（预防兽医学专业论文）乳酸杆菌pPG质粒表达系统理想表达条件的探索.pdf

摘要 相对于大肠杆菌原核表达系统，乳酸菌表达系统还不够成熟，主要表现在外源蛋白的表 达量较低、乳酸菌的某些遗传背景不够清楚，操作比较繁琐，表达条什相对不够稳定等，因 此探索乳酸菌载体系统适宜的表达条件，提高表达量，建立乳酸菌表达系统的技术平台t 对 表达的外源蛋白更有效的发挥作用具有重要的实践意义。 本试验对乳酸杆菌p p g 质粒表达系统理想表达条件进行了探索，以干酪乳杆菌 l a c t o b a c i l l u sc a s e i3 9 3 为宿主菌，b - 葡萄糖苷酸酶( g u s a ) 基因作为表达的报告基因，探索 了其表达过程中诱导物种类、诱导物浓度、诱导时间、培养基p h 、培养方式等各个影响表达 的关键因素进行了研究。试验结果表明，活化的种子菌以1 接种于m r s 液体培养基，并用 l 乳糖为诱导物。初始培养基p h 值在6 0 7 0 之间，3 0 ( 2 或3 2 ( 2 ，静j p 培养约7 8 小时， 菌液浓度至a 5 9 0 0 d 达0 5 ，表达效率晟高，外源蛋白的表达量可占菌体总蛋白的1 4 。分泌 表达载体干酪乳杆菌p p g - 2 l 3 9 3 上清液分别经4 c 透析和冷冻干燥浓缩5 0 倍后，w e s tb l o t 未检测到目的蛋白，而将p p g - 2 l 3 9 3 的菌体沉淀经w e s t b l o t 检测后出现明显的目的带由 此说明干酪乳杆菌p p g - 2 l 3 9 3 表达的g u s a 目的蛋白仍结合在菌体上：培养基中葡萄糖的浓 度对g u s a 的表达有抑制作用。当葡萄糖终浓度为o 1 以下时对p p g - 1 几3 9 3 表达g u s a 未 见明显影响，而当其含量达到0 5 时。表达量明显下降，至葡萄糖浓度达到2 时基本看 不到g u s a 的表达试验通过对乳酸杆菌p p g 质粒表达系统理想表达条件的探索为更好利用 该系统表达活性蛋白( 肽类) 奠定了基础 关键词乳酸杆菌；干酪乳杆菌；表达系统： 葡( 萄) 糖苷酸酶( g u s a ) e x p l o r a t i o no fo p t i m a le x p r e s s i o n c o n d i t i o n si n l a c t o b a c i l l u se a s e lw i t hp p gv e c t o r a b s t r a c t c o m p a r i s o nw i t l lt h ee c o l i se x p r e s s i o ns y s t e i l l t h ee x p r e s s i o ns y s t e mo fl a c t i ca c i d b a c t e r i a ( l a b 、i si m m a t u r e i tm a i n l y r e f l e c t so nt h ef o l l o w i n g s ：l o w e x p r e s s i o ni e v e l o f h e t e r o l o g o n sp r o t e i n , s o m eg e n e t i cc h a r a c t e r sa m b i g u i t y , t r o u b l e s o m eo p e r a t i o n ，i n s t a b i l i t y o f e x p r e s s i o nc o n d i t i o na n ds oo i lt h e r c f o r e e x p l o r a t i n gs u i t a b l ee x p r e s s i o nc o n d i t i o n so fl a b v e c t o r st o i r e p r o v ee x p r e s s i o nl e v e la n de s t a b l i s h t h ep l a t f o r mo fl a b se x p r e s s i o nw a sv e r y i m p o r t a n t i th a sp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c eo nt h eh e t e r o l o g o u sp r o t e i nr e a l k i n gi t sf u n c t i o n t h ee x p e r i m e n te x p l o r e dt h ei d e a le x p r e s s i o nc o n d i t i o n so fp l a s m i dp p ge s c h e r i c h i ac o i i g l u c u r o n i d a s e ( g n s a ) g e n ew a su s e da sar e p o r t e rg e n ef o ra n a l y z i n ge x p r