（动物学专业论文）大熊猫主要组织相容性复合体（mhc）Ⅰ类基因的研究.pdf

大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) i 类基因的研究 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期： 年月日 1 1 3 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) i 类基因的研究 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸江盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权逝姿态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字目期：年月日签字日期： 年月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 1 1 4 电话： 邮编： 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 内容提要 大熊猫是我国特有的i 级濒危野生动物，被称为“国宝”，倍受世界瞩目。 历史上它曾经在我国有广泛的分布，但是受冰期和人类活动的影响，大熊猫的生 境越来越破碎化，到现在仅分布于秦岭、岷山、邛崃、凉山、大相岭和小相岭六 个山系中，其中秦岭种群已经分化成了大熊猫的一个亚种一一秦岭亚种 ( a i l u r o p o d am q i n l i n g e n s i s ) 。 作为濒危动物离体保护的重要内容之一，我们构建了大熊猫的基因组b a c 文库，以保存大熊猫的珍贵的遗传资源，同时为后面开展大熊猫的比较基因组学、 基因功能研究打下基础。主要组织相容性复合体( m h c ) 是具有抗原呈递功能 的免疫基因家族，其i 类和i i 类基因具有重要的适应性意义，被应用于种群抗病 能力的研究。本研究成功地分离出了三个大熊猫的m h cl 类基因。主要结果如 下： 以大熊猫“成功”的新鲜外周血液为材料，成功地构建了大熊猫的基因组文 库，共包含2 0 58 0 0 个克隆，保存于2 1 0 0 块9 6 孔培养板上。对随机挑取的 1 7 4 个b a c 克隆进行酶切和大小检测，计算出文库的平均插入片段为9 7 k b ， 空载体率为5 7 4 。参照黑熊和喜马拉雅黑熊的基因组大小，本文库的基因 组覆盖率为6 8 倍，获得单拷贝基因的概率是9 9 9 3 。1 6 对引物检测文库阳 性克隆的数目范围为2 1 6 ，平均每对引物的阳性克隆数为6 2 。 我们采用4 dp c r 的方法，从文库中筛选出目的基因。我们将文库分成4 3 个超级库和1 4 6 2 ( 4 3 x 3 4 ) 个1 d 、2 d 、3 d 、4 d 超级亚库。每对引物首先通 过4 3 个p c r 反应确定阳性克隆所在的超级库，然后只需要7 + 7 + 8 + 1 2 - - - - 7 7 个p c r 反应，就能从超级亚库中筛选到所需的阳性b a c 克隆。 本研究从大熊猫m r n a 和基因组b a c 文库克隆了三个m h ci 类基因，分别 定名为a i m e - - 1 2 8 、彳砌p 一1 5 2 和彳砌e 一1 9 0 6 。基因结构、蛋白质结构预测、 启动子分析、系统进化树分析都表明，这三个基因属于m h ci 类基因家族。 么砌e 一1 9 0 6 是大熊猫非常特殊的一个非经典的l 类基因，体现在： i 彳砌e 一1 9 0 6 在外显子7 的起始区域含有一个提前的终止子，使得该基因 具有缩短的细胞质尾链。分析彳砌e 一1 9 0 6 基因外显子2 和3 里面哺乳动 4 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) i 类基冈的研究 物l a 基因都保守的十个氨基酸时，发现只有五处是保守的； i i 外显子2 和3 的编码子第三个碱基的g c 含量分布显示，a i m e - - 1 9 0 6 比 彳砌p 一1 2 8 和彳砌e 一1 5 2 都要低，显示出它更倾向于是i b 基因； 谳外显子2 和3 的氨基酸变异显示，只有约1 3 的氨基酸变异是位于抗原 结合区域的，与经典的i 类基因情况不符； i v 系统进化树分析表明，么砌e 一1 9 0 6 与d l a 一7 9 亲缘关系更近，显示出 它们可能有着共同的起源关系，与大熊猫和其它食肉目动物的i 类基因处 于完全隔开的进化枝上，推测该基因可能有着与其它大熊猫的i 类基因不 一样的进化历史。 a i m e - - 1 2 8 ，彳砌e 一1 5 2 是属于大熊猫i 类基因的两个位点，体现在： i 基因序列：彳加e 一1 2 8 、彳砌e 一1 5 2 的5 u t r 、3 u t r 和e x o n1 都呈 现出很大的差异性，序列相似度分别为8 4 、8 7 和8 8 。上游启动子 序列分析表明，彳砌e 一1 2 8 、彳泐e 一1 5 2 在核心元件e n h a n c e ra 和w s 都有较大的差异。