（森林培育专业论文）植物对SOlt2gt伤害的反应及生理抗性研究.pdf

摘要 根据浙江省主要工业园区的植物调查和熏气试验，研究了主要大气污染物二 氧化硫( s 0 2 ) 对不同植物的伤害症状，伤害等级和植物体内可溶性蛋白质( p r ) 、 丙二醛( m d a ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 和游离脯氨酸( p r o ) 的动态变化，探讨了植物对s o ：的抗逆机理。 ( 1 ) 浙江省主要工业园区植物共有5 0 科9 0 种，其中豆科、菊科、蔷薇科 居多；植物品种的丰富度与工业园区的性质有关，由高到低依次为医药、火电、 水泥、化工及其它行业；植物分布与地理位置有关，距园区越远，植物品种越丰 富；生长较好的野生植物有构树、盐肤木、枫杨、络石、化香、苎麻、算盘子、 覆盆子、虎刺、乌桕、紫藤等，人工种植的有海桐、龟甲冬青、茶梅、夹竹桃、 海枣等。 ( 2 ) s 0 2 对不同植物的伤害症状具有差异性，短时间熏气试验表明：没有发 现对植物的芽及皮孔造成可见伤害，但对于叶片伤害明显，s 0 2 浓度和接触时间 与症状出现时间、症斑颜色变化、症斑数量及存活时间密切相关，浓度越高反应 越明显。供试品种抗性较强的为海桐、龟甲冬青、茶梅、夹竹桃、女贞等；抗性 较差的为红叶石楠、桃叶石楠、四照花等。 ( 3 ) 植株受到s 0 。污染后，m d a 含量随着浓度的升高和试验时i 日j 的延长而上 升；受伤害后，p r 含量降低，伤害程度越深则下降越多，因此可以根据p r 含量 判断植物受伤害的程度；c a t 、s o d 则随着s 0 ：浓度的提高和接触时问的延长而下 降；p o d 酶活性、p r o 含量随着s 0 ：浓度的升高和接触时间的延长均有提高，积 累星增大。 ( 4 ) 不同植物的对比试验表明：植物受到伤害的程度与植物的生物学特性、 保护酶反应机制有关，叶质较厚、含有角质层或有绒毛，增加脯氨酸的含量、提 高保护酶的活性的和清除活性氧的能力，有助于增强植物的抗逆性。 关键词：二氧化硫伤害反应蛋白保护酶丙二醛脯氨酸 a b s t r a c t t m sp a p e ra c c o r d i n gt ot h ei n v e s t i g a t i n gv e g e t a t i o ni n s i d ea n da r o u n dm a i n i n d u s t r i a l p a r k s i n z h e j i a n gp r o v i n c e a n df u m i g a t i o nt e s t , s t u d i e dt h ei n j u r y s y m p t o m ，i n j u r yg r a d e sa n dp rc o n t e n t ，m d ac o n t e n t ，s o da c t i v i t y ，p o da c t i v i t y ， c a t a c t i v i t ya n dp r oc o n t e n t ，d i s c u s s e dt h em e c h a n i s mt h ep l a n tr e s i s t a n t t h er e s u l t i n d i c a t e da st h ef o l l o w i n g s ( 1 ) t h ei n v e s t i g a t i n gr e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ea r e9 0 p l a n ts p e c i e s ，w h i c hb e l o n g t o5 0f a m i l i e s a m o n gt h e ml e g u m i n o s a e ，c o m p o s i t a e ，r o s a c e a ef a m i l i e sa l em o r e t h a no t h e r s t h er i c h n e s so ft h ep l a n ts p e c i e sh a sr e l a t i o nw i t ht h ec h a r a c t e ro ft h e m a i ni n d u s t r i a lp a r k , t h eg r a d a t i o n sf r o mt h eh i g ht ol o wa lep h a r m a c e u t i c a lf a c t o r y 、 f o s s i l - f u e lp o w e rp l a n t 、c e m e n tf a c t o r i e s 、c h e m i c a lp l a n ta n dt h eo t h e r s t h ed i s t a n c e i sm o r ef u r t h e rf r o mt h ep a r k s ，t h e r ea l em o r ep l a n ts p e c i e s n ep l a n t sg r o ww e l l i n