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西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 毛细管电泳分析方法及应用研究 摘要 毛细管电泳以其分离效率高、分析速度快、操作模式多等特点，迅速发展成 为一种极为有效的分离技术。在分离、分析方面具有十分重要的作用和广泛的应 用前景。本学位论文进行了毛细管电泳分析方法及其应用研究。全文包括六个部 分。 第一章综述 概述了毛细管电泳的基本原理、特点、分离模式以及检测方法。综述了毛细 管电泳在分析化学中的应用及其进展。并在此基础上提出本文拟研究的内容。 第二章芳香族羧酸的毛细管电泳分离测定方法研究 研究建立了一种新的分离、测定8 种芳香族羧酸的方法。探讨优化了分离测 定条件：以1 0 n l l n o 儿9 环糊精存在下的硼砂缓冲溶液( 1 0 n u n o 帅h 1 0 o ) 为电 泳缓冲液，工作电压2 5 k v ，检测波长2 1 4 n m 。进行了8 种芳香族羧酸的分离和 测定。结果表明，在5 1 2 0 p 咖l 范围内8 种芳香族羧酸的浓度和峰面积呈良好 的线性关系，其相关系数在o 9 9 6 7 到o 9 9 9 2 之间。该方法高效、快速、简便， 已应用于药物“足光散 中苯甲酸和水杨酸的分析，结果满意。 第三章毛细管电泳分离测定复合维生素b 中的l 、2 和烟酰胺 采用高效毛细管电泳同时分离、测定了复合维生素b 片中v b l 、v b 2 和烟酰 胺的含量。探讨了缓冲溶液的酸度、浓度和工作电压等对分离的影响。在一定的 实验条件下，上述3 种分析物在5 分钟内实现了分离和测定。 第四章非水毛细管电泳测定蔬菜中氰戊菊酯的含量 首次建立了一种非水相体系毛细管电泳紫外检测法测定农药氰戊菊酯的新 方法。讨论了电泳介质、酸度及工作电压等因素的影响。该方法应用于蔬菜中氰 戊菊酯的测定，取得了满意结果。 第五章金纳米修饰的毛细管电泳分离氨基苯甲酸 以3 一巯基丙酸钠为稳定剂，柠檬酸钠为还原剂制备了3 衄粒径的金纳米。 西北大学硕士学位论文 毛细管电泳分析方法及应用研究 研究建立了金纳米修饰的毛细管分离氨基苯甲酸的新方法。研究发现金纳米修饰 的毛细管有效地增强了分离度，并改变了电渗流的大小。理论上探讨了缓冲液中 加入金纳米对提高分离的稳定性和重现性的作用机理。在优化的实验条件下3 种氨基苯甲酸在9 分钟内实现了分离。在o 5 4 0 p 咖l 范围内3 种分析物的浓度 与峰面积呈良好的线性关系，检出限在0 1 到o 5 p 咖l 间。 第六章应用金纳米修饰的毛细管电泳测定血清中头孢菌素类抗生素 采用金纳米修饰的毛细管电泳首次分离测定了4 种头孢类抗生素。进行了金 纳米修饰的石英片上吸收光谱的测定和表征。结果表明，通过一定的修饰方式， 可以在石英表面修饰一定量的金纳米。并且探讨了实验条件，4 种头孢菌素在7 分钟内分离、测定。该方法操作简便、快速、准确。将该法用于血清中药物含量 的测定取得了满意结果。 关键词：毛细管电泳；芳香族羧酸；维生素b ；氰戊菊酯；金纳米；氨基苯甲酸； 头孢菌素类抗生素 i i 西北大学硕士学位论文 毛细管电泳分析方法及应用研究 s t u d y o nt h ea n a l y t i c a lm e t h o d sa n d a p p l i c a t i o n so f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s a b s t r a c t c 印i 1 1 a r ) ，e l e c 仃0 p h o r e s i si sau s e m ls 印a r a t i o nt e c l l i l o l o g ) ，a 1 1 dh 硒b e e n 印p l i e d t 0m a n yf i e l d s ，o w i n gt oi t sc h a r a c t 甜s t i c s ：h i 啦e m c i e n c ys 印a r a t i o n ，h i g l ls p e e d a 1 1 a l y s i s ，m o r em a i l i p u l a t i o nm o d ea i l dc ta 1 ，n l e 印p l i c a t i o i l si na i l a l y t i c a l t e c l l i l 0 1 0 9 y w e r es t i l d i e di nt l l i sd i s s e r t a t i o n t h ed i s s e r t a t i o ni n c l u d e ss i xp a r t s ： c h a p t e r1 ：r e v i e w t h em n d a m e n t a lp r i n c i p l e ，c h a r a c t e r i s t i c sa i l ds 印a r a t i o nm o d e so fc a p i l l a 拶 e l e c 仃o p h o r e s i sw e r en r o d u c e d a n dt h ea p p l i c a t i o