比较i a 抗原结合区保守的十个氨基酸，a i m e - - 1 5 2 存 在两个常规的氨基酸改变，l 5 和r 1 4 6 ； i i g c 含量检测：彳砌e 一1 5 2 抗原结合区域和非抗原结合区域编码子的第三 个碱基的g c 含量值比彳砌e 一1 2 8 要小； 谳系统进化树分析：彳咖p 一1 2 8 、月砌p 一1 5 2 在用e x o n 2 - - 3 构建的食肉目 系统进化树里面，都形成了单独的进化枝。进化关系显示，大熊猫基因 组上还存在着比爿砌g 一1 5 2 更接近于彳拥p 一1 2 8 的i 类位点； 本研究所获得的大熊猫的i 类基因外显子2 和3 等位基因抗原结合区域的无 义突变和有义突变的置换率( d s 、d n ) 计算都显示咖远大于出，表明了大 熊猫的i 类基因也存在着强的平衡选择； 本研究显示，大熊猫的l 类基因与其它哺乳动物的i 类基因特征相似，是具 有多个位点的复杂的基因家族。 关键词：大熊猫；基因组b a c 文库构建；m h ci 类基因位点分离；彳拥e 一1 2 8 ； a i m e - - 1 5 2 ；么锄e 一1 9 0 6 ；进化树；平衡选择检验 5 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基冈的研究 a b s t r a c t g i a n tp a n d a ( a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) i sa ne n d a n g e r e ds p e c i e st h a ti se n d e m i ct o c h i n aa n dh a sr e c e i v e d g r e a t a t t e n t i o nf o ri t sc o n s e r v a t i o na n ds u r v i v a b i l i t y h i s t o r i c a l l y , i ti sw i d e l yd i s t r i b u t e da c r o s st h em a j o rl a n d ，b u td u et og l a c i a le f f e c ta n d h u m a n a c t i v i t i e s ，c u r r e n t l yt h er a n g eo fg i a n tp a n d ai ss h r u n kt os i xi s o l a t e dm o u n t a i n a r e a s ：q i n l i n g ，m i n s h a n ，q i o n g l a i ，l i a n g s h a n ，d a x i a n g l i n g ，x i a o x i a n g l i n gm o u n t a i n s b e c a u s eo ft h eh i s t o r i c a li s o l a t i o nf r o mo t h e rp o p u l a t i o n s ，t h eq i n l i n gs p e c i e sh a s d i f f e r e n t i a t e dt oan e w q i n l i n gs u b s p e c i e s0i l u r o p o d am q i n l i n g e n s i s ) a sp a r to ft h ec o n s e r v a t i o ns t r a t e g i e st oc o n s e r v eg e n er e s o u r c e so ft h eg i a n t p a n d a ，w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dah i g hq u a l i t yg e n o m i cb a cl i b r a r y , w h i c hi sa l s o a p p l i c a b l e a n di m p o r t a n tf o r s u b s e q u e n ts t u d y o f c o m p a r a t i v eg e n o m i c s a n d f u n c t i o n a lg e n e sf r o mt h eg i a n tp a n d a i nv i e wo fi t sg r e a ti m p o r t a n c eo ft h er o l eo f m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) g e n e si np e p t i d ep r e s e n t a t i o nt otc e l l s ， m h cg e n e sw e r ew i d e l ys t u d i e di nv a r i o u sf i e l d s h e r ew ec o n d u c t e daf i r s t c h a r a c t e r i z a t i o no fm h cc