e s s i o nc o n d i t i o n si n l a c t o b a c i l l u sc a s e i3 9 3 a c c o r d i n gt ot h ec f i t i c a if a c t o r sd u r i n ge x p r e s s i o n w eh a v ee x p l o r e dt h e f o l l o w i n ga s p e c t s ：i n d u c o r , c o n c e n t r a t i o no fi n d u c c r , i n d u e t i o nt i m e ，p ho fm r sa n di n c u b a t i o n m o d e t h ee x p r e s s i o nl e v e io fg a s ac o u l da c h i e v e1 4 0 o ft h ew h o l ec o l lp r o t e i n sw h e nt h e a c t i v a t e dr e c o m b i n a n tl c o s e i3 9 3w a si n c u b a t e di nb a s a lm r sm e d i u mo f p hb e t w e e n6 0a n d7 0 s u p p l e m e n t e d 、v i t i ll l a c t o s e ，a t3 0 o r3 2 ，w i t h o t l ts h a k i n g , a b o u t7t o8 h t ot h ea b s o r b o fa 5 9 0 0 dr e a c h i n ga b o u t0 5 t h ee x p e r i m e n th a sr e a l i z e dg u s a sh i 曲l ye f f e c f i v ea n ds t a b l e e x p r e s s i o n r e c o m b i n a n tl a c t o b a c i l l a sc a s e iw i t hp p g - 2m e d i a t i n gs e c r e t i o ne x p r e s s i o nw a s i n d u c o db yl a c t o s ea n d 乜s u p e m a t a n t sw e r ec o n c e n t r a t e d5 0 一f o l du n d e rv a c u u mo rb yd i a l y s i sa t 4 b t i tp u r p o s ep r o t e i nc o u l d n tb ed e t e c t e db yw e s tb l o t h o w e v e r , a r lo b v i o u sp r o t e i nb a n d c o r r e s p o n d i n gt og a s aw a sd e t e c t e db yw e s tb l o ti np r o t e i ne x t r a c t s 。w h i c hs h o w st h a tg u s a r e m a l n e da t t a c h e dt ot h ee e l ls u r f a c e t h e u c o s ei nm i 强i n h i b i t sg u s a se x p r e s s i o n w h e n g l u c o s e sc o n c e n t r a t i o nw a su n d e r0 1 e x p r e s s i o no f g a s aw a sh a r d l ya f f e c t e d ；h o w e v e r w h e n t h el e v e lo fg l u c o s ea c h i e v e d0 5 g u s a se x p r e s s i o nw a sb a d l yr e p r e s s e d a st h ec o n t e n to f g l u c o s er e a c h e d2 g n s ac o u l d tb es e e n t h i se x p e r i m e n tp r o v i d e st h eb a s i sf o re x p r e s s i n go t h e r a c t i v ep r o t e i n ( p e p t i d e ) b y e x p l o r i n go p t i m a le x p r e s s i o nc o n d i t i o n s o fp l a s m i dp p gi n l a c t o b a c i l l u s k e y w o r d s ：a c t i ca c i d b a c t e r i a ；l a c t o b a c i l l u sc a s e i ；e x p r e s s i o ns y s t e m ；争g l u c o r o n i d a s o ( g u s a ) m a s t e rc a n d i d a t e ：x i ac h u t l l i m a j o r ：p r e v e n t i v ev e t e r i n a r yd e p a r t m e n t s u p e r v i s o r ：p r o f l i i n g 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 洼! 