c l u d i n gw i l ds p e c i e sp t e r o c a r y as t e n o p t e r a ，g l o c h i d i o np u b e r u m ，s a p i u ms e b i f e r u m ， 1 4 q s f p n as m e m 括d a m n a c a n t h u si n d i c u s ，b r o u s s o n e t i ap a p y r i f e r a ，p l a t y c a r y as t r o b i l a c e a ， r u b u sc h i n g i ia n dp l a n ts p e c i e si l e xc r e n a t a ，p i t t o s p o r u mt o b i r a ，p h o e n i xc a n a r i e n s i s 、n e r i u m i n d i c u m 、c a m e l l i as a s a n p u a a n ds oo n ( 2 ) t h ei n j u r ys y m p t o m sa r ed i f f e r e n ta m o n gp l a n t s t h es h o r tt i m ef u m i g a t i o n s h o w e dt h a t ：t h e r ew e r e n tf o u n dv i s i b l ei n j u r yo nt h eb u d sa n dl e n t i c e l s b u tt h e i n j u r ys y m p t o mo nl e a v e sw a sv e r ys e r v e s n es 0 2c o n c e n t r a t i o na n dt h ec o n t r a c t t i m eh a v er e l a t i o nw i t ht h et i m eo fi n ju r ys p o ta p p e a r e d 、t h ec o l o rc h a n g eo ft h ei n j u r y s p o tc o l o r 、t h en u m b e ro ft h ei n j u r ys p o t s t h o s eh a v eh i 曲r e s i s t a n ta m o n gp l a n t s w h i c hw e r ef u m i g a t i o nt e s tw e r ep i t t o s p o r u mt o b i r a i l e xc r e n a t a ，n e r i u mi n d i c u m ， l i g u s t r u ml u c i d u ma n dc a m e l l i as a s a n p u a ；t h o s eh a v ew e a kr e s i s t a n ta r ep h o t i n i ap r u n i f o l i a p h o t m i as e r r u l a t aa n dd e n d r o b e n t h a m i a j a p o n i c a ( 3 ) i nt h es 0 2p o l l u t i o na i r , t h em d a c o n t e n ti nt h ep l a n t sb e c a m em o r e ；t h ep r c o n t e n ts o da c t i v i t ya n dc a ta c t i v i t yb e c a m el e s sa n dl o w e rw h e ns 0 2 c o n c e n t r a t i o nb e c a m eh i g h e r p o da c t i v i t ya n dp r oc o n t e n tb e c a m eh i g h e ra n dm o r e w h e ns 0 2c o n c e n t r a t i o nb e c a m eh i g h e r ( 4 ) t h o s ee x p e r i m e n t st h r o u g ht h ec o m p a r i s o n sa m o n gd i f f e r e n tp l a n t ss h o w e d t h a t ：t h ed e g r e e so fp l a n t si n j u r yh a v er e l a t i o nw i t ht h ep l a n t sc h a r a c t e ro fb i o l o g y t h o s ep l a n t sw h i c hh a v es t r a t u mc o n i u ma n df l o s si n c r e a s i n gp r oc o n t e n tp r o m o t i n g p o da c t