n sa i l dp m g r e s so fc a p i l l a r y e l e c 们p h o r e s i si na 1 1 a l y s i sw e r es 吼m 撕z e d c h a p t e r2 ：s t u d yo nt h em e t h o df o rs e p a r a t i o no fa r o m a t i ca c i d sb yc a p a r y e l e c t r o p h o r e s i s an o v e lm e t h o df o rs 印a r a t i o no fe i 曲ta r o m a t i ca c i d sw 硒d e v e l o p e di l lm e p 印e r t h em n i l i n gb u 蜀衙w 弱c o n s i s t e do f1o i l m o 。t e t r a b o r a t e ( p h10 0 ) a i l d 1o n u n o 。p c d t h ea p p l i e dv 0 1 t a g ew 弱2 5 l 【、，a 1 1 dt h ed e t e c t i v ew a v e l e n g t hw a u sa t 21 4 m t h ee i 曲ta r o m a t i ca c i d sw e r ec o m p l e t e l ys 印a r a t e da n dd e t e n n i n e dw i t h i n 9 m i n 1 1 1 el i n e a rr e l a t i o l l sw e r e 舶m5t o12 0 p 咖1 la i l dt h e i rc o r r c l a t i o nc o e 硒c i e n t s ( r ) w e r eb e 俩e e n0 9 9 6 7a i l do 9 9 9 2 t 1 1 em e t h o dw a sr a p i d ，s i m p l ea 1 1 de 仃e c t i v e i t h a sb e e na p p l i e df o rt h ed e t e n n i n a t i o no ft h ec o m e n to fb e n z o i ca c i d 觚ds a l i c y l i c a c i di nz u g u a l l g s a i lw i t hs a t i s f a c t o 巧r e s u l t c h a p t e r3 ：s e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fv b l v b 2a n dn i c o t i n a m i d ei nt h e v i t a m i nbt a b l e tb yc a p i a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h es 印a r a t i o na 1 1 dd e t e n n i n a t i o no fv b l ，v b 2a i l dn i c o t i n 锄i d ei nv i t 锄i nb t a b l e tw a sp r e s e n t e dw i t hc a p i l l a 黟e l e c t r o p h o r e s i si nt h i sp a p 既t h ee 腩c t so f c o n c e n t r a t i o n ，t h ep ho ft h en m i l i n gb u f r e ra i l d 印p l i e dv o l t a g ew e r cd i s c u s s e d u n d e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n ，t h et l l r e ev i t 锄i n sw e r ew e u s 印a r a t e da 1 1 dd e t e m i n e d i i i 西北大学硕士学位论文 毛细管电泳分析方法及应用研究 c h a p t e r4 ：d e t e r m i n a t i o no ff b n v a l e r a t ei nv e g e t a b l e sb yn o n a q u e o u sc a p n l a r y e l e t r o p h o r e s i s a s i m p l ea i l dr 印i dm e m o do fn o n a q u e o u sc a p i l l a 巧e l e c 仃0 p h o r e s i sw i t hu v d e t e c t i o nf o rd e t e m i n a t i o n 向v a l e r a t ew 弱d e v e l o p e d 1 l l ee 虢c t so fr u j l l l i n gb u 虢r t h ec o n c e n 仃a t