（海洋生物学专业论文）利用微卫星标记探讨坛紫菜的遗传多样性.pdf

摘要 参考w 撕e r 等( 2 0 0 0 ) 的方法从坛紫菜叶状体中提取基因组 d n a ，并用c t a b n a c l 加以纯化，得到质量较高的d n a 。经紫外分 光光度计检测其o d 2 6 徊d 2 8 0 比值为1 8 9 1 9 5 ；琼脂糖凝胶电泳检测 其大小约为2 3 k b 且无r n a 污染，适用于微卫星分子标记研究。根 据胡则辉等( 2 0 0 6 ) 报道的坛紫菜微卫星d n a 序列设计特异引物， 进行坛紫菜微卫星的p c r 扩增反应。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电 泳并采用b r a n t 等( 1 9 9 1 ) 的银染方法染色。结果表明，在所设计的 2 5 对引物中有7 对扩增出了较好的d n a 图谱，且仅有3 对引物得到 了3 条可区分坛紫菜野生种及2 个优良群体( 生长快型、高蛋白型) 的差异性条带：2 5 襻2 3 1 、1 4 撑3 0 2 和4 撑1 1 7 ，其中2 5 撑2 3 1 与1 矿3 0 2 两差异条带经纯化、克隆及测序后，根据特征带的序列和原引物序列 重新设计引物并进行p c r 扩增反应，电泳结果表明这两条带确实可 以作为生长快群体及野生种群体的特征分子标记。 本研究同时还使用1 5 对微卫星引物对坛紫菜4 个非养殖群体8 0 个样品进行了遗传多样性分析，扩增的总位点数为3 9 个，其中多态 性位点为2 9 个，占7 4 4 。在这4 个群体中，平均有效等位基因数 为1 3 8 0 6 ( 1 3 2 3 3 1 5 1 6 3 ) ，平均遗传杂合度为o 2 5 9 3 ( o 2 1 7 8 o 3 31 0 ) ，平均p i c 值为0 4 8 3 3 ( 0 4 8 0 8 o 4 8 7 8 ) 。结果表明，本实 验所用的1 5 个微卫星位点具有较丰富的多态性，显示了这4 个坛紫 菜非养殖群体的遗传多样性。用p o p g e i l 3 2 软件构建4 个坛紫菜群体 间的n e i s 遗传距离矩阵，结果表明，4 个坛紫菜群体的n e i s 遗传相 似系数在o 8 9 3 3 o 9 6 1 7 之间，n e i s 遗传距离在o 0 3 9 0 o 1 1 2 8 之间。 a m o v a 结果说明坛紫菜遗传多样性主要体现在个体的遗传差异上。 根据n e i s 遗传距离矩阵通过m e g a4 o 软件用u p g m a 法构建4 个 坛紫菜群体间的聚类图。结果表明生长于平潭县同一岛上的阳面和阴 面群体首先聚在一起，个体之间的遗传差异很小( 相似系数高达 o 9 6 1 7 ) ，说明两群体之间的基因交流平凡，没有群体分化的现象出 现，虽然它们在表型上差异很大。这同时也反映出不同的生境对坛紫 菜叶状体形态会产生较大的影响。相对来说，泉州古浮生长的坛紫菜 独立于其它的群体，它们的多态位点( 3 3 ) 、多态性( 8 4 6 2 ) 、s h a i l n o n 指数( 0 4 8 7 0 ) 、有效等位基因数( 1 5 1 6 3 ) 、预期杂合度( o 3 31 0 ) 、 p i c ( o 4 8 7 8 ) 等值也是最大的，揭示这个群体可能更适合被用于杂 交遗传育种的材料。 关键词：坛紫菜，微卫星，遗传距离，种质鉴定，遗传相似性 g e n e t i cd i v e r s i 哆o f 助垆匆，朋 m i c r o s a t e n “e 办口z 忽z 刀e 船s 妇r e v e a l e db v力口髓口刀e ，1 s z sr e v e a l e db v m a r k e r s a b s t r a c t g e n o m l cd n aw a se x t r a c t e d 丘o m 而吒融) ，口办口f 勿刀田函廿1 a l l u s a c c o r d i n gt o u 1 em e m o dd e s c r i b e db yw a t t i e re ta 1 ( 2 0 0 0 ) a 胁 p u r i 6 c a t i o nw i t hc t a ba n dn a c l ，h i g hq u a l i 哆d n ac o u l db eo b t a i n e d t h ea v e r a g es i z eo fn o r ig e n o m i c 聊蛆w a sa b o u t2 3k be s t i m a t e db y a g a r o s eg e le l e c 们p h o r e s i sw h i c hs h o w e dn or n ac o n t 锄i n a t i o n ，a n d t h er a t i oo fo d 2 6 徊d 2 8 0w a sa r o u n d1 8 9 1 9 5d e t e n n i n e ds p e 瞻o p h o t o m e t r i c a l l y ，i