（发育生物学专业论文）不同倍性鱼类血细胞研究.pdf

摘要 异源四倍体螂鲤是世界上首例人工培育的两性可育的四倍体鱼， 这为研究四 倍体动物的生物学 特性提供了良 好的实验材料， 本文对异 源四倍体螂鲤及其相关的三倍体湘云卿、 二倍体红螂血液及血细胞的 生物学特性进行 了研究，主要研究结果如下: ( 1 ) 对异源四 倍体螂鲤、 三倍体湘云螂、二倍体红卿的血液指 标 ( 红细胞数、血红蛋白值、红细胞脆性、比 容) 、细胞大小及它们 的显微结构进行了比 较观察。结果表明: 在不同倍性鱼中，四倍体、 三倍体、 二倍体红细胞在数目 、 脆性、比 容方面随倍性的降 低而依次 升高; 血红蛋白含量无显著差异; 在细胞大小方面， 四倍体、 三倍体、 二倍体的红细胞及细胞核、 嗜中性粒细胞、 单核细胞表现出4 : 3 : 2 的比例关系; 在红细胞的形态方面， 异源四 倍体螂鲤、 三倍体湘云卿. 二倍体红螂存在明 显差异，异源四 倍体螂鲤红细胞短径/ 长径比 值为 0 .5 9 ， 表现为明 显的长椭圆形， 另外有 3 3 % 的红细胞有哑铃形细胞核; 湘云螂的红细胞短径/ 长径 比值为 0 . 6 3 ，细胞呈椭圆形，近 2 5 %的红 细胞有哑铃形细胞核;二倍体红螂红细胞短径/ 长径比 值为 0 .7 4 ，接 近圆形，未见哑铃形细胞核。 ( 2 ) 用光学显微镜和电子显微镜对异源四 倍体螂鲤外周血细胞 的显微结构及亚显微结构进行了观察。 结果表明: 在异源四 倍体螂鲤 外周血中， 可观察到红细胞、 嗜中 性粒细胞、 单核细胞、 淋巴 细胞和 血栓细胞， 且嗜中性粒细胞依据细胞质中颗粒的形态分为 i 、ii , i q 三种类型， 其中 1 型嗜中性粒细胞含特殊颗粒， 而在光学显微镜下观 察三倍体湘云螂、二倍体红螂外周血中 仅有ii . i q 型嗜中性粒细胞， 未见含特殊颗粒的i 型嗜中性粒细胞。 异源四 倍体细鲤外周血光学显 微镜和电 子显微镜下均未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞， 三倍体 湘云卿、 二倍体红螂外周血在光学显微镜下也未发现嗜酸性粒细胞和 嗜碱性粒细胞 。 ( 3 ) 用光学显微镜对异源四 倍体螂鲤的肝脏、肾脏、脾脏中的 血 .细胞发生过程进行了比 较系统的 观察。 结果表明:其肾脏、 脾脏、 肝)u r 内血细胞的发育大致经过 3 个阶段: 原始阶段、 幼稚阶段、 成熟 阶段。 关键词: 异源四倍体0鲤，三倍体湘云螂， 二倍体红螂， 血液指标， 血细胞， 显微结构， 超显微结构， 血细胞发生 abs t ract t h e f o r m a t io n o f t h e p o p u l a t io n o f t h e a l lo t e t r a p lo i d h y b r i d s o f r e d c r u c i a n c a r p a n d c o m m o n c a r p i s t h e fi r s t c a s e in t h e w o r ld w h ic h b o th t h e f e m a le a n d th e m a l e a ll o te t r a p lo id s a r e fe r ti le , t h e y a r e t h e g o o d m a t e r i a l s f o r s t u d y in g th e b io lo g ic a l c h a r a c t e r i s t ic s o f te t r a p l o i d a n i m a l s . w e m a d e a lo t o f s t u d ie s a n d e x p l o r a t io n o n t h e b lo o d c e ll s in a ll o te t r a p l o i d h y b r i d s , a ll o t r i p lo id c r u c ia n c a r p a n d d i p lo id r e d c r u c i a n c a r p . t h e r e s u l t s w e r e s u m ma r i z e d a s f o l l o w s : ( 1 ) t h e b l o o d in d ic e s i n c lu d in g t h e n u m b e r o f e ry t h r o c y te , h e a m o g lo b in c o n te n t , e r y t h r o c y te o s m o t