垫遗直基地霞要挂别直盟的：奎拦卫窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 彩励 1 日期： 学位论文版权使用授权书 6 日倥e l 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 一 学位论文作者签名： 导师签名： 1 引言 乳酸菌旺出a c i db a c t e r i a ，l a b ) 是一群革兰氏阳性、无芽孢、不运动或极少运动、细长 或弯曲的杆菌或球曲。此类菌发酵碳水化合物产生大量乳酸；具有调竹机体胃肠道微生态平 衡：降低血清胆固醇以及控制内毒素等诸多重要生物学功能，成为机体正常菌群的一部分。 乳酸菌在食品加工、医药工业等各个领域中的长期应用已证明其无致病性，被公认为安全级 ( g e n e r a l l yr e c o g n i z e d s a f e 。g r a s ) 微生物。 乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l ) 是乳酸菌的一个重要菌种，呈杆状，排列成栅或链状或单个存 在；乳酸杆菌属微需氧，在5 i 0 , c 0 2 环境内生长更好。生长最适温度为3 0 4 0 ， 最适p h 为5 5 6 2 ，但到p h 为3 5 仍然生长。不产色素。菌落除白色外，偶亦有呈黄红色。 乳酸菌不液化明胶，不还原硝酸盐，过氧化氢阴性。同型发酵由葡萄糖主要产生乳酸，异型 发酵由葡萄糖产生5 0 的乳酸和c 0 2 、乙酸和乙醇。d n a 的e 屺含量的克分子百分比在3 2 5 3 克分子。乳酸杆菌属的各菌种，其生物化学性质、生态学性质、分子生物学性质和免疫 学性质各不相同。这些差异主要是由于d n a 的g e 2 含量的不同造成的，如嗜酸性乳杆菌和 瑞士乳杆菌d n a 的g + c 含量约为3 6 ，而发酵乳杆菌d n a 的g + c 含量约为5 0 。不同属 的细菌转录和翻译情况不同，这表明一个乳酸菌属的相关特性并不一定适合另一个乳酸菌属 ( p o u w e l sp h ，e ta 1 1 9 9 8 ) 2 0 世纪8 0 年代，为更好的控制乳酸杆菌参与食品加工的过程，人们开始致力于对乳酸 菌生物学性质和分子机制的研究分子生物学技术的不断进步为探索其新的应用潜力提供了 基础：如利用基因工程乳酸苗在生物反应器内发酵食品或直接在人和动物消化道内生产蛋白 等，其中最有前景的应用即是乳酸菌作为活载体将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜表面，继而 同时诱导黏膜免疫和系统免疫 1 1 乳酸杆菌质粒及表达载体 1 1 1 乳酸杆菌质粒及人工构建的质粒载体 乳酸杆菌质粒最早由c h a s s y 及其同事于1 9 7 6 年发现的( c h 笛s yb m 。e ta 1 1 9 7 6 ) 。后来 w a n g t r 等研究发现约有3 8 的乳酸杆菌中含有大小不等的质粒( w a n gt t , e ta 1 1 9 9 n ，约在 1 2 1 5 0 k b 之间，许多乳酸杆菌带有1 个或多个质粒。这些小的质粒同其他革兰氏阳性菌的 线型质粒具有高度的相似性。一些乳杆菌质粒复制子具有广泛宿主范围，因而可在其他种类 的革兰氏阳性菌及大肠杆菌中发挥作用。大多数乳酸杆菌质粒表现出了分离稳定性，尤其是 小的隐蔽性质粒更加相对稳定虽然质粒普遍存在乳杆菌中，但对这些质粒的功能了解极少， 这一点不同于乳球菌。最近几年开展了有关质粒与细菌特性关系的广泛研究已有多种乳酸 杆菌质粒被提出及鉴定有些质粒编码功能已经明确，并已应用于乳杆菌的鉴定、载体构建 及修饰中。亦从中发现了质粒与某些表型有关，如抗药性、糖苷的代谢、糖代谢、氨基酸代 谢以及细菌素的产生，乳杆菌的大多数质粒，尤其是小质粒都是隐蔽性的( 吕晓英，2 0 0 5 ； 东北农业大学农学硕士学位论文 易庆，2 0 0 0 ) 晟近十年来随着乳酸杆菌表达调控元件的分离，构建了多种不同类型的乳酸杆菌质粒， 相继研制出自主复制型质粒载体、染色体整合型质粒载体和诱导型质粒载体等，以实现不同 外源蛋白的有效表达。针对蛋白过量表达对细胞造成的毒害作用，开发出多种含有不同诱导 型启动子的表达系统，通过诱导物、抑制物或环境因素的控制将外源基冈的表达限定在需要 的范围内。 已成功的利用乳酸菌复制子构建了多种自主复制型质粒载体( 易庆2 0 0 0 ) 。