（生物化学与分子生物学专业论文）哮喘疾病中锌转运体表达的初步研究.pdf

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l m r n a 表达下降 了4 5 ，哮喘组中z n t - l m r n a 表达上升了6 7 ，地塞米松干预组z n t - l m r n a 表达 上升了4 5 ；z i p - 8 m r n a 和z i p - 1 3 m r n a 在对照组中的表达明显低于缺锌哮喘组、 哮喘组以及地塞米松干预组；与哮喘组相比，低锌哮喘组中z n t - l m r n a 显著下降 山东大学硕士学位论文 了6 7 ，z i p - 8 m r n a 和z i p - 1 3 m r n a 表达升高，地塞米松干预组中z n t - l m r n a 、 z i p - 8 m r n a 和z i p 一1 3 m r n a 表达均没有明显的改变。 二、哮喘婴儿血清锌含量显著低于对照组婴儿( p 0 0 1 ) ；哮喘患a , # i - 周 血免疫球蛋白e 含量明显高于正常对照组婴儿：哮喘组婴儿和对照组婴儿外周血 白细胞中z n t - 1 ，z n t - 3 ，z n t - 5 ，z i p - 1m p , n a 表达没有显著的差异；哮喘患儿组 外周血白细胞中z i p - 2 m r n a 表达明显高于对照组婴儿( p o 0 1 ) 。 结论： 低锌干预后，低锌哮喘组大鼠肺组织z n t - l m r n a 的表达降低，z i p - 8 m r n a 和 z i p - 1 3 m r n a 表达升高；哮喘模型大鼠肺组织z n t - l m p , n a 、z i p - 8 m r n a 和z i p - 1 3 m r n a 表达增加，地塞米松干预后，锌转运体表达无明显改变；哮喘儿童外周血白细胞 中，z i p - 2 m r n a 表达明显升高。 意义： 锌是生物体必需的微量元素，六大功能性蛋白家族中超过3 0 0 种金属酶需要 锌作为其关键的结构组分或者是辅助因子，广泛参与生物体代谢，还涉及到细胞 的生长、增殖和分化。两个大的基因家族参与了哺乳动物锌的代谢调节：z n t 和 z i p 。z n t 蛋白能够促进细胞质锌的外流以及使锌在各细胞器内区室化，从而降 低细胞浆锌的含量；z i p 则能够增加锌的内流摄取或者促进细胞器内锌的释放， 来增加胞浆中锌的含量。在哺乳动物中，饮食中锌水平不足会导致皮肤病病变， 生长迟缓，精神障碍，并损害免疫系统和生殖系统。在动物中，锌平衡的保持主 要是通过调节肠吸收率，过量锌的排除，肾重吸收和分配到细胞中，包括细胞内 存储。很多文献中提到急性和慢性炎性疾病实验动物模型中锌的代谢发生改变， 病例对照研究发现，锌摄入量低的人遗传过敏症，哮喘和过敏性反应型的症状相 结合的风险是锌摄入量高的人的4 到5 倍，哮喘病人血清锌含量要低于健康对照 患者。哮喘和锌缺乏都被认为是有利于t h 2 细胞炎性因子产生，系统性锌缺乏的 哮喘病人有可能进一步增加t h 2 细胞促炎性因子的产生。哮喘是许多慢性炎症疾 病中的一种，是世界公认的医学难题，被世界卫生组织列为疾病中四大顽症之一。 据调查，在我国至少有2 0 0 0 万以上哮喘患者，哮喘的发病机制和发病原因非常 复杂，因此探讨哮喘疾病中锌转运体的表达以及锌对锌转运体表达的影响很有必 要。 2 3 p o s t g r a d u a t e ：x ut o n g - f u s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gl i a n - y i n g p r o f e s s i o n ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y a b s t r a c t o b j e c t i v e n l ez i n cd e f i c i e n c ya s t h m a t i cr a t s m o d e l sw e r ee s t a b l i s h e di no r d e rt oe x p l o r e e f f e c t so fd i e t a r yz i n ca n dd e x a m e t h a s o n eo nt h ez i n ct r a n s p o r t e r se x p r e s s i o ni nr a t s l u n gt i s s u e a n dl e u c o c y t e s c h a n g e so fz i n ct r a n s p