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华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 利用酿酒酵母菌富集硒的研究 微生物学 2 0 0 7 届研究生朱昌雄指导老师马爱民 摘要 硒是人类基本营养元素，硒缺乏导致很多疾病的发生。目前在动物中己发现有 1 4 种含硒蛋白发挥着重要功能，其中包括抗氧化、调节甲状腺荷尔蒙作用、调节维 生素c 的抗氧化状态等。硒与心血管疾病、糖尿病、肿瘤及艾滋病等密切相关。硒 缺乏可导致克山病，缺硒是克山病的发病根源。在艾滋病的患者中也普遍发现缺硒。 因此硒在人类健康中的重要地位开始被人们所重视。 食品与农业组织、世界卫生组织推荐硒的日常用量是：男性每天3 4 1 t g ，女性2 6 1 t g 。 中国大部分地区处于缺硒状态，在中国的缺硒地区，人均硒摄入量仅为3 - 1 1 i j t g d - 天然食品中的硒含量普遍较低，而无机硒毒性高不能用于食品中，因而通过微生物 转化开发有机硒食品对于国民健康有着重要意义。 本文以酿酒酵母为材料进行了微生物富集硒的研究，主要工作如下： ( 1 ) 从实验室现有的七株酿酒酵母菌株中筛选出一株富硒能力相对较强的菌 株l 作为富硒酵母研究的出发菌株。 ( 2 ) 通过对菌株l 的驯化培养、d e s 多次诱变和含硒平板、乙硫氨酸抗性平板 筛选，获得了一株高生物量、高硒和硒蛋氨酸含量的菌株l - 1 1 7 2 。相对出发株l 而 言，l 1 l 7 - 2 将细胞硒浓度和生物量分别提高到t 2 4 5 2 p g g 和7 9 9 l 。利用g c - m s 对 1 , - 1 1 7 2 进行了硒蛋氨酸检测，结果显示l - i i 7 2 硒蛋氨酸含量为1 6 5 0 t t g g ，占总硒 比例6 7 3 。 ( 3 ) 通过3 0 l 全自动发酵罐流加培养，将富硒酵母成功扩培，酵母细胞硒含 量3 3 5 1 1 a g g ( 折干) ，总硒吸收量为2 2 9 9 ，吸收率为9 5 4 ，其中硒蛋氨酸含量为 2 1 5 7 9 9 g ，占总硒含量的“3 6 。 关键词：酿酒酵母；富硒；选育；总硒；硒蛋氨酸 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 s t u d y o ns e l e n i u m e n r i c h m e n tb ys a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e a b s t r a c t s e l e n i a mi sa ne s s e m i a it r a c ee l e m e n ti nh u m a nn u t r i t i o na n ds e l e n i u md e f i c i e n c yo r e x c e s sh a sb e e ni m p l i c a t e di ns e v e r a ld i s e a s e st od a t e , f o u r t e e ns e l a n o p r o t e i n sh a v eb e e n i d e n t i f i e di na n i m a l sa n dt h ek n o w nb i o l o g i c a lf u n c t i o n so fs ei n c l u d ed e f e n s ea g a i n s t o x i d a t i v es t r e s s ，r e g u l a t i o no f t h y r o i dh o r m o n ea c t i o n , a n dr e g u l a t i o no f t h er e d o xt c c a t u s o f v i t a m i nc s e l e n i u mi sa l s oc o r r e l a t e dw i t hm a n yd i s e a s e sd e v e l o p m e n ta n da d v a n c e s , e s p e c i a l l yc a r d i o p a t h y ，d i a b e t e s ，t u m o u ra n da i d s s e l e n i u md e f i c i e n c yi sac o n t r i b u t i n g c a t l s eo f k e s h a nd i s e a s es e l e n i a md e f i c i e n c yi sa l s oo b s e n ，e di np a t i e n t sw i t hh i v a i d s s os e l e n i a mh a se r u c i a lr o l e si nh u m a nh e a l t h t h ef a o w h 0h a ss e tt h er e c o m m e n d e dd a i l ya l l o w a n c ef o rs e ：2 6 t t g da n d 3 4 p g df o rw o m e na n dm e nr e s p e c t i v e l y d i e t a r ys e l e n i u mi n t a k e si nl o ws o i ls ea r e a so f c h i n ai s3 - l1p g d 。