖不断积累， 二者之间呈显著正相关【4 9 - 5 0 1 。类似的结果在桃子【5 l j 、柑橘【5 2 】研究中均有相同报道。 草莓、甜瓜、芒果、猕猴桃等果实发育过程中，蔗糖的合成积累与s p s 活性的升高 呈正相关【5 2 - 5 3 1 。在日本梨中，成熟过程中s p s 和s s 活性的上升引起蔗糖含量的增加， 但s p s 的作用小于s s 。 此外，高糖含量的日本梨品种c h o j u r o 比低糖含量的中国鸭梨具有更高的s p s 活性。在甜瓜【1 9 1 ，玉米【5 4 】等作物中也表现这个规律。在蔗糖积累型果实如温州蜜柑、 本地早等品种中，蔗糖积累与s p s 活性上升相平行，而可溶性酸性转化酶活力在蔗 搪快速积累后期接近零【5 5 】。香蕉采前果实蔗糖形成受s s 和s p s 共同控制，采后蔗糖 含量的增加和淀粉含量的降低是由s p s 调控的，蔗糖积累与s p s 呈高度正相关【5 酬。 成熟的普通番茄果实中蔗搪含量不超过1 5m m o l g ( f w ) ，其s p s 活性在整个果实发育 过程中都很低：而蔗糖积累型番茄成熟期果实蔗糖含量约为1 1 8m m o l g ( f w ，其s p s 活性在果实发育末期约为前期的8 倍垆7 。 3 3s p s 在果实成熟衰老过程中的作用 果实成熟是一个复杂的发育调控过程，伴随着许多生理生化变化，如呼吸上升、 乙烯合成、果实软化、色素转变、糖及芳香物质等风味因子的变化等，不仅直接影响 果实的食用品质，而且影响贮存寿命、商品价值印j 。不同糖积累型的果实成熟过程 的生理生化如呼吸跃迁、乙烯释放等不尽相同，淀粉转化型和中间类型的果实基本属 于呼吸跃变类型，在采收后熟过程中的一定阶段呼吸与乙烯释放速率显著上升，糖直 接积累型的果实多属于呼吸非跃变型，在成熟过程中呼吸与乙烯释放速率没有显著变 化。s p s 在不同类型的果实成熟衰老变化规律不同，其活性表现与呼吸速率、乙烯释 放量有密切关系。通过对淀粉转化型果实猕猴桃、香蕉的研究可以发现，香蕉采收后 在低氧环境中呼吸降低，糖积累减少，但不被乙烯逆转。蔗糖积累早于果糖和葡萄糖 积累，含糖量的提高与c 0 2 形成量高度相关，同时伴随着s p s 活性的急剧升高，此 时呼吸速率、乙烯释放量都表现较为明显的提高【5 引。猕猴桃果实成熟过程与香蕉表 现相似，s p s 活性的提高发生在蔗糖大量积累前，随着s p s 活性的提高蔗糖积累不 1 0 福建农林大学硕士学位论文 断增加，呼吸速率的提高出现在可溶性糖增加以前，两者不同步【5 5 9 1 。芒果果实成熟 过程中，随着淀粉降解的开始s p s 活性升高。另有研究证明，乙烯处理猕猴桃可以 促进果实淀粉酶活性的增加，加速淀粉降解和己糖积累，从而直接或间接增加s p s 活性，促使蔗糖积累。s p s 活性的变化，受己糖对它的激活和蔗糖对它的反馈抑制两 方面的影响。乙酰水杨酸( a s a ) 、乙烯、低温等外界因素对猕猴桃果实糖代谢的调节 主要是通过对s p s 活性的影响而实现的【叫j 。 果实成熟衰老的标志是果肉、果皮的软化，细胞的软化松弛主要是构成细胞壁的 主要成分纤维素结构及果肉糖分发生变化。s p s 参与细胞分化与纤维细胞壁合成，澳 大利亚棉花育种生产者在利用转基因技术改善纤维品质时发现，超表达的s p s 可增强 发育过程中纤维素的沉积，提高纤维质量和产量。m i c h e l l e 6 1 】认为s p s 在纤维沉淀 细胞合成时起重要作用。对棉花胚珠进行组培，隔一段时间进行s p s 活性和蔗糖含量 的测定，发现棉花纤维由初级细胞到次级细胞发育过程中，s p s 活性提高，伴随着纤 维合成的速率也提高。在进入次级细胞壁发育过程后，s p s 的活性也是一直增高。 h a i g l e r 等也发现含有融合基因的转基因棉花中，s p s 活性的提高使纤维次级细胞壁 沉淀量增加。香蕉果实采后软化和腐烂是影响贮藏寿命的主要因素，软化的主要原因 是果胶、半纤维素及淀粉的水解，果胶分解及淀粉降解，同时伴随着s p s 活性的升 高【6 2 】。2 0 采后猕猴桃果实软化启动阶段，淀粉酶活性快速上升，当进入快速软化 阶段，淀粉迅速水解，葡萄糖和果糖快速积累，s p s 活性增加，酸性转化酶活性下降， 蔗糖积累。