o r t e r s m r n ae x p r e s s i o ni n p e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e so fn o r m a li n f a n t sa n da s t h m a t i ci n f a n t si na s t h m a t i c d i s e a s ew a sp r e l i m i n a r ys t u d i e d m e t h o d s 2 0m a l ew i s t a rr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o4g r o u p s ：z i n c - l o w e ro v a g r o u p 、o v ag r o u p 、c o n t r o lg r o u pa n dd e x a m e t h a s o n et r e a t e dg r o u p z i n c - l o w e rg r o u p w a sg i v e nt h el o w - z i n cf e e da n dt h eo t h e rg r o u pw a sg i v e nn o r m a lf e e d 1 1 1 e a s t h m a t i cr a t s m o d e l sw e r ee s t a b l i s h e da c c o r d i n gt ot h el i t e r a t u r e mb o d yw e i g h t a n d 向o di n t a k eo ft h er a t sw e r er e c o r d e de v e r yt w od a y s 1 1 1 ea n i m a l sw e r ek i l l e d a f t e r5w e e k s ，a n dt h ec o n t e n to fz i n ci nt h el u n ga n ds e r u mw a sm e a s u r e d ，a n dt h e m r n ae x p r e s s i o no fz i n ct r a n s p o r t e ro ft h el u n gt i s s u ea n dp e r i p h e r a lb l o o d l e u k o c y t e sw e r et e s t e dv i ar t - p c rm e t h o d ar o u t i n eb l o o dt e s td a t a 、l e ed a t a 、s e r u l nz i n cc o n c e n t r a t i o nd a t aa sw a l la s 撇b l o o do f9n o r m a li n f a n t sa n d9i n f a n t sw i t hb r o n c h i a la s t h m aw e r ec o l l e c t e d 1 1 地m r n ae x p r e s s i o no fz i n ct r a n s p o r t e ro f p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e sw a st e s t e d v i al u 卜p c rm e t h o d r e s u l t s w e i g h to fz i n cd e f i c i e n ta s t h m a t i cr a t sw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ec o n t r o l 4 d e f i c i e n c ya s t h m a t i cg r o u p ，a s t h m a t i cg r o u pa n dd e x a m e t h a s o n ei n t e r v e n t i o ng r o u p c o m p a r e d 丽mt h ea s t h m a t i cg r o u p ，z n t - i m r n ae x p r e s s i o no fz i n cd e f i c i e n c y a s t h m a t i cg r o u ps i g n i f i c a n t l yd e = c i e a s e db y6 7 ，z i p - 8 m r n aa n dz i p 一13 m r n a e x p r e s s i o ni n c r e a s e d z n t - l m r n a , z i p 一8 m r n aa n dz i p 一1 3 m r n ae x p r e s s i o no f t h ed e x a m e t h a s o n ei n t e r v e n t i o ng r o u pw e r en o to b v i o u s l yc h a n g e d s e r u mz i n cc o n t e n to fa s t h m a t i ci n f a n t sw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nc o n t r o l g r o u pi n f a n t s ( p 0 0 1 ) ；t h e r ea r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si np e r i p h e r a lb l o o d l y m p h o e y t e sz n t - l ，z n t - 3 ，z n t 一5 ，z i p 一1m r n ae x p r e s s i o nb e t w e e na s t h m a t i c i n f a n t sa n dt h ec o n t r o lg r o u pi n f a n t s ；p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e sz i p 2 m r n a e x p r e s s i o no fa s t h m a t i ci n f a n t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o li n f a n t sg r o u p 口 o 0 1 ) c o n c l u s i o n z i n ci se s s e n t i a lt oc e l lg r o w t ha n di sc o f a e t o rf o rm o r et h a n3 0 0e n z y m e s ， r e p r e s e n t i n go v e r5 0d i f f e r e n te l l z y i n ec l a s s e s a l s oi ti si n v o l v e di nd i v e r s ec e l l u l a r p r o c e s s e s ，f r o mc a t a l y s i st og e n ee x p r e s s i o nt oc e l lp r o l i f e r a t i o n s e v e r a lp r o t e i n sa n d g e n e si n v o l v e di nc e l l u l a rz i n ct r a n s p o r t , w h i c hb e l o n gt ot w og e n ef a m i l i e s ：z n ta n d z i p z n tt r a n s p o r t e r sr e d u c ei n t r a c e l l u l a rz i n cb yp r o m o t i n gz i n ce f f l u xf r o mc e l l so r i n t oi n t r a c c l l u l a rv e s i c l e s ，w h i l ez i pt r a n s p o r t e r si n c r e a s ei n t r a c e l l u l a rz i n cb y p r o m o t i n gi n t r a c e l l u l a rz i n cu p t a k ea n d , p e r h a p s ，v e s i c u l a rz i n cr e l e a s ei n t ot h e c y t o p l a s m i nm a m m a l s ，i n a d e q u a t el e v e l so fz i n ci nt h ed i e tl e a dt od e r m a t o l o g i c l e s i o n s ，g r o w t hr e t a r d a t i o n , m e n t a ld i s o r d e r s ，a n dc o m p r o m i s e df u n c t i o no ft h e i m m u n ea n dr e p r o d u c t i v es y s t e m s i na n i m a l s ，z i n cb a l a n c ei sp r i m a r i l ym a i n t a i n e d t h r o u g har e g u l a t e dr a t eo fi n t e s t i n a lu p t a k e ，f e c a e l i m i n a t i o no fe x c e s sz i n c , r e n a l r e , a b s o r p t i o na n dd i s t r i b u t i o nt oc e l l s ，i n c l u d i n gi n t r a c e l l u l a rs t o r a g e al a r g en u m b e r 5 d e f i c i e n c ym a yh a v ef u r t h e ri n c r e a s e si nt h 2p r o i n f l a m m a t o r yc y t o k i n e s a s t h m ai s o n eo fc h r o n i ci n f l a m m a t o r yd i s e a s e s ，w h i c hi sr e c o g n i z e da so n eo ft h ew o r l d m e d i c a lp r o b l e m s a c c o r d i n gt ot h es u r v e y , t h e r ea l ea tl e a s tm o r et h a n2 0m i l l i o n p a t i e n t sw i t ha s t h m ai nc h i i l 或t h e r e f o r e , i ti sn e c e s s a r yt oe x p l o r et h ez i n c t r a n s p o r t e r s e x p r e s s i o na n dt h ei n f l u e n c e so f z i n co nz i n ct r a n s p o r t e r si na s t h m a i nt h i ss t u d y , w ee x p l o r et h ez i n ct r a n s p o r t e r s e x p r e s s i o ni nt h el e u k o c y t e so f a s t h m a t i ci n f a n t s t h i si st h ef i r s tr e p o r t , w h i c hd e t e c t s t h ez i n c t r a n s p o r t e r s e x p r e s s i o ni na s t h m ai n f a n t s a tt h es a m et i m e , w ee x p l o r et h ee x p r e s s i o no fz i n c t r a n s p o r t e r sa f t e rt h ea s t h m a t i cr a t st r e a t e db yz i n ca n dd e x a m e t h a s o n e ，t om a k es o m e e f f e c ti nt h es t u d yo f z i n ct r a n s p o r t e rr e g u l a t i o ni na s t h m a k e yw o r d s ：a s t h m a ；z i n c ；z i n ct r a n s p o r t e r , g e n ee x p r e s s i o n 6 山东大学硕士学位论文 符号说明( 按字母排序) 缩写英文名称 中文名称 c d fc a t i o nd i f f u s i o nf a c i l i t a t o r阳离子扩散转运体 d e p c r t h y lp y r o c a r b o n a t e焦碳酸二乙酯 e be t h i d i u m b r o m i d e 溴化乙锭 e l i s a e n z y m 争l i n k c