i v i t y 、s o da c t i v i t y 、c a ta c t i v i t ya n dc l e a ra w a ya c t i v eo x y g e n , c o u l d a d v a n c e dt h ea b i l i t yo fr e s i s t a n t k 呵w o r d s ：s 0 2i n j u r ys y m p t o mp rp r o t e c t e de n z y m em d ap r o 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文，是在指导教师指导f ，通过我的努力取得的成果，并且 是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包 含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江林学院或其他教育机构获得学位或证书 而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名：蛆 日期： 翠石! 隍 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江林学院有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印 件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采川影印、缩印或 其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权+ b 。口 不保密，本学位论文属r 不保密。 ( 请在方框内打“”) 学位论文作者亲笔签名：垒蝤一日 指导教师亲笔签名：日期：趔 l 植物对s 伤害的反应及生理抗性研究 1 目的意义 先进制造业基地建设是浙江经济高速发展的动力，而生态省建设则是浙江省经济 可持续发展的保障。近几年来，随着海宁的皮革制品业、绍兴的化纤制造业、新昌的 医药制造业、富阳的造纸业、余姚的塑料制品业、台州的化工制造业、嘉兴的木业、 乐清的低压电器等特色制造业基地的形成，区域特色产业集聚，发挥了规模经济 产业带的优势，多家企业分享公共基础设施，大大降低了生产成本和交易费用，极大 地促进了浙江省工业经济的飞速发展。但是，区域特色工业的大量发展，由于同一区 域生产结构( 产品、原料等) 的类同性以及污染处理能力的薄弱，导致一种或几种工 业污染物的大量积聚，从而形成了严重的生态环境问题。 不同工业园区，产生不同的主要污染物。其中，铅主要来源于冶炼、含铅燃料、 蓄电池制造、涂料工业，汞来源于造纸业、采掘业、制碱业、塑料工业，砷是一些农 药、采矿、磷肥厂废弃物带来的，氟污染来自冶炼厂、玻璃厂排放的粉尘和富氟煤燃 烧释放的废气，s o ：由燃烧含硫的煤、石油和焦油等产生。氮氧化物来自电厂、工业 窑炉等燃烧过程。工业废气产生的各种有害气体如烟尘、二氧化硫、氮氧化物、氟化 物、氯气、甲醛、乙烯、碳氢化合物、臭氧等对空气质鼍造成严重影响，排放物使土 壤重金属( 铅、铬、贡等) 超标、农产品农药残留污染严重，废水造成水域富营养化， 已远远超出了环境自然净化的能力，整个生态系统受到严重破坏。这将直接威胁到工 农业生产的发展和人民群众的健康安全，制约了投资环境条件的改善。 植物修复足门利用植物的富集作用，清理陆地和水生态系统污染的技术，利用 植物及其微生物与环境之问的相互作用，对环境污染物质进行消除、分解、吸收或吸 附，使空气、土壤、水环境重新得到恢复( 唐世荣，1 9 9 9 ) 。植物修复既呵用于对有机 污染物质分解，也可用于对无机污染物的清理，虽然这一环境处理技术作为一个单独 技术进行研究的时问不长，但幽际上已越来越引起人们的重视。与其它环境污染处理 的工程技术相比，植物修复具有应用成本低、生态风险小、对人类和环境副作用小等 特点，并以其明显的生态效益、经济效益和景观功能，具有非常大的市场潜力( 张建 梅，2 0 0 3 ) 。 s o ：污染足我国工业化进程中面临的较为严重的环境污染问题，是我国空气污染 的主要成分之一。据有关专家估算( 余瑞祥，2 0 0 6 ) ，中国2 0 世纪8 0 年代以来经济增 长的环境成本大致占g d p 的3 - - 一8 ，2 0 0 3 年，中国环境污染和生态破坏造成的经济损 失约占当年g d p 的1 5 。而单位g d p s o ：的排放强度是美国的的8 倍，德国的2 6 倍， 日 本的8 1 倍。这与我国经济发展水平的阶段性特征、能源消费结构等有着极其密切的关 系。但其根本原因在于，我国工业化发展进程中工业科技低水平的发展，使得经济增 长的同时无法合理解决对环境造成的负效应。 植物对s 0 2 伤害的反应及生理抗性研究 。o r v 删 辎 霉 堰 s 罐 l | 年份 本项目以浙江省主要工业污染区为对象，通过对植被调查，发现可以在污染环境 下生存的植物，根据植物受害状况结合当地人气污染物种类及浓度，初步判断不同植 物对不同大气污染的抗性等级。