i o no f 砌o i l i 啪a c e t a t e ，a c e t i ca c i da l l dm e 印p l i e dv o l t a g ew e r e i i e s t i g a t e d t h em e m o dw 嬲s u c c e s s f h l l ya p p l i e dt od e t e n i l i n ef e n v a l e r a t ei i l v e g e t a b l e sw i t hs a t i s f a c t o 巧r e s u l t c h a p t e r5 ：s e p a r a t i o no fa m i n o b e z o i ca c i d sb yg o i dn a n o p a r t i c l e s - m o d i f i e d c a p m a 眄e l e c t r o p h o r e s i s a s 印a r a t i o nm e t h o df o ra m i n o b e n z o i ca c i d sb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i sw 弱 d e v e l o p e di nt h i sp a p 既t h ei n n e rw a l lo fc a p i l l a 巧e l e c t r o p h o r e s i sw 勰m o d i f i e dw i t h g o l dn a i l o p a n i c l e s nw a sf 0 u n dt h a tt l l ee 伍c i e n c yo fm es 印a r a t i o nw a se i l l l a i l c e d a 1 1 dt h ee l e c t r o o s m o t i cn o w c h a i l g e d 弱w e l la f t e rt h ec 印i l l a 巧w 弱m o d i f i e d u n d e r t h e0 p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n ，s 印a r a t i o n sw e r ed o n ei nab u 腩rc o n t a i l l i n g5 m m 0 1 l p h o s p h a t e 锄d0 2 3 6 肛m o 儿g o l dn a i l o p a r t i c l e s ，p h 5 3 “n e a r i t yw 嬲e s t a b l i s h e do v e r 廿l ec o n c e i l 仃a t i o n r 锄g eo 5 4 0 p 酌n l ，w i t hc o 玎e l a t i o nc o e m c i e n t s ( r ) 姗舀n g b e t w e 锄o 9 9 7 8a n d0 9 9 9 2 t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) 砌g ew e r c 行o mo 1t o o 5 肛舭 c h a p t e r 6 ：d e t e r m i n a t i o no ff l o u r c e p h a l o s p o r i n a n t i b i o t i c s b y g o l d n a n o p a r t i c l e s m o d i f i e dc a p i a r ye l e c t r o p h o r e s i s an e ws 印a r a t i o nm e t h o df o rf b u rc 印h a l o s p o r i na n t i b i o t i c s b yc a p i l l a d r e l e c t r o p h o r e s i sw 弱d e v e l o p e df i r s t l yh lt h ee x p e r i m e l l t ，t h ea b s o 叩t i o ns p e c t m m so f m o d i f i e d 趾du r 皿o d i f i e dq u a n zf i l mw e r em e a s u r e d 锄dc o m p a r e d i tw a ss h o w nt h a t m e r ew e r em o d i f i e dn a n o p a r t i c l e so nt l l es u r f a c eo ft h ec 印i l l a 巧i n n e rw a l l t h e m e m o dw a u s 印p l i e dt od e t e n n i n et 1 1 e 锄o u i l to ft h ef o u rd r u g si nh u m a l ls e m mw i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t k e y w o r d s ：c a p i l l a 巧e l e c 仃0 p h o r e s i s ；a r o m a t i ca c i d s ；v i t 锄i nb ；f l e n v a l e r a t e ；g o l d n a i l o p a n i c l e s ；a m i n o b e n z o i ca c i d s ；c 印h a l o s p o r i na i l t i b i o t i c s i v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 霎差蓑妻凳篓墓主? 