di m m u n o s o r b c u ta s s a y酶联免疫吸附测定 e p e p p e n d o r fe p 管 i f nh t c r f c r o n 干扰素 i g ei m m u n o g l o b u l i n免疫球蛋白e i l i n t e r l e u k i n 白介素 n f kbn u c l e a rf a c t o ro f k a p p a b 核因子 o d o p t i c a ld e n s i t y光密度 o v ao v a l b u m i n 卵清蛋白 r ir n a s ci n h i b i t o r r n a 酶抑制剂 r p m r o u n dp e rm i n u t e每分钟转速 p c r p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n 聚合酶链式反应 t h h e l p e rt - c e u辅助性t 细胞 t m d s t r a n s m e m b r a n ed o m a i n s跨膜结构域 z i pz r t ，i r t l i k ep r o t e i n 锌调，铁调样蛋白 z n tz i n ct r a n s p o r t e r锌转运体 7 山东大学硕士学位论文 _ 上- 一 刖吾 哮喘是一种世界范围内严重威胁公众健康的主要慢性呼吸道炎症性疾病，全 球约有3 亿病例。哮喘是以嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞浸润为特征，多 种细胞因子及炎性介质参与的气道变态反应性炎症【1 1 在过去的2 0 年，哮喘的发 病率在世界范围内呈上升趋势。在发达国家，自1 9 8 0 年以来，哮喘发病率增加了 将近1 倍，达到了流行的人数。这一现象引起了全世晃，特别是工业化国家及其医 学科学家的广泛关注及重视，从而极大地推动了哮喘基础研究的进程。 哮喘使易感者对多种激发因子具有气道高反应性，并可引起气道缩窄，表现 为反复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和( 或) 清晨发作、 加剧，常常出现广泛多变的可逆性气流受阻，是一种世界范围内严重威胁公众健 康的主要慢性呼吸道炎症性疾病，全球约有3 亿病例【2 1 。2 0 0 2 年我国儿童哮喘流 行病学调查显示，2 年内患病率为0 5 - 3 3 ，较1 0 年前上升6 4 8 ，据调查， 在我国至少有2 0 0 0 万以上哮喘患者，因此研究哮喘的发病机理，一直是各国科 学家关注的热剧引。 ( 一) 影响哮喘发生和发展的因素 哮喘的影响因素可以分为两部分，一是可以引起哮喘的发生，二是在哮喘的 发展过程中起作用。前者包括自身因素，如遗传，性别和肥胖，后者通常是环境 因素，包括过敏源，感染，室内外空气污染，香烟和饮食 4 1 。有很多研究证明多 基因可能参与到哮喘的发病过程【5 同，不同的人群可能参与的基因不同，哮喘发展 相关的基因主要分布在四个领域：过敏源特异性的i g e 抗体的产生；气道高反应 性的产生；炎性因子的产生，如细胞因子，趋化性因子，生长因子；t h l 和t h 2 免疫应答的比例 7 1 ( 与哮喘的发病过程相关) ，肥胖也是哮喘发病的一个潜在因 素，一些调节因子如瘦素可能影响气道的功能和增加哮喘患病的几率 s , g i 。男性 儿童较易患哮喘，在1 4 岁之前男童的患病率大约是女童的两倍 1 0 l ，随着年龄的增 长性别差异会减小，并且成年人中女性的患病率要高于男性。性别差异导致患病 率不同的机制还不清楚，但出生时男孩肺脏小，而成人时男性肺脏更大【1 1 l 。环境 因素主要包括某些激发因素，如吸入物：尘螨、花粉、真菌、动物毛屑等各种特 异和非特异性吸入物；感染，如细菌、病毒、原虫、寄生虫等；香烟可能会加速 哮喘病人肺功能的降低，会导致病人对吸入和内吸收糖皮质激素治疗不敏感 8 山东大学硕士学位论文 【圮b l ，降低哮喘被控制的可能性。 饮食也会对哮喘产生一定的影响，一些研究证实多食用加工过的食品，减少 使用抗氧化物食品( 如水果和蔬菜) ，增加n 一6 不饱和脂肪酸摄入和减少n - 3 不 饱和脂肪酸的摄入都会增加哮喘患病的可能 1 4 1 。 ( 二) 分子机制 免疫机制是支气管哮喘的重要发病机制之一，i 型变态反应和i g e 合成调控 紊乱抗原( 过敏原) 初次进入人体后，作用于b 淋巴细胞，使之成为浆细胞而产 生i g e ，吸附于肥大细胞或嗜酸粒细胞上，其f c 段与细胞膜表面的特异性受体 结合，使i g e 牢固吸附于细胞膜上，使机体处于致敏状态。