l l u s l 础i n gt h a tm eq u a l 姆o fe x t r a c t e d 聊nw a s9 0 0 d e n o u 曲t o m e e tt h en e e d sf o r a n a l y s i s o fm i c r o s a t e l l i t em a 呔e r s s s r - p c r 锄p l i f i c a t i o nw a sp e r f o m e du s i n g t h e s p e c i a lp r i m e r s 出s i g n e da c c o r d i n gt ot h em i c r o s a t e l l i t ed n as e q u e n c e sr e p o r t e db yh u e t a 1 ( 2 0 0 6 ) i 1 1d e t a i l ，a n dt h ep c rp r o d u c t sw e r e d e t e c t e d b y p o l y a c 拶1 a m i d eg e le l e c t r ) p h o r e s i sa i l ds t a i n e db ys i l v e rm e t h o d t h r e e s p e c i a ld n ab a n d sn 锄e d2 5 襻2 31 ，14 莽3 0 2a n d4 襻1 17w e r ef o u n d a m o n gt h ew i l d 帅ea n dt h eo t h e r 铆ob r e ds t r a i n s ，n a m e l yf a s t - 伊o w i n g a n dh i g hc o n t e mo fp r o t e i n ，o ft h i sr e ds e a w e e d n l et w ob a n d s ，2 5 撑2 31 a n dl4 殍一30 2 ，w e r ep 谢缸e d ，c l o n e da n ds e q u e n c e d ，a 1 1 dn e ws p e c i a l p r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e du p o nt h e s et 、os e q u e n c e s e l e c t r o p h o r e s i s o f 吐1 en e wp c ra m p l i j c i e dp r o d u c t ss h o w e d 也a t2 5 群一2 3 l 髓dl4 # - 3 0 2 c o u l db er e g a r d e da st h es p e c i a lm a r k e r s 矗竹i d e n t i f i c a t i o no f 1 e f a s t g r o w i i 玛s t r a i na n dw i l d 卯e ，r e s p e c t i v e l y ，o f 尸办口f 姗钌凼 f i f 研e e np r i m e r sw e r ee m p l o y e dm ss r - p c ra m p l i f i c a t i o nf o r p o p u l a t i o ng e n e t i c sa n a l y s i so fp 加泐聍绷括s 啪p l e d 丹o mf o u rd i 毹r e n t a r e a si nf u ji a np r o v i l l c e ，m eh o m e t o w no ft h i sr e da l g a o f39l o c i ，2 9 p o l y m o 印h i cl o c iw e r ed e t e c t e do u t ，s h o w i n gt i l ep o l y m o 印h i s mo f7 4 4 i nt h ef o u rp o p u l a t i o n ，m ea v e r a g ee 疗b c t i v ea l l e l en u m b e rw a s1 38 0 6 ， t h ea v e r a g eh e t e r 0 巧g o s i t yw a so 2 5 9 3 ，a n dm ea v e r a g ep i cw a so 4 8 3 3 i an e i sg e n e t i cd i s t a n c em a ：t r i xc o u l db ec o n s t m c t e d 锄o n gt h ef _ o u r p o p u l a t i nb yu s i n gt h ep o p g e n 3 2s o r w a r e ，d e m o n s t r a t i n gt h a t n e i s g e n e t i cs i m i l a d 够w a sr