i c f r a g il it y , s p e c i f ic v o lu m e , n o r m a l s iz e o f th e b lo o d c e l l s a n d f in e s t r u c t u r e o f p e r ip h e r a l b l o o d w e r e c o m p a r e d a m o n g a llo t e t r a p lo id h y b r id s , a l lo t r i p lo id c ru c i a n c a r p a n d d i p lo id r e d c r u c i a n c a r p . t h e r e s u l ts r e v e a l e d t h a t th e n u m b e r o f e ry t h r o c y t e , e r y t h r o c y t e o s m o t ic fr a g i li ty , s p e c i fi c v o l u m e w e r e in c r e a s e d g r a d u a ll y w i t h t h e p l o id y l e v e l d e c r e a s in g , w h i le th e r e h a d n o o b v i o u s d i ff e r e n c e s i n h e a m o g l o b in c o n t e n t . f u r th e r m o r e t h e s iz e o f th e e ry t h r o c y t e a n d c e l l n u c le u s , m o n o c y t e , n e u tr o p h i l in t e tr a p l o id y , t r ip l o id y , d ip l o id fi s h h a d t h e p r o p o r t io n o f 4 : 3 : 2 . i n t h e r e s p e c t o f e ry th r o c y te m o r p h o lo g y , 3 t y p e s o f fi s h h a d e v i d e n t ly d iff e r e n c e s . t h e e ry t h r o c y t e o f a llo t e tr a p lo id h y b r id s a p p e a r e d t h e l o n g e l li p s e w it h th e w i d t h b e i n g 0 .5 9 o f th e l e n g t h a n d 3 3 % o f th e e ry t h r o c y t e h a d th e d u m b b e l l n u c l e u s . t h e e ry t h r o c y te o f a llo t r ip l o id c r u c ia n c a r p a p p e a r e d e l li p s e w it h th e w id t h b e in g 0 .6 3 o f t h e l e n g t h a n d 2 5 % o f t h e e ry t h r o c y t e h a d th e d u m b b e ll n u c l e u s , w h e r e a s t h e e ry t h r o c y t e o f d ip l o id r e d c r u c ia n c a rp t e n d e d to b e r o u n d w it h th e w id t h b e in g 0 .7 4 o f th e le n g th , b u t n o n e o f t h e e ry t h r o c y t e w i t h t h e 如m b b e i l n u c l e u s w a s f o u n d . ( 2 ) t h e f in e s tr u c t u r e a n d u lt r a s tru c t u r e o f p e r i p h e r a l b l o o d i n a ll o t e t r a p l o id h y b r id s w e r e s t u d i e d b y t h e lig h t m i c r