当抗原再次进入致敏 机体时，即吸附于肥大细胞及嗜酸粒细胞上结合i g e ，导致细胞脱颗粒，释放一 系列化学介质包括组胺，前列腺素等，这些物质可导致毛细血管扩张、通透性增 强、平滑肌痉挛引起支气管哮喘。气道炎症是哮喘的最主要的特征，其机理是多 种炎性细胞和炎性介质参与下导致气道结构性的改变，哮喘发作时，粘膜肥大细 胞会释放支气管收缩介质如组胺，白三烯和前列腺烈瑚，这些肥大细胞被通过高 亲和力的i g e 受体被过敏源激活，而且数量增加的肥大细胞也会引起气道高反应 性【1 6 1 ，气道中巨噬细胞数量也会增加，通过低亲和力的i g e 受体被过敏源激活， 释放炎性介质和细胞因子加重炎性过程 z 7 1 ，嗜酸粒细胞数量的增多也会释放破坏 气道上皮细胞的蛋白，可能在生长因子的释放和气道重塑中起一定作用。t 淋巴细胞会释放特异的细胞因子，包括i l 一4 ，i l 一5 ，i l - 9 和1 3 ，引起嗜酸性炎 症和b 淋巴细胞i g e 的释放。由于调节t 细胞活性的减弱，使t h 2 细胞活性增强。 另外数量增加的i n k t ( 不变自然杀伤t 细胞) 也会释放大量的t h l 和t h 2 细胞 因子【1 9 1 。各种细胞因子和环境因素可作用于气道上皮细胞，后者分泌内皮素一l 和基质金属蛋白酶并活化各种生长因子特别是t g f 1 3 。以上因子共同作用于上 皮下成纤维细胞和平滑肌细胞，使之增殖而引起气道重塑。气道高反应性，也是 是哮喘疾病的特征之一，与气道炎症和气道修复相关，会使哮喘患者在刺激下( 对 正常人无害) 引起气道狭窄，气道狭窄会导致气流受限和间歇性症状，具体的机 制还不是很清楚 2 0 1 ，另外由于支气管平滑肌受交感神经和副交感神经双重支配， 并且保持平衡，正常人支气管平滑肌张力取决于胆碱能受体的兴奋状态，而哮喘 病人副交感神经张力升高，q 肾上腺素能神经活动增强，b 肾上腺素能神经功能 9 山东大学硕士学位论文 低下或部分被阻滞，导致患者气道反应性亢进，是哮喘发作的病理生理基础之一。 锌是生物体所必须的一种生命元素，在许多生物化学过程中都起着非常重要 的作用。它作为大约3 0 0 多种酶的辅助因子，广泛参与了蛋白质、核苷酸、糖以 及脂类的代谢，同时在基因转录、细胞生长、成熟和分化的过程也扮演了重要的 角色【2 1 1 。生物体由于锌的缺乏可引发皮肤损伤、佝偻病、生长发育不良、免疫功 能低下等疾病。另一方面，锌在体内积聚过多也可以导致锌中毒。其中毒机制尚 不清楚，可能和锌能与其他金属离子竞争结合酶的活性中心有关【捌。因此，机体 的锌水平的稳定就显得至关重要。在动物体内，锌的稳态调节是由肠内吸收，过 量锌的排泄，肾的重吸收以及细胞内的再分布等环节组成( 2 3 1 。特别是细胞内锌的 再分布是维持锌水平稳定的基本环节。然而锌不能自由通过生物膜，只有在特殊 的膜蛋白协助下才能完成，相关的膜蛋白为锌转运体。在哺乳动物，锌转运体主 要涉及两大s l c ( s o l u t e l i n k e dc a r r i e r ) 基因家族：s l c 3 0 a 和s l c 3 9 a ，分别 编码相应的c d f ( c a t i o nd i f f u s i o nf a c i l i t a t o r ) 和z i p ( z r t ，i r t l i k ep r o t e i n ) 蛋白。c d f 蛋白能够促进细胞质锌的外流以及使锌在各细胞器内区室化，从而降 低胞浆锌的含量。与之相反，z i p 则能够增加锌的内流摄取或者促进细胞器内锌 的释放，来增加胞浆中锌的含量。尽管大多数蛋白转运体的转运机制不是很清楚， 但可以肯定的是c d f 和z i p 在结构和功能上都有很大的相似性1 2 4 | 。近十年来，关 于锌转运体的研究有了快速的发展，特别是锌转运体的调控以及锌转运体和哮喘 之间的关系，取得了一些进展。 锌的研究是微量元素研究中一个重要的领域，近年来对于两大锌转运体家族 的研究发现，为锌以及锌转运体在细胞和分子水平的更深刻认识奠定了基础。哮 喘是威胁人类健康的一大疾病，而哮喘的发生，发展过程可能与锌有着一定的联 系，锌的稳态是通过锌转运体来维持的，所以锌转运体与哮喘关系的研究，为以 后哮喘的预防与治疗提供了一个新的方向。 坐奎奎堂堡主堂垡笙茎 材料与设备1 1 竹 e k 圈 一、材料： ( 一) 主要材料和试剂 t r i z o l 总r n a 提取试剂盒 c d n a 反转录试剂盒 p c r 试剂盒 a g a r o s e 琼脂糖凝胶 随机引物、p c r 引物 e d t a 、d e p c 红细胞裂解液 卵清蛋白( o v a l b u m i n ，o v a ) 人i g ee l i s a 试剂盒 地塞米松 其他试剂均为国产分析纯 ( 二) 临床标本 i n v i t r o g e n 公司 p r o m e g a 公司 t a k a r a 公司 加拿大b i o b a s i ei n e 上海生工生物工程有限公司合成 加拿大b i o b a s i ci n c 杭州碧云天有限公司 美国s i g m a 公司 北京嘉美诺斯生物科技有限公司 山东新华制药 哮喘儿童和正常对照儿童( 卜3 岁) 新鲜血液标本，取自于临床门诊病人。 ( 三) 实验动物 w i s t a r 大鼠( s p f ) ，雌雄各半，3 4 周龄，体重( 1 0 3 2 ) g ，购于山东 大学动物实验中心，山东大学医学院动物房饲养。 二、实验仪器 l h 系列通风橱济南隆宏净化设备有限公司 d k - 9 8 1 电子恒温水浴锅天津市泰特斯仪器有限公司 8 0 - 2 离心沉淀器 上海手术器械厂 s 1 型迷你磁力搅拌器 北京倍的科学器材有限公司 s i g m a 2 1 6 k 高速冷冻离心机德国s i g m a 公司 - 2 0 低温冰箱德国西门子公司 w f 2u v - 2 0 0 0 型紫外可见分光光度计 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 b l 2 2 0 h 电子天平日本s h i m a d z u 公司 f a i10 4 电子天平 上海天平仪器厂 f i n n p i p e t t e 彩色单道可调式移液器芬兰f i n n p i p e t t e 公司 v x q g 0 2 型电热蒸汽消毒器山东新华医疗器械有限公司 m d f 3 9 2 1 3 0 c 超低温冰箱日本s a n y o 公司 c 0 2 恒温细胞培养箱美国f o r m as c i e n t i f i c 公司 s z - d 2 倒置显微镜 重庆光学仪器厂 s w c t - t f 型超净工作台 苏州净化仪器厂 s z 9 3 自动双重纯水蒸馏器上海玻璃仪器一厂 g e l m a r d 5 m m 可换针头式滤器美国p a l l 公司 儿不锈钢正压滤器 宁波新芝仪器厂 青制0 0 0 0 0 0 0 3 号电子卡尺 青海量具刀具有限责任公司 1 1 山东大学硕士学位论文 y ) ( 型洁净动物柜 u v - 1 2 0 - 0 2 紫外分光光度计 p c r 扩增仪 d y y - 1 0 型电泳仪 d y y - 1 1 1 型电泳槽 z f - 1 紫外投射仪 s m a r tv i e w 凝胶扫描分析仪 a l p h a i m a g c r t m 数字凝胶成像系统 o l y m p u sa u 2 7 0 0 全自动生化分析仪 倒置荧光显微镜 f 4 5 0 0 荧光分光光度计 原子吸收分光光度计 雾化加湿器 北京文惠净化设备厂 日本岛津公司 德国艾本德公司 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 上海长明光学电子仪器厂 上海复日生物试验技术研究所 美国a l p h a l m a g e r 公司 日本o l y m p u s 公司 日本尼康公司 日本日立公司 美国热电公司 鱼跃医疗公司 山东大学硕士学位论文 实验一哮喘大鼠锌转运体m r n a 表达的初步研究 方法 ( 一) 哮喘大鼠模型的建立 2 0 只w i s t a r 大鼠( s p f 级) ，雌雄各半，3 4 周龄，体重( 1 0 3 2 ) g 。 纯洁动物柜中s p f 级无菌培养( 条件：昼夜明暗交替1 2 h ：1 2 h ，温度：2 2 2 4 0 c ， 5 0 湿度) 。待一周适应期满后，分别饲喂缺锌饲料和正常饲料。致敏阶段：第 1 8 和2 5 天，大鼠腹腔注射含0 1 的卵清白蛋白和l o o m g 的a i ( o h ) 3 无菌生理盐 水混合液l m l 。激发阶段：致敏一周之后，大鼠置于4 l 玻璃罩中，雾化吸入含 i o v a 的无菌生理盐水，每次2 0 m i n ，持续一周。记录初始体重，定期观测大鼠 体重变化及摄食变化。 1 动物饲养 山东大学动物实验中心饲料加工房协助加工两种大鼠饲料：参照a i n 9 3 标 准，采用全价饲料配方配置普通饲料，根据文献来配制缺锌饲料颗粒，饲料机加 工制成直径为l c m 的颗粒饲料，低温烘干，饲喂前经高温高压蒸汽灭菌处理。 所有饲养笼具均经过1 的e d t a 溶液浸洗处理，以尽可能消除锌污染。 两种饲料成分如下： ( 1 ) 普通饲料：全价饲料，未做任何添加处理，每千克饲料含锌元素1 3 5 m g 。 ( 2 ) 缺锌饲料：每千克饲料含锌元素2 7 m g 。 