a n g i n gb e 铆e e no 8 9 3 3 o 9 6l7a n dn e i sg e n e 主c d i s t a n c ew a s 行0 mo 0 3 9 0t oo 1 1 2 8 a m o r e s u l tr e v e a l e dt h a tm e g e n e t i cv 撕a t i o na m o n gm d i v i d u a l sm a i l l l yc o n ：t r i b u t e dt om et o t a lo n e ， w h i c hp o s s i b l ya tl e a s tr e s u l t e d 丘o mt h ed i f r e r e n c ei nf l a c tb e t w e e n 诧m a i ea n dm a i et h a l l u sa n d 舶mg e n e t i c 蹦盘s a nu p g m am o l e c u l 站 d e n d r o g r a mw a sc o n s 饥j c t e da c c o r d i n gt o t 1 1 en e i s g e n e t i cd i s t a n c e m a t r i xb yu s i n gt h em e g a4 os o f l = 、a r e nr e v e a l e dt h a tt h e 似o p o p u l a t i o n so ft h i sr e da l g a 伊o 、7 l mi i ls 吼s h i n e ( p 气n g ) a n ds h a d o w ( p y i n ) s l p o e sa tt h es a m ei s l a n d 矗r s tc l u s t e r e d s h o 、树n gt 1 1 a tt h e r ew a sa c l o s er e l a t i o n s h i pb e 铆e e nt h e s e 觚op o p u l a t i o n si ng e n o 够p e ( t h eg e n e t i c s i m i l 撕t yw a so 9 617 ) ，a l t h o u 曲m e yv 撕e ds i 鲈i a n t l yi np h e n o t y p e t h i sa l s or e n e c t e dd i 虢r e n th a b i t a ：t sp o s s i b l yh a dag r e a te 毹c to nt h e t h a l i u sc h a r a c t e r so ft h i sa l g a g u 血p 叩u l a t i o no ft h i sa l g am i g h tb em o 诧 s u i t a b l et ot h er e s o u r s ec h o i c ef o ro u t c r o s sb r e e d i n g ，b e c a u s ei ts e p e r a t e d 仔o mo t h e r si ng e n e t i cd i s t a n c e ，a 1 1 dt h eh i 曲e s tv a l u e so ft h ep o l y m o 印h i c l o c i ( 3 3 ) ，s h a r u l o n i n d e x ( o 4 8 7 0 ) ，e 虢c t i v en u m b e ro fa 1 1 e l e s ( 1 51 6 3 ) ， h e t e r o z y g o s i t y ( o 3 3lo ) ，a n dp i c ( o 4 8 7 8 ) k e yw o r d s ：肋印砂阳加f 幼2 绷s 捃，m i c r o s a t e l l i t e ，g e n e t i c d i s 伽1 c e ，g e m l p l a s mi d e n t i f i c a t i o n ，g e n e t i ci d e n t 埘 上海水产大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：买磊圣 日期：。扩车6 月驴日 上海水产大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口 学位论文作者签名：象形琵 日期：带年石月伊日 指导教师签名 日期：泸学 口 【、 己i言 丁i 目 紫菜属红藻门( r h o d o p h y t a ) 、原红藻纲( p r o t o n o r i d e o p h y c e a e ) 、红毛菜目 ( b a i l g i a j e s ) 、红毛菜科( b a i l g i a c e a c ) 、紫菜属( ，i d 枞y 阳c a g ) ，是目前世界上 人工栽培经济价值最高的一种海藻，仅日、韩、中三国紫菜的初级加工品年产值就 超过2 0 亿美元。