o s c o p y a n d t r a n s m is s i o n e le c t r o n m ic r o s c o p y . t h e r e s u lt s s h o w e d th a t th e p e r i p h e r a l b l o o d o f t h e a l l o t e t r a p lo i d h y b r id s h a d t h e c e ll t y p e s i n c lu d i n g e r y t h r o c y t e , m o n o c y t e , n e u t r o p h il , ly m p h o c y t e a n d t h r o m b o c y t e , wh il e t h e n e u t r o p h i l w a s d iv id e d in t o i ， ii ， iii 3 t y p e s b as e d o n t h e g r a n u l e s i n t h e c y t o p la s m . b u t t h e n e u tr o p h il o f a l l o t r ip l o i d c r u c ia n c a r p a n d d ip l o i d r e d c r u c ia n c a r p o n ly h a d t w o ty p e s o f c e ll s i n c lu d in g th e ty p e ii a n d ty p e iii , a n d n o n e o f t h e ty p e i w it h p u r p li s h r e d g r a n u le s w a s f o u n d . n e it h e r e o s in o p h il n o r b a s o p h il w a s f o u n d d ir e c t ly i n t h e p e r ip h e r a l b lo o d o f a l lo t e tr a p lo id h y b r id s b y t h e l ig h t m ic r o s c o p y a n d tr a n s m i s s i o n e l e c tr o n m ic r o s c o p y , a n d n e ith e r e o s in o p h i l n o r b a s o p h i l w a s f o u n d d i r e c tly in t h e p e r ip h e r a l b lo o d o f a ll o tr ip lo i d c r u c i a n c a r p a n d d ip l o id r e d c r u c i a n c a r p b y t h e l ig h t m ic r o s c o p y . ( 3 ) t h e b l o o d , k i d n e y a n d s p le e n o f t h e a l l o t e tr a p lo id h y b r id s w e r e o b s e r v e d o n s t a i n e d s me a r s b y t h e l i g h t m i c r o s c o p y . t h e r e s u l t s r e v e a l e d t h r e e s t a g e s o f b l o o d c e l l d e v e l o p m e n t i n c lu d in g t h e p r im it i v e s t a g e , t h e im m a t u r e s t a g e a n d t h e m a tu r e s t a g e . k e y w o r d s : a l lo t e t r a p lo id h y b r i d s , a l lo t r ip l o i d c r u c ia n c a r p , d ip l o i d r e d c r u c i a n c a r p , b l o o d i n d i c e , b l o o d c e l l s , f i n e s t r u c t u r e , u l t r a s t r u c t u r e , b l o o d c e l l d e v e l o p me n t 引言 鱼类的血液循环系统与其他脊椎动物一样， 主要肩负输送组织和 细胞活动所需的氧， 带走活动后产生的二氧化碳的 主要任务， 与此同 时 还负责 输送激素调节体内 各部 位机能以及防御外来微生物、 细菌等 各种毒素对机体侵害的 功能。 