但双歧杆菌 来源的质粒很难得到，仅国外有少数几位研究者获得并改造构建出适用于双歧杆菌的穿梭质 粒载体。复制型质粒载体通常具有较高的拷贝数，这对乳酸杆菌高效表达外源基因十分有利。 但这类载体在缺乏抗性选择时往往表现不稳定，且有发生细苗种间水平传播的可能。 整合载体在表达稳定性及安全性方面优于复制型质粒载体，故许多研究者选择将外源基 因通过整合载体整合至宿主菌的染色体上，并构建了多种基于位点特异性重组( m a r t i nm c e t a 1 2 0 0 0 ；d u p o n tl ，c ta 1 1 9 9 5 ) 或同源重组( g o s a l b e sm j ，e ta 1 2 0 0 0 ；h o l sp e ta 1 1 9 9 4 ：b h o w m i k t e ta 1 1 9 9 3 ) 的染色体整合载体系统。构建位点特异性重组型整合载体需要有整合酶胁和靶 位点a t t p 的参与，当整合载体导入宿主菌中，在整合酶的作用下通过其上的a t t p 位点与染色 体上a t t b 位点特异结合并发生整合。这类载体通常由噬菌体改建而成，如m a r t i n 等( m a r t i n m c ， e t a l 2 0 0 0 ) 应用噬菌体a 2 构建的干酪乳杆菌整合载体p e m 7 6 。d u p o n t 等( d u p o n t l e ta 1 1 9 9 5 ) 利用保加利亚乳杆菌m y 4 噬菌体构建而成的p m c i 整合载体。利用同源重组技术构建染色体 整合载体，将同源片段和筛选标记重组到一个非复制性质粒载体上组成整合载体：转化宿主 菌，并通过同源重组整合至染色体上i 以适当的筛选策略筛选重组菌。通过对同源片段的不 同处理可达到不同的改造目的。如在同源片段中插入外源基因，通过双交换同源重组就可 实现外源基因的稳定整合；对同源片段进行突变缺失处理就可对宿主菌染色体的某些基因进 行精细的改造或研究。 1 i 2 乳酸杆菌的电转化 乳酸杆菌为革兰氏阳性菌致密的细胞壁结构使外源基因导入受体菌变得极为不易。因 此，乳酸杆菌表达外源基因的先决条件是建立方便可靠的转化方法。目前乳酸杆菌的转化方 法有：原生质体转化法和电击转化法由于电击转化法优于繁琐、耗时和不稳定的原生质体 转化法，已被广泛采用( 阮孟斌等，2 0 0 4 ) 。但乳酸杆菌的电转化还不十分完善尤其是重复 性不好，转化率低综合分析有以下几种因素可能影响转化效果：致密的革兰氏阳性菌细胞 壁可以阻止d n a 进入细胞内，但用溶菌酶、甘氨酸或青酶素处理受体乳酸菌以致弱细胞壁， 可以提高转化效率：乳酸杆菌的不同培养时期对电击敏感程度存在着显著的差别，干酪乳杆 菌培养到对数中期电转化率最高；在电转化参数中，场强是影响转化效率的一个重要参数， 原核细胞一般要求场强在6 1 2 k v c m 之间，但不同的乳酸菌株需要的场强也存在较大差异 例如保加利亚乳杆菌的最高转化效率只需要场强2 0 k v c m ，而干酪乳杆菌在1 2 5 k v c m 场强 的条件下才获得最高转化率。另外，经过电击之后的细菌，需要及时补充含有1 0 2 0 蔗 糖的m r s 高渗培养液，3 7 ( 2 静置培养复苏一段时间后再涂选择平板，这是电转化成功的关 2 引言 键，可能是由于电击使细胞产生瞬间小孔在非高渗的m r s 培养液中容易破裂，致使转化失 败( h o l oh e t a l ，1 9 8 9 ) 。复苏的时间长短与转化效率也有一定关系，试验发现一般电击后至 少要在3 7 保温2 3 h ( 贾士芳1 9 9 8 ) 。筛选转化子用的平板，其抗生素浓度也影响转化效 率试验发现细胞涂在含氯霉素3 9 9 m l 比在5 t t g m l 的氯霉索平板上长出的转化子数多1 0 2 0 倍，氯霉素浓度的影响随菌种而异，在低抗生素浓度下选择转化子，再转到较高浓度的抗 生素平板上，确保转化子的可靠性。 在电转化中还涉及到转化缓冲液的问题，几种常用的缓冲液都可以利用，但在转化需要 很高电压的情况下，尽量选用盐离子浓度低的缓冲液这样在高电压一f 不易被击穿，且可提 高转化效率。其它的可能屏障包括：菌株内部的限制系统，非特异性核酸酶：不表达的m a k e r 基因；不表达必要的复制功能：干扰宿主必需的功能，载体和受体菌本身吲有质粒的不相容 性。因此乳酸菌的转化效率也和受体菌的差异有很大关系 1 1 3 乳酸杆菌食品级表达载体 利用乳酸杆菌作为表达系统最吸引人的是因为其安全、没有内毒索表达的外源蛋白可 以直接连同菌体一起服用。而且乳酸杆菌为机体正常菌群可以在肠道中存活定植，因此口 服基因工程乳酸杆菌后，表达的目的蛋白就可以源源不断在肠道中生产并起到相应的作用。 但目前所使用的载体都带有一个或多个编码特定抗生素( 如红霉素、氯霉素等) 抗性的基因， 虽然这为遗传操作时保持一定的选择压力，对载体的选择作用和筛选转化子是有效的但将 抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于抗性因子的转移，将带来生物安全性的 严重后果( 张振中等2 0 0 2 ) 。因此使用安全的食品级标记替代抗生素标记，以建立食品级选 择标记的载体是今后发展的重点方向。 