2 0 0 3 年度我国的紫菜产量按国际标准计算，约达1 8 2 亿张( 每张3 g ) ，其中条斑紫菜( 尸。矽砂嘲j ，聊p 珊西u e d a ) 为2 2 亿张，坛紫菜( 肋印厅胛 j i z 口f 幼? p 瑚西) 约折合4 8 1 0 4t ( 干重) ，产量居世界首位【1 1 。我国主要栽培紫菜的种 类为坛紫菜和条斑紫菜，养殖区域以浙江省为分界，除浙江省两个物种都有养殖外， 在浙江以北的江苏、山东、辽宁等省主要以条斑紫菜为主，占总产量的2 0 ，而在 浙江以南的福建、广东等省主要以坛紫菜为主，其产量约占紫菜总产量的7 5 以上。 但是长期以来，坛紫菜的养殖使用的都是野生型苗种，蛋白含量低、口感差、经济 效益不高，因此有必要进行坛紫菜的良种选育，以获得坛紫菜优良品系。要达到遗 传改良的目的，首先必须筛选和建立有效的遗传标记，以辅助坛紫菜遗传育种及优 良品系的筛选培育；同时，研究坛紫菜不同地理种群之间的遗传结构，评价坛紫菜 的种质资源状况，为其今后种质资源保护和杂交遗传育种等奠定基础。 1 遗传结构的研究意义及方法 1 1 遗传结构的研究意义 遗传结构是遗传变异在群体内的存在格局或特征，它反映了遗传多样性的组成 形式和变化特征。评价群体的遗传结构，即研究群体的基因频率、交配与繁殖模式、 群体分化模式、群体的基因流动模式等。了解突变、选择压力、迁移扩散、交配基 因流等因素对群体遗传多样性的影响，是对群体资源进行开发、利用和保护的基础。 遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，它具有广义和狭义的双重含义。广义的 遗传多样性是地球上所以生物携带的遗传信息的总和，狭义的遗传多样性是指种内 不同群体或同一群体内不同个体的遗传变异总和。但一般所指的遗传多样性是指狭 义遗传多样性，即种内遗传多样性，或称遗传变异。物种的遗传多样性是长期进化 的产物，是生存和进化的前提。一个群体的遗传变异越高或遗传多样性越丰富，对 环境变化的适应能力就越强，越易扩散其分布范围和拓展新的环境。影响生物遗传 多样性的因素有很多，主要有瓶颈效应( g e n 撕cb o t t l e n e c k s ) 、随机遗传漂变( g e n e t i c d r i f t ) 、近交衰退( i i l b r e e d i n gd e p r e s s i o n ) 、杂交( h y b r i d i z a t i o n ) 、遗传渐渗( g e i l e t i c i n n d 嚣e s s i o n ) 和人为因素等。 1 2 遗传标记的研究方法 遗传标记( g e n e t i cm a r k e r ) 是指用来区分不同的个体或群体，能够稳定遗传的 物质或性状。它是基因型的、特殊的、易于识别的表现形式，它是生物分类学、育 种学、遗传学和物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。理想的遗传标记应具 备以下凡条主要标准：具有较丰富的多态性；表现为共显性，因而能鉴别出纯合基 因型和杂合基因型；选择中性( 即无基因多效性) ；对主要性状无影响；经济方便和 易于观察记载。 遗传标记主要分为四种类型，即形态标记、细胞学标记、生化标记和聊妊分 子标记。形态标记是以生物的外部形态特征来检测遗传变异的方法，也是最简单易 行的方法。它具有取样简单、操作简单、易于分析等优点。细胞学标记主要是染色 体核型，包括染色体数目、大小、随体、着丝点位置和带型( c 带、n 带和g 带) 。 生化标记主要运用蛋白质电泳技术从基因的表达产物蛋白质水平探讨遗传变 异。蛋白质作为基因的表达产物，它的电泳谱带表型、区带的数目及强弱程度的不 同在一定程度上表现出生物进化的关系。目前用于遗传分析的蛋白质包括同工酶 ( i s o z 脚e ) 和非酶蛋白( 或称特异性蛋白) 。同工酶是功能相同但结构不同的一组 酶，同工酶是基因表达的产物，由凝胶电泳揭示的同工酶和蛋白质组成的变化可以 反映编码他们那些基因的变异，从蛋白质水平来揭示生物的遗传变异。但是，这一 技术仍然存在一定的局限性，如同工酶只能检测编码酶蛋白的基因位点，对非结构 基因则无能无力，而且所检测的位点数目受技术限制而不可能很多。这前三种标记 是以基因表达的结果( 表现型) 为基础，是对基因的间接反映；而d n a 分子标记 则是d n a 水平遗传变异的反映。与表型标记相比，d n a 分子标记具有能对各发育 时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测，既不受环境的影响，也不受基因表 达与否的限制；数量丰富；遗传稳定；对生物体的影响表现“中性 以及操作简便 等特点【2 】，因而成为遗传标记中强有力的工具，在揭示物种的遗传变异性研究中发 挥着独特的优势。