一方面血细胞是鱼类机体重要的免疫细 胞， 其中白 细胞直接参与了免疫应答及其他与免疫应答直接相关的过 程， 同时还肩负着鱼类机体非特异性免疫的 主要机能， 在鱼类疾病防 治中发挥着重要作用 ” 2 ， ; 另一方面， 鱼类血细胞对自 身生理状态变 化和外界环境因子的 刺激十 分敏感， 通过检测其血液指标， 可以 初步 了 解鱼类的健康状况及其生活水环境的质量3 、 4 。目 前， 国内外己 有 大量有关鱼类血液及血细胞的 研究报道， 尽管其总体研究水平与哺乳 动物血细胞相比还有较大差距， 而且对部分血细胞的分类及其功能也 仍存在一定分歧。 但是， 随着现代分子生物学技术与方法逐渐应用于 鱼类血细胞的 研究，一些争论己 久的问 题相继得到澄清或确认， 6 ， 。 血液的组成成分 血液由体液的血浆( p las m a ) 及悬浮于其中的血细胞组成。每 1 0 0 毫升血液中血细胞所占 的容积， 称血细胞比 容。 由于鱼类血液中白 细 胞的含量很少， 所以 血细胞比 容主要由红细胞的数量和体积决定。 不 同种类的鱼， 血细胞比容各不相同， 运动能力强的 鱼， 血细胞比 容的 值较大， 如金枪鱼可达 4 0 %以 上; 而活动能力 较差的鳃则不到 i q % e 同一条鱼在不同生理状态下， 血细胞比 容也会发生变化， 如在患病期 间， 血液的血细胞比 容会下降; 而二氧化碳则能改变红细胞的通透性， 使水易于进入红细胞， 增加细胞体积升高血细胞比容; 另外， 季节变 化、 摄食营养条件、温度及盐度的变化，都会影响血细胞比容。 2鱼类血细胞的种类及其主要功能 鱼类血细胞的分类与命名主要根据其形态和功能， 参照哺乳动物 相关血细胞而进行的。 它包括红细胞和白细胞; 其中白 细胞又包括淋 巴 细胞、 血栓细胞、 单核细胞、 嗜中 性粒细胞、 嗜酸性粒细胞、嗜碱 性粒细胞 、浆细胞和巨噬细胞等。 2 . 1红细胞( e r y t h r o c y t e ) 除短腹冰鱼( c h a e n o c e p h a l u s a c e r a u s ) 等极少数南极目 鱼类没有 红细胞或红细胞含量很少外 7 ， ， 绝大多 数鱼类的红细胞含量均占 其血 细胞总量的 9 0 %以 上 5 )。该细胞呈椭圆形或长橄榄形， 表面光滑， 成熟的红细胞中央有一个圆形或椭圆形的细胞核， 与哺乳动物的无核 的成熟红细胞显著不同4 . 8 )鱼类红细胞的大小因鱼的种类、d n a 含量和生活环境而有一定的差异， 除少数软骨鱼类的红细胞的长径可 超过 2 0 u m 外，绝大多数鱼类红细胞的长径为 9 - 1 8 u m，短径为 7 . 51 0 .5 u m; 细胞核长径为 5 l1 m - 6 .5 1a m ， 短径为2 .5 11 m - 4 .5 11 m . 透射电子显微镜镜下， 鱼类红细胞的胞质内 只有少量线粒体、 核糖体、 滑面内 质网、 高尔基体或囊泡等结构 4 ) ; 但也有些鱼类红细胞的胞质 内没有任何细胞器 7 。 在鱼类红细胞的细胞膜下方， 具有与细胞膜平 行排列的边缘微管束， 该微管束具有维持红细胞正常形状并使红细胞 保持一定的弹性的双重功能吕 。血红蛋白是红细胞的主要组成成分， 血红蛋白 在氧分压高时结合氧， 在氧分压低时释放氧的特性， 使它特 别适宜在体内 担负运输氧的 机能。 血红蛋白的量以 每 1 0 0 毫升血液中 所含血红蛋白的克数表示。 血红蛋白 的量随鱼的种类、 营养状况、 季 节变化等有所不同。 一般来说， 硬骨鱼类的血红蛋白 含量比 软骨鱼类 多; 营养条件好的鱼血红蛋白 含量高; 运动能力强的鱼类较运动能力 弱或底栖生活的鱼类有较多的血红蛋白。 血红蛋白 从红细胞内释放出 来称血容， 此时血红蛋白 携带氧气的能力丧失。 溶血的发生或因红细 胞膜破裂， 基质溶解; 或因红细胞膜孔隙增大，以 致血红蛋白 逸出而 留下双凹圆盘形的细胞膜， 这个空壳医学上叫做“ 血影细胞” 。 正常红 细胞在渗透压逐渐减低的 溶液 ( 如氯化钠溶液) 中表现有一定抵抗低 渗 ( 或低张) 溶液的能力， 也即抗张力强度， 它与脆性相对。 换言之， 红细胞抗张力越低就愈易 溶血， 也即是脆性越大。 我们把红细胞在低 渗盐溶液中出 现溶血的特性， 叫做“ 红细胞渗透脆性” ， 各种淡水鱼中， 红螂1 鳃鱼、 娜鱼、 鲤鱼抵抗力大， 鳗鱼、 马苏大麻哈鱼、 虹鲜的抵 抗力小4 ) 。 