（分析化学专业论文）荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究和应用.pdf

月菇bi， | | i i ii ii iii i iii lli iii ii 、t19 0 8 718 s t u d ya n da p p l i c a t i o n so ff l u o r e s c e n ts i g n a la m p l i f i c a t i o nf o r b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u e sa n a l y s i s b y g u oq i u p i n g b s ( c e n t r a lc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y ) 19 9 8 m s ( x i a m e nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 1 ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f d o c t o ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a n u n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rw a n gk e m i n d e c e m b e r , 2 0 10 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 秆事呵 引堋7日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名 导师签名 训啤协月7 日 舢引堋7 日 荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究与应用 摘要 多年来，人们一直致力于发展和完善生物大分子的研究和分析方法，使其更 加灵敏、精确、便捷、经济，以满足各个领域对其越来越高的要求。生物分子信 号放大检测技术是近年来发展起来的一种利用各种工具酶和纳米颗粒等手段，并 结合电化学、光学、压电等技术的高灵敏检测方法，可实现对生物分子的直接高 灵敏检测，是生物分析科学领域中的一个研究重点和热点。如何利用现有分子生 物学技术和手段将生物分子的含量、相互作用等信息实时、灵敏、特异地转化为 易于检测的物理量并拓展其在分子生物学及生物医学中的应用，如何设计新的信 号转换手段和建立新的生物分子信号放大检测技术平台来解决生命研究过程中的 新问题，仍然是生物医学和分析化学工作者所面临的重大科学问题。 本论文以上述科学问题为目标，以核酸和蛋白质这两类组成生命的最主要生 物大分子为研究对象，利用多种核酸工具酶和荧光核酸探针技术，建立了一系列 简便、快速的生物大分子荧光信号放大检测技术平台，在核酸定量分析、点突变 ( p o i n tm u t a t i o n ) 检测、多重单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ， s n p s ) 基因分型和蛋白质的的分析方面得到重要应用。主要内容归纳如下： 1 、基于接近连接效应的滚环扩增( r o l l i n gc h a i na m p l i f i c a t i o n ，r c a ) 方法的 建立及用于点突变的高灵敏检测。滚环扩增技术由于具有高灵敏、高特异性和等 温操作等诸多优点，在生物化学分析和临床医学诊断中有很好的应用前景，但同 时也存在着用于扩增的模板挂锁探针的合成难的问题，限制了滚环扩增技术的广 泛应用。本部分在普通的滚环扩增技术基础上，利用接近连接效应原理，建立了 一种滚环扩增模板挂锁探针合成的新方法。该方法不但解决了普通滚环检测技术 中存在的长片段d n a 合成难和成本高的问题，而且提高了线性片段成环的效率， 为滚环扩增的进一步广泛应用提供了帮助，并利用该方法合成的挂锁探针进行滚 环扩增实现了对基因点突变的高灵敏检测。 2 、基于分子信标的等温循环链置换聚合酶反应的荧光信号放大技术用于核酸 的检测。利用特殊设计的长臂分子信标作为聚合酶反应的模板和检测探针，在靶 核酸分子与分子信标杂交中引发引物与分子信标臂部退火，在d n a 聚合酶存在 下产生循环的链置换聚合酶反应，从而实现了对靶核酸的荧光信号循环放大检测。 该技术以靶d n a 诱发链置换聚合酶反应的循环发生来实现信号放大，而无需直 接扩增靶d n a 分子，避免了反应产物污染，并且设计简单、操作简便快捷、在 等温条件下反应，灵敏度高，检测下限可达6 4f m o l l ，为核酸定量分析和病毒 检测提供了一种简单、快速、高灵敏的荧光信号放大分析方法，有望在病毒检测 j i 博士学位论文 分析等方面得到广泛的应用。 3 、基于切刻酶介导的循环链置换聚合反应用于多重s n p s 的荧光信号放大检 测。癌症、心脑血管疾病和精神性疾病等复杂疾病均由多个s n p s 相互作用引起， 因而在关联分析研究中同时对多个s n p s 进行基因分型和检测已成为多基因复 杂性状疾病的遗传易感性研究的重要技术手段。目前基于杂交稳定性的差异或点 突变引起的酶反应速度差异的多重s n p s 基因分型和检测方法具有分析点突变差 异不显著的缺点，并同时很难将多个s n p s 等位基因完全有效地分开，且没有信 号放大检测的过程。本部分设计合成了分别带信号识别序列、酶切位点和引物识 别序列的等位基因核酸探针，通过连接酶反应，巧妙结合切刻内切酶和聚合酶反 应，建立了一种等温、快速、高灵敏和高特异的等温循环荧光信号放大的多重s n p s 检测技术平台。该方法同时将多重s n p s 基因的点突变信号准确转换为了多种具 有显著差异、并可循环生成的单链d n a 信号识别序列分子，并与带不同荧光标 记的分子信标识别，获得不同的荧光信号，从而准确实现了对多重s n p s 的信号 放大检测。该检测平台克服了现有检测方法的缺陷，操作简单，等温反应，既能 准确判断s n p s ，又能将检测信号进行放大，还能对多个s n p s 等位基因同时进行 分析，为相关疾病筛查和临床诊断、防治和手术预后监测提供了一种新的强有力 手段。 