盟指导教师签名：邀学位论文作者签名：硷丝 指导教师签名：! 型丝受边 砌岔年岁月) 7 日多加矿年厂月7 日 l| 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：誊伍 2 玖摩年夕月多9 日 ， 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 第一章综述 1 1 引言 毛细管电泳( c 印i l l a d ，e l e c t r o p h o r e s i s ，简称c e ) 又称高效毛细管电泳 ( h p c e ) ，是2 0 世纪8 0 年代兴起并且迅速发展起来的一种新型液相分离分析方 法，是现代分析化学中继高效液相色谱之后的又一重大发展，它一出现就引起分 离科学界极大的关注。目前，它已成为和2 0 世纪5 0 年代末、6 0 年代初出现的 气相色谱( g 嬲c h r o m a t o 伊a p l l y ，简称g c ) 以及2 0 世纪7 0 年代初出现的液相色 谱( m 曲p e r f o m a n c el i q u i dc h r o m a t o 黟a p h y 简称h p l c ) 相媲美的一种分离技 术，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究方向，也是近二十年来发展最 快的分离分析技术之一。它使物质的分离从微升水平进入纳升水平，并使单细胞 分析，乃至单分子分析成为可能。可应用于药物分析、生化分析、环境分析、食 品分析等几乎所有的分析领域。 1 2 毛细管电泳的基本原理、分离模式、检测方法和特点 一、基本原理 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组 分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。c e 的基本仪 器装置由毛细管、缓冲液槽、进样系统、高压电源和检测器组成，如图1 1 所示。 其中毛细管是c e 的关键部件，它由石英制成，外壁涂以聚合物以增强毛细管的 韧性及强度。内壁分为涂层和无涂层两种。毛细管的内径一般是2 5 p m 1 0 0 肛m ， 减小内径和增加毛细管的长度都可以提高分离效率。缓冲液槽是用来盛放缓冲液 的。电渗流在毛细管电泳中起着非常重要的作用，而缓冲液的p h 值及浓度对电 渗流的影响很大，并对分离度产生影响。目前c e 主要的进样方式有压差进样和 电动进样。c e 可以配以各种类型的检测器，如紫外检测器、荧光检测器、电化 学检测器等。 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 图1 一lc e 的基本装置 毛细管电泳仪的工作原理：毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在p h 3 的情 况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成一双电层。在高电压作用下，电层中 的水合阳离子引起流体整体朝负极方向移动的现象叫电渗流。粒子在毛细管内电 解质中的迁移速度等于电泳和电渗流( e o f ) 两种速度的矢量和。正离子的运动 方向和电渗流方向一致，故最先流出；中性粒子的电泳速度为“零”，故其迁移速 度相当于电渗流速度；负离子的运动方向与电渗流方向相反，但因电渗流速度一 般都大于电泳速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同 而实现了分离。 二、分离模式 c e 可分析的成分小至无机离子，大至生物大分子，如蛋白质、核酸等。可 用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，肿c e 分析高效、 快速、微量。根据其分离样本的原理不同，主要分为以下几种类型：毛细管区带 电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) ，毛细管等速电泳( c a p i l l a 叮 i s o t a c h o p h o r e s i s ，c i t p ) ，胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re 1 e c 仃0 1 【i n e t i cc a p i l l a 巧 c h r o m a t o 伊印y ，m e c c ) ，毛细管凝胶电泳( c a p i l l a 巧g e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) ， 毛细管等电聚焦( c 印i l l a 拶i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c 正f ) 。