s e l e n i u mi sa l w a y sv e r yl o wi nn a t u r a lf o o d , a n di n o r g a n i cs ei sn o t a b l et ob eu s e di nf o o db e c a u s eo fi t sh i g h e rt o x i c i t y , i ti si m p o r t a n tt or e s e a r c ha n d d e v e l o pk i n d so f s e - e n r i c h e df o o d sb ym i c r o o r g a n i s mf o rh e a l t h s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew a su s e df o rs t u d y i n gt h ea b i l i t yo fe n r i c h i n gs ei n m i c r o o r g a n i s m , t h em a j o r i t yo f w o r ka sf o l l o w s ： ( 1 ) s c r e e n e dal s t r a i nw h i c hh a sh i g h e ra b i l i t yo f e n r i c h i n gs ef r o m7s t r a i n si n0 1 1 1 l a ba se x p e r i m e n t a ls t r a i n ( 2 ) b r c e d e das t r a i nn a m e dl - ii - 7 - 2w i t hh i g h 盯b i o m a s s ，h i g h e rs ec o n t e n ta n d h i g h e rs e m e tc o n t e n ta f t e ra d 印t c dc u l t i v a t i o n , d e sd o m e s t i c a t i o na n ds c r e e n i n gf r o m c u l t u r ec o n t a i n e ds ea n dc u l t u r ec o n t a i n e de t h i o n i n e c o m p a r e dt ol - l i - 7 2s t r a i n , t h e s ec o n t e n ta n dt h eb i o m a s so fls t r a i nw e r ee n h a n c e dt o2 4 5 2 i _ t g ga n d7 9g l r e s p e c t i v e l y u s i n gg c m st om e a s u r et h ec o n t e n to fs e m e t ，t h er e s u l ts h o w s t h a tt h e c o n t e n to fs e m e tw a s1 6 5 0 p g gw h i c hw a sn e a r l y6 7 3 o f t h et o t a ls e ( 3 ) a f t e rf e d b a t c hc u l t i v a t i n g , t h ec o n t e n to f s ei n 矗c e r e v i s i a ew a su pt o3 3 51 t l g g i nt h es a m et i m e ，t h em i c r o o r g a n i s ma s s i m i l a t e d2 2 9 9s e ，a n dt h ea b s o r p t i v i t yo f s ew a s 9 5 4 t h ec o n t e n to f s e m e tw a s2 1 5 7 p g g a b o u t6 4 3 6 o f t h et o t a ls e 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 k e yw o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e , s e l e n i u m e n r i c h m e n t ；b r e e d i n g ；t o t a ls e ； s e l e n o m e t h i o n i m e 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个入在导师指导下进行的研究1 - 作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生张缔易佩帆沙7 年一月舢 学位论文使用授权书 学位黻储始特希导撇：另则 脚瓤柳川阳跏飙7 “帆 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 前言 1 1 硒的理化性质 硒，原子序数3 4 ，原子量7 8 9 6 ，元素名来源于希腊文，原意是“月亮”。