4 、利用双链荧光核酸适体探针建立了简便快速的蛋白质的荧光分析方法。核 酸适体因能高效、特异地结合各种配体和具有易合成、易修饰等特点，在蛋白质 检测方面具有广泛的应用前景。本部分基于结构转换信号核酸适体探针的设计， 发展了一种新的基于双链荧光核酸适体探针的蛋白质检测方法。该方法对蛋白质 的线性响应范围为6 0 1 0 0 0n m o l l ，检测下限为6 0n m o l l 。该方法对核酸适体 探针的空间结构和与靶标的结合位点没有特殊的限制和要求，设计简单，操作方 便，有望为基于核酸适体探针的靶物质检测提供一种简便、快速的通用检测平台。 5 、基于发夹型核酸适体探针和聚合酶反应的荧光信号放大检测技术用于蛋白 质检测。核酸分子由于可借助各种工具酶来检测，因而其检测方法远比传统的蛋 白质检测方法灵敏和特异。通过检测核酸来定量蛋白质，一直是人们研究的热点 和重点。本部分设计了一种新型的发夹型核酸适体探针，利用其与靶蛋白反应后 构象发生变化的特点，建立了一种基于聚合酶反应的荧光信号放大的蛋白质检测 新方法。该发夹型核酸适体被设计成蛋白质配体和聚合酶反应模板，当蛋白质与 核酸适体特异性结合后，探针的构象由发夹型转变为线型，成为聚合酶反应的模 板，在引物和聚合酶作用下启动聚合酶反应，聚合酶反应的进程被荧光染料实时 转换为荧光信号，实现了在未直接标记核酸适体的情况下检测蛋白质，同时由于 聚合酶的链置换活性，使诱导发夹型核酸适体构象变化的靶蛋白能在聚合酶反应 中被置换出来，重新诱导下一轮的聚合酶反应，从而可实现对靶蛋白的循环放大 i j i 荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究与应用 检测，对蛋白质的线性响应范围为0 5 8 0n m o l l ，检测下限为o 5n m o l l 。该方 法无须直接标记核酸适体探针、对核酸适体的空间结构无特殊要求、且只需一个 核酸适体靶位点，因而可广泛应用于蛋白质的高灵敏检测。 关键词：核酸探针；荧光信号放大；生物大分子 i v 博士学位论文 a bs t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fg e n o m ep r o je c ta n dp r o t e i np r o je c t ，m o r es e n s i t i v e ， a c c u r a t e ，c o n v e n i e n ta n de c o n o m i cd e t e c t i o nm e t h o d sf o rb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s h a v eb e e nt h ef o c u so fb i o l o g y , m e d i c i n ea n dc h e m i s t r y i nr e c e n ty e a r s ，s i g n a l a m p l i f i c a t i o nd e t e c t i o nt e c h n o l o g i e sb a s e do ne l e c t r o c h e m i c a l ，o p t i c a l ，p i e z o e l e c t r i c t e c h n o l o g i e sa n dt h eu s eo fv a r i o u se n z y m e sa n dn a n o p a r t i c l e s ，h a v er e a l i z e dh i g h l y s e n s i t i v ed e t e c t i o n s o fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s h o wt ou t i l i z et h ee x i s t i n g m o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e sa n dt o o l st oc o n v e r tt h ei n f o r m a t i o no fb i o l o g i c a l m o l e c u l e st od e t e c t a b l es i g n a l sw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y ，h o wt of u r t h e r e x p a n dt h eu s eo fs i g n a la m p l i f y i n gm e t h o d si nm o l e c u l a rb i o l o g ya n db i o m e d i c a l a p p l i c a t i o n ，a n dh o wt od e s i g nn o v e ls i g n a l c o n v e r s i o nm e a n sa n dd e v e l o pn o v e l s i g n a la m p l i f i c a t i o nd e t e c t i o nt e c h n o l o g yp l a t f o r mt oa d d r e s st h er e s e a r c hp r o c e s st o l i f ei nt h en e wi s s u e ，a r es t i l ls i g n i f i c a n tt o p i c sf o rr e s e a r c h e si nb i o m e d i c a l a n d a n a l y s i sc h e m i c a la r e a s i nt h i st h e s i s ，as e r i e so ff l u o r e s c e n c es i g n a la m p l i f y i n gd e t e c t i o nt e c h n o l o g y p l a t f o r m sb a s e do