食品级基因表达系统必须具备如下基本条件，首先，载体必须是食品级的，不得含有非 食品级功能性d n a 片段。其次，表达宿主必须是安全的、特性清楚而稳定的食品级微生物， 如乳酸乳球菌、乳酸杆菌及其它已经在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株，并且在食品 中或进入肠胃及消化道后必须是足够稳定的。另外，诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、 嘌呤、嘧啶、乳链菌肽等可被人食用的物质。用于乳酸杆菌食品级表达系统的食品级选择性 标记主要有糖类利用标记( d - 木糖、乳糖) 、营养缺陷型标记( 氨基酸缺陷、嘧啶营养缺陷) 、 抗金属离子或噬菌体标记、编码细菌素抗性或免疫性的标记 1 2 乳酸杆菌表达外源蛋白的研究进展 1 8 5 7 年p a s t e u r 在研究乳酸发酵过程中发现了乳酸菌1 8 7 8 年j l i s t e r 从酸败的牛乳中分 离出了乳酸菌，h t i s s i e1 9 8 9 年发现了肠道中的双歧杆菌及嗜酸乳杆菌。后来人们发现乳酸 菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌。2 0 世纪8 0 年代，人们开始致力于对乳酸菌生物学 性质和分子机制进行了研究 3 1 2 1 乳酸杆菌外源蛋白表达系统 乳酸杆菌属于人和动物体内的正常菌群，不会引起不适还能拮抗致病菌，且在酸性环 境易于生存。同时，乳酸杆菌以其生长迅速、易于操作等优点成为表达外渊蛋白、作为活载 体传递抗原的理想选择。作为一种原核表达系统，在表达外源基因上有以下特点：某些菌种 本身带有大量的染色体外因子如质粒和噬菌体，易于发展新的表达载体系统；本身为食品 级细菌，易构建成食品级的基因克隆及表达系统。可以有效提高基因：i ：程产品的安全性，并 可在一定程度上简化表达产物的后处理工艺：可在细胞内表达也可在细胞表面表达并分泌到 胞外培养基中；用常驻的乳酸杆菌表达目的蛋白比用宿主自身的细胞表达产物更安全，因为 后者可能引起正常细胞基因突变；乳酸杆菌还有佐剂作用。基于上述原因，乳酸杆菌作为粘 膜免疫载体的研究正受到越来越多的重视。迄今为止，在乳酸杆菌中已经成功表达了多种病 原微生物抗原，如表l 。 表l ：乳酸杆菌作为疫苗载体 t a b 1 ：l a c t o b a c i l l u s 笛v a c c i n ev e h i c l e s 1 2 2 外源蛋白表达产物的运输与定位 外源基因在l a b 中表达后，其产物( 蛋白质) 可溶解在细胞质中，也可分泌到细胞外培养 基中以及锚定到细胞壁表面 1 2 2 1 分泌表达 外源蛋白分泌到胞外培养基主要是通过信号肽引导分泌实现的。在表达外源基因时，通 过信号肽来引导外源蛋白的分泌可简化产物的表达后提纯。在l a b 表达系统中已成功使用了 内源信号肽( s p s 、s p 哳等) 和外源信号肽( s p n 。等) 引导外源蛋白的分泌表达。表达同一种外 源蛋白时不同的信号肽之间的分泌表达效率有很大的差别。在对l 1 a e t s 表达葡萄球菌核酸酶 ( n l i c ) 的研究中发现，以内源信号肽s p 哳与n u c 基因融合进行分泌表达，其分泌表达率可达 4 引言 到9 5 ，而外源信号肽s p n 。与n u c 基因融合表达的分泌表达率只有6 5 。相关的研究表明， 在成熟蛋白n 末端与信号肽之间融合- - d , 段特定的肽链不会影响蛋白活性。但会对分泌表达 率和表达量产生极大的影响，酸性或中性的肽链以及带负电或不带电的肽链能提高分泌表达 率和产量，而碱性或带正电的肽链则正好起相反的作用( r i b e i r ol a ，e ta 1 2 0 0 2 ；l el o i ry e ta 1 2 0 0 1 ；l el o i r y , e ta 1 1 9 9 8 ) 1 2 2 2 细胞壁锚定 锚定外源蛋白于乳酸菌细胞壁分为两个步骤：首先，通过s e c 依赖性机制( 一种普遍存在 于革兰氏阳性菌中的蛋白分泌机制，包括一系列由前肽介导运输的蛋白) 跨膜运输外源蛋白； 然后s o r t a s e 依赖性机制将外源蛋白锚定于细胞壁上。s o r t a s e 依赖性机制是在金黄色葡萄球 菌中发现的，锚定于细胞表面的蛋白起初是以前原肽的形式合成的，包括连接在成熟蛋白部 分n - 末端的信号肽和位于c 末端的细胞壁锚定区大约3 0 个氨基酸残基的细胞壁锚定区包 括一个保守的l p x t g 基元、一个跨膜片段和一个带净电荷的c 一末端。前原肽经跨膜运输后， l p x t g 基元中1 1 l r 与g l y 之间的酰胺键被断开，然后c 末端的1 1 i r 共价连接到位于肽聚塘 桥多肽的一个氨基酸上，从而锚定到细胞壁上( d i e y ey e ta 1 2 0 0 1 ) 1 2 3 重组乳酸杆菌表达外源抗原的免疫效果 如何使所表达的外源抗原与免疫系统充分接触继而诱导有效免疫应答成为目前该领域研 究的热点。 