1 8 1 7 年瑞典化学家贝采力乌斯从硫酸厂铅泥中发现。硒在地壳中的含量为o 0 0 0 9 0 , 6 ，广 泛分布于硫化物矿中，独立矿物有硒铜矿、硒铜银矿等。硒是有金属光泽的固体， 熔点2 1 7 ( 2 ，沸点6 8 4 9 ，密度4 8 1 9 c m 3 ；硒有六种同素异形体，剧毒。硒是准 金属，能与氢气、卤素、金属直接反应。硒元素化合价有- - 2 、0 、+ 2 、+ 4 和+ 6 价。六价硒或硒酸盐在碱性或氧化条件下是稳定的，因此其在碱性土壤中易被植物 利用。亚硒酸钠是自然界中以四价存在的硒，在土壤中紧密结合于铁和铝的氧化物， 因此很难溶于水，不易被植物吸收利用。在碱性溶液中若有氧存在，易缓慢氧化生 成六价硒。二氧化硒作为亚硒酸的脱水产物升华，这就是通过燃烧产生空气硒污染 的重要原因。以负二价形式存在的硒主要包括多数有机硒化物、硒化氢和一些金属 硒化物。硒能导电、导热，电导率能随光照的强弱而急剧变化，可用于制造光电管， 高纯度硒用于高效整流器，硒也用作塑料、油漆、搪瓷、陶瓷和墨水的颜料等。 1 2 硒的生物学功能 1 2 1 抗氧化功能 硒是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分在体内特异地催化还原谷胱甘肽与 过氧化物的氧化还原反应，如超氧阴离子、羟游离基、脂酰游离基，修复水化自由 基，从而保护生物膜免受损害，维持细胞的正常功能，硒的抗氧化作用主要通过 g s h - p x 酶促反应清除脂质过氧化物( r o t r u e ke ta 1 ，1 9 7 3 ；m a r g a r e t ，2 0 0 0 ) 。缺硒会 造成g p x 活性降低，导致组织细胞抗氧化损伤能力减弱，直接影响细胞的分裂、繁 殖、遗传及生长。机体内存在大量的不饱和脂肪酸，会发生过氧化反应生成过氧化 物。这些过氧化物可以影响器官的正常代谢功能或其受损时的自我修复功能。硒对 维护组织弹性，延缓不饱和脂肪酸的氧化，防止早期衰老均有积极作用，硒与维生 素e 构成了动物机体抗氧化的两条防御途径，两者共同发挥作用( r e i l l y 1 9 9 8 ) 。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 2 2 增强免疫功能 硒对动物和人免疫功能影响的研究始于本世纪7 0 年代( s h a m b e r g e r , 1 9 7 1 ) ，目 前越来越受到人们的重视。硒对机体的非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均存在 重要影响。硒的摄入量如果低于最适量时可损坏机体免疫系统的发育和功能。补硒 可使细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫功能得到改善，有利于细胞毒性t 淋巴细胞 ( c t l ) 的诱导，并明显加强c t l 的细胞毒活性，能刺激蛋白质及抗体的产生，还 可以影响吞噬细胞的杀菌活力，显著提高吞噬过程中吞噬细胞的存活率和吞噬率( 姚 莉和段玉峰，2 0 0 4 ) 大量研究结果显示，硒缺乏会降低多种动物的免疫功能，适 当补硒则可增强它们的免疫功能。硒能增强人、鼠、犬、猪、羊和牛等外周血淋巴 细胞或脾细胞对丝裂原刺激的转化能力( s p a l l h o l z , 1 9 8 2 ) 。给动物补硒能提高动物 对红细胞抗原或破伤风类毒素的抗体滴定度，降低免疫时间，促进动物抗体和免疫 球蛋白的合成。 1 2 3 解毒功能 硒元素是带负电荷的非金属离子，可以与生物体内带正电荷的有害金p b 、h g 等 离子相结合，形成金属硒蛋白质复合物，把能诱发癌变的金属离子排出体外，缓 减了金属离子的毒性，起到了减毒排毒的功效。解毒过程中硒是抵抗有毒物质的保 护剂( 夏奕明，1 9 9 3 ) 在人体内与金属有很强的亲和力，它与毒性强的重金属如 汞、甲基汞、镉、铅等结合形成金属硒蛋白复合物而解毒，并将金属排出体外i 从 而保护肝细胞。动物实验还发现硒有降低黄曲霉毒素b l 的急性损害( 陈必链等， 1 9 9 9 ) 。 1 2 4 促进基础代谢 硒与脱碘酶活性有密切关系，能影响其生物活性而调节甲状腺的功能从而提高 基础代谢率，增加组织细胞耗氧率，维持正常的生理功能。硒对昏酮戊二酸脱氢酶 系有明显的激活作用，硒参与辅酶a 和辅酶q 的生物合成，故硒与三羧酸循环和呼吸 链的电子传递有关而三羧酸循环是物质代谢的枢纽，是三大物质氧化分解获得能 量的途径。 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 2 5 其他功能 硒是生长和繁殖所必需，缺硒可致生长迟缓。硒有保护视神经，预防白内障， 增强视力的功能( 石金柱，1 9 9 1 ) 人眼的巩膜、水晶体、视网膜内含硒量很高。 白内障及糖尿病性失明者补充硒后视觉功能有所改善( 关玉群，2 0 0 3 ) 。硒还能有 效地提高机体的免疫水平，其作用涉及体液免疫和细胞免疫两部分。