nav a r i e t yo fn u c l e i ca c i de n z y m e sa n df l u o r e s c e n tn u c l e i ca c i d p r o b e sh a v eb e e nd e v e l o p e d f o rq u a n t i t a t i v e a n a l y s i so fd n a ，p o i n tm u t a t i o n d e t e c t i o n ，m u l t i p l es i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) g e n o t y p i n ga n dp r o t e i n d e t e c t i o n t h em a i nr e s e a r c h e si n c l u d e di nt h i sd i s s e r t a t i o na r ep r e s e n t e da s f o l l o w i n g ： 1 t h ec o n s t r u c t i o no fap a d l o c kp r o b ef o rr o l l i n gc h a i na m p l i f i c a t i o nb a s e do n p r o x i m i t y l i g a t i o na n dd e t e c t i o no fp o i n tm u t a t i o n r o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n ( r c a ) h a saw i d er a n g eo fa p p l i c a t i o n si nt h eb i o c h e m i c a la n a l y s i sa n dc l i n i c a ld i a g n o s i s d u et oi t sh i g hs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y , i s o t h e r m a lo p e r a t i o na n dm a n yo t h e r a d v a n t a g e s b u tt h i sm e t h o di ss t i l ld i f f i c u l tt oc o n s t r u c tp a d l o c kp r o b e s ，w h i c hh a s r e s t r i c t e dt h er c at ob eu s e dw i d e l y i nt h i sp a r t ，w ed e v e l o p e dan o v e lm e t h o df o r c o n s t r u c t i o no fp a d l o c kp r o b eb a s e do np r o x i m i t y l i g a t i o n t h i sm e t h o da v o i d st o s y n t h e s e sc o s tl o n gd n af r a g m e n ta n di m p r o v e s t h ec o n s t r u c t i o n e f f i c i e n c yo f p a d l o c kp r o b e s h e r e ，p o i n tm u t a n tg e n e sh a v eb e e nd e t e c t e ds e n s i t i v e l yu s i n gt h i s m e t h o d 2 f l u o r e s c e n c es i g n a la m p l i l y i n gd e t e c t i o no fn u c l e i ca c i d sb a s e do ni s o t h e r m a l c i r c u l a rs t r a n d d i s p l a c e m e n tp o l y m e r i z a t i o nr e a c t i o nw i t hm o l e c u l a rb e a c o n i nt h i s v 荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究与应用 m e t h o d ，t h es p e c i f i cl o n g - s t e mm o l e c u l a rb e a c o n ( m b ) i sd e s i g n e da sat e m p l a t eo f p o l y m e r i z a t i o nr e a c t i o na n df l u o r e s c e n c es i g n a lc a r r i e ra n dt h et a r g e ti sd e s i g n e da sa t r i g g e ro fp o l y m e r i z a t i o nr e a c t i o n u p o nr e c o g n i t i o na n dh y b r i d i z a t i o nw i t ht h et a r g e t s s d n a ，t h es t e mo ft h em bi so p e n e d t h eo p e n e dm ba n n e a l sw i t ht h ep r i m e ra n d t r i g g e r st h ep o l y m e r i z a t i o nr e a c t i o nc i r c l e a f t e r c i r c l e ，w h i c hr e s u l t st oa m p l i f i c a t i o n o ff l u o r e s c e n c es i g n a l t h i sd e s i