随着毛细管电泳技术的 不断发展，逐渐出现了非水毛细管电泳( n o n q u e o u sc a p i l l a 巧e l e c 仃o p h o r e s i s ， n a c e ) 、毛细管阵列电泳( c a p i l l a r y a r r a ye l e c n d p h o r e s i s ，c a e ) ，毛细管电泳免 疫分析( c a p i l l a 巧e l e c t r o p h o r e s i sb a s e dh n m u i l o a s s a y ，c e 认) 、毛细管电色谱 ( c 叩i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o 乒a p h y c e c ) 等分支。非水毛细管电泳法是在以非水 介质为溶剂的缓冲溶液中进行的，主要用于分析不易溶于水而易溶于有机溶剂的 2 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 物质，分离在水溶剂毛细管电泳中淌度十分相似的物质。毛细管阵列电泳是在常 规毛细管电泳法原理和技术的基础上，结合微型制造技术设计出来的一种检测技 术，是一种新型的生物芯片。毛细管电泳免疫分析技术利用抗原抗体复合物与游 离的抗原、抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为分离与检测手段。毛细 管电色谱是一种在毛细管内充填、涂布或键合色谱固定相，用电渗流作为驱动力 的分离模式。 三、检测方法 紫外检测法( u v ) 是c e 常用的检测方法。常规的检测器还有灵敏度很高 的荧光( f l ) 检测器，检出限为10 7 m o l l 。近些年，在实际应用中还产生了灵 敏度达到1 0 d 4 m 0 1 l 的激光诱导荧光( l ) 检测器、有良好选择性的安培( e c ) 检测器、通用性很好的电导( e d ) 以及可以获得结构信息的质谱( m s ) 等多种 检测器。 四、特点 与经典电泳相比，毛细管电泳法克服了由于焦耳热引起的谱带宽和柱效较低 的缺点。c e 引入高的电场强度，改善了分离质量，具有分离效率高、速度快和 灵敏度高等特点，而且所需样品少、成本低，更为重要的是，它又是一种自动化 的仪器分析方法。毛细管电泳法与高效液相色谱一样同是液相分离技术，在很大 程度上两者互为补充，但无论从效率、速度、用量和成本来说，毛细管电泳法都 显示了它独特的优势：如毛细管电泳成本相对较低，且可通过改变操作模式和缓 冲液成分，根据不同的分子性质( 如大小、电荷数、疏水性等) 对极广泛的物质 进行有效分离；而高效液相色谱法要用价格昂贵的色谱柱和溶剂。可见，毛细管 电泳法具有仪器简单、分离模式多样化、应用范围广、分析速度快、分离效率高、 灵敏度高、分析成本低、环境污染小等优点。 1 3 毛细管电泳的进展 1 3 1 毛细管电泳技术的发展概况 如果以毛细管区带电泳( c z e ) 的出现为起点，毛细管电泳技术的起源可以 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 追溯到2 0 世纪6 0 年代中期，瑞典科学家h i e r t e n 【1 】首先提出毛细管区带电泳的概 念。他采用了内径为3 m m 的石英管来研究细胞的电泳分离，为锐化区带，以甲 基纤维素涂布管壁并使分离管绕轴旋转。该方法构思奇巧，但操作麻烦，未能推 广。1 9 7 0 年，等速电泳研究先驱e v e r a e r t s 等报道了关于等速电泳中的区带电泳 效应的研究【2 l ，所用方法为现代c e 雏形，可惜当时的分离效率低下，未引起人 们的关注。1 9 7 9 年，m i l ( 1 【e f s 等以2 0 0 “m 内径的聚四氟乙烯管做电泳，获得了 小于1 0 “m 板高的分离效果【3 】，成为c e 发展史中的第一个重大突破。接着，1 9 8 1 年j o 玛e n s o n 和l u k a c s 使用7 5 m 内径的熔融石英毛细管做c z e ，以电迁移进样， 结合荧光检测，在3 0 k v 电压下产生了4 1 0 5 p l a t e s m 个理论塔板数的空前高分离 效率【4 】，成为毛细管发展史上的一个里程碑。此后，1 9 8 3 年硒e n e l l 先后提出了 毛细管凝胶电泳法【5 1 和毛细管等电聚焦法【6 1 ，不仅大幅度地提高了电泳效率，而 且使之实现了操作自动化，便于定性和定量工作。1 9 8 4 年，t e r a b e 运用含十二 烷基硫酸钠( s d s ) 胶束的缓冲液分离了中性组分【| 7 1 ，从而建立了胶束电动毛细 管色谱( m e c c ) ，电泳与色谱的结合从此开始。1 9 8 6 年，l a u e r 报道了应用c e 分离蛋白质，效率高达l o l a t e 咖理论塔板数【8 】，逼近理论极限。