通过现场对比分析、植物体内主要污染物化学元素含 量的测定和室内熏气试验等，确定其在污染区正常生长的原冈：是不是有个别植株产 生变异，适应了污染环境，还足这个物种本来就适应污染环境：哪些植物品种叮以吸 收转化污染气体，具有植物修复功能，哪些树种足 于其自身的一些特性，不富集污 染气体，仅是抵抗力强，适合在污染区生长。找出适合本地区种植的，具有良好植物 修复功能的，工业p 目区造林绿化植物品种。 2 植物对s 傥伤害的反应及生理抗性研究 2 国内外研究概况 s 0 。为无色，具辛辣及窒息性气味的气体，属中等毒性物质。易溶于水形成亚硫 酸，在空气中可在亚铁和锰等金属离子的催化下进一步氧化成三氧化硫，s 0 。又可溶 于空气的水分中形成硫酸，并以气溶胶状态在空气中存在，形成二次污染物，其危害 更加严重。据研究表明，s o ：污染对地球一生物圈的影响大致有以下七个方面：使湖泊、 河流等水系酸化；使水生和陆生的生物种群结构改变，生物多样性减少，影响生态系 统的结构和功能；抑制硝化细菌、固氮菌等的活动，使有机物的分解、固氮过程减弱， 因而土壤肥力下降；影响植物的光合作用和呼吸作用，降低植物的生产力；使土壤酸 化；腐蚀建筑物表面；对人类健康造成危害( 李清丽，2 0 0 3 ) 。 空气污染对绿色植物有一定的影响和危害，但另一方面，绿色植物对空气污染又 有一定的抵抗和修复( 吸收净化) 能力。硫是植物生长必需的大量元素，它与植物的 正常生理代谢活动相关。植物体内的硫元素主要通过根系从土壤中吸收，但有一部分 可来自空气中的s 0 2 ( 刘艳菊，2 0 0 1 ) 。 2 1s 0 2 对植物的伤害症状、机理及生理反应 2 1 1s 0 2 的伤害机理及症状 2 1 1 1 伤害症状 不同植物对s o ：的敏感性相差很大。总的来说，草本植物比木本植物敏感，木本 植物中针叶树比阔叶树敏感，阔叶树中落叶的比常绿的敏感，c 3 植物比c 4 植物敏感。 植物受s o ? 伤害后的主要症状为：叶北f j j l f l i 出现h 啬绿色水渍斑，叶失去原有的光泽， 常伴有水渗出；叶片萎蔫：有明显失绿斑，呈灰绿色：失水干枯，出现坏死斑。 2 1 1 2 伤害机理 s 0 ：通过气孔进入叶内，溶化于细胞壁的水分中，成为重亚硫酸离子( h s 0 3 一) 和 亚硫酸离子( s 0 3 2 一) 。并产生氢离子( h + ) ，这三种离子会伤害细胞。 直接伤害。h + 降低细胞p h 值，干扰代谢过程；s 0 3 、h s 0 3 直接破坏蛋白质的结 构，使酶失活。如卡尔文循环中的核糖一5 一磷酸激酶( r u 5 p k ) 、n a d p 、甘油醛一3 一磷 酸脱氢酶( g a p d h ) 、果糖一1 ，6 一二磷酸酶( f b p a s e ) 三种酶活性明显受抑制。酶失 活与一s h 基被氧化有关，迫使一s h 基氧化的毒物是h ：0 2 ，它是s 0 ：进入细胞后由次生反应 生成的。当暴露停止后，酶活力恢复，光合速度回升。因此低浓度、短时间s o ：引起 的光合障碍是可逆的，如浓度高、暴露时间长则恢复慢，甚至无法复原。 间接伤害。在光下由硫化合物诱发产生的活性氧会伤害细胞，破坏膜的结构和 功能，积累乙烷、丙二醛、h ：o 。等物质，其影响比直接影响更大。在这种情况下，即 使外观形态还无伤害症状也会使物质积累减少，促使器官早衰，产量下降。 3 植物对s 0 2 伤害的反应及生理抗性研究 2 1 2 植物在污染气体胁迫下生理生化反应 通过植物对污染气体胁迫下的生理生化反应的研究，植物对大气污染表现出一定 的净化能力。c o r n e j i ( 1 9 9 9 ) 等发现，植物可吸收空气中的苯、三氯乙烯和甲苯。 据c a y 等研究，在生长季植物树冠的吸收作用可使大气中的h + 、n 0 3 - 和n h 4 + 减少5 0 - - - - 7 0 ，n h 3 几乎被全部吸收。s a n d e r m a n n 认为，植物含有代谢异生素的专性同功酶及 相应基因，以束缚保存代谢产物。如过氧化物酶( p o d ) 、脱卤酶、硝基还原酶等可 直接降解大气中的有机污染物。另据g o r d a n 用同位素标记实验证明，植物中的酶可以 降解三氯乙烯，最终形成二氧化碳和氯气( s c h o o rjl ，1 9 9 5 ) 。张德强( 2 0 0 3 ) 等 采用盆栽对比法研究了3 2 种园林绿化植物对大气s 0 2 和氟化物的净化能力，表明竹节 树、傅园榕等1 4 种植物对s o 。和氟化物等具有较高吸收净化能力。鲁敏( 2 0 0 1 ) 等研 究发现，在我国北方主要城市修复大气s 0 2 污染能力强的树种有加杨、旱柳、花曲柳。 罗红艳( 2 0 0 0 ) 等研究表明树木吸收、积累s 0 ：的能力为落叶乔木 灌木 常绿针叶树。 蒋高明( 1 9 9 5 ) 发现油松针叶的s 含量与大气s 晚浓度之问有显著相关性。鲁敏( 2 0 0 5 ) 等分析了北方主要的绿化树种对大气氯化物及氟化物的吸收净化能力，表明吸滞大气 氯污染能力强的有榆树、京桃、枫杨、皂角、卫矛等，吸滞大气氟污染能力强的有榆 树、花曲柳、刺槐、旱柳。植物通过气孔吸收h f ，进入叶片的 1 f 与细胞中c a 反应形成 c a f 积累。植物吸f 量大小与叶片形态解剖学特性有关，如叶片覆有蜡质的树种吸h f 量较少。至于重金属污染，k o v a c s ( 1 9 8 9 ) 指出许多重金属累积植物都具有较大树 冠和较宽叶面积。