改善情绪状况， 脑组织缺乏过氧化氢酶，因此脑组织代谢产生的过氧化物必须由抗氧化硒酶清除。 低硒状态与抑郁和其他不良情绪状况如焦虑、不安和敌对等明显相关，高硒饮食的 人可明显改善头脑清醒和自信( 周国霞和熊正英，2 0 0 6 ) 。 1 3 硒与疾病的关系 1 3 1 硒与克山病 克山病是一种病因至今未明的地方性心肌病，主要病理改变是心肌肌溶性坏死。 自1 9 3 5 年在我国黑龙江省克山县发现以来全国已有1 4 个省发现有克山病流行，经大 量流行病学调查研究主要分布在我国由东北至西南的一条低硒地带上( 范中学等， 2 0 0 6 ) 。西安医学院与中国医学科学院先后使用亚硒酸钠预防该病取得了初步成效 后，又在克山病发病区作临床试验表明亚硒酸钠是目前预防克山病最有效的药物 病区人群处于低硒状态，给病区人群补硒可以预防急型、亚急型克山病的发生，所 以硒缺乏是克山病发病的重要因素，但缺硒并不能解释克山病年度多发、季节多发 的特点，因此硒不是克山病发病的唯一因素( 于维汉等，1 9 9 1 ) 1 3 2 硒与癌症 大量的研究显示，不同人群中癌症发生率的不同与s e 的摄入量有关。癌症患者 血清或血小板s e 水平明显低于健康对照组，并且该差异具有统计学意义。早s e 水平 的各种参数与膀胱、大脑、食道、肺、头颈、卵巢、胰腺、甲状腺、胃的癌症、黑 色素瘤、前列腺和结肠癌及癌前期损害的危险因素呈负关联( y o s h i z a w ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 据报道啤酒酿造者通过酵母菌补s e 可以明显地抑制癌症的发生，使发病率和死亡率 几乎降低5 0 0 , 4 ( t a p i e r oe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。一项营养防癌试验在美国进行，研究者在西部 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 人群中首先设计了双盲安慰剂对照防治实验，1 3 1 2 个有非黑色素皮肤癌病史者随机 分成2 组进行对照，一组补s e 2 0 0 雌r d ，对非黑色素皮肤癌的原发终点无效，而接受 补s e 者却显示继发终点作用。癌症总死亡率降低5 0 ，癌症总发病率下降3 7 ，其 中前列腺癌降低6 3 ，结肠癌降低5 8 ，肺癌降低4 6 。卵巢癌患者化疗后服用s e 可使化疗后的各种毒性症状得到抑制，并且各项指标得到改善( s i e j aa n dt a l e r e z y k , 2 0 0 4 ) 。 1 3 3 硒与心血管疾病 缺硒被认为是冠心病发生的危险因素。流行病学调查发现，美国和芬兰等过高 硒地区冠心病、高血压的发病率比低硒地区明显降低，血硒浓度与冠心病具有负相 关关系。用富硒酵母治疗冠心病，能使其l p o 均值下降，g s h p x l p o 比值有所提高。 另外，全血粘度、血浆粘度、纤维蛋白原等血液流变血指标也明显改善( 钟国赣和 李云义，1 9 9 1 ) 动物实验表明，补硒可使心肌梗塞损伤减少，加速梗塞区细胞的 修复过程；还可增加冠状血管的血流量，降低心肌耗氧量。有利于心肌细胞损伤的 修复和功能的改善。 1 3 4 硒与糖尿病 研究表明，缺硒引起的胰岛损伤的主要变化是以b 2 细胞为主体的结构与功能的 异常。硒可改善机体糖耐量和血红蛋白含量，使白细胞数、甘油三酯含量明显下降， 血小板数及胆固醇含量明显升高。另外硒和维生素e 产生的联合生物学效应可以明显 改善糖尿病。实验发现，糖尿病患者血清硒均值明显低于健康人( 吴万征，2 0 0 0 ) 。 型糖尿病患者存在硒代谢紊乱( 倪银星，2 0 0 3 ) 。研究发现，硒具有与胰岛素相 似的作用，含硒中药可改善糖尿病患者的症状。硒与胰岛素一样具有增强葡萄糖的 转运功能，加速葡萄糖的运输，降低机体血糖的作用( 吴蕴棠，2 0 0 4 ) 。i n m o l l 胰 岛素与lm r n o l l n a 2 s e 0 3 降低机体血糖作用相当( 张霆，2 0 0 3 ) 。 1 4 硒营养的安全计量 日常硒的吸收取决于地域硒的可利用性和典型食品的消费。在美国，一个成年 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 人每日吸收的硒是8 0 - - 1 6 5 t t g ，从食品中吸收硒的安全范围是5 9 9 s e k g d ，一个体重 7 0 k g 的成年人，吸收的硒的安全范围是3 5 0 9 9 d 。世界卫生组织推荐的日常摄入量为 男性2 6 l a g d ，女性3 4 9 9 d 。中国通过对湖北恩施地区硒中毒区和非中毒区居民体内 硒水平、膳食硒摄入量的数据进行分析，并以指甲变形作为鉴别硒中毒的临床诊断 指标。最后提出膳食硒的人体最大安全摄入量为4 0 g d 。最近，中国营养学会制定 了中国居民膳食硒的参考摄入量，提出成人膳食硒平均需要量( e a r ) 为4 1 9 9 d ，推荐 摄入量为5 g d ，可耐受的最高摄入量4 0 0 9 9 d ( 中国营养学会，2 0 0 0 ) 。 1 5 硒蛋氨酸的代谢和生理重要性 1 5 1 不同硒化合物的毒性( 牟维鹏，2 0 0 1 ) 硒的毒性大小依硒化合物种类不同而异。