此外， 王旭东等对多种鱼类红细胞功能的研究表明， 有些 鱼类的红细胞除 具有以上主要作用外， 还有与吞噬细胞类似的吞噬能 力，因此，红细胞有时也有一定的非特异性免疫功能 9 ， 。 2 .2白 细胞 ( l e u c o c y t e 鱼类的白 细胞种类很多， 包括淋巴细胞、 血栓细胞、单核细胞、 嗜中 性粒细胞、 嗜酸性粒细 胞、 嗜碱性粒细胞、 浆细胞和巨 噬细胞等。 2 .2 . 1 淋巴细胞( l y m p h o c y te ) 淋巴细胞是鱼类血液中最常见的白 细胞。 虽然不同淋巴细胞之间 有较大的大小差异， 但外形上基本一致， 且与其他脊椎动物的淋巴细 胞相似， 呈不规则圆形; 细胞中央有椭圆形或马蹄形细胞核， 核质比 2 ( s . 7 . (0 。透射电子显微镜下， 淋巴 细胞的细胞质内 有较大型的线 粒体、 游离的核糖体或粗面内 质网， 有的还有高尔基体、 溶酶体和吞 饮泡等 。 ， 。过去， 有些学者根据淋巴细胞的 大小的不同而将其分为 大淋巴 细胞和小淋巴 细胞， 但目 前越来越多的学者反对这种纯粹依据 大小的分类方式， 因为淋巴细胞大小的差异是一种连续变化， 不同大 小的 淋巴 细胞只是同一种细胞处于不同发育阶段或不同功能状态 ， ，。 鱼类与哺乳动物在免疫器官组成上的主要区别为: 鱼类没有骨髓 和淋巴结。 胸腺、 头肾、 脾脏以 及粘膜淋巴 组织是鱼类淋巴细胞分化 成熟的主要场所。 在早期文献中， 虽然也有学者将鱼类淋巴细胞的发 育过程分为未成熟淋巴细胞和成熟淋巴细胞两大类 ” ， 但是目 前己 基本根据其分化程度的不同而统一将其分为原淋巴 细胞、 幼稚淋巴细 胞、成熟淋巴 细胞 3 个阶段 12 ) 。 从 2 0 世纪 7 0 年代以来，虽然对鱼 类淋巴细胞是否具有与哺乳动物相似的t , b细胞分化有较长时间的 争论，不过， e l l is 和 w a r r ( 13 首先报道了 鱼类膜表面免疫球蛋白 ( s u r fa c e m e m b r a n e i m m u n o g l o b u l in ,s m l g ) ; 陈昌 福 用 直接 荧光 抗 体法证明了鲤鱼的淋巴细胞存在 s m l g和胸腺淋巴 细胞表面抗原 ( c a t l c ) 2 种细 胞 类型， p a r t u la (b ， 和s c a p i g li a ti 等( 15 ， 还通 过单克 隆 抗 体技术、 分子生物学技术和流式细胞仪技术等在有效分离淋巴 细胞的 基础上， 确定了鱼类淋 巴细胞也与哺乳动物淋巴细胞一样存在表面抗 原以 及表面受体不同的t , b两类淋巴细胞。 有关鱼类淋巴 细胞的进 一步研究还表明，鱼类不仅存在t和b淋巴 细胞，而且其 t细胞还 可以 与哺乳动物一样分为t辅助细胞 ( t h 细胞)和t抑制细胞 ( t s 细胞)2 种不同的亚群。 鱼类淋巴细胞也像高等脊椎动物那样能被抗原激活而产生相应 的 抗体和淋巴因子。 其中， t 淋巴 细胞具有直接杀伤细胞以及通过分 泌细胞因子调节免疫反应的作用 6 ，它的作用受温度影响较大，低 温不仅能 抑制其受有丝分裂素和异源细胞刺激而增生的功能， 而且可 抑制其帮助的功能“ ， 。 b淋巴 细胞为抗体生成细胞，对于非胸腺依 赖性抗原，它的激活需要吞噬细胞的帮助，而 对于胸腺依赖性抗原， 它的激活需要吞噬细胞和t细胞的共同参与。 b淋巴细胞被激活后， 可直接演化成免疫淋巴细胞和浆细胞，并产生细胞免疫和体液免疫， 此外b细胞本身也可以作为抗原的传递细胞， 还具有记忆的功能 日 ，。 2 .2 .2血检细 胞 ( t h r o m b o c y te ) 虽然有的研究认为有些鱼类可能没有血栓细胞 “ ” ; 但绝大多数 研究表明，鱼类的血栓细胞是数量上仅次于淋巴 细胞的白 细胞 。 ， 。 该细胞常成群分布， 呈纺锥形或泪滴形， 表面有粗钝的突起， 细胞核 大， 位于中央， 并常因发育阶段或生理状态不同 而呈现2 至4 种不同 形态， 包括泪滴形、 纺锥形、 卵圆 形等 3 ， 。 透射电子显微镜下， 在血 栓细胞内缘有较多的空泡和边缘微管束， 在胞质的其他部位则有血栓 颗粒、 线粒体、高尔基体和核糖体等结构。 其中， 空泡和边缘微管束 是电 子显微镜下区分血栓细胞、 小型淋巴细胞等其他白 细胞的主要标 ， 公 鱼类血栓细胞具有与哺乳动物血小板相似的凝血功能。在结构 上， 位于血栓细胞外缘的空泡也类似于哺乳动物血小板的表面连接系 统， 具有增加血浆凝血因子附着面积的作用 3 ， 。 另外， 尽管有些学者 从细胞发生的角度认为血栓细胞不可能 具有吞噬功能， 但已 有越来越 多的 研究证实， 实验鱼类在静脉或腹腔注射胶碳颗粒后， 血栓细胞确 实具有一定的吞噬胶碳颗粒的能力 刁 ; 有的研究还表明， 血栓细胞中 的胞质小泡、 溶酶体和边缘维管束其实是与其吞噬作用直接相关的结 构 “ ， 口 2 .2 .3单核细胞 ( m o n o c y t e ) 在鱼类白 细胞中， 单核细胞的大小仅次于巨噬细胞和一些大型的 嗜碱性粒细胞。 