植物在遭受有害气体的胁迫下生理乍化指标的变化：据彭长连 ( 2 0 0 2 ) 等物长期牛长在含有二氧化硫、氮氧化合物等有害物质的环境下，叶绿素含 量、f v f m 都不i 川程度的降低，细胞膜渗漏率则k 升。据高厚强( 2 0 0 3 ) 等人的研究 表明叶绿素b 较绿索a 分解的快，导致叶绿素a b 值上升。勾晓华( 2 0 0 0 ) 等根据其氟 化氢熏气对植物的影响试验得出在氟化氧气体的胁迫下，m d a 含量和相对电导率都足 上升的，但是加入抗坏血酸( v c ) 和苯甲酸钠等自由基清除剂则可以降低m d a 含量和 相对电导率。韩素梅( 1 9 9 6 ) 的研究根据其试验得出在二氧化硫污染条件下，植物叶 脯氨酸含量与k + 渗出量( ) 呈负相关变化，并因树种和o 叶片成熟度而异、脯氨酸 含量为成叶 老叶，k + 出量则是老叶 成叶，外施脯氨酸对植物哑硫酸伤害具有一定的 保护作用。 2 2 植物对污染气体的抗性研究进展 2 1 1 植物对污染气体的抗性机制 屏蔽性：污染物不进入或少进入组织，细胞与叶片形态，气孔控制能力有关。例 如角质层后，表皮细胞小而致密，细胞壁木栓化等，调节气孔运动( 武维华，2 0 0 3 ) 。 忍耐性：可以通过气孔调节防止一部分进入，但不能完全闭合，所以一部分仍能 4 植物对s 0 2 伤害的反应及生理抗性研究 进入。通过一系列生理生化特性而限制起毒性或减少起毒性，还可以通过代谢解毒机 制和恢复能力，与细胞的缓冲能力，酶的稳定性及代谢解毒机制有关( 王沙生，1 9 9 1 ) 。 适应性：生长在污染地区的植物，在一定的大气污染浓度阙值下，伤害不再继续 增加，产生种抗污染的适应机制。 在大气污染物作用下，每种植物反应不同，或敏感或忍耐。植物对有害气体表现 抗性，是我们在污染区应用植物净化空气的先决条件，为现有植物划分抗空气污染等 级，是修复大气污染的环保功能植物选择的基础。随着大气污染物对植物生理生化、 分子水平影响研究的不断进展，相应的研究方法和抗性指标层出不穷，现将目前主要 采用的方法特征简介如下。 2 1 2 植物抗性研究方法 现在国内外大部分是采用室内熏气实验来判断不同浓度的单一污染物对植物的 伤害作用，以此筛选单一污染物下的抗性植物。熏气装置多半是采用由开顶式气室、 活性碳过滤器、风机、流量计、减压阀、各种污染气体贮存钢瓶及通气管路等组成。 当植物面临着多种混合污染物作用时，这种研究方法则无能为力。 污染地区树木调查法，通过观察植物的生长状况和叶片的宏观受害症状，主要靠 经验来粗略判断植物对污染物的抗性等级，不同的使用者得出的结论可能偏差很大， 可比性较差。其实在出现可见受害症状前，植物叶片的光合和呼吸作用等微观特征已 经发生某些变化。污染物对花粉粒的形态和叶基分生组织细胞也产生影响( m ic i e t a l k ，1 9 9 8 ) 。因此，需结合其他方面的反应特征，4 能科学地推断植物的抗性程度。 污染物对植物生理生化和物理特性的影响，如s o ：使细胞膜脂过氧化，导致细胞 膜透性增加；臭氧使烟草出现伤害症状时，会促进呼吸作用而阻碍光合作用( 高绪 评，1 9 8 2 ) 。超氧化物歧化酶是一种保护酶，已有研究探讨它与s o ? 污染的关系( m i c i e t a k ，1 9 9 8 ) ；还有人认为，s o d 的活性氧代谢能反映植物的综合抗逆性，可划分植物的 抗性等级( 高绪评，1 9 8 2 ) 。但这种综合抗逆性不能区分植物对污染物的抗性和对寒、 旱的抗性。 植物表皮是阻隔大气污染物和植物个体之问的屏障，外被的蜡质覆盖层，是外界 影响植物表面的第一步。国际上对针叶类植物叶片蜡质层在污染物环境下的结构变化 有大量研究( 杨礼锐，1 9 8 9 ：韩阳，1 9 9 5 ) 实验表明，污染区植物叶片吸收的硫有1 3 一2 4 积累于叶片表面的蜡层中，蜡质层结构的伤害症状被用来判断污染物对植物 的伤害程度( b a c i s ，1 9 9 8 ) ，气孔腔室内的蜡质层结构可能是针叶类气体交换的又一 道障碍，欧洲七叶树( a e s c u l u sh i p p o c a s t a n u m ) 在污染区的蜡层表面就失去了对照 区叶片蜡质层相应的小折叠，并且叶片气孔形态也不正常( g o d z i k ，1 9 9 4 ) 。 2 1 3 植物对大气污染的忍耐抗性指标研究 当环境胁迫长期作用于植物，使其产生的活性氧超出活性氧清除系统的能力所及 5 植物对s 0 2 伤害的反应及生理抗性研究 时，就会产生氧化损伤。活性氧可以攻击蛋白质的氨基酸残基，尤其是t y r 、p h e 、t r p 、 m e t 和c y s ，形成羰基衍生物( b e r m a d i n g e r ，1 9 9 4 ) 。此外，活性氧可以促进分子内和 分子间的交联，如二硫键的形成和蛋白质的断裂，超氧化物可使一些含金属的酶类失 活，或产生羟自由基，引发磷脂的过氧化( g o d z ks ，1 9 7 8 ) g 。1 0l am o l l 的h z o ：可以 抑制碳固定，在ll am o l l 的低浓度下，它可使卡尔文循环中的一些巯基酶类失活。最 主要的是h ：0 2 能够通过h a b e r w e is s 反应产生更活跃、更有毒性的o h 一，从而导致膜脂 过氧化、碱基突变、d n a 链的断裂和蛋白质的损伤( s t a d t m a n ，1 9 9 2 ) 。