l a s sig e n e si nt h eg i a n tp a n d a a l lt h er e s u l t sa r el i s t e da s f o l l o w s ： f r e s hb l o o dw a su s e dt oc o n s t r u c tt h eg e n o m i cb a c l i b r a r y , w h i c hi sc o n s i s t e d w i t ht o t a l l y2 0 5 ，8 0 0c l o n e sa n ds t o r e di n2 ，10 09 6 一p l a t e s a c c o r d i n gt ot h es t u d i e s o f1 7 4c l o n e sr a n d o m l ys e l e c t e d ，t h ea v e r a g es i z eo ft h eb a cl i b r a r yi se s t i m a t e d t ob e9 7 k b ，w i t he m p t yc l o n e so f5 7 4p e r c e n t u s i n gt h eg e n o m i cs i z eo fb l a c k b e a ra n dh i m a l a y ab e a ra sr e f e r e n c e ，t h ew h o l el i b r a r yi se s t i m a t et ob e6 8 一f o l d o ft h eg i a n tp a n d ag e n o m e ，a n dt h ep r o b a b i l i t yt og e tt h ep o s i t i v ec l o n ei s9 9 9 3 p e r c e n t t h er e s u l t so fs c r e e n i n gt h el i b r a r yw i t h16g i a n tp a n d ap r i m e r ss h o w e d t h a tt h en u m b e ro fp o s i t i v ec l o n e sr a n g e df r o m2t o1 6 ，w i t ha na v e r a g eo f6 2 a4 dp c rm e t h o dw a sa p p l i e dt os c r e e np o s i t i v ec l o n e sf r o mt h eb a c l i b r a r y w ed i v i d e dt h ew h o l el i b r a r yi n t o4 3s u p p e r c o o le a c hh a v i n g3 4s u b s u p e r c o o l ， i n c l u d i n gs e v e n1 d ，s e v e n2 d ，e i g h t3 da n dt w e l v e4 d t oo b t a i nap o s i t i v ec l o n e ， f i r s tw es c r e e nt h ep o s i t i v es u p e r c o o li n4 3p c rr e a c t i o n s ，t h e ni to n l yn e e d s 6 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 7 + 7 + 8 + 1 2 = 7 7p c rr e a c t i o n st od e t e r m i n et h ep l a c eo ft h ep o s i t i v ec l o n ei nt h e s u b s u p e r c 0 0 1 w e s u c c e s s f u l l yc h a r a c t e r i z e dt h r e eg e n e sf r o mm r n a a n dg e n o m i cb a c l i b r a r y a n a l y z i n gt h eg e n e s t r u c t u r ea n dc h a r a c t e r i s t i c s ，p r o t e i ns t r u c t u r em o d e l i n g ， m o t i f so fr e g u l a t o r ye l e m e n t s ，p h y l o g e n e t i ct r e e sa l ld e m o n s t r a t e dt h a tt h et h r e e g e n e sa r et y p i c a lo fm h c c l a s si g e n e s w ed e s i g n a t e dt h e ma sa i m e - 1 2 8 ， a i m e 1 5 2a n da i m e 1 9 0 6 a i m e - 19 0 6i sav e r ys p