d n a 分子标记p 1 大多以电泳谱带的形式表现，依据其所用的分子 生物学技术，大致可分为以s o u t l l e m 杂交技术为核心的分子标记，包括限制性酶切 长度多态性( r e 嘶c t i o nf r a g i i l e n tl e n g lp o l y m o 印1 1 i s m ，r f l p ) 1 4 j 、染色体原位杂 交( i i ls i t uh y b r i d i z a ：t i o n ) 【5 棚、d n a 指纹图谱( d n af i n g e 平血l t i n g ) 【7 卅；以p c r 技术为核心的分子标记，包括随机扩增多态性d n a ( r 锄d o m a m p l i f i e dp o l y m o 印1 l i c d n a ，凡心d ) 【蚺1 1 】、序列特征化扩增区域( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e d a m p l i f i e dr e g i o i l s ， s c a 黜) 【1 2 1 、简单序列重复( s i m p l es e q u e n c er c ：p e a t s ，s s r ) 【1 3 1 、简单重复序列间 区( i n t e r - s i r n p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 1 1 4 j 、扩增片段长度多态性( a m p l i f i e d f r 孵n e n tl e n g t l lp o l y m o 印h i s m ，a f l p ) 【1 5 。1 引、单链构象多态性( s i n g l es t r a u n d c o r 怕n 1 1 a t i o np 0 1 y m o 印l l i s m ，s s c p ) 1 1 7 j 、单核苷酸多态性( s i n g l e - n u c l e o t i d e 2 p o l y m o r l 蛳s m ，鼢咿) 【1 8 】。 2 微卫星d n a 技术的实践方法及发展 2 1微卫星d n a( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) 与微卫星d n a 标记( m i c r o s a t e u “ed n a m a r k e r ) 大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一，植物基因组中一般含 有5 0 以上的重复序列。重复序列按其在染色体上的分布方式，可分为散布重复序 列( d i s p e r s e dr e p e a t ss e q u e n c e ，d r s ) 和串联重复序列( t a i l d e mr e p e a ts e q u e n c e ， t r s ) 。前者的重复单位与其它无关重复序列和单拷贝序列相闯排列。而后者的重 复单位则首尾相连，成串排列。按照重复单位的大小又可以将串联重复序列分为卫 星序列( s a t e l l i t e ) 、小卫星序列( m i n i sa = t e l l i t e ) 和微卫星序列( m i c r o s a c e l l i t e ) 3 种。 微卫星e i n a 是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。微卫星d n a 也称简 单串联重复序列( s 抽p l es e q u e n c er e p e 船，s s 凡) 或简单串联重复序列多态性( s h o n t 锄d e mr e p e a tp o l y m o 印l l i s m ，s t i 心) ，这些位点由非常短的串联重复d n a 片段( 1 5 个碱基) 组成。w e b e r 【1 9 】将微卫星分为3 类：完全重复( 无间隔) 、不完全重复( 有 非重复单位的碱基间隔) 和复合重复( 2 个或更多重复单位彼此毗邻连续出现) 。 这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知 的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上差异【2 0 2 1 1 的突变率高：每代每 个配子的每个位点有2 5 1 0 一1 x 1 0 以突变陇l ，因此造成了它们的多态性。但微卫星 周围的单拷贝序列一般不受其影响。c h o u m a n e 等f 2 3 】在对c f 沈r 属8 个年生种和1 个 多年生种的9 0 个微卫星侧翼序列的研究中，发现所有引物均能在鹰嘴豆的近缘种中 成功扩增，也表明微卫星侧翼序列具有保守性。目前对这些重复序列的功能和起源 还不清楚，但许多研究已经证明重复序列可以作为种或基因组水平的遗传标记，是 分子水平上研究遗传多样性的一个有力工具，己成为取代砌m p ( r e s t r i c t i o nf r a 鲫e 瞰 l e n g t l lp o l y m o 印l l i s m ，r n j ) 的第二代分子标记。 