有关硒对啮齿类动物的毒性研究比较 广泛，大鼠硒的生理需要量为0 2 9 9 g ，慢性亚硒酸钠中毒开始于3 4 9 9 g ，当硒 摄入水平达1 6 t t g g 时几乎没有大鼠可以存活。大鼠慢性摄入硒酸钠和亚硒酸钠后的 毒性表现几乎相当，然而有机硒化合物的毒性表现则有很大差别。与亚硒酸盐相比， 硒半胱氨酸的毒性大小与亚硒酸钠接近，硒蛋氨酸的毒性则相对较小，甲基硒半胱 氨酸是存在于对硒有蓄积作用的植物中的一种非蛋白氨基酸，在小鼠表现为减弱的 或迟发的毒性。虽然硒对人体和动物的重要性被普遍认识，但应补充何种硒化合物 一盲存存争议。珲撼的硒补充剂应该帚自然界所存存的。l 硒蛋氧酪以及d l - 硒罨 氨酸是生物界所普遍存在的，也是生物中主要的存在形式，因此合成的l 硒蛋氨酸 或者硒酵母是非常理想的硒补充剂，对于动物而言，d l - 硒蛋氨酸也是可以代谢的。 生物所摄取的硒蛋氨酸一般直接参与代谢，在体内形成各种形式的硒化合物或者取 代蛋氨酸进入蛋白中。因此开发富含硒蛋氨酸的硒酵母具有重要的实际意义。 1 5 2 硒蛋氨酸在生物体内代谢 动物实验证明，硒主要在小肠吸收。一般说来，硒化合物极易为人体吸收，如 亚硒酸盐的吸收率大于8 0 ，硒蛋氨酸和硒酸盐的吸收率大：f 9 0 ，其吸收率似乎 不受机体硒营养状况的影响。目前认为人体内的硒存在于硒蛋氨酸代谢库( 蛋氨酸代 谢库) 和硒调节代谢库中硒蛋氨酸只存在于硒蛋氨酸代谢库中，并且是这一代谢 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 库中硒的唯一存在形式，它不被机体硒状态所调节，可以看作是一个非调节的储存 库。硒蛋氨酸不能在体内合成，全部来自于膳食，它常替代蛋氨酸参入到蛋白质中。 当膳食硒供应不足时，硒蛋氨酸代谢库中的硒蛋氨酸可通过转硫途径降解为硒半胱 氨酸，供机体合成硒蛋白。硒蛋氨酸在体内的生物转化与蛋氨酸十分相似，首先在 腺苷化作用下被激活，途经硒同型半胱氨酸和硒胱硫醚去甲基化转变成硒半胱氨酸， 此过程无硒蛋氨酸特异性酶参与，形成的硒半胱氨酸在肝脏中进一步降解生成丝氨 酸和硒化物，后者可用于合成有生物活性的硒蛋白如谷胱甘肽过氧化物酶 ( g s h - p ) 【) 、碘甲状腺原氨酸脱碘酶( d ) 、硒蛋白p ，或经甲基化转变为二甲基 硒化物和三甲基硒离子，经呼吸或粪尿排出体外( k a j a n d e r e ta 1 ，1 9 9 1 ；n a k a m u r oe t a l ，1 9 9 7 ) 。 1 5 3 硒蛋氨酸的生理重要性 1 9 3 0 年代，植物中的硒蛋氨酸等含硒氨基酸被怀疑是一种有毒物质。1 9 5 0 - - 1 9 6 0 期间，硒蛋氨酸从植物中分离出来，同时在酿酒酵母、假丝酵母、大肠杆菌、瘤胃 细菌以及海藻中分离到。7 0 年代中期，代谢研究显示，硒蛋氨酸可以被代谢和被生 物体保留，硒蛋氨酸可以作为硒的补充剂使用。与此同时，硒酵母被证实含大量硒 蛋氨酸，是人和动物的良好硒源( p o w e r , 1 9 9 4 ；s c h r a u z e r , 1 9 9 8 ) 。蛋氨酸是必需氨 基酸，高等动物没有有效的机制合成蛋氨酸，因此也合成不了硒蛋氨酸。用亚硒酸 钠喂养的小鼠。体内只能检测到硒半胱氨酸，而检测不到硒蛋酸( o l s o na n d p a l m e r , 1 9 7 6 ) 亚硒酸盐和硒酸盐可用于硒蛋白的合成，也是以硒蛋酸的形式才能整合到 蛋白中。硒蛋氨酸可整合入蛋白中，因为t r n a m 4 无法区分m e t 和s e m e t 。硒进入生 物细胞内是通过硫的代谢途径，通过硫的载体进入细胞，无机硒盐离子和无机硫酸 酸根离子在酵母对他们的吸收过程中竞争同一转运系统，他们竞争共同的透性酶， 硒取代硫整合到氨基酸和含硫蛋白质中( g o l u b e va n do o l u b e v , 2 0 0 2 ) 。硒蛋氨酸参 入到蛋白质合成率高的器官中，如骨骼肌、红细胞、胰腺、肝脏、肾脏、胃和胃肠 粘膜等。给予饲以缺硒基础饲料的大鼠硒含量为2 t t g g 的硒蛋氨酸饲料，结果大鼠肌 肉中的硒水平为给予等量亚硒酸盐或硒半胱氨酸形式硒的大鼠的1 0 倍( d e a g a ne t a l 1 9 8 7 ) 硒蛋氨酸在大脑中的贮存也很明显。血浆中的硒主要分布于g s h p x 、硒 蛋白p 和白蛋白中，前两者中的硒以硒半胱氨酸的形式存在，后者中的硒主要以硒蛋 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 氨酸形式存在。如同硒酸盐或亚硒酸盐一样，硒蛋氨酸可为含硒酶的合成提供硒。 然而只有硒虽氨酸可直接参入到蛋自质中而贮存于机体内，并可通过正常的代谢过 程可逆性地释放出来。在营养范围内增加硒的摄入量，组织的硒水平升高并最终维 持于稳定态，从而防止硒在体内累积至中毒水平。补充硒蛋氨酸的动物较补充亚硒 酸钠的动物在停止补充硒后，可在更长的时间内保持含硒酶的更高活性。补充硒蛋 氨酸的动物较补充亚硒酸钠的动物在停止补充硒后，可在更长的时间内保持含硒酶 的更高活性。对于乳母，硒蛋氨酸或硒酵母可阻止血浆硒、g s h - p x 活性以及母乳硒 下降，服用硒蛋氨酸者乳汁中的硒含量要明显高于服用亚硒酸盐者( a l a e j o sa n d r o m e r o ，1 9 9 5 ) 硒蛋氨酸在营养方面优于其它硒化合物。 