e c i a ln o n c l a s s i c a lc l a s sig e n ed i v e r g e n tf r o ma l lo t h e r g i a n tp a n d am h c c l a s sig e n e s a n dt h er e a s o ni sa sf o l l o w s ：f i r s t ，a i m e 一1 9 0 6h a s as h o r t e n e dc y t o p l a s m i dt a i lo w i n gt ot h ep r e s t o pc o d o na tt h eb e g i n n i n go fe x o n 7 o n l yf i v er e s i d u e sa r ec o n s e r v e dc o n c e r n i n gt h et e na m i n oa c i d sw h i c ha r e c o n s e r v e da c r o s sn e a r l ya l lm a m m a l i a nc l a s s i c a lc l a s sig e n e s ；s e c o n d ，t h eg c c o n t e n ti nt h et h i r db a s eo ft h ec o d o ni np e p t i d eb i n d i n gr e g i o na n dn o n p e p t i d e b i n d i n gr e g i o na r eb o t hl e s st h a na n o t h e rt w og e n e s ，s u g g e s t i n gi ti sm o r ei n c l i n e d t ob eal bg e n e ；t h i r d ，i n v e s t i g a t i o no fa m i n oa c i ds u b s t i t u t i o ni ne x o n2a n d3o f i t sa l l e l e si sf o u n dt h a to n l yo n e t h i r do ft h ec h a n g e sa r el o c a t e da tt h ep e p t i d e b i n d i n gr e g i o n ，w h i c hd i f f e r e d f r o mc l a s s i c a lc l a s si g e n e s ；f o u r t h ，i nt h e p h y l o g e n e t i ct r e e s ，a i m e - 1 9 0 6a l w a y sc l u s t e r e dw i t hd l a 一7 9a n ds e p a r a t e df r o m t h eo t h e rc l a s sig e n e so fc a r n i v o r es p e c i e s ，i n d i c a t i n gad i f f e r e n ta n c e s t r a ls o u r c e o ft h ea i m e 一1 9 0 6g e n e a i m e 一12 8a n da i m e 一15 2w e r eb e l i e v e dt ob ed e r i v e df r o mt w ol o c ii nt h eg i a n t p a n d a f i r s t ，s e q u e n c ec o m p o s i t i o ni sv e r yd i f f e r e n ti nt h et w og e n e s p a i r w i s e c o m p a r i s o n so ft h et w os e q u e n c e s f r o m5 u t r 3 u t ra n de x o n1a r e8 4 、8 7 a n d8 8 r e s p e c t i v e l y ；t w or e g u l a rs u b s t i t u t i o n sw e r ef o u n df r o mai m e 一15 2i nt h e t e na m i n oa c i d sw h i c ha r ec o n s e r v e di nn e a r l ya l lm a m m a l i a nc l a s s i c a lc l a s si g e n e sw h i l ei na i m e 一12 8a l lo ft h e ma r ew e l lc o n s e r v e d ；n u c l e o t i d ev a r i a t i o n sa r e f o u n di nt h ec o r er e g u l a t o r ye l e m e n t sb e t w e e na i m e 一1 2 8a n da i m e 一1 5 2 ；s e c o n d ， t h eg cc o n t e n ti nt h et h i r db a s eo ft h ec o d o ni np e p t i d eb i n d i n gr e g i o na n d n o n p e p t i d eb i n d i n gr e g i o ni sa l s od i f f e r e n ti nt h e s et w og e n e s ，w h i c hi sh i g h e ri n a i m e - 1 2 8 ；t h i r d ，i nt h ep h y l o g e n e t i ct r e e s ，t h ea i m e - 1 2 8c l u s t e rw i t hi t sa l l e l e s 7 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 a n di ss p e r a t e df r o ma m e - 1 5 2 ，i n d i c a t i n gt h e r ei sa tl e a s ta n o t h e rc l a s sig e n e m o r er e l a t e dw i t h a m e 1 2 8t h a n a m e 一1 5 2d o e s c a l c u l a t i o no fs y n o n y m o u sa n dn o n s y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o nf o rt h e s ec l a s si g e n e sd e m o n s t r a t e dt h a ts t r o n gp o s i t i v es e l e c t i o ne x i s t e di nt h ep e p t i d e b i n d i n g r e g i o no fg i a n tp a n d ac l a s sig e n e s m h cc l a s sig e n e so fg i a n tp a n d ai sa l s oac o m p l e xm u l t i g e n ef a m i l y , s i m i l a rt o o t h e rm a m m a l i a nm h cc l a s sir e g i o n s k e y w o r d s ：g i a n tp a n d a ；g e n o m i cb a c ；i s o l a t i o no fm h cc l a s sig e n e s ；a m e 一1 2 8 ； a h n e 1 5 2 ；a i m e - - 1 9 0 6 ；p h y l o g e n e t i ct r e e s ；b a l a n c i n gs e l e c t i o nt e s t i n g 8 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) i 类基因的研究 第一部分 文献综述 9 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 第一章大熊猫研究综述 大熊猫( a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) 是我国特有的国家l 级重点保护野生动物， 被世界自然保护联盟物种生存委员会( i u c n ) 确定为濒危( e ) 保护等级。自 1 9 6 1 年世界野生生物基金会( w w f ) 将其图案作为会旗和会徽的标志以来，大 熊猫便成为了全世界野生动物保护的旗舰物种和全世界生物多样性保护的象征， 受到了全世界人民的喜爱和关注。 第一节大熊猫的形态和分布 大熊猫的形态和习性 大熊猫虽食竹子，但却与熊类动物一样，隶属于食肉目动物。大熊猫体型似 熊，头大而圆，身体肥胖，尾巴极短，成年个体的体长在1 2 0 1 8 0 厘米范围， 其尾长1 2 2 0 厘米，肩高6 5 7 5 厘米，胸围8 7 8 9 厘米，臀高6 4 6 5 厘米， 耳长7 2 1 1 5 毫米，野生的体重6 0 7 3 千克，最重可达1 1 0 千克。人工饲养的 体重8 0 1 2 5 千克。体色以黑白色为主，两耳、眼周及四肢全黑，鼻端和尾端也 都为黑色( 胡锦矗2 0 0 1 ) 。 新近发现的大熊猫秦岭亚种在形念和分子两方面已与指名亚种( 四川亚种) 之间存在着显著的差异( w a ne ta 1 2 0 0 5 ) 。头骨对比发现：四j i i 亚种头大牙齿小， 秦岭亚种头小牙齿大；四川亚种头部外形似熊，而秦岭亚种则像猫。毛色差异显 示：四川亚种胸部都为深黑色，9 4 2 的个体腹部为白色，5 8 的个体腹部是毛 干白色，毛尖黑色；秦岭亚种胸部都为深棕色，9 0 5 的个体腹部为棕色，9 5 的个体腹部毛干白色，毛尖棕色。 大熊猫的性情温顺，一般不会主动攻击人和动物。它们视觉很差，听觉和 嗅觉却很灵敏。喜欢游荡，没有固定的觅食处和休息地，习惯于在气温1 0 。