一时间，关于 c e 的研究急速升温，许多科学家和分析仪器厂商都先后投入到c e 的研究中。 随之，商品仪器于1 9 8 8 年推出了。1 9 9 0 年改进和应用了紫外检测器，1 9 9 2 年激 光诱导荧光检测器的应用。至此，毛细管电泳仪得到不断改进和完善，不到2 0 年的时间，在世界范围内就已推出十几种型号的毛细管电泳仪。目前，毛细管电 泳技术已成为分析化学中发展最为迅速的分析方法之一，其研究已成为分析化学 领域的热门方向，研究论文数直线上升，应用范围迅速扩大。 1 3 2 基础理论研究的不断深入 c e 涉及许多基本的理论问题，如区带增宽和塔板高度计算，分离度优化， 溶质与柱壁间的互相作用，热效应，电渗流等，深入的研究这些问题将有助于 c e 技术的进一步提高与应用的迅速推广。 区带增宽的理论模型及板高计算，一直是人们关注的基本理论问题。1 9 8 9 年，i 址o d e s 等【9 1 和g i d d i n g s 对影响区带增宽因素进行了定量分析。1 9 9 0 年f o l e y 提出优化c e 分离度的理论【1 1 】。1 9 9 3 年，林炳承等【1 2 】也对c z e 中各种影响区带 4 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 增宽的因素进行了定量分析，得到计算c z e 区带宽度的数学表带式，用计算机 对多肽的c z e 分析进行了全过程模拟。k h a l e d i 等讨论了酸性和碱性化合物在 m e c c 中的迁移行为【1 3 】。k e i l n d l e r 等【1 4 】讨论了c g e 的分离效率和峰增宽。l u c h e y 等【1 5 1 提出优化c g e 分离d n a 的模型。t r 印p 【1 6 1 利用动力学色谱和毛细管电泳技 术测定了速率常数，进而直接计算得到甲巯丙脯酸异构化的势垒；m u z i k a r 等【1 7 1 采用实验设计和人工神经网络( a n i f i c i a ln e u r a ln e 帆o r k 砧呵n ) 相结合的方法， 对高浓度氯离子溶液中含有的硫酸盐进行了测定。 1 3 3 技术研究的逐步完善 早期的毛细管电泳仪大多是研究工作者自己组装而成的，自1 9 8 8 年出现商 品c e 后，短短几十年间，世界范围内就已推出十几种型号的商品仪器。由于毛 细管电泳表现出的高分离效率及广阔的应用范围，使得其研究和应用不断深入。 特别是联用技术的发展，如：毛细管电泳质谱联用( c e m s ) ，毛细管电泳x 射线相关检测联用，毛细管电泳拉曼光谱联用( c e r s d ) 等和柱技术以及包括 样品处理在内的进样技术的研究。 1 3 3 1 联用技术 一、毛细管电泳质谱联用 与质谱( m s ) 的联用，是毛细管电泳发展史中的一个重大事件。自1 9 8 7 年 第一次报道c z e m s 工作【1 8 】以来，c e m s 研究已经历近2 0 多年的发展。c e m s 可分为在线联用和离线联用两类。在线联用有许多优势，比如能减小样品损失、 操作容易实现自动化、可以用于选择性检测、能直接给出总离子流图或给出特定 离子的电泳图和质谱数据。但是在线方法也存在许多问题，首先是它限制了离子 源的使用，仅电喷等几种有限方法可以选用；其次是在线c e 。m s 通常不允许采 用最佳的缓冲条件，这就基本上限制了c e 优势的发挥；此外，因为c e 出峰快， 欲进行二级质谱研究，时间常常不够。离线联用则能克服上述问题，且操作简单， 特别是允许c e 优化其分离条件。离线联用不存在溶剂转移问题，因此无需对 c e 和m s 仪器进行过多的改造。 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 二、毛细管电泳x 射线相关检测技术 x 射线发射光谱和x 射线荧光是基于x 射线的检测技术，它们的灵敏度非 常高，但是成本比较昂贵，因此有关这类技术与毛细管电泳联用的报道比较少。 但是，由于x 射线发射光谱和x 射线荧光具有高灵敏度的优点，所以仍然吸引 了研究工作者对其与毛细管电泳联用技术的可能性进行探索。黜n g o 建立了同步 加速x 射线荧光与毛细管电泳联用系统，其可以进行多元素同时在线分析。但 是它所用毛细管要求特别高，普通毛细管无法替代【1 9 】。 三、毛细管电泳激光诱导荧光检测技术 激光诱导荧光( l ) 用于c e 检测以其高的灵敏度等特点引起了广大研究 工作者的兴趣。c e l i f 的建立很快得到了广泛的应用。l i u 等利用c e l 对腐 胺、组胺、尸胺、酪胺等进行了测定，检出限提高到5 1 0 1 0 1 0 1 0 。1 0 m 0 1 刖2 们。 z 1 0 t o r z y l l s k a 等对甲胺、二甲胺、吗啉等7 种低分子量的胺用异硫氰酸荧光素 ( f i t c ) 衍生进而应用c e l 检测分析，其检出限在5 啦! 5 0 p 咖l 水平【2 。 z a u g g 建立的分析尿液中的阿斯匹林的代谢物水杨酸、龙胆酸、水杨尿酸的 c z e l 方法，无需进行萃取，只需作简单的过滤及稀释便可进行分析【2 2 1 。 1 3 3 2 柱技术 作为毛细管电泳分离的核心部件，毛细管的制备始终是人们关心的重点。