试验己经证明了在腹膜内注射乳酸杆菌，可以非特异的增加抗原特异性免疫反应 ( l i n k - a m s t e r he t a l ，1 9 9 4 ：i s o l a u r i ee t a l ，1 9 9 5 ) 。与非肠道途径使用乳酸杆菌相比，使用乳 酸杆菌口服疫苗在试验动物机体中通常只会产生低效价x g c 抗体，这是因为这些细菌为存在 于消化道中的正常菌群，机体的免疫系统己经对消化道中的正常菌产生了耐受。为了确定乳 酸杆菌在细胞内或细菌表面表达外源抗原是否能够引起免疫应答，用活的重组菌经口服途径 免疫小鼠抗体产生水平通过e l i s a 检测。发现口服免疫必须在初次免疫后再进行一次加强 免疫才可检测到显著的对外源抗原的免疫应答( r c v e n e a un e ta l ，2 0 0 2 ) 可是非经肠道的 免疫，初次免疫后，即可检测到抗体。腹膜内注射或皮下注射细胞内表达外源抗原的 l a c t o b a c i l l u se a s e l 或厶啪c d c c 后，可引起显著的免疫应答( 用i g o 抗体衡量) 。同时细菌表 面表达抗原的重组菌经腹膜内注射或皮下注射后也可获得同样的效果。这些结果说明由遗传 工程乳酸杆菌菌株表达外源抗原的量足以引起免疫应答，而且，通过口服或鼻的初次免疫后- 再进行一次同样途径的加强免疫，对于重组乳酸杆菌表达的抗原可观察到显著水平的i g a ， i g g 。 1 3 乳酸杆菌作为黏膜免疫活载体疫苗的相关特性 1 3 1 乳酸杆菌的黏附性和定植能力 黏附是定植的第一步，不能粘附于肠上皮细胞表面的细菌。只能是过路菌，不能在肠道 内定植。定植抗力指的是宿主对致病菌与潜在致病菌在正常微生物群中定植和繁殖的阻抗力 或抵抗力( d ev o sw m , 1 9 9 9 ) 。乳酸杆菌被称之为定植抗力因子是形成生理屏障的主要组 成部分。如果这个屏障一旦遭到抗生素或其他因素的破坏，宿主便丧失了对外来菌的抵抗力。 或者会使具有耐药性的肠内菌异常增殖而取代优势菌的位置，造成肠道内微生态平衡的失调。 易位的主要原因是需氧菌或兼性厌氧菌等条件致病菌的大量增殖。一旦易位发生，肠粘膜微 生物的屏障就受到损坏。引起肠道细菌微生态平衡的失调、紊乱，同时乳酸杆菌等厌氧菌的 数量就会减少，造成定植抗力下降，从而使得以革兰氏阴性菌为主的条件致病菌得以黏附、 定植于受损伤的肠粘膜表面，进而大量繁殖传播，使易位得以彻底实现，成为感染的来源。 乳酸杆菌在防止肠道菌群发生易位中起到重要作用。其作用机理为：直接参与构成肠道定植 抗力，阻止病原菌的定植和入侵：对肠道有营养作用，有利于肠道屏障的修复：并且能增强 宿主吞噬细胞的活力，从而提高机体特异性和非特异性抗感染能力：还可间接抑制肠道革兰 氏阴性菌的过度繁殖调整菌群失调。 在分类学上明确的多种乳杆菌属中，有1 1 种已经发现于动物胃肠道及猪或鼠的粪便中。 另外1 0 种也分离于动物或人的肠道中，这表明寄居于胃肠道的乳杆菌属的多样性。通常认为， 有效地定植和黏附于组织表面对于乳杆菌发挥其益生作用很重要( c o c o n n i e re ta l ，1 9 9 8 ) 而 且，定植和黏附可能在激活特异性和非特异性免疫应答中可能也起着很重要的作用。 1 3 2 乳酸杆菌的体外黏附 外来细菌定植于胃肠道必须能够且持续黏附于组织表面。由于对细菌在体内黏附的试验 操作很困难，近年来发展了多种体外的细菌黏附模拟系统。研究表明体外黏附具有宿主特 异性。例如只有从鼠体内分离出的乳杆菌可以黏附于鼠的扁平上皮细胞，同样，只有从鸡体 内分离出的乳杆菌可以黏附于鸡嗉囊( p e r d i g o ng e ta 1 2 0 0 1 ) 。相反，猪源和人源的发酵乳杆 菌1 0 4 r 和发酵乳杆菌k l d 在黏附于猪组织时未发现特异性，但人源菌黏附于人组织相对 于黏附于猪组织容易些( c o n w a y , e t a l 1 9 9 3 ) 。猪消化道内乳杆菌的体外黏附和体内定植之间没 有明确的关联，黏附性乳杆菌和非黏附性乳杆菌表现出相同的胃上皮细胞定植能力。 对乳杆菌黏附机制的研究表明：黏附是由多糖或糖蛋白介导的。在对j j 道细胞和肠上皮 细胞黏附的研究中显示：黏附与细菌的亲水性有关，同时一种细胞外蛋白和非蛋白性因子也 参与黏附。其它试验表明蛋白性物质和碳水化合物成分参与乳杆菌在黏膜的黏附。c o c o n n i e r 等0 9 9 8 ) 总结出嗜酸性乳杆菌b g 2 f 0 4 通过一种分泌蛋白、一种表面结合蛋白及碳水化合物 因子黏附于c a c o 2 细胞。目前仍未清楚乳杆菌的表面结构与其组织受体之间相互作用的机 制。另外，对于宿主黏膜表面乳杆菌受体结构的研究成果十分有限，目前仅发现纤维素是由 腺胃黏膜分泌的一种糖蛋白，对许多革兰氏阳性菌包括乳杆菌具有亲和性。细胞外基质中也 发现了几种细菌可能结合的蛋白胶原质、弹性蛋白原等 1 3 3 免疫原性和佐剂性 乳酸杆菌可以间接地增强机体免疫系统的功能，能明显促进细胞分裂、促进抗体产生， 还能活化吞噬细胞、刺激腹膜巨噬细胞、诱导产生干扰素，从而增强机体的特异性和非特异 6 性免疫反应，提高机体的抗病能力( h a i l e rde t a l ，1 9 9 9 ；s u s a n a a l v a r e ze t a l ，1 9 9 8 ) 。