该细胞呈球形、 圆梨形或不规则形， 表面有细长的 伪 足样胞突。 单核细胞的核较小， 呈肾形或马蹄形， 常偏于一侧， 核质 比1 。 鱼类巨噬细胞与哺乳动物的巨噬细胞 一样， 具有良 好的吞噬能力， 18 不仅能吞噬颗粒性抗原， 还能吞噬可 溶性抗原。 此外， 有些鱼类的吞噬细胞表面还有表面抗体， 能够部分 参与抗体的 特异性免疫反应3 。 3鱼类血细胞的发生 鱼类血细胞发生的部位包括胸腺、 头肾、 体肾、 脾脏、 肝脏和肠 粘膜下层。 鱼类由于缺乏哺乳动 物红骨髓等那样的造血组织， 也没有 与哺乳动物类似的 淋巴 结，其发挥中枢免疫功能的主要结构为胸腺。 鱼类的胸腺有淋巴 母细胞、 浆细胞、 淋巴 细胞、 分泌样细胞、 巨噬细 胞、 肥大细胞和肌样细胞等组成， 它除具有中枢免疫功能 外， 也是淋 巴 细胞发生的主要场所。 鱼类肾脏分为头肾和体肾， 其中， 头肾为专 的免疫和造血器官; 体肾则担负着机体主要的排泄功能， 只是在其 肾小管之间以 及肾小管和集合管之间的管间组织仍保留着一定的造 血和免疫功能。 在个体发生上， 鱼类的头肾是继胸腺之后第 2 个发育 的淋巴样器官， 它既具有自 主产生红细胞和 b淋巴 细胞的能力，也 是单核细胞等免疫细胞的重要发源地， 具有类似哺乳动物中 枢免疫器 官和外周免疫器官的 双重功能2 0 ) 。 软骨鱼类的肝脏与哺乳动物不同， 哺乳动物肝脏的主要功能为消化和解毒， 只在应急时才有一定的造血 能力; 而鱼类肝脏的窦状隙是其另一个重要的 造血部位， 具有良 好的 产生红细胞的能力。 此外， 鱼类小肠的粘膜下层也具有一定的造血功 能，它与红细胞和嗜中性粒细胞的发生有一定的关系 2 0 ) 4鱼类血细胞研究方法及发展方向 鱼类血细胞研究与生物学的 其他许多 研究一样， 研究方法直接决 定着其研究水平和发展方向。 长期以来， 鱼类血细胞研究基本是借用 哺乳动物血细胞研究中比较成熟的方法， 并根据具体研究的需要作些 适当的调整， 其中， 比 较传统的方法包括w ri g h t 染色、 g ie m s a 染色、 罗氏染色等血细胞常规染色法以及苏丹黑b反应、 p a s 反应、 过氧化 物酶反应、 酸性磷酸酶反应和碱性磷酸酶反应等组织化学方法， 这些 传统的研究方法为确定鱼类各种血细胞的基本形态以及细胞内各种 常见组分的性质发挥了重要作用， 并且仍然是当前及今后各种鱼类血 细胞研究最常见的基本方法。自2 0 世纪 7 0 年代以来， 随着电子显微 镜技术的高速发展， 透射电子显微镜、 扫描电 子显微镜以 及透射电子 显微镜的冷冻蚀刻技术等己 相继应用于鱼类血细胞研究， 为揭示鱼类 血细胞的超微结构发挥了重要的作用 3 . 4 . 1 4 。 在鱼类血细胞研究中， 由于其白 细胞种类繁多且功能复杂， 因此， 对白 细胞的形态、 结构与 功能的 研究一直是国内外鱼类血细胞研究的焦点， 而在鱼类白细胞研 究中， 首先要做的工作是进行白 细胞的分离， 并且对白细胞分离效果 的好坏常常直接决定着白细胞研究的成败。目 前， 通常采用的白 细胞 分离 法: 普 通 离 心后 挑取 血块 黄 层( b u f fl y c o a t ) 法、 应 用f i e c o l l p a q u e 或 p e r e o ll 液进行密度梯度离心法以 及应用流式细胞分拣技术 ( f l o w c y t o m e t r y c e ll s o r t i n g t e c h n i q u e ) 等 4 . 12 ) 。 随 着 许多 现 代生 物技术的 高速发展， 对鱼类血细胞研究的手段也在不断更新， 应用单克隆抗体 技术， 流式细胞技术以 及分子生物学 技术进行鱼类血细胞的研究己成 为近年来的发展新趋势， 此外， 随着这些新技术方法的 成功应用， 许 多有关鱼类血细胞分类和功能方面争论己 久的关健问 题己经得到了 解决。 相信在今后一段时间内， 这些新方法还将在鱼类血细胞研究中 发挥重要的作用， 从而进一步推动鱼类血细胞以 及与之相关的鱼类免 疫学研究向更深的层次发展。 5本项研究的主要内容 湖南师范大学生命科学院鱼类发育生物学研究室与其协作单位 湘阴东湖渔场合作在世界上首次人工培养出两性可育并形成群体的 异源四倍体螂鲤 ( 2 n = 2 0 0 ) ， 至今四倍体螂鲤己 连续繁殖了 1 4 代， 形 成了一个遗传性状稳定的四倍体鱼新种群(2 3 . 3 2 ) 。