g no fm e t h o di ss i m p l ea n di t so p e r a t i o ni se a s yi n i s o t h e r m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n s t h ed e t e c t i n gl i m i ti s6 4 1 0 15m o l l i ti s e x p e c t e dt op r o v i d eas i m p l e ，f a s ta n ds e n s i t i v ep l a t f o r mf o rd e t e c t i o na n ds u b s e q u e n t a n a l y s i so fn u c l e i ca c i d s ，a n dp o t e n t i a lt ob ew i d e l yu s e di nv i r u sd e t e c t i o n 3 m u l t i p l ef l u o r e s c e n c es i g n a l sa m p l i f y i n gd e t e c t i o no fs n p sb a s e do nn i c k i n g e n z y m em e d i a t e dc i r c u l a rs t r a n d d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s er e a c t i o n i nt h i sp a r t ， b a s e do nn i c k i n ge n z y m em e d i a t e dc i r c u l a rs t r a n d - d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s er e a c t i o n ， a ni s o t h e r m a lf l u o r e s c e n c es i g n a l sa m p l i l y i n gm e t h o df o rm u l t i p l es n p sd e t e c t i o n p l a t f o r m ，i se s t a b l i s h e dt h r o u g ht h eu s eo fm u l t i p l e xa l l e l e s p e c i f i cp r o b e sc o n t a i n i n g s i g n a ld i s c r i m i n a t i n gs e q u e n c e s ，n i c k i n ge n z y m es i t e sa n dp r i m e ra n n e a l i n gs i t e t h e t r i c ko ft h i sm e t h o di st od i v e r tt h ea l l e l e s p e c i f i cd i s c r i m i n a t i o n st o m u l t i p l e x f l u o r e s c e n c es i g n a l s t h i sm e t h o di ss i m p l ea n de a s yt oo p e r a t i o n f u r t h e r m o r e ，t h i s a s s a yc o u l dn o to n l yd e t e r m i n et h es i t e so fm u l t i p l e xs n p s ，b u ta l s oi d e n t i f yt h e m a c c u r a t e l y t h i sa p p r o a c hw o u l db e ap r o m i s i n gt e c h n o l o g yf o rm u l t i p l es n p s g e n o t y p i n g 4 d e v e l o p m e n t o fa s i m p l e m e t h o df o r p r o t e i n d e t e c t i o nb a s e do n d o u b l e s t r a n d e df l u o r e s c e n ta p t a m e rp r o b e a p t a m e rh a saw i d er a n g eo fa p p l i c a t i o n s f o rp r o t e i nd e t e c t i o nd u et oi t se a s yt os y n t h e s i sa n dl a b e l ，h i g ha n ds p e c i f i ca f f i n i t y w i t hi t st a r g e t i nt h i sp a r t ，an o v e lm e t h o dw i t had o u b l e s t r a n d e df l u o r e s c e n tp r o b e f o rp r o t e i nd e t e c t i o nh a sb e e nd e v e l o p e d al i n e rr a n g eo f6 0 10 0 0n m o l lo f p r o t e i nd e t e c t i o ni sa c h i e v e d t h em e t h o dh a sad e t e c t i o nl i m i to f6 0n m o l l t h i s s t r a t e g y i s e a s yt og e n e r a l i z ef o ra n ya p t a m e rw i t h o u tp r i o rk n o w l e d g eo fi t s s e c o n d a r yt e r t i a r ys t r u c t u r e ，a