o h 一可以修饰 一些蛋白质使它们对蛋白水解酶的作用更敏感( a s a d ak ，1 9 8 7 ) ，一旦被破坏，蛋白 质就会进一步被肽链内切酶降解，已发现在类囊体的膜上存在这样的酶。此外，一种 具有多种催化功能的蛋白酶复合体己在哺乳动物和植物中被证实其具有选择性地降 解活性氧所破坏的蛋白质( c a s a m olm ，1 9 9 4 ) 。植物体内有效清除活性氧的保护机 制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、抗坏血酸过氧 化物酶( a p x ) 、( c a t ) 和谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 等。非酶类抗氧剂包括抗坏血 酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。所以在研究植物对各种污染气体抗性方面大部分采 用对晦活性指标研究来推断出植物抗性的强弱。 由上面介绍主要污染气体对植物的伤害机理可知，污染气体对植物生理生化影响 包括气孔丌度、质膜透性、光合作用、呼吸作用及酶的活性等指标。 气孔开度：污染气体对植物气孔关闭有显著影响( p a c i f i cre ，1 9 9 3 ) 。通常 情况下，气体浓度越高，暴露时问越长，气孑l 所受的影响越大，在气体超过一定剂量 后，气孔的关闭往往边得不可逆转( 刘燕云等，1 9 8 9 ) 。 质膜透性：污染气体对质膜透性的影响比较复杂，在低浓度时，气体浓度增加 对膜透性的影响不大，但当气体浓度增大到一定值时，质膜透性随气体浓度的增加而 显著增加( 曹洪法等，1 9 8 5 ) 。 光合作用：污染气体能使植物的光合作用强度减弱，导致干物质减少，产量降 低，但对不同的植物及不同发育期的植物，影响会有区别。污染气体对光合作用的影 响足通过引起气孔关闭、减少叶面面积、改变色素含量和性质、改变光系统和电子传 递链的正常传递、影响乙醇酸代谢等途径，影响光合作用的( 高吉喜，1 9 9 7 ) 。 呼吸作用：污染气体对植物呼吸作用的影响较为复杂，条件不同，植物的反应 亦不同。目前为不同植物对各种污染物抗性程度罗列各式各样的抗性等级或强弱次 序，常常基于现场调查法和熏气试验方面的研究，经常可发现同一种植物抗性等级相 差很大的现象，如不同方法得出银杏对氯气抗性很强和敏感两种相反的结论( 刘艳菊 等，2 0 0 1 ) ，说明这些方法片面而且没有统一指标，判定植物抗性等级的结论还不十 分肯定。如据李成，胡丁猛( 李成等，2 0 0 6 ) 在研究园林苗木对s 0 2 反应中采用的是净 光合速率( p n ) 、蒸腾速率( t r ) 和气孔导度( g s ) 三个指标来判断苗木对s 0 2 的敏 6 植物对s 0 2 伤害的反应及生理抗性研究 感程度，此三个指标容易受环境因素的影响，就此判断敏感度有很大的局限性；关丽 杰，陶飞等( 2 0 0 5 ) 在判断植物对s 0 。抗性采用过氧化物酶( p o d ) 、超氧化物歧化酶 ( s o d ) 、抗坏血酸氧化酶( a s o ) 、多酚氧化酶( p p o ) ，单单是从酶方面。所以在 空气污染作用下植物的生理生化、物理方面反应特性有不同程度的变化，发展一种综 合各种特性变化的量化指标来科学确定植物抗污染能力是目前植物抗性方面研究的 前沿课题。s i n g h 等( 1 9 9 1 ) 用计算机得到植物在污染物作用下反应特性的综合参数， 以此推断植物忍耐程度的经验指数法，他们从植物敏感性的传统指标，叶片可见伤害， 叶片电导、细胞膜透性、抗坏血酸、相对水含量、叶绿素含量、叶提取液p h 及过氧化 物酶活性中选择四个因素抗坏血酸( a ) 、叶绿素的总含量( t ) 、叶提取液p h 值( p ) 、 叶组织中相对水含量的百分数( r ) ，纳人大气污染忍耐指数公式a p ，r i = h ( t + p ) + r 1 0 ，他们用该指数法所得结论与实验室和野外观察到的植物反应一致。 7 植物对s i z 伤害的反应及生理抗性研究 3 研究方法 3 1 外业调查 本项调查于2 0 0 6 年7 月8 月进行。根据浙江省的工业情况、自然条件和植物 区域分布等实际情况，分别选择台州化工原料药工业园区( 临海、椒江) 、衢州石化 基地、宁波镇海石化基地、上虞精细化工园区、长兴电厂、德清水泥厂、丽水、东阳、 龙泉等化工生产基地，进行植物调查和环境测定。 3 1 1 基本情况调查 工业园区的基本情况：工业园区的建立时间，主要生产的产品、规模，最近生产 情况，是否停产过等，气体排放时是否经过处理等。 天气状况包括阴晴、风向、风力、温度等，不仅是当天还包括近期内天气变化： 大气成分的浓度主要包括s o 。等。 3 1 2 植物调查 调查污染区植物生长状况，主要包括植物群落特征和单株植物生长状况； 植被群落特征：林分起源，郁闭度，盖度，植物群落结构等级，乔、灌、草的生 长状况。 单株乔木、灌木调查：主要起源、树龄、树高、胸径、枝下高、冠幅、生长势和 抗性等级等指标，并对树木叶子表血状况和受害状况进行描述，对于生长状况良好的 树种要进行挂牌k 期定点监测。 草本：调查频度、盖度、高度、抗性等级等指标，并对草本生长的总体状况进行 描述。 