1 5 4 作为主要硒营养补充剂的硒代蛋氨酸检测现状 酵母中总硒的含量检测有h g a a s 、f i - h g - a a s 、h g - i c p - a e s 、h g i c p m s 等方法，其基本原理是将各种形态的硒转化为六价的硒，然后再还原成四价的硒进 行测定( g o m e z a d z ae ta 1 1 9 9 8 ) 。分光光度法也是常用的检测方法，刘曲滨等；f 用酸性条件下s e 与3 ，3 二氨基联苯胺的作用，生成黄色络合物( s e - d a b ) ，在 p h 7 0 - 7 。5 左右，用甲苯萃取，进行分光光度法测定( 刘曲滨等，2 0 0 0 ) 。郝素娥利 用四价硒能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子，然后与变色酸偶合生成红色的偶 氮染料，其吸光度与硒的浓度成正比来测定总硒的含量( 郝素娥和滕冰，1 9 9 9 ) - 对于硒酵母中主要成分( 硒代虽氨酸s e m e t 和硒代半胱氨酸s e c y s ) 的测定较 总硒复杂得多，主要原因是酵母细胞壁坚硬且s e m e t 、s e c y s 不稳定，剧烈的水解 环境会导致其结构破坏。在酸水解条件下，游离的s e c y s 破坏率9 0 ，结合态的 s e c y s 破坏率为6 0 。s h e p h e r d 等报道，s e m e t 在6 m o f l 的h c l 中，在1 1 0 ( 2 下水 解7 小时，其水解程度为1 0 0 ( s h e p h e r da n dh u b e r , 1 9 6 9 ) 。吴江等根据s h e p h e r d 提出的c n b r 与s e m e t 定量反应，而设计的用g c 法测定其反应物之一c h 3 s e c n 取得了满意的效果，其最小检测量在8 x 1 矿克，共存的硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸 无干扰，此法无需将硒酵母水解，而是在室温进行，避免了对s e m e t 的破坏，但共 存的c h 3 s e 基团化合物干扰检测结果的准确性( 吴江和欧阳政，1 9 8 8 ) 。农晋奇等 将s e c y s 甲基化成c h 3 s e c y s ，然后利用c n b r 与c h 3 s e 基团的特异反应测定c h 3 s e 的含量。减去其中s e m e t 量即得s e c y s 的量( 农晋奇，1 9 9 4 ) 。l u 等认为硒酵母中 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 s e m e t 不同的抽提方法，其结果差异很大，比较了6 m o l l h c i 、t m a h 和各种酶法 水解以及用c n b r 直接反应的效果，认为经过4 m o l l 甲基磺酸1 6 小时回流水解， 再经氯甲酸甲酯衍生，g c m s 检测，s e m e t 的检测结果最准确，c n b r 直接反应法 其次，但其得到的结果比甲基璜酸水解法低3 4 ，酶法低5 0 ，h c i 、t m a h 水解 法最差( l ue ta 1 ，2 0 0 4 ) 本研究综合前人的研究成果，采用甲基磺酸回流水解， c , - c m s 检测富硒酵母中硒代蛋氨酸的含量。 1 6 富硒酵母的研究进展 1 6 1 酵母同化无机硒的机理 酵母菌吸收无机硒，首先对硒的要有一定的耐受性。酵母对硒的耐受性决定于 酵母自身代谢系统对s e 和s 的识别能力( g o l u b e va n dg o l u b e v 2 0 0 2 ) 和细胞质组分 将硒还原的能力( m o h a m m e da n dg e o f f i e y 1 9 9 8 ) 。无机硒盐离子和无机硫酸酸根离 子在酵母对它们的吸收过程中竞争同一转运系统，它们竞争共同的透性酶( l a u c h l i ， 1 9 9 3 ) 。含硫氨基酸的合成受到抑制，在培养基中添加含硫氨基酸可以刺激酵母菌的 生长，在较低的硒浓度下硫酸根离子的存在对于酵母对硒的耐受性有帮助，而在较 高浓度的硒中，硫酸根离子的作用则不明显。在硒过量的情况下，硒利用硫代谢的 酶系统，而在正常水平下，自身的硒代谢酶起作用。在硒被生物的同化吸收中，最 开始的步骤是利用s 的代谢中酶的作用进入细胞，取代s 整合到游离氨基酸和蛋白质 中，在低浓度的硒存在下，硒的代谢酶才起作用( n e s t o ra n dc a t h e r i n e 1 9 8 4 ) 。含 硒游离氨基酸和整合到蛋白质中的硒代氨基酸，都是硫的类似物，当细胞处于亚致 死计量时，或比正常的微量元素的浓度高时，硒代替部分硫进入氨基酸中，从而进 入蛋白质中。由于t r n a m 4 不能区分蛋氨酸和硒蛋氨酸，所以有一部分硒蛋氨酸在蛋 白质翻译中可替代蛋氨酸掺入到蛋白质中( g e r h a r d , 2 0 0 0 ) 。硒代半胱氨酸本身由 u a g 编码，在编码硒蛋白的m r n a 中有一段硒代半胱氨酸插入序列s e d i s 所构成的 二级结构，帮助硒代半胱氨酸t r n a 识别这种密码子，在蛋白质翻译过程中，在一些 特定的酶作用下掺入其中( 王镜岩等，2 0 0 2 ) 。