n dw o u l db eu s e da sas i m p l ea n dg e n e r a lt o o lf o r p r o t e i nd e t e c t i o n 5 f l u o r e s c e n c es i g n a la m p l i f y i n gd e t e c t i o no fp r o t e i nb a s e do nh a i r p i na p t a m e r p r o b ea n ds t r a n d d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s er e a c t i o n i nt h i sp a r t ，an o v e lf l u o r e s c e n t m e t h o do fp r o t e i nd e t e c t i o nh a sw a sd e v e l o p e du s i n gh a i r p i na p t a m e rb a s e do n p o l y m e r a s er e a c t i o n t h eh a i r p i na p t a m e rw a sd e s i g n e dt ob ee m p l o y e da st h ep r o t e i n l i g a n da n dt e m p l a t eo ft h ep o l y m e r a s er e a c t i o n w h e nt h ea p t a m e rw a sb o u n dt ot h e p r o t e i n ，i tw o u l dc h a n g et o al i n e rs t r a n da n di n d u c et h e s t r a n d d i s p l a c e m e n t v i 博士学位论文 p o l y m e r a s e r e a c t i o n t h e np r o t e i nd e t e c t i o nw a sc a r r i e do u tb ym o n i t o r i n gt h e p o l y m e r a s er e a c t i o nw i t h o u td i r e c t l yl a b e l i n gw i t ht h ea p t a m e r t h e nt h ed i s p l a c e d p r o t e i nc o u l db i n dt ot i l ea p t a m e ra g a i na n dt r i g g e r an e x ts t r a n d - d i s p l a c e m e n t p o l y m e r a s er e a c t i o n ，l e a d i n gt o f l u o r e s c e n c es i g n a la m p l i f y i n gd e t e c t i o no ft a r g e t p r o t e i n t h er e s u l t s h o w e dt h em e t h o dw i t hal i n e rr a n g eo f0 5 - 8 0n m o l la n d d e t e c t i o nl i m i to f0 5n m o l l t h i sp r o p o s e dm e t h o dh a st h ep o t e n t i a lt od e s i g no t h e r p r o t e i np r o b ew i t hc o m p l e xs t r u c t u r ea p t a m e ra n db eu s e da sas i m p l ea n dg e n e r a l t o o lf o rp r o t e i nd e t e c t i o n k e yw o r d s ： n u c l e i ca c i dp r o b e ；f l u o r e s c e n ts i g n a la m p l i f i c a t i o n ；b i o l o g i c a l m a e r o m o l e c u l e v i i 荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究与应用 目录 学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书i 摘 要一i i a b s t r a c t v 目录v i i i 第1 章绪论1 1 1 核酸和蛋白质检测的意义1 1 2 核酸和蛋白质的主要检测方法1 1 3 核酸分子体外扩增技术及其在生物大分子检测中的应用2 1 3 1 聚合酶链式反应( p c r l 2 1 3 2 链替代扩增技术( s d a ) 2 1 3 3 核酸依赖的扩增技术( n a s b a ) 3 1 3 4q1 3 复制酶技术4 1 4 生物分子信号放大检测技术及其在生物分析检测中的应用4 1 4 1 基于酶联催化反应的信号放大检测4 1 4 2 基于滚环扩增( r c a ) 的信号放大检测6 1 4 3 基于切刻内切酶介导的链置换聚合酶反应信号放大检测9 1 4 4 基于核酸酶切反应的信号放大检测1 0 1 4 5 基于接近连接酶反应的信号放大检测一1 2 1 4 6 基于脱氧核酶( d n a z y m e ) 催化的信号放大检测1 4 1 4 7 基于纳米粒子的信号放大检测1 6 1 5 本论文拟开展的工作j1 8 第2 章基于接近连接的r c a 探针的合成及用于点突变的高灵敏检测2 1 2 1 引言21 2 2 实验部分2 2 2 2 1 仪器与试剂2 2 2 2 2 实验方法2 2 2 3 结果与讨论2 5 2 - 3 1 实验设计原理一2 5 2 3 2 接近效应连接模板的筛选一2 6 2 3 3 两种方法合成挂锁探针效率的比较一2 8 2 3 4 对点突变的高灵敏检测一2 