重点观测的树种：严重污染情况下，生长特别好的树种；生长特别差的树种；不 常见的树种，但是有一定的开发潜力。尤其足野生种，重点以乔、灌、藤本为主。 3 2 熏气试验 3 2 1 实验内容 通过s 0 ：熏气试验，观察表象特征，测定生理生化指标和植物组织中元素的含量， 生理生化指标包括s o d 、c a t 、p o d 、m d a 、蛋白质含量和脯氨酸，初步探索植物是如 何运用本身的酶保护体系柬保护本身降低受逆境的影响，维持正常的生长。 试验观测指标：将供试植物盆栽进行熏气试验，观察表象特征，并定期对有关的 生理生化指标进行测定。观测的指标主要有：树年龄、叶片的变化( 颜色变化，伤斑 的形状、大小、有无明显界限、占叶面积的比例等) 、株高、分枝、地径等生长情况、 受害状况( 对于顶芽的影响，是否有斑点等) 等。对不同植物在不同污染浓度下出现 受害状况的时间，及忍耐时间进行对比分析。 8 植物对s 0 2 伤害的反应及生理抗性研究 3 2 2 供试植物材料 选择了海桐、龟甲冬青、红叶石楠、茶梅、央竹桃、女贞、桃叶石楠、四照花等 8 个树种，2 年生容器苗；一年蓬、商陆、牵牛、艾草4 种草种，一年生苗。 根据调查结果和树种供应情况，选择适合的苗木，海桐、龟甲冬青、红叶石楠、 茶梅、夹竹桃、女贞、桃叶石楠、年蓬、商陆、牵牛、艾草均为调查出来的植物品 种，但是生长状况不一样，四照花作为对比。因此选择了这四个草种和八个树种作为 试验对象。 3 2 3 试验方法 本项实验在浙江林科院实验室进行，采用开顶式熏气室，时间为2 0 0 6 年1 0 中旬 1 2 月中旬，s 0 2 浓度设置8 5 8 m g m 3 ，2 5 7 4 m g m 3 和5 1 4 8 m g m 3 三个梯度。 开顶式熏气室底座为径为1 2 m 的六面体，整体高2 5 m ，分为两层，下层0 4 m ， 用打孔的有机玻璃分开，可以使气体均匀进入，上面有个开口，保持气体的流畅。二 氧化硫纯度为9 9 9 9 。 浓度梯度根据预试验和野外二氧化硫浓度情况，结合植物的表现症状还有仪器设 备的灵敏度可操作性等情况，选择了这三个浓度。 每几熏气时间为9 ：0 0 1 5 ：0 0 。9 ：0 0 - - - 1 5 ：0 0 时段，每隔l h 观察植物形态变化一 次，移出熏气事后在每天的1 8 ：0 0 时、2 1 ：0 0 时、0 ：0 0 时、3 ：o o 时和6 ：0 0 时各观测 一次。 3 2 4 观测内容 i 叶i 现症状的时i h j ，症状从整体和单片叶了两方面来观测，整株又分上、中、下三 部分来描述，对顶芽、侧芽、叶、茎的影响等，译片叶子详细描述症斑的出现时问、 颜色、形状大小，出现位置、有无边界等。 试验终止：当叶片6 0 - 7 0 出现症状时，判定为在此浓度下死亡，中止对其试验。 当连续十天熏气后仍然存活的初步判定为在此浓度f 仃较强的抗性，终止试验。 每个处理每种植物5 盆，指标测试重复3 次。 3 3 生理生化指标的测定 主要包括：s o d 、c a t 、p o d 、m d a 、蛋白质含量和脯氨酸 3 3 1 s o d 的测定 3 3 1 1 酶液的提取 取待测植物叶片0 5 9 于预冷的研钵中，加入2 m l 预冷的提取介质，冰浴下研磨 成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使终体积为l o m l ，于4 c 下1 0 5 0 0 r m i n 。1 离心 2 0 m i n ，上清夜即为s o d 粗酶液。 9 植物对s 0 2 伤害的反应及生理抗性研究 3 3 1 2 s o d 活性测定与计算 取透明度好、质地相同的试管按照下表n a , 试剂。混匀后，给一支队照管罩上比 试管长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各试管同时置于光照培养箱内反应l o - - - 2 0 m i n ( 要求各试管光照情况一致，反应温度控制在2 5 - - - 3 5 之间，视酶的活性高低适当调 整酶的浓度和反应时间) 。 3 3 1 3s o d 活性测定与计算 反应结束后，用黑白罩于上试管，终止反应。以遮光的对照作为空白，分别在 5 6 0 n m 波长下测定各试管的吸光度，按下式计算s o d 活性。以能抑制反应5 0 的酶量 为1 个s o d 酶单位。用u 表示。 s o d 活性= ( - h 。) v ，( 0 5 a o w ，v 。) q s o d 比活力= s o d 总活性c 1 s o d 总活性一1 个酶活单位每克( u g ) s o d 比活力一1 个酶活单位每毫克蛋白( u m g ) k 一照光对照管的光吸收值 a s _ 样品管的光吸收值 v ，一样液总体积( m l ) v 。一测定时样品用量( m l ) w ，一样品鲜重( g ) c 一鲜植物叶片中蛋白质的质量分数( m g g ) 3 3 2c a t 的测定 3 3 2 1 酶液提取 称取待测植物叶片或其他组织0 5 ，置研钵内，加入2 - - 3 m l 4 c 下预冷的p h = 7 0 的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入2 5 m l 容量瓶内，并用磷酸缓冲液洗 研钵数次，合并冲洗液并定容至刻度线。