该四倍体螂鲤群体 形成的创新性得到了 国内外专家的充分肯定 6 ， 、 “ 2 ， ，四倍体鱼种群的 获得不但在大规模制备不育三倍体鱼的方面具有重要的应用价值， 在 生物进化以 及不同倍性鱼的生物学特性比较方面也具有非常重要的 作用。以前我们对四 倍体螂鲤、三倍体湘云螂的染色体数目、 组型、 d n a含量、 性腺结构、生长速度、食性、 m td n a结构等方面开展了 一系列研究2 3 - 4 8 ) ， 但对其血液及血细胞的研究尚未见系统报道，本 项研究主要包括 以下内容: 5 .1不同倍性螂鲤鱼血液指标及显微结构的比 较 对异源四倍体0 4 鲤、 三倍体湘云螂、 二倍体红螂的血液指标 ( 红 细胞数、 血红蛋白 值、红细胞脆性、比 容) 、细胞大小 ( 红细胞及细 胞核、 白 细胞、 血栓细胞的长、 短径值) 及显微结构进行了 观察比较。 5 2异源四倍体蜘鲤外周血细胞显微及亚显微结构 用光学显微镜和电子显微镜对异源四倍体螂鲤外周血细胞的显 微结构及亚显微结构进行了 观察 5 .3异源四 倍体细鲤血细胞发生研究 用光镜技术对异源四 倍体卿鲤的肝脏、 肾脏、 脾脏中的血细胞发 生过程进行了较系统的观察。 以上研究结果为不同 染色体倍性鱼的鉴定及确证异源四倍体卿 鲤的遗传进化地位提供了 重要实验数据， 为异源四 倍体卿鲤血细胞及 其免疫学研究提供了重要的 基础资料。 第一章不同倍性螂鲤鱼血液研究 材料与方法 实验材料 实验鱼为池养健康的 f 1 ， 异源四倍体螂鲤、三倍体湘云螂、二倍 体红卿。 异源四倍体螂鲤3 0 尾， 平均体重为 ( 2 8 5 .5 4 1 6 0 .2 5 ) g ，平 均体长为 ( 2 3 .4 4 士 2 .5 5 ) c m;三倍体湘云细 2 4尾，平均体重为 ( 5 5 0 .6 7 1 6 5 . 1 ) g , 平均体长为( 3 5 .5 5 1 3 .8 0 ) c m ; 二倍体红卿3 0 尾， 平均体重为 ( 3 1 5 .6 5 1 5 6 .2 3 ) g ， 平均体长为 ( 2 3 .2 4 1 3 .5 0 ) c m . .2血液指标测定 取样前，实验鱼禁食2 4 h ，采取血样后进行下述指标测定: ( 1 ) 红细胞数:将血液用 0 .7 5 %的 生理盐水稀释 2 0 0 倍后在显 微镜下计数。 ( 2 ) 血红蛋白 值: 用沙利 ( s a h l i ) 法测定。( 3 ) 红细胞 比容及 ( 4 ) 红细胞脆性的测定参照林光华等方法4 4 1 0 ( 5 ) 确定血细 胞大小用血涂片经瑞氏染色液染色后在装有测微尺的显微镜下测量 血液细胞的长径、短径。 .3光镜样品的制备 从异源四 倍体螂鲤、 三倍体湘云螂、 二倍体红卿尾静脉取血， 常 规法制作血涂片， 瑞氏 染色液染色， o ly m p u s 显微镜下观察并摄影。 实验所得数据借助 e x c e l中统计软件进行处理，t 检验分析显 著性水平设置为 。 = 0 .0 5 . 2实验结果 2 . 1 血液常数值比 较 表 1 显示了异源四倍体螂鲤、 三倍体湘云细、 二倍体红螂单位体 3 分析讨论 从表 1 可看到单位体积血液中3 种鱼的红细胞数目 的多少是: 异 源四倍体卿鲤 三倍体湘云螂 二倍体红娜，这种分布可以 补偿红细胞数量减少带来的不足， 从 而保证了 气体运输的正常实现。 我们认为红细胞数目 、 体积及血红蛋 白值 3 者之间是一个有机整体，其数目、形态与功能之间有机协调。 在形态方面，异源四 倍体卿鲤红细胞短径/ 长径比值为 0 .5 9 ，表 现为明显的长椭圆 形， 另外有3 3 %的红细胞有哑铃形细胞核; 湘云细 的红细胞短径/ 长径比 值为 0 . 6 3 ，细胞呈椭圆形， 近 2 5 % 的红细胞有 哑铃形细胞核; 二倍体红细红细胞短径/ 长径比 值为0 .7 4 ， 接近圆形， 未见哑铃形细胞核; 在大小方面， 红细胞及细胞核、白 细胞长、 短径 值都是随着染色体倍性的增大而增大。按照一般规律，细胞大小与 d n a 的含量或染色体多少成正比，而且为了 维护恒定的核质比例， 随着染色体数目 增多， 细胞大小 及细胞核大小按一定比例增加， 因此 组成多倍有机体的细胞及细胞核通常要比二倍体大。 怎样解释 3 种鱼 的不同短径/ 长径比 值以 及哑铃形的细胞核呢?有研究表明年龄、性 别、核的大小及新陈代谢都可能影响红细胞及细胞核的形态， 3 种鱼 红细胞核的体积比为:异源四倍体螂鲤/ 三倍体湘云螂/ 二倍体红细 = 4 / 3 /2 ，随着d n a含量增多，细胞核体积增大，细胞的体积也随之 增大。 变形的细胞核可以 增大细胞核的表面积， 从而有利于核膜的核 孔进行物质和信息交流 5 2 ) 。四、三倍体鱼红细胞哑铃形核可作为他 们区别于二倍体鱼的一个重要鉴定标志。 在光学显微镜下， 我们还看 到异源四倍体in鲤血涂片中少量红细胞核已 分裂但胞质没有分开及 细胞质正在分裂但细胞核没有分裂的现象， 而在二倍体、 三倍体鱼中 这种现象极少见到。 