乳酸杆 菌可以提高动物的非特异性免疫( v i l m am o r a t ad e e t a l ，1 9 9 8 ；g a b r i e l ap e r d i g o n e t a l ，1 9 9 4 ； t a k e s h it a k a h a s h i e t a l 。1 9 9 3 ) ，例如在小鼠腹腔内注射乳酸杆菌可以增加噬菌体的活性及n k 细胞的活性( y e o n h e el e e e t a l , 2 0 0 5 ；d a l l o u l 凡a e t a l ，2 0 0 3 ) 并且曾有报道称不同的乳酸 杆菌可以促使t n f - a 、i l 6 的产生( h i s a k oy a s u i c t a l ，1 9 8 9 ) 。乳酸杆菌可以黏附于胃上皮细 胞刺激宿主的免疫系统包括激活淋巴细胞及抗体的产生( s h i n j im u r o s a k iak o u t a r o u e t a k 2 0 0 0 ；p e r d i g o nge t a l , 1 9 9 3 ) 干酪乳杆菌( l c a s e ig o ) 可以增加哺乳小鼠体内乳清蛋白的 抗体。另有许多研究提出给小鼠口服乳酸杆菌能加强机体免疫功能而抑制肿瘤的生长也会 增加淋巴细胞仃细胞及b 细胞) 的发育等。表2 总结了乳酸杆菌的免疫作用( 吴惠芬，2 0 0 3 ) 。 乳酸杆菌可以增强肠道上皮细胞的屏障层在消化道内生成致密性膜菌群，形成微生物 屏障，从而阻止病原菌穿越上皮细胞( s a l mi n e n s e t a l ，1 9 9 8 ：c o c o n n i c r e t a l ，1 9 9 8 ) ，并且乳酸 杆菌具有促进上皮细胞修复功能，因此，乳酸杆菌不仅可以抑制消化道黏附病原菌、中和毒 性产物，阻止毒素和废物的吸收，而且可以提高上皮细胞对病原的抗侵袭力( g a b r i e l a p e r d i g o n e l a l 。1 9 9 1 ；l k u ok a t o c l a l 1 9 8 4 ：孟昭赫。1 9 9 3 ) 表2 ：乳酸杆菌的免疫作用 t a b 2 ：h n m u l l er e s p o n s eo f l a c t o b a c i l l u s 1 3 4 抗原口服提呈的优点 乳酸杆菌是人体和动物肠道中的益生菌，具有多种生理功能，还具有很好的安全性t 非 常适宜作为口服疫苗载体而抗原的口服提呈途径较其它途径( 非肠道途径) 有很多优势： n 服疫苗配给方便。减少了针头和针筒等污染的可能性，可以大规模实施，且成本较低；对 于一些病原，口服免疫还可以产生群体免疫效应，即在给- - 4 , 部分个体免疫之后，其产生的 免疫原性可以在整个群体之间传播；再次。许多细菌、病毒和寄生虫抗原经黏膜表面进入动 物机体，因此，胃肠道是机体的第一道防线构成机体最大的免疫器官，机体每天产生的抗 体有6 0 分泌入胃肠道：另外，口服免疫可以诱导体液免疫，而体液免疫是粘膜免疫效应的 主要过程。产生分泌型免疫球蛋白a s i g a ( s 唧o r yl g a ) ，s i g a 是粘膜应答过程中的主 要效应因子，是黏膜免疫的核心。因此，口服乳酸菌疫苗是现代疫苗的发展方向，在我国兽 医传染病预防方面是很有潜力的研究和开发领域。 7 1 4 乳酸菌表达外源基因存在的问题及应用前景 乳酸菌作为表达功能性蛋白和外源抗原的工具和条件已相对成熟，这些条件为进一步开 发安全级的新型活载体疫苗提供了基础。但是该领域的研究目前仍面临很多问题：( 1 ) 由于 目前大多数表达载体都含有氯霉素、红霉素等抗生素基因，给人和动物使_ ；i 这样的活载体黏 膜疫苗时存在生物安全隐患。因此，开发安全的食品级表达系统代替目前的含抗性基因表达 系统是很必要的。( 2 ) 尽管目前已经成功实现了多种外源抗原在乳酸菌中的表达但这些表 达毕竟都是在体外操作的，目的蛋白在体内的表达情况、生物活性仍无法准确检测。因此， 开发更严谨的表达系统进而准确定位外源蛋白在乳酸菌中的表达位置，使重组抗原与黏膜免 疫系统充分接触是未来研究的主要方向之一。( 3 ) 合理地控制重组细菌在宿主肠道内存活时 间，避免免疫耐受是未来研究的重要方向。 总之，随着对黏膜免疫机制和乳酸菌基因功能的研究逐渐深入，乳酸菌作为黏膜免疫的 活载体疫苗传递外源抗原必将具有广阔的应用前景。 1 5 本研究的目的及意义 乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌在医药、食品加工，发酵和饲料等行业广 泛应用，被公认为安全级微生物。基于此，乳酸菌载体表达系统表达功能性蛋白质、活性物 质或外源抗原的表达传递系统作为人和动物的口服疫苗备受关注。与其他原核或真核表达系 统相比乳酸菌表达系统相对不够成熟。主要表现在外源蛋白的表达量相对较低、乳酸菌的 某些遗传背景不够清楚，操作比较繁琐，表达条件相对不够稳定等，因此探索乳酸菌载体系 统适宜的表达条件，提高表达量，建立乳酸菌表达系统的技术平台，实现外源表达蛋白功能 更有效的发挥具有重要的实践意义。 