混合均匀后，将容量瓶至5 冰箱中静置 l o m i n ，取上部澄清液4 0 0 0r m i n 1 离心1 5 m i n 上清液即为粗提掖，5 下保存备用。 取1 0m l 试管4 支，其中两只为样品测定管，两只为对照管，各管内先后分别加入粗 酶液0 2 m l ，磷酸缓冲液1 - 5 m l ，水1 o r a l ，但对照管加入的酶液为煮沸的酶液。 1 0 植物对s o b 伤害的反虑及生理抗性研究 3 3 2 2 c a t 活性测定 活性测定：2 5 c 预热后，逐管加入0 3m e o 1 m o l l 的h ：0 2 ，每加完一管立即计 时并迅速倒入石英比色杯中，2 4 0 h m 下测定吸光值，每隔l m i n 读数一次，共测4 m i n 。 3 3 2 3 结果计算 以l m i n 内a 2 4 0 减少o 1 的酶量为一个酶活单位( u ) 。 c a t 酶活性= ( a ：柏v ，) ( 0 1xv 。t w ，) _ a ：= 凡一( a i + a 2 ) 2 艋一加入煮死酶液的对照管吸光值 a 1 、a 2 一样品管吸光值 v 广粗酶提取液总体积( m l ) v 。一测定用粗酶液体积( m l ) w 广样品鲜重( g ) o 1 一a 2 4 0 每下降o 1 为一个酶活单位( u ) t 一加过氧化氢到最后一次读数时问( m i n ) 3 3 3p o d 的测定 3 3 3 1 p o d 酶液的提取 取5 0 克待测植物组织，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀 浆液全部转入离心管中，以4 0 0 0r m i n 1 离心l o m i n ，上清液转入2 5 m l 容最瓶中。 沉淀用5 m l 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存 备用。 3 3 3 2 p o d 活性测定 酶活性测定的反映体系包括：2 9 m l 。0 0 5 m o l l 磷睃缓冲液；1 o r a l 。质量分数为2 的h 2 0 2 ；1 o m l o 0 5 愈创木酚和0 1 m l 酶液。用加热煮沸5 m i n 的酶液作为对照， 反映体系加入酶液后，立即于3 7 水浴中保温1 5 m i n ，然后迅速转入冰浴中，并加入 2 o m e 质量分数为2 0 的三氯乙酸终止反应，然后，过滤( 或以5 0 0 0r m i i l 1 离心 l o m ir 1 ) ，适当稀释，4 7 0 n m 波长下测定吸光度。 3 3 3 3 结果计算 以每分钟内a , 7 0 变化o 0 1 为一个p o d 活性单位( u ) 。 p o d 活性= ( a 凡，o v t ) ( 0 0 1 w ，v s t ) 1 凡，。- 反应时间内吸光值的变化； w ，一待测样品鲜重( g ) t 一反应时间( m i n ) v 广提取酶液总体积( m l ) v 广测定时取用酶液体积( i l l l ) 植物对s 0 2 伤害的反应及生理抗性研究 3 3 4m d 的测定 3 3 4 1 m d a 的提取 称取剪碎的材料l g ，加入2 m l 质量分数为1 0 的t c a 和少量石英沙，研磨至匀 浆，再加入8 m l t c a 迸一步研磨，匀浆在4 0 0 0r m i n 1 离心l o m i n ，上清液为样品提 取液。 3 3 4 2 显色反应和测定 吸取离心的上清液2 m l ( 对照加入2 m l 蒸馏水) ，加入质量分数为0 6 的t b a 溶液，混匀，将混合物置于沸水浴上反应1 5 m i n ，迅速冷却后再离心。取上清液测定 4 5 0 ，5 3 2 和6 0 0 波长下的消光度。 3 3 4 3 结果计算 m d a 质量摩尔浓度( | im o l g ) = c n w c 埘d a 的浓度( um o l g ) n 一提取液体积( m l ) w 一植物组织鲜重( g ) 3 3 5p r o 的测定 3 3 5 1p r o 标准曲线的制作 取】0 毫克脯氨酸，溶于少量8 0 乙醇中、用蒸馏水配成1 0 0 毫升( 1 0 0 微克 毫升) 的母液，然后稀释成下列浓度：0 、1 o 、2 5 、5 0 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 微克 毫刀 。分别取上述各溶液2 毫升，冰醋酸2 毫升，茚三酮试剂2 毫升，加于试管、 管口盖上空心玻璃球，于沸水浴中加热2 0 分钟，冷却后，用分光光度计于波长5 1 5 n m 下进行比色测定。以浓度零为空白对照。将测定结果以脯氰酸浓度为横修标、以光密 度值为纵啦标，作标准曲线。 3 3 5 2 植株中游离p r o 的提取 称取0 5 克材料，放入研钵( 或匀浆器) 中，用3 毫升8 0 乙醇( 加少量石英 砂) 研磨成浆状，将匀浆移入大试管并用8 0 乙醇沈研钵，洗涤液也并入大试管中。 8 0 乙醇总量为1 0 毫升，加盖置于黑暗下浸提- d , 时以上，然后加入0 2 5 克活性炭 粉木、振荡，过滤，并用8 0 乙醇洗试管，滤渣和滤纸三次以上；，直到残液中测不 出游离