所 谓的毛细管制备，是指用动态吸着、物理吸附或化学键合的方法对内壁表面进行 修饰或改性。给毛细管内壁修饰上某种材料，可以达到抑制样品吸附、改善分离、 改变分离机制、控制电渗流等目的，所以修饰技术是毛细管制备中的关键技术。 表1 1 列举了毛细管的不同修饰方法。 6 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 表1 1 修饰技术 方法类型 试剂种类 作用机理 备注 p h 法 h + 或o h 改变硅羟基解离度影响电渗，改变分离 金属离子改变管内壁电荷量影响电渗，改善分离 静电电渗大小与方向控 吸引二胺或有机铵盐等改变电荷量与符号制，抑制碱性样品吸 动态 附 吸着 纤维素，葡萄糖，聚 掩盖电荷，增加表面 抑制电渗，抑制样品 分子间力 丙烯酰胺等黏度吸附 表面活性剂，如s d s ，电渗大小及方向控 表面张力改变电荷量与符号 c t a b 等制，改善分离 健合类型为 s i o s i r ，制备比较 容易，在p h = 和7 ( 某 桥连过渡 聚丙烯酰胺，五氟芳些为9 ) 之间稳定， 改变电荷量与符号或 化学基，p e g ，p e o 等疏水涂层会增加蛋白 改变管壁其他物化性 键合质的吸附水平 质 键合类型为s i c r ， 直接键合 p h 稳定范围宽 涂层稳定，可耐极端 溶胶凝胶多种硅烷化试剂 p h 适合碱性物质分离， 物理吸附聚乙烯亚胺，环氧树 改变电荷符号，掩盖 减小吸附，p h 稳定范 化学交联脂电荷 围较宽 掩盖或改变电荷量或 稳定性较差，能改善 物理涂布吸附 纤维素及其衍生物 符号分离 7 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 1 3 3 3 迸样技术 毛细管电泳技术的高分离性能以及消耗试剂少等特点使其在化学、生物、环 境等领域得到了广泛的应用。但是在分析痕量样品时，其灵敏度通常达不到分析 的要求，限制了它的应用和推广。这时就需要将样品柱上富集或在线预富集，以 提高分析的灵敏度。 一、柱上富集 毛细管电泳在线富集技术是适应当前痕量分析的要求而发展起来的样品在 线富集检测技术，它不需要特殊的设备、消耗试剂少、操作简单、成本较低、灵 敏度高。因此，其已在c e 中得到了应用。 l 、场放大样品堆积( f i e l d - a m p h n e ds a m p l es t a c “n g ，f a s s ) 在这一方法中，样品用与缓冲液( 高电导) 不同的低电导溶液配制。最方便 的样品配制方法是用1 1 0 0 或l 1 0 0 0 的缓冲液配制。经过稀释的缓冲液电导率低。 开始时，毛细管充满了高电导的缓冲液：然后将样品溶液引入毛细管至一定的长 度：样品进入完成后，在毛细管两端施加电压，由于样品溶液的电导率低、电阻 大，因此在样品区间形成高电场，使得离子的迁移速度加快。一旦离子到达缓冲 液和样品溶液的界面，由于电导率增大，电场强度突然降低，离子的迁移速度变 慢，使得样品组分在界面处富集。因为电渗流( e o f ) 的迁移速度高于离子的迁 移速度，所有的组分最终向着毛细管末端的检测窗口迁移( 阳离子的迁移快于阴 离子) ，并以c z e 的模式实现分离。在该方法中，样品的进样体积( 1 0 3 0 毛细管长度) 必须进行优化选择，因为进样体积过大，会导致样品富集困难，使 分离效率变差。 2 、大体积样品堆积( l a r g ev b l u m es a m p l es t a c k i n g ，l v s s ) l v s s 方法中使用的缓冲液与f a s s 使用的缓冲液相似，但是施加的电压极 性正好相反，因而e o f 方向相反。在开始阶段，样品溶解在低电导的缓冲液中 或者溶解在水中。当毛细管中充满高电导的缓冲液后，将样品溶液引入毛细管至 一定的长度，此时毛细管两端施加反向电压，e o f 流向入口端。只有阴离子向 8 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 检测器( 出口端) 迁移并在缓冲液和样品溶液的界面处堆积。同时，阳离子和中 性组分向进样端( 入口端) 迁移并流出毛细管。这时需要仔细地监测电泳电流， 当其达到其初始值的9 5 9 9 时，迅速将毛细管两端的电压调节至正向，使 e o f 改变方向。如果不进行这一改变，阴离子组分就会流失。后面的分离则以 c z e 模式进行。与f a s s 相比，该方法可以允许引入更大的样品量而不会造成分 离的明显变差。为了获得好的重复性，电流需要非常严密地监测。而且需要注意 的是这种方法不能同时分离阴离子和阳离子，对于低淌度组分的分离也有限制。 尉m 掣2 3 1 将大体积样品堆积富集扩大到非水介质中，建立了大体积样品堆积富 集非水介质毛细管电泳分离的分析方法，检出限达到i l i l l o 儿水平，同时将灵敏 度提高了3 0 0 至4 3 0 倍。将大体积样品堆积作为富集手段与高分离的毛细管电泳 结合用于分析软饮料以及乳酸饮料等是比较好的选择，其检出限可降低两个数量 级【2 4 】。 、 3 、p h 修饰的堆积( p h - m o d i f i e ds t a c k i n g ) f a s s 和l v s s 方法是将样品溶解在低电导的溶液中。但是有些样品，如尿 液或血液，因为含有盐，其电导一般很高，如果不对样品进行预处理，很难使用 这些堆积技术。