c 左 右、湿度在7 0 一8 0 的高山中过着独栖的生活。惧酷热，但不畏寒冷，也从 1 0 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) i 类基因的研究 不冬眠。( 胡锦矗2 0 0 1 ) 。 大熊猫主要以竹类的竹笋、竹叶为食。据研究，可供大熊猫采食的竹种达1 2 属6 0 多种，其中仅箭竹属就有2 0 多种。大熊猫为性二型，发情期为每年4 - - - - 5 月份，也有秋季交配的，每胎1 2 仔( 胡锦矗2 0 0 1 ) 。 大熊猫的分布演化 大熊猫的祖先是始熊猫( a i l u a r a c t o sl u f e n g e n s i s ) ，这是一种由拟熊类演变成 的以食肉为主的最早的熊猫，在九百多万年前的中新世晚期就已经诞生( f l y n n & q i ，1 9 8 2 ；邱占祥，1 9 8 9 ) 。始熊猫的主枝在中国的中部和南部继续演化，其中一 种在距今约3 0 0 万年的更新世出现，体形比现在的熊猫小。在生存斗争中小型大 熊猫逐渐趋于灭绝，取而代之的是巴氏大熊猫，它们体型进一步增大，主要分布 于我国长江流域、珠江流域以及华北部分地区，并扩大到了越南、泰国和缅甸( 胡 锦矗2 0 0 1 ) 。到晚更新世末期，秦岭及其以南山脉出现大面积冰川等自然环境的 剧烈变化，特别是在距今约1 万8 千年前的第四纪冰期之后，大熊猫剑齿象 动物群衰落，北方的大熊猫绝迹，南方的大熊猫分布区也骤然缩小，进入了历史 的衰退期，时至全新世，大熊猫的分布范围缩小，生活区域逐渐破碎化( 马安成， 1 9 9 2 ；宗冠福，1 9 8 5 ) ，并在距今20 0 0 年前于河南、湖北、湖南、贵州和云南 五个省仅有零星分布( l u ，2 0 0 1 ) 。 在最近两百年内，气候并没有大的变动，除了箭竹开花的影响，也没有对大 熊猫生存有威胁的大的自然灾害发生，因此，造成大熊猫分布区和数量急剧减少 的主要原因，是人类活动的影响( 蔡绪慎2 0 0 1 ) 。近四十年来，大熊猫的栖息地 减少了4 5 ，且生活区域更加破碎化，造成物种现仅分布于陕西西南的秦岭南麓， 四川盆地西北缘的岷山和邛崃山，以及西缘的大、小相岭及大、小凉山而适于大 熊猫生活的地区仅占上述区域的2 0 ，总面积约60 0 0k m 2 ，栖息地的严重片断 化已导致各大山系的种群隔离( o b r i e n ，1 9 9 4 ) 。 近年来，大熊猫野外就地保护工程实施的显著效果，就是大熊猫的种群数量 已从1 0 0 0 左右( m o f ，w w f1 9 8 9 ) 增长到了近1 6 0 0 只( 国家林业局，2 0 0 6 ) 。 但是，栖息地片断化的严重性和小种群的近交等问题( w a ne ta 1 2 0 0 3 ) ，仍然 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 威胁着大熊猫的生存和可持续发展。 图1 1 大熊猫的当前和历史分布图( h ue ta 1 ，1 8 9 5 ) 。现在的大熊猫分布区域仅限于 陕两西南的秦岭南麓，四j i i 盆地西北缘的岷山和邛崃山、西缘的大、小相岭及大、小凉山 ( 0 b r i e n1 9 9 4 ) 。黑色区域为现今分布区，空心圈为更新世早期化石发现地，实心圆点为更 新世中晚期化石发现地。 f i g1 1 c u r r e n ta n dh i s t o r i c a ld i s t r i b u t i o no ft h eg i a n tp a n d ao t ue ta 1 1 8 9 5 ) 1 2 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 第二节大熊猫分子生物学研究概况 近3 0 多年来，科学家们从形态学、地理学、地质学、生态学、生物化学、细 胞及遗传学、繁殖生物学、兽医学和应用技术等方面，对大熊猫进行了多学科的 研究。分子生物学技术的应用，为大熊猫的研究注入了前所未有的活力，将大熊 猫的研究带入了一个崭新的阶段。r a p d 、r f l p 、微卫星、小卫星、功能性标记 m h c 等技术以及非损伤性取样的出现( 林峰等，1 9 9 7 ；蒙世杰等，1 9 9 8 ；张志和 等，2 0 0 3 ；w a ne ta 1 2 0 0 6 ；z h ue ta 1 2 0 0 7 ) ，使得人们在大熊猫的遗传多样性、 分子系统发育、生态学等领域，取得了如下的可喜进展。 1 分子系统学的研究 长期以来，大熊猫的科属地位一直存在着争议( 胡锦矗2 0 0 0 a ) 。由于形态 结构的差异是有机体为适应不同环境的长期进化的结构，所以，有关大熊猫的分 类学地位具有三种不同的观点，即大熊猫或为浣熊科，或为熊科或应单独为熊猫 科( 朱靖，1 9 7 4 ；李涛等2 0 0 4 ) 。 王希成等人( 1 9 9 0 ) 利用兔抗大熊猫i g g 免疫扩散和微量免疫电泳的方法对 大熊猫的分类地位进行了研究，发现大熊猫与熊的亲缘关系较近而与小熊猫的亲 缘关系较远。h a s h i m o t o ( 1 9 9 3 ) 等人通过测定基因表达产物一血红蛋白和血红 蛋白的氨基酸序列来分析大熊猫与其近缘种之间的亲缘关系，其结果与王希成等 人的结论一致，从而形成了大熊猫隶属于熊科的“熊学派”。 