p p g 系列的乳酸杆菌表达系统属于非葡萄糖诱导的新型表达系统，但对其诱导表达确切 的诱导物种类、诱导物的浓度及影响表达的其他关键因素控制技术的掌握还不成熟从而限 制了该表达系统的实际应用 本试验乳酸杆菌表达质粒p p g 转化的干酪乳杆菌表达系统以b 葡萄糖苷酸酶( g u s a ) 基 因作为表达的报告基因，探索了其表达过程中诱导物种类、诱导物浓度、诱导时间、培养基 口h 、培养方式等各个关键因素的影响进行了试验研究，以期为实践中更好掌握和利用该表达 系统提供重要试验数据。 8 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 菌种与质粒 乳酸杆菌质粒p p o 一1 及p p g - 2 均属非葡萄糖诱导型启动子g u s a 位于启动子的下游， 该基因可被所插入的外源基因取代，抗性基因为氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c m ) 基因，含有 s s u s p 分泌信号肽序列。p p g - 1 为表面表达型质粒含有a n c h o r 序列，p p o - 2 为细胞外分泌表 达型质粒上述质粒均为大肠杆菌一乳酸杆菌穿梭质粒，由荷兰n i z o 研究所惠赠，a t c c 干酪乳杆菌3 9 3 由本教研室保存 2 1 2 抗体制剂 兔源g u s a 抗血清购自北京生命科学研究所：辣根过氧化物酶( h r p ) 标记羊抗兔增g 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供 2 1 3 试剂及试剂配制 2 1 3 1 乳酸杆菌表达试剂及配制 乳糖为分析纯购自s i g m a 公司，核糖购自s i g m a 为h p l c 级，甘露醇和葡萄糖均购自上 海生物工程有限公司为分析纯。上述糖类均以m r s 基础培养基配制成1 0 贮存液，0 2 2 无 菌滤膜过滤，4 c 保存备用。氯霉素购自s i g m a 公司。 溶菌酶( 购自s i g m a ) ：用p h 8 0 的1 0 m mt r i s - h c i 溶解，配制成1 0 m g m l 溶菌酶贮存 液 2 1 3 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p ：a g e ) 主要试剂及其配制 丙烯酰胺、n n - 亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠( s d s ) 、二硫苏糖( d 厂r ) ( 贮存 液浓度为l m o l l ) 、t r i s - h c i 缓冲液、t e m e d ( 四甲基乙二胺) 、过硫酸铵( a p s ) 、t r i s 一甘氨 酸电泳缓冲液( 9 0 0 m l 纯化水中溶解1 5 i gt r i s - b a 和9 4 9 甘氨酸，再加入5 9 电泳级s d s ， 用纯水定容至1 0 0 0 m l ，配成5 贮存液) 、考马斯亮蓝r 2 5 0 染色液( 4 5 甲醇，1 0 0 o 冰乙酸， 4 5 纯水，0 2 5 考马斯亮蓝r 2 5 0 ) 脱色液( 配比同染色液，只是不含考马斯亮蓝r 2 5 0 ) 、 蛋白质分子量标准( 1 4 4 9 7 4 k u ) 购自上海华瞬生物工程有限公司；蛋白质分子量标准 ( 1 4 3 9 7 2 k u ) 购自t a k a r a 生物工程( 大连) 有限公司。 2 s d s 凝胶加样缓冲液：l o o m m o l l t r i s h c i ( p h 6 8 ) ，2 0 0 m m o l l 二硫苏糖醇( d - r r ) 4 * 0 电泳级s d s ，0 2 溴酚蓝2 0 甘油 9 东北农业大学农学硕士学位论文 2 1 3 3 蛋白质免疫印迹( w e s tb l o t ) 主要试剂配制 转印缓冲液：1 4 5 9 甘氨酸，2 9g i r i s - b a s e ，0 1 8 5g 电泳级s d s ，1 0 0m l 甲醇，加纯水 至5 0 0 m l 。 4 氯1 萘酚底物显色液：4 氯1 - 萘酚6 m g 溶于4 c 预冷的2 m l 甲醇中，然后慢慢加入3 t c 预热的p b s1 0 m l ，再加入2 0 3 0 h 2 0 2 丽春红染色液：丽春红o 0 2 9 , 纯水1 9 r n l ，冰乙酸i m l ，现用现配 洗涤液( 0 0 1 m o l lp b s t 液) ：n a c i8 0 9 ，k h 2 p 0 4 0 2 9 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 9 9 ，k c l0 2 9 0 5m l t w e e n 2 0 ，溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水。调p h 至7 4 。 脱脂乳封闭液：5 9 脱脂乳，加0 0 1 m o l lp b s 液至1 0 0 0 m l 。 2 1 3 4 培养液及培养基配制 m r s 液体培养基：酪蛋白胨1 0 9 ，肉浸膏 0 9 ，葡萄糖2 0 9