而p h 修饰的堆积方法则能克服这一缺点。在开始阶段，将样品 用高离子强度的溶液配制并通过电迁移进样引入毛细管。然后通过电迁移进样引 入一小段强酸溶液并在毛细管两端施加电压。该强酸中和了样品溶液，产生一中 性区域( 高电阻区域) 。结果在中性区域间产生高电场，导致离子的迁移速度加 快，因此待测组分在中性区域和缓冲液的界面处堆积。a e b e r s o l d 等将碱性基 质中的肽引入到充满酸性背景缓冲溶液的毛细管中。肽在其等电点以上的p h 溶 液中带负电荷，而在等电点以下的溶液中带正电荷。因此当样品区带由碱性变为 酸性时，肽的电泳淌度方向反向，这样在样品溶液和缓冲溶液的界面处形成一个 窄的区带，肽被浓缩，最后带正电荷的肽在酸性溶液中分离，其检测灵敏度可提 高2 3 个数量级。 二、预富集 由于c e 的应用范围非常广泛，几乎涉及到各个领域。但其对样品的要求也 9 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 比较高，特别是一些生物样品，如对其未做任何前处理，可能会给实验结果带来 很大的误差。因此毛细管电泳中的预富集，可以去除样品基质，消除干扰。这些 预富集的方法包括固相萃取、固相微萃取、液相微萃取和微透析等。 l 、固相萃取 固相萃取技术用作净化和预富集技术可以提高分析的选择性和灵敏度。固相 萃取技术具有溶剂消耗量少、预处理时间短等优点。由于离线样品预处理方法都 可能丢失待测组分，而且生物样品量越小，样品预处理越困难。因此，g u z m 锄 等首次将固相萃取技术应用于c e 的在线样品富集，用填充结合抗体的玻璃球浓 集器置于分离毛细管前端，成功地实现了尿液中脱氧麻黄碱的在线浓集和c e 分 离分析2 6 1 。至此，固相萃取毛细管电泳联用技术得以迅速发展【2 7 。2 9 1 。 2 、固相微萃取 固相微萃取技术集样品的萃取、浓缩、解吸于一体，具有操作简便、仪器价 廉、灵敏度高的特点，易于自动化和与其他技术在线联用。固相微萃取是在固相 萃取基础上发展起来的，保留了其所有的优点，摒弃了其需要柱填充物和使用溶 剂进行解吸的弊病，它只要一支类似进样器的固相微萃取装置即可完成全部前处 理和进样工作。该装置针头内有一伸缩杆，上连有一根熔融石英纤维，其表面涂 有色谱固定相，一般情况下熔融石英纤维隐藏于针头内，需要时可推动进样器推 杆使石英纤维从针头内伸出。因此，固相微萃取( s p m e ) 技术自问世以来【3 0 1 ， 其和c e 的联用就受到了广泛的关注【3 1 。3 1 。 3 、液相微萃取 液相微萃取是一种新的利用微量有机溶剂的样品制备技术，它具有比较多的 优点，如快速、廉价、减少了对有毒有机溶剂的接触，同时它可以很好地与气相 色谱、液相色谱、毛细管电泳等仪器联用。它的萃取原理与传统的液液萃取相 同，早期发展源于对流动注射萃取的改进，既简化了实验过程，减少了试剂及有 机溶剂的用量，同时也提高了萃取速度，降低了实验成本。l 锄r 0 1 e 1 1 l ( o 等【3 4 】以液 相微萃取固相微萃取一毛细管电泳联用分析了不同水果中的阿特拉津的含量。通 l o 西北大学硕士学位论文毛细管电泳分析方法及应用研究 过液相微萃取一固相微萃取联用的技术可以使分析物更好的净化和富集。 4 、微透析 微透析通常用来去除特殊的物质，净化样品，可以与很多分离技术进行在线 联用，已经成为一个非常重要的样品预处理工具，在生物医学、药理学以及神经 科学领域广泛用于流动活体采样。近年来，将透析作为样品的预处理手段与毛细 管电泳联用进行痕量分析也有比较多的报道【3 5 3 6 】，其核心部分就是微透析与毛细 管仪器电泳之间的联用接口的设计，既要保证实验动物与毛细管电泳的高电压有 效隔离，又要将每分钟的微升透析流转为不连续的纳升样品进行电泳分析，同时 不增加系统的扩散。 1 4 毛细管电泳在分析技术中的应用 毛细管电泳技术经过2 0 多年的发展，已经在药物分析、手性分离、基因研 究、农残分析、环境分析等领域得到了广泛的应用。 1 4 1 毛细管电泳在药物分析中的应用 药物是用来预防、治疗、诊断人类疾病，有目的地调节人的生理机能并规定 用法、用量的特殊商品。为保证用药的安全、合理与有效，在药品的研制、生产、 供应以及临床使用过程中都必须执行严格的分析检验。药物制剂中成分复杂，除 含有有效成分外，往往还含有一些有效成分的稳定剂或保护剂，一般几毫克的有 效成分需要几十毫克的基体。c e 法具有能排除高含量复杂基体干扰、检测痕量 成分的能力，且样品只需经简单预处理即可分析其有效成分含量，现已广泛应用 于片剂、注射剂、糖浆、滴耳液、乳膏剂及复方制剂等各种剂型中药物成分的定 量测定。李霞等【3 7 】以1 5 m m o l l d 环糊精，5 0 衄o l l 硼砂( p h l 0 5 ) 为缓冲液， 在1 0 m i n 之内分离、测定了板蓝根中的苯甲酸、水杨酸的含量，且回收率高并用 于样品中苯甲酸等含量的测定，取得了满意的结果。韦寿莲等【3 8 1 以1 0 i n i i l o 儿三 ( 羟甲基) 氨基甲烷( 瓢s ) ，3 m m o 姗3 8 0 3 ( p h 8 0 ) 为缓冲液，采用n a c e - 电导法分离、分析了水杨酸类药物。f o t s i n g 【3 9 】等建立了一种同