2 动物分组及给药 2 0 只w i s t a r 大鼠按体重随机分成4 组：缺锌哮喘组、哮喘组、对照组和地塞 米松处理组，分别饲喂以上两种不同的饲料；哮喘致敏和激发阶段，对照组均以 生理盐水腹腔注射以及雾化处理；地塞米松处理组在每次雾化处理前，以含 5 0 0 u g 地塞米松注射液皮下注射。动物不限制饮水，饮用水为灭菌去离子双蒸水。 3 生长监测 每两天记录一次动物体重和摄食量并观测大鼠生长状态。雾化一周之后，麻醉 处死大鼠，解剖大鼠并收集肺组织，留取新鲜血液，于1 3 0 0 c 冰箱低温保存。 ( 二) 组织和血清锌水平检测 原子吸收分光光度计检测大鼠肺组织和血清锌含量。 山东大学硕士学位论文 ( 三) 外周血自细胞的分离 ( 1 ) 取新鲜血液，放入e d t a 管中，4 0 0 - 5 0 0 9 离心5 分钟，离心弃上清。 ( 2 ) 加入1 0 r a l 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1 2 分钟，持续1 0 分钟。 ( 3 ) 4 ，4 0 0 - 5 0 0 9 离心5 分钟，弃红色上清。 ( 4 ) 重复上述步骤2 和步骤3 一次， ( 5 ) 沉淀中加入2 m 3 0 m l 的生理盐水充分混匀，4 0 0 - 5 0 0 9 离心5 m i n ，沉淀即为 白细胞。 ( 四) r t - p c r 检测大鼠肺组织和自细胞中锌转运体m r n a 的表达 1 引物设计见表1 2 组织总r n a 的提取 ( 1 ) 液氮中将肺组织研磨成粉末状，转移至1 5m ie p 管中，每5 0 m g 组织中加 入1 o m l 的t r i z o l 细胞裂解。 ( 2 ) 1 5 3 0 室温放置5 m i n ，加入2 0 0 m 氯仿，用力振荡3 0 s ，室温放置2 - 3 m i n 。 2 - 8 低温离心，1 2 0 0 0 r p m 。 ( 3 ) 小心转移上清至r n a a s c - f r e e 的新e p 管中，加入等体积的异丙醇，1 5 3 0 室温放置5 m i n ，2 - 8 低温离心，1 2 0 0 0 r p m ，5 m i n 。 ( 4 ) 移去上清，加入7 0 0 m 7 0 乙醇( d e p c 水配制) 洗涤沉淀，2 8 低温离心 1 2 0 0 0 r p m ，2 m i n 。重复洗涤。 ( 5 ) 自然晾干r n a ( 不可干透) ，3 m 5 0 山d e p c 水溶解，r n a 贮存于1 2 0 冰 箱中备用。 ( 7 ) r n a 的浓度和纯度：用紫外分光光度仪检测所提r n a ，要求达到如下标准： o d 2 6 0 o d 2 8 0 = 1 8 “2 0 ，浓度为0 5 - 5 p g 似。 3 r n a 反转录成e d n a ( r e v e r l ta i dt mf i r 吼s t a n dc d n as y n t h e s i sk i t ) ( 1 ) 冰上准备好各反应液： 总r n al 嵋 随机引物六聚体( 0 2 蚓山)1 山 d e p c 水 u p t 01 2 p l 轻轻混匀，并离心3 5 s ( 2 ) 7 0 放置5 m m ，冰上冷却，短暂离心。 ( 3 ) 冰上操作，依次加入以下成分： ( 7 ) 7 0 ，1 0 m i n 中止反应，冰上冷却，c d n a 于- 2 0 c 贮存。 4 p c r 反应 ( 1 ) 冰上准备好反应体系： 模板 10 x p c rb u f f e r 棚叮t pm i x t u r e2 5 m m 上游引物( 2 0 1 x m ) 下游引物( 2 0 1 x m ) 灭菌三蒸水 2 1 1 9 5 m 4 m 1 m 1 m u pt 05 0 山 9 4 预变性5 m i n 。 ( 2 ) 加入t a c l 酶( 5 u p 1 ) o 2 5 p 1 。 ( 3 ) 循环扩增： 9 4 5 3 6 0 7 2 l m i n l m i n l m i n 3 0 个循环后，7 2 延伸1 0 m i n 中止反应，扩增产物存放于4 c 冰箱保存， 待电泳分析。 5 p c r 产物分析 取p c r 扩增产物1 8m ，1 0x 上样缓冲液2 p 1 ，混匀后上样，1 0 琼脂糖凝胶 电泳，0 5 t b e 缓冲液，8 0 v 电压电泳6 0 m i n ，e b 染色，紫外下观察，凝胶成像 系统扫描。锌转运体m r n a 相对表达量用特异p c r 产物和b 。a c t i n 的灰度密度比 来表示。 标准差( m e a n s d ) 山东大学硕士学位论文 结果 一、各组大鼠特征观察 用低锌饲料喂养2 周后，低锌哮喘组大