l a n ( 1 9 9 8 ) 通过r d n a 的r f l p 分析结果表明，在亲缘关系上大熊猫更接 近于熊类，而不是小熊猫。林峰等( 1 9 9 7 ) 用p c r 和s o u t h e r n b l o t t i n g 杂交法， 对包括大熊猫在内的几种动物r a p d 的产物进行了分析，结果与前面的结论相 同。l e d j e 和a m a s o n ( 1 9 9 6 a ；1 9 9 6 b ) 利用线粒体1 2 sr r n a 的全基因序列，重建 了食肉目动物的系统发育关系，认为食肉动物在相对较短的时期内就发生了多歧 分化，且大熊猫在亲缘关系上与熊类动物更为接近。同年，两人又根据食肉目犬 科动物c v tb 基因的全序列测定结果，推测出食肉类动物的5 个支系 犬科，小熊 猫科，鼬超科，熊科( 含大熊猫) 及鳍足目 在相对较短的时间内，就产生了进化 隔离，其遗传距离表明，这种进化分离发生在4 5 0 0 万年以前。张亚平和r y d e r 1 3 人熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) i 类基因的研究 ( 1 9 9 7 ) 在就熊超科8 个科动物线粒体d n a 的d 一环、c y tb 、1 2 sr r n a 、t r n a p r o 和t r n a - - t h r 基因序列及线粒体d n a 的全序列进行分析后，发现大熊猫 与熊科关系较近。虽然也有研究者认为大熊猫与小熊猫的亲缘关系较近( 张亚 平，1 9 9 1 ) ，但总的来说，目前大多数的研究结果支持将大熊猫列入熊科。 万秋红等人通过对秦岭、岷山、邛崃、凉山、大相岭和小相岭等6 个山系的 大熊猫进行分子和形态学的对比研究后，发现秦岭山系的大熊猫与四川和甘肃的 大熊猫之间，已产生了显著的分化，是一个独立的亚种( w a ne ta 1 2 0 0 3 ；2 0 0 5 ) ， 其分子证据表明，秦岭亚种大约是在1 万年之前的晚更新世冰川末期分化出来的。 此结果为国家主管部门进一步制定大熊猫的保护策略与保护计划，提供了重要的 科学依据，同时也为人们深刻理解地质事件与人类活动将会对物种的生存进化产 生怎样的影响，提供了参考证据之一。 2 遗传多样性的研究 大熊猫目前仅分布在六个山系中，栖息地为道路、河流和人类居留地所分割， 目前呈2 0 多个岛屿状分布。在片段化的栖息地中，大熊猫常以小种群的方式存活， 有些小的栖息地斑块的个体数量不足5 0 只，加上种群之间的交流被限制，可能导 致近交衰退，使目前野生大熊猫种群可能遭受灭绝的危险( 胡锦矗，1 9 9 0 ) 。为 了加强对这一濒危物种的保护，研究者急切地需要了解下列问题：1 大熊猫的遗 传多样性现状；2 已经隔离种群的遗传差异和分化程度，并根据研究结果对大熊 猫的管理和保护提出合理的建议。 在过去二十年里，各种各样的分子标记被尝试应用于大熊猫的遗传多样性背 景的研究，关于大熊猫的遗传多样性，历来都有争议，但倾向于认为，大熊猫的 遗传多样性较低。 宿兵等( 1 9 9 4 ) 通过蛋白电泳技术，分析了成都动物园1 2 只大熊猫的3 6 种血 液同功酶及蛋白质的4 0 个遗传座位，认为只有一个座位存在多性态，并由此得出 了大熊猫遗传多样性贫乏的结论。张亚平等( 1 9 9 7 ) 从4 0 只大熊猫的2 1 个奠基者 中，共检出9 种线粒体单倍型。大熊猫群体遗传分化程度，比棕熊、亚洲黑熊、马 来熊和北极熊为低。同年，张亚平( 1 9 9 7 ) 等对线粒体d 1 0 0 p 和t r n a 基因的分析 也表明，大熊猫的遗传变异很低。 1 4 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 方盛国等( 1 9 9 7 a ，b ，c ) 用d n a 指纹图谱对大熊猫的遗传多样性进行了研究。 他们发现，五个山系中8 6 只大熊猫的平均等位基因频率为0 2 3 6 2 ，平均杂合率为 7 6 7 4 ，d n a 指纹图的相似系数为0 4 0 0 9 ，其近交程度在家养动物的限值范围( 0 3 0 7 ) ，因而认为现存大熊猫的遗传多样性极度贫乏。2 0 0 3 年，方盛国等( 2 0 0 3 ) 又利用指纹图谱对邛崃和凉山地区的大熊猫遗传多样性进行了分析比较，结果发 现大熊猫总体来说遗传多样性低，且凉山山系( 总面积小但未片断化) 大熊猫的 遗传多样性相对邛崃地区( 总面积大却发生了片段化) 来说更低。这说明种群数 量和栖息地大小这两个因素中，前者对大熊猫的遗传多样性影响更大。此外，万 秋红等( 2 0 0 6 ) 运用功能性遗传标记主要组织相容性复合体( m h c ) i i 类基 因d r b 位点对秦岭和四川亚种6 0 个个体进行了遗传多样性的评价，发现大熊猫的 遗传多样性与其它经受过瓶颈效应的濒危物种( 如红狼和南非白纹大羚羊等) ( h e f i c ke ta 1 2 0 0 2 ；2 0 0 2 b ) 相似，遗传变异度较低，等位基因的杂合度比预期值 还要低，且在该位点上发现了与其它猫科动物有跨物种进化的现象。朱亮等人 ( 2 0 0 7 ) 利用m h ci i 类基因d o a 位点对上述相同样品进行检测后的结果，同样发 现大熊猫的遗传多样性比较低。 