产生这种现象的原因尚 不清楚， 估计可能与四 倍 体螂鲤染色体的倍性有关。 如何解释四倍体、 三倍体、 二倍体的比容依次升高这一现象呢? 据其他学者5 “ ， 的 研究， 三倍体鲤鱼的比容较二倍体鲤鱼低，为二倍 体鲤鱼的 0 .8 8 。我们的研究结果表明:比 容29ffi f* :比容二 。= 0 .8 s ;而 比容， 。 体 :比 容二 ， 体 = 0 .9 1 ，两者相似。比容是由 红细胞数目 及红细胞 体积两个值决定， 显然 3 种鱼血液比容随着倍性降 低而升高是由它们 单位体积内红细胞数目随 着倍性降低而升高决定的。 红细胞膜脆性是说明红细胞本身 特性的生理指标， 它与膜的流动 性相关。 鱼的红细胞膜微粘度会随 温度的降低而升高， 在低温下 膜的 流动性变小， 将导致膜的通透性、 变形性、 脆性、 物质运输及酶的活 性发生改变，造成生理功能的紊乱5 、 5 6 一 ，。就红细胞膜脆性而言， 3 种鱼的红细胞膜脆性有显著差异， 即四 倍体的 红细胞对低渗盐水的 抵抗力最强， 三倍体其次，二倍体最弱。 我们的观察结果表明， 不同倍性卿鲤鱼在血液指标及形态大小上 都存在明显差异。 两性可育、 遗传性状稳定的异源四倍体卿鲤在血红 蛋白 含量、 红细胞膜脆性、 红细胞及细胞核的形态等方面均表现出了 明显的优越性。 第二章异源四倍体螂鲤外周血细胞显微及亚显微结构 材料与方法 实验材料 实验鱼为池养健康 的 f ,。 异源 四倍体g o 鲤，平均体重 为 ( 2 8 5 .5 4 士 6 0 .2 5 ) g ，平均体长为 ( 2 3 .4 4 1 2 .5 5 ) c m . .2光镜样品制备 从四倍体娜鲤尾静脉取血， 常 规法制 作血涂片， 瑞氏染色液染色， o ly m p u s 显微镜下观察并摄影。 3 电镜样品制备 从四倍体螂鲤尾静脉取血2 m l ，注入含 1 m l白 细胞分离液的 离 心管中，经7 5 0 0 r / m i n 离心 1 0 m i n ，除去血清， 4 % 戊二醛固定过夜， 挑取富含白 细胞的一层，1 % 饿酸固定，常规脱水、包埋、 超薄切片 后用醋酸双氧铀一柠檬酸铅双重染色，在 h i ta c h i - 6 0 0型 透射电子显 微镜下观察并摄影。 实验结果 异源四倍体螂鲤外周血细胞的显微结构 红细胞: 细胞呈椭圆形或长椭圆 形， 部分呈哑铃形， 细胞表面光 滑。 核为椭圆形或哑铃形， 经瑞氏染色液染色呈紫红色，1 2 0 个四倍 体卿鲤红细胞中， 4 0个有哑铃形细胞核，约占总数的 3 3 %。细胞质 浅蓝色 ( 图2 - 1 : 1 ) 。 外周血中还可见到红细胞直接分裂现象， 细胞 核向两侧伸展呈哑铃形， 细胞拉长， 中间由 细丝连接， 少部分细胞表 现为泪滴状 ( 图 2 - 1 : 1 ) 。此外，我们还观察到少量红细胞核己分裂 但细胞质没有分开及细胞质正在分裂但细胞核没有分裂的现象 ( 图 2 - 1 :2 ) 0 嗜中性粒细胞:i 型嗜中 性粒细胞呈圆形。 核分叶或不分叶， 稍 偏位， 核内 异染色质带状分布于核膜周围或成岛状分布于中央。 光面 内质网和g o l g i 复合体丰富， 胞质内有大小不等的 液泡， 特殊颗粒较 多，其中 a型颗粒基质均匀，呈圆形、卵圆形或长棒状，电子密度 较高， 着色深; b型颗粒呈圆 形，电子密度中等， 可见丝状或絮状结 晶 ( 图2 - 2 : 4 , 5 ) o ii 型嗜中 性粒细胞为椭圆 形， 核分叶或圆形。 胞 质内有大量大小不等的吞噬泡， 特殊颗粒少，只有极少量 a型颗粒。 电 子显微镜下还可看到ii 型嗜中 性粒细胞吞噬红细胞的 现象( 图2 - 2 : 6 ,图2 - 3 ; 1 ) i ii 型嗜中 性粒细胞呈圆形。 核不分叶， 较小， 位于细 胞中央。细胞质中 充满了大小不等的空泡，胞质内几乎无颗粒 ( 图 2 - 3 : 2 , 3 ) 。 单核细胞:细胞表面有细长的小胞突。核不规则偏于细胞一侧， 核周隙明显， 核内 异染色质少， 沿核膜内 侧呈薄层分布。 线粒体数量 多， 呈 椭圆 形， 其中 可见 和纵 轴 平 行排 列的 蜡 ， 胞 质中 还 可看g o lg i 复合体， 粗面内质网以及一些致密的颗粒和大小不等的囊泡( 图2 - 3 : 4 , 5 ) 。 血栓细胞: 细胞呈纺锤形， 表面光滑。 核为梭形或肾形，中央有 一陷窝凹进很深，居于细胞中央， 核内异染色质丰富，沿核膜分布。 胞质成分较小， 含有线粒体、内 质网 及大小不同的 囊泡 ( 图2 - 3 : 6 ) . 3分析讨论 异源四 倍体卿鲤 外周血细胞中含有红细胞、 嗜中性粒细胞、 淋巴 细胞、 单核细胞、 血栓细胞， 未发现有嗜酸