其它硒化合物如硒胱氨酸、甲基硒 胱氨酸，即使土壤中的硒含量较高，它们在植物中仍处于比较低的水平，而且也不能 参入到蛋白质中。g e r h a r d ( 2 0 0 0 ) 报道的无机硒同化入酵母内的途径如图1 1 ： 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 s e 0 3 2 s e l e n i t e i g s s e s g + g s h t r i s u l f i d e + s e n e h i l 2 s e s e o j j 2 s e l e n a t e i + a t p a d e n o s y l p h o s p h o s e l e n a t e h s e c h 2 c h ( n h 2 ) c o o h s e l e n o c y s t e i n e h o m o s e 帆 h o o c ( n h z ) c h c h 2 s e ( c h 2 ) 2 c h ( n h 2 ) c o o h s e l e n o c y s t a t h i o n i n e h s e c h 2 c h 2 c h ( n h 2 ) c o o h s e l e n o h o m o c y s t e i n e 上 c h 3 s e c h 2 c h 2 e h ( n h 2 ) c o o h s e l e n o m e t h i o n i n e 图1 - 1 啤酒酵母中硒的同化途径 f i g 1 - 1t h ep a t hf o ra s s i m i l a t i n gs ei ns a c c h a r o m y c e sc e r e v l s i a e 由图1 1 可以看出，在啤酒酵母内的硒的代谢以亚硒酸为起点时，首先与谷胱甘 肽结合生成硒代谷胱甘肽三硫化合物，然后还原成硒化氢，硒化氢与丝氨酸生成硒 代半胱氨酸，硒代半胱氨酸与高丝氨酸生成硒代胱硫醚，硒代胱硫醚分解为硒代高 半胱氨酸，硒代高半胱氨酸甲基化生成硒代半胱氨酸 液泡是酵母细胞内最大的细胞器，其主要功能是储存氨基酸、水解酶和钙离子。 研究显示，酵母在细胞质组分中氧化还原酶和液泡内v - i c - a t p 酶作用下将硒盐还 原，液泡腔可聚集被还原的硒。液泡缺陷型和液泡内v ：盯a t p 酶缺陷型的酵母菌株 富集硒的能力都明显低于正常的亲本的菌株，液泡腔以及v 司 r a t p 酶与矿的动态平 衡都影响到了对硒的耐受性和对硒的吸收，细胞内氧化还原酶的活性越强，酵母细 胞吸收、聚集硒的能力越强( m o h a m m e da n dg e o f f r e y 1 9 9 8 ) 。研究显示谷胱甘肽还 原酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性强的酵母细胞可吸收更多的硒c g - e r h a r d , 2 0 0 0 ) 。 ，微生物在高浓度无机硒环境中同化硒，其本质是一个解毒过程。微生物细胞转 化硒的方式包括：高毒性的无机硒转化为低毒的有机硒( b r a d ye ta 1 ，1 9 9 6 ) ，前 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 面叙述的将无机硒同化成有机硒就是这种方式；将高毒的无机硒还原成无活性的 单质硒( g h a r i e be ta l ，1 9 9 4 ) ，这一点与f a l c o n e 的研究结果一致，可由在高浓度的 硒存在下，酵母菌落的颜色呈粉红至红色可得到证实，硒进入微生物细胞后与氨 基酸整合形成短肽，包括t 一谷氨酰甲基硒代半胱氨酸和t 一谷氨酰甲基硒代胱硫脒， 但这些短肽都不用来合成蛋白质( f a l c o n ea n dn i c k e r s o n , 1 9 6 3 ) 。 1 6 2 硒在酵母细胞中的分布及存在状态 酵母中硒聚积在细胞壁、细胞膜以及游离氨基酸和可溶性蛋白质中。硒主要是 蛋氨酸硒形态的蛋白质或其他大分子状态存在。杨林生和侯少范( 1 9 9 5 ) 报道酵母 细胞内有5 8 硒以此种形式存在，4 2 以可透析的小分子存在。可透析的非结合态 硒包括硒蛋氨酸、硒谷胱甘肽等有机态硒和少量的无机硒存在。w h a n g 盯( 2 0 0 0 ) 报道硒酵母内含有4 硒酸盐，2 3 - 6 3 硒代蛋氨酸，1 3 2 1 硒代半胱氨酸，6 - 2 0 0 , s e - 甲基硒代半胱氨酸和谷氨酰s e - 甲基硒代半胱氨酸，1 3 5 1 其它类型的硒，主要 是硒化双丙氨酸、硒代胱硫醚、谷氨酰硒代乙硫氨基丁酸、硒代腺甘高半胱氨酸、 s e - 烯丙基硒代半胱氨酸、s e - 丙烯基硒代半胱酸和未知成分等。也有报道在酵母中， 硒代半胱氨酸是主要存在形式( b i r r i n g e re ta 1 2 0 0 0 ) ，这可能与酵母中培养基的成 分有关。有报道部分硒以t 谷氨酰甲基硒代半胱氨酸和t 谷氨酰甲基硒代丙氨酸丁 氨酸硫醚的小分子形式存在，但不被用于细胞蛋白的合成，此种形式也是硒脱毒后 存在的重要形式( b r o w na n ds h r i i t , 1 9 8 2 ) 。