除上述研究外，吕植等人( 2 0 0 1 ) 用4 个遗传学指标( 线粒体d n a j 艮锘i j 性片段 长度多态性、线粒体d n a 的控制区序列、d n a 指纹图谱和微卫星d n a 性) 对岷山、 邛崃及秦岭山系的大熊，也进行了遗传多样性的研究，发现大熊猫的遗传多样性 在一些肉食动物中【如印度豹( a c i n o n y x j u b a t u s ) 和北美洲豹( p u m ac o n c o l o r ) 处于 中等水平。魏辅文领导的研究小组最新完成的一项研究成果表明，大熊猫并未走 到进化历史的尽头，仍然具有进化潜力。物种现有种群仍保持较高的遗传多样性， 大熊猫在末次冰期消融后还经历了强烈的种群扩张，而现在的种群的衰退仅始于 几千年前，因为人类的影响而加剧了衰退的过程( z h a n ge ta 1 2 0 0 7 ) 。 综上所述，虽然不同的遗传标记具有不同的进化速率，但迄今利用这些标记 对大熊猫遗传多样性的检测结果，均表明了该物种遗传多样性较低这样一个不争 的事实。 3 其它方面 大熊猫在圈养条件下的性行为能力相对低下。相应地，人们便采用了人工授 1 5 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 精与自然交配相结合的多雄配一雌的方法来提高其受孕产仔率，这就同时带来了 大熊猫谱系难以确定的难题。现有的相关生物学技术，为解决这个难题提供了技 术支撑。o b r e i n ( 1 9 8 4 ) 用血液、皮肤为材料，分析2 9 中同工酶的迁移距离，鉴 定了二雄配一雌所生一子的关系，但是方法繁琐，且材料是个难题。 相对地，微卫星位点在大熊猫亲子鉴定研究中运用更广泛，它的方法简单， 所需样品少，可以采用非损伤性采样，实验重复性强。于是，张亚平等( 1 9 9 5 ) 利用p c r 技术对从毛发中获得的大熊猫微卫星d n a 位点进行了扩增，并研究了 不同个体间的亲缘关系。张志和等( 2 0 0 3 ) 用1 8 对微卫星引物进行圈养种群的父 亲鉴定，因为母子关系已经知晓，所以能够有效的确认出大熊猫的父子关系。因 此，随着更多大熊猫的微卫星引物被筛选出来( 沈富军等，2 0 0 5 ) ，其应用也将 更加广泛。 与此同时，同样具有优良检测效果的d n a 指纹技术，也被应用于大熊猫的亲 子鉴定工作中( 方盛国等，1 9 9 4 ；张志和等，2 0 0 3 ) ，其结果为避免圈养条件下 大熊猫的近亲繁殖，提供了重要的科学依据。继后，方盛国等人以粪便为材料， 并利用自行研制的大熊猫基因指纹探针( f ：z g p 9 6 0 6 0 8 0 1 ) 对冶勒自然保护区、佛 坪国家级自然保护区三官庙地区，以及唐家河国家级自然保护区进行了大熊猫的 数量调查( 方盛国等，1 9 9 4 ；1 9 9 6 a ；1 9 9 6 b ；欧维富等，1 9 9 9 ) ，取得了满意的结 果，为该领域深入开展大熊猫的分子生态学研究，奠定了基础。 近年来，有关大熊猫功能基因克隆方面的研究也有较多的报道。周荣家等 ( 1 9 9 8 ) 应用p c r 技术克隆了与性别决定和分化有关的6 个s o x 基因序列和2 个 z l x 基因序列。林峰等( 1 9 9 8 ) 根据人的b d n f ( b r a i nd e n v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ) 基因序列设计引物，通过p c r 扩增，克隆了大熊猫b d n f 基因并在大肠杆菌中成 功表达。l i a o 等( 2 0 0 3 ) 通过r t p c r 扩增，克隆了大熊猫促卵泡激素( f s h ) 和促黄体激素( l h ) 的c d n a ，并在大肠杆菌中进行了表达。z h a n g 等( 2 0 0 5 ) 扩 增克隆了大熊猫垂体泌乳激素的c d n a ，且在大肠杆菌中进行了表达检测。此外， t a n 等( 2 0 0 7 ) 克隆了大熊猫的a 干扰素( i f n a ) ，并检测了它的蛋白表达和 生物活性。这些研究结果无疑对于了解大熊猫的性别决定与分化发育机制，提供 了相关的基础资料。 自2 0 0 5 年以来，有关大熊猫基因组学方面的研究也相继有了报道，如大熊猫 1 6 大熊猫主要组织相容性复合体( m h c ) l 类基因的研究 线粒体的全基因组测序分析( p e n ge ta 1 2 0 0 7 ) 、大熊猫基因组b a c 文库的构建 ( u ue ta 1 2 0 0 6 ) ，以及以m h ci i 类基因d q a 为探针，将大熊猫的m h c 基因 组定位于9 号染色体长臂上( z e n ge ta 1 2 0 0 5 ) 等研究结果，为进一步开展大熊猫 功能基因的研究，奠定了基础。 第二章基因组b a c 文库构建 第一节基因组文库与保护遗传学的关系 2 0 世纪7 0 年代末，为解决地球上日益严重的生物资源的破坏问题，生物学中 - l - j 新兴的分支学科一保护生物学( c o n s e r v a t i o nb i o l o g y ) 应运而生。保护生物学 是一门综合性学科，目标是评估人类对生物多样性的影响，提出防止或减缓物种 灭绝的具体措施(