果实软化后期，s p s 活性降低，蔗糖含量下降。s p s 在采后猕猴桃果实中 的糖代谢和果实软化过程中起着一个核心作用1 6 0 l 。因此，研究不同果实采后生理生 化变化及糖代谢关键酶的调节机制，为调控采后果实品质、贮藏环境因素等提供基本 的理论依据。 3 4关于s p s 的其它功能 s p s 影响源强和库强，h u b e r 旧3 曾指出s p s 活力越高，蔗糖积累得越多。s p s 活性 的高低代表了旗叶光合产物转化为蔗糖的能力“田。在甘蔗中( 世界上7 0 的糖来自甘 蔗) ，茎中蔗糖的含量依赖于s p s 的活力。s p s 调节光合产物在蔗糖和淀粉的分配， h u b e r 曾指出s p s 与淀粉积累呈现负相关，而与蔗糖形成呈正比关系，s p s 的活力大 小直接影响光合产物在淀粉与蔗糖之间的分配。h u b e r 嘲1 还指出s p s 在光合产物蔗糖 和淀粉的分配中起关键的调控作用。s p s 可提高瓜果的品质l e s t e r 等5 1 将高蔗糖积 累型和低蔗糖积累型的两个网纹甜瓜品种分别在春秋季栽培，发现不管是在春季还是 在秋季，在花后5 2 5d 内，两个品种的s p s 活性较低，没有或几乎没有蔗糖积累。 只有到了花后3 0d 后，s p s 的活性高，这时两个品种才有了蔗糖积累，可见s p s 对 蔗糖的积累发挥了重要作用晦3 删 番茄果实s p s 反义表达载体的构建及遗传转化的研究 4 关于标记基因的缺陷 标记基因被用于筛选转化细胞并不参与转化生物改良，由于常用的标记基因多是 一些对抗生素或除草剂有抗性的基因，他们的流动性或逃逸可能造成的抗药病原微生 物或杂草的出现，已经成为人们广泛关注和担忧的问题。研究标记基因的剔除已成为 转基因生物研究中的新课题，以便使转基因具有高效、可预测性，稳定性和安全性 随着转基因作物产品的商品化，人们对转基因植物的生物安全性也心存疑虑。目前转 基因技术效率较低，外源基因整合到植物基因组中的频率通常为千分之几至百万分之 几，因此目的基因的导入通常需串联易于识别的标记基因来选择，这种标记基因又称 为“选择标记 或“筛选标记。目前转基因过程中使用的“筛选标记力如g u s 、n p t i i 、a p hi v 和b a r 基因，这些“标记 大大提高了选择转化子的准确性，但也带来 ( 或潜伏) 一系列问题。 首先选择标记可能危及人身安全。1 9 9 7 年苏格兰r o w e t t 研究所( r r l ) 的 a r p a d p u s z t a i l 6 7 】宣布，转雪花莲凝聚素基因的马铃薯可延缓大鼠生长发育并破坏其免 疫系统。这些结果虽针对目的基因和非相关生物，但已引起人们对标记基因可能产生 的危害的关注。很多抗生素是人类控制疾病的重要武器，但如果作为转基因标记的抗 “抗生素 类基因若“漂流”转移到微生物( 特别是病原物) 中则会给人类带来巨大 的负作用。转基因植株中大多数标记基因可表达相应的酶或蛋白质，这种产物本身会 对人体产生何种影响尚无安全可靠的评价，参与植物生化系统中后究竟会导致何种次 级代谢产物、并对人体产生何种影响尚无研究，这对转基因食物的安全性带来很大的 影响。 其次选择标记可能影响基因的表达。筛选标记随目的基因导入后有可能影响目的 基因的表达，转基因过程中常发生选择标记表达而目的基因不表达的现象。虽尚无充 足证据证明外源基因的进入一定会打破原有基因秩序的合理性，但这的确是不应忽略 的问题。筛选标记的使用目前仅为准确地选择到转化子，转基因的目的是为把更多的 有用基因转进去，而不应让那些对植物生长发育无用的基因也带进去。大多数选择标 记都是通过药物筛选发挥作用，持续的药物筛选往往会引起基因的重排，导致被改造 生物的基因组发生变异。选择标记可能影响作物的某些性状，外源基因的插入会改变 受体基因组的正常状况。植物基因的表达要消耗其体内很多能量和原料，而选择标记 的表达必然在一定程度争夺能量和原料，从而影响其他基因的表达。选择标记的表达 产物多为蛋白质和酶类物质，既可改变植物产品的蛋白质构成，又影响植物生化合成 与代谢的酶系统进而导致更复杂的物质组成变化，这些都会影响植物的生长发育，并 造成许多不确定性。四是选择