谢丽琪等( 1 9 9 0 ) 报道无机硒一般只占 总硒的3 0 。在人和哺乳动物细胞组织里，硒主要是以硒代半胱氨酸的形式存在， 谷胱苷肽氧化物酶、s e - p 蛋白、g 蛋白都被鉴定有硒代半胱氨酸的存在，在哺乳动 体内，硒代半胱氨酸可由硒代蛋氨酸转化而来( l o b i n s k ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 6 3 国内富硒酵母的研究进展 目前的硒酵母生产主要是在酵母生长过程中，在培养基中添加无机的硒酸钠或 者亚硒酸钠，以达到酵母在生长过程中对无机硒的同化，将无机硒转化为有机硒。 所使用培养基一般为甜菜糖蜜或者蔗糖糖蜜，加入生物素、无机盐等，所使用的菌 种以酿酒酵母( 最c e r e v i s i a e ) 居多。由于硒对酵母有一定的毒性，酵母同时也具有 一定的解毒能力，但如果超过酵母本身的解毒能力后会抑制酵母生长，甚至停止生 1 0 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 长。富硒酵母的研究原则是在获得高硒含量的同时获得高的生物量，这样才有能走 向工业化，真正的实现硒营养补充剂的功能，因此富硒酵母发酵一般采用分次添加 硒或者流加硒。国内对富硒酵母进行的研究为数不少，其中实验结果比较好的主要 有：陆建安等( 2 0 0 2 ) 以啤酒酵母为菌种，通过正交试验确定的最优条件为：温度 2 8 c ，硒浓度为2 5 g r n l ，发酵培养3 0 h 。成品酵母中的硒含量达到6 5 0 1 _ l g g 左右： 范秀英等( 2 0 0 3 ) 对菌株z f f 2 8 在的糖蜜培养基：糖浓度6 ，硒添加量为6 0 喀, m l ， p h6 0 - 6 5 ，装液量5 0 m l 2 5 0m l 三角瓶中培养2 5 h ，硒总含量最高。培养时间延长， 富硒量略有升高，但生物量却呈下降趋势；李明春等( 2 0 0 0 ) 以酿酒酵母n k 4 菌 株，分别在酵母培养1 6 h 、2 0 h 、2 4 h 、2 8 h 时加入l o 4 m o l l 的s e “，研究表明当酵 母菌培养至2 0 h 时，加入se _ ，酵母菌的含硒量达到最高值。但以上报道都是在实 验室摇瓶实验报道，从摇瓶到实现发酵罐生产还有很长一段距离，真正实现工业化 大生产的报道确未见。本研究从筛选菌株开始，从摇瓶到发酵罐，结果均比较理想， 同时采用的是糖蜜培养基和玉米淀粉水解液进行流加培养，采用的原料价格低廉， 获得高硒含量的同时获得了高的生物量，具有重要的实用价值。 1 6 4 国外富硒酵母的研究进展 d e m i r c i 等( 1 9 9 9 ) 利用& c e r e v i s t a e 作菌种，甜菜糖蜜为培养基，补加0 4 m g l 的生物素，在甜菜补料培养基中加x 6 3 2 9 l 的硒酸钠，分批发酵培养，其酵母中硒 含量为1 3 8 2 p g g 。s u h a j d a 等( 2 0 0 0 ) 在sc e r e w s i a e 的指数生长期添加亚硒酸钠，发 酵培养结果，酵母硒浓度为1 2 0 0 1 4 0 0 9 9 g 。硒酵母的一项美国专利u s p a t n o 6 ，1 9 7 ，2 9 5 ，其硒浓度为1 0 0 0 - 5 0 0 0 1 j r g g ，其使用菌种为& b o u a r d ip y 3 1 ( a t c c n o 7 4 ，3 6 6 ) ，其方法是将酵母菌种接种到含硒培养基中，糖蜜共培养，然后收集菌体 洗涤，巴斯德灭菌或直接干燥。另一项美国专利u s p a t n o4 , 5 3 0 ，8 4 6 ，使用菌种为 酿酒酵母sc e r e v i s i a e ，硒浓度为1 0 0 0 - - 2 5 0 0 # g g 之间，其蛋氨酸的含量为5 5 ，无 机硒含量在l 以下。近年来也有用酵母细胞对工业和生活废水进行处理，一方面可 将废水中的无机硒转化为有机硒，充分利用其中的有机物，减少向环境中的排放。 m o h 姗a d 等( 2 0 0 3 ) 利用化学是食品工业的废水，筛选富集硒能力强的酵母，发现 假丝酵母具有更强的富集硒的能力，吸收六价硒的能力为1 3 5 峙儿。o l e n a 等( 2 0 0 5 ) 将无机硒盐加入到蔬菜和水果加工后的废液，将啤酒酵母接入其中，酵母在利用废 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 水中的有机物的同时，将硒同化入细胞，获得了含硒1 5 0 峙僖左右的硒酵母。利用酵 母来吸收废水中的有毒物，使其转化为有机物，减少毒性，综合利用为硒酵母的开 发利用提供了新的思路。 1 7 选择酿酒酵母作为富硒载体的原因 1 7 1 酿酒酵母具有较强的吸收硒的能力 酿酒酵母属于子囊菌，子囊菌一般比担子菌具有更强的硒耐受性和富集能力， 在子囊菌里面，酿酒酵母的耐受硒的能力比较强，甚至可以在1 0 也m o l l 含硒环境中 生长( g o l u b e va n dg o l u b e v 2 0 0 2 ) 。 1 7 2 酿酒酵母营养丰富 酿酒酵母化学组成中蛋白含量丰富， 其中赖氨酸和甲硫氨酸的含量相对较高， 一般含氮量在7 ，含有8 中必需氨基酸， 而赖氨酸和甲硫氨酸在营养学上是第一、 第二限制性氨基酸。酿酒酵母的蛋白质消化率