9 第3 章基于等温循环链置换聚合酶反应的核酸信号放大检测方法一3 2 博士学位论文 3 1 引言 3 2 3 2 实验部分3 3 3 2 1 仪器与试剂3 3 3 2 2 实验方法3 4 3 3 实验结果和讨论3 5 3 3 1 实验设计原理3 5 3 3 2 长臂m b 的设计3 6 3 3 3m b 性能的考察3 7 3 3 4m b 茎部与靶d n a 互补碱基长度对检测的影响3 8 3 3 5 引物长度的对检测的影响3 9 3 3 6 等温循环链置换聚合酶反应对靶d n a 的检测4 0 3 3 7 等温循环链置换聚合酶反应放大定量分析靶d n a 一4 2 3 3 8 循环链置换聚合酶反应转化率的计算4 4 第4 章切刻酶介导的循环链置换聚合酶反应用于多重s n p s 的荧光信号放大检 澳0 4 7 4 1 引言4 7 4 2 实验部分4 8 4 2 1 仪器与试剂4 8 4 2 2 实验方法5 0 4 3 结果和讨论5 1 4 3 1 实验设计原理5 1 4 3 2m b 对信号识别序列检测性能的考察5 3 4 3 3 对点突变的荧光信号放大检测一5 5 4 3 4 多重s n p s 基因分型检测一5 7 4 3 5 方法的灵敏度和特异性检测5 9 第5 章双链荧光a p t a m e r 探针用于蛋白质的简便快速检测一6 2 5 1 前言6 2 5 2 实验部分6 3 5 2 1 试剂与仪器6 3 5 2 2 实验方法6 3 5 3 结果与讨论6 4 5 3 1 实验设计原理6 4 5 3 2 互补d n a 序列的筛选6 5 5 3 3 检测条件的优化6 6 5 3 4 双链荧光a p t a m e r 探针对蛋白质的检测6 8 i x 荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究与应用 5 3 5 特异性考察一7 0 第6 章基于发夹型核酸适体探针和聚合酶反应的蛋白质荧光信号放大检测7 1 6 1 引言7 1 6 2 实验部分7 2 6 2 1 试剂与仪器7 2 6 2 2 实验方法7 2 6 3 结果和讨论7 3 6 3 1 发夹型核酸适体探针的设计及检测原理7 3 6 3 2 发夹型核酸适体探针的筛选7 5 6 3 3 引物长度筛选7 6 6 3 4 基于发夹型核酸适体和聚合酶反应对蛋白质定量分析7 7 6 3 5 方法特异性考察7 8 结论8 0 参考文献8 2 附录攻读学位期间所发表的学术论文目录1 0 2 致谢1 0 4 x 博士学位论文 本文所用英文缩写词表 x i 博士学位论文 第1 章绪论 1 1 核酸和蛋白质检测的意义 核酸和蛋白质是组成生命的最主要两类生物大分子。核酸是生物的基本遗传 物质，是基因表达的基础，它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能，在生物 的生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位【l 。3 】。蛋白质 是基因表达的最终产物，是细胞内各类代谢和调控等生命功能的执行者，也是致 病因子、药物对机体作用的最重要的靶分子。人类的绝大多数疾病都是由蛋白质 异常引起的，蛋白的表达指示了细胞的生理和病理状态，揭示了药物及环境因素 对生命体的影响，系统性的蛋白质表达研究是理解生命现象、疾病进程和药物作 用所必需的 4 - 6 】。因此核酸和蛋白质己成为现代生物学、化学和医学中的重要研究 领域，对它们的研究和分析将会对疾病诊断、基因治疗和新型药物筛选等诸多方 面产生非常重要的意义1 7 以。 1 2 核酸和蛋白质的主要检测方法 多年来，人们一直致力于发展和完善核酸和蛋白质的研究和分析方法，使其 更加灵敏、精确、便捷、经济，以满足各个领域对其检测越来越高的要求。核酸 杂交技术是最早的核酸检测方法，也是目前大多数常用检测方法的基础。核酸杂 交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性、核酸标记物的灵敏度而建立的 检测核酸及其结构与功能的方法。通过制备带有不同标记物的探针，利用核酸杂 交技术可以在均相及固相界面对特定的d n a 或r n a 分子进行定性或定量检测。 基于核酸杂交原理的核酸经典分析方法主要包括有s o u t h e r n 印迹杂交【l2 1 、 n o r t h e r n 印迹杂交【1 3 , 1 4 和原位杂交【1 5 】等。然而这些方法都操作繁琐、费时，灵敏 度低。与核酸研究相比，蛋白质的复杂性、缺少高通量蛋白质检测技术和检测灵 敏度低等原因使蛋白质研究受到了很大的制约。传统的免疫分析技术主要有酶联 免疫吸附测试( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) l 1 6 】、w e s t e r nb l o t 1 。7 1 、 免疫荧光技术【1 8 j 、免疫组化技术【1 9 】等。目前，这些传统方法仍然是蛋白质分析的 主要手段。但以上技术实验过程复杂，操作繁琐，效率低，不适合系统化、大规 模的蛋白质组学研究。 随着生物技术的不断发展，一些新的灵敏和特异的核酸和蛋白质分析技术不 断涌现。核酸探针为一类可以在分子水平上进行设计、标记、合成的分子探针， 荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究与应用 并可利用核酸与核酸、核酸与蛋白质之间的相互作用关系，将生物分子的成分、 序列、结构和相互作用等信息转变为光电等信号，在现代医学、生命科学、生物 化学、分子生物学和蛋白质组学研究等诸多领域得到了广泛的应用 2 0 - 5 1 】。然而直 接利用核酸探针检测技术的原理主要是通过探针与靶d n a 的核苷酸碱基互补杂 交或与蛋白质的相互作用来进行检测的，而当靶d n a 或蛋白质的浓度很低时， 直接进行检测的效果就比较差。 1 3 核酸分子体外扩增技术及其在生物大分子检测中的应用 核酸分子体外扩增技术是近年来发展起来的一类核酸检测技术，它们能在短 时间内将靶核酸分子扩增放大数百万倍，使检测灵敏度得到极大的提高，是目前 生物医学与化学生物分析研究的重要手段，同时也在临床医疗诊断、基因突变监 测和分子进化等方面具有重要用途。下面就核酸体外扩增技术进行简单介绍。 1 3 1 聚合酶链