2 2 微卫星标记d n a 技术的实践方法及发展 通过p c r j 广增并使用凝胶电泳分离产生大量含有微卫星d n a 片段的方法有3 种：( 1 ) 用在3 端或57 端被放射性标记的微卫星d n a 引物做p c r ；( 2 ) 用微卫星 d n a 两端的保守序列做p c r ；( 3 ) 用被放射性标记的微卫星d n a 引物和凡心d 随机 引物共同扩增含微卫星d n a 的序列和随机序列。其中第2 种方法最为普遍，它一般 可分成4 个步骤： 微卫星序列：通常有2 种途径：一种是从基因组文库中获得含有微卫星的阳性 克隆；另一种是通过检索g e 以a n k ( 美国基因、蛋白数据库) 、e m b l ( 欧洲分子 3 生物学实验室数据库) 和d d b j ( 日本国家遗传研究所基因数据库) 等d n a 序列数 据库，从互联网上获得含有微卫星的序列。前者获得微卫星d n a 标记需要建立、筛 选基因组文库和克隆测序等一系列实验，消耗经费多，工作量也大。而通过后者可 以直接快速地获得微卫星标记，是对种一种途径的有效补充。 微卫星引物：微卫星两侧的序列对于同一物种高度保守，因此可以使用与两 侧保守的d n a 序列相互补的方式设计特定的寡聚核苷酸引物。实验室中通常采用两 种方式得到所需微卫星引物：可以通过检索所研究物种g e 心a 1 1 l ( 等数据库查找带简 单重复的d n a 序列，用p r i m e r 5 5 及m a c v e c t o r 6 o 等软件设计引物；另外，也可以直 接应用若干已发表的微卫星标记引物。 微卫星p c r 扩增：由于是特异性扩增，所以其重现性和稳定性相对较好。但 是随着每对引物( g + c ) 含量的不同和扩增片段长度的不同，与每对引物相对应 的合适的扩增条件也不同。通常采用改变退火温度、缓冲液中m 9 2 + 浓度及循环数等 来获得清晰可靠的条带。 微卫星扩增产物检测：微卫星经过p c r 扩增所得产物在l o 瞄0 0 妊之间，丽 且基因型间的差异仅为几个b p 。因此一般采用3 种方法进行分离阱】：高浓度( 3 络q ) 的琼脂糖凝胶电泳，利用溴化乙锭染色；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用银染法 来检测，分辨率较高；将p c r 产物进行荧光标记( 如f a m 、t e t 、h e x 等) ，然 后经商温变性，在p ea p p l i e db i o s y s t e l n s3 l o 等遗传分析仪上利用毛细管电泳分离， 并通过g 锄e s c a l l 和g b n 0t y p e r ( p ea p p l i e db i o s y s t e m s ) 等软件进行分析。 随着研究的不断深入，在微卫星标记的基础上发展起来几种相近的分子标记： 1 ) i s s r ( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 技术，也称a s s r ( a n c h o r e ds i m p l es e q u e n c e r e p e a t ) ，是一种类似m 婶d ，但利用包含重复序列并在5 端或3 端锚定单寡聚核 苷酸引物对基因组进行p c r 扩增的标记系统。与微卫星分析相比，i s s r 不要求预 知基因组序列信息，大大减少了多态性分析的预备工作。2 ) 把s s r 互补的寡聚核 苷酸作为多位点的i 强l p 技术中的探针。3 ) 涨s ，用标记的s s r 探针与& 好i d 扩 增片段杂交。4 ) 删p s ，把与s s r 互补的寡聚核苷酸作为p c r 引物，扩增基因 组特定片段。 3 微卫星标记在遗传学中的应用 3 1 遗传多样性分析 物种的遗传多样性是长期进化的才产物，也是其生存和发展的前提。对物种遗 传多样性和遗传结构的研究，是探讨其生存性、生存力的基础，也是分析濒危物种 致濒机制的基础，从而帮助制定科学有效的保护策略和措施。遗传结构是遗传变异 在群体内的存在格局和特征，它反应了遗传多样性的组成形式和变化特征。评价群 4 体的遗传结构，即研究群体的基因频率和基因型频率、交配和繁殖模式、群体分化 模式、群体的基因流动模式等。基因杂合度又称基因多样性( g e n e t i cd i v e r s 埘) ，一 般认为它是度量种群变异的一个最适的参数，平均基因杂合度的大小近似地反映出 遗传结构变异程度的高低。p 0 、v e ue ta 1 【2 5 】指出微卫星比其他分子标记如r a p d 和 r f l p 更能揭示遗传多样性。c o l s o ne ta 1 【2 6 】通过实验分析表明微卫星比当前所有的分 子标记能够带来更多的信息。海洋生物人工育种的一个前提就是要知道育种群体的 遗传变异的大小，从而制定出科学的管理措施，防止人工育种过程中进行遗传背景 相似品系交配所造成遗传多样性的丢失，非科学的人工增殖常常造成子代杂合度降 低和等位基因频率发生变化，特别是稀有等位基因的丢失。因此微卫星在估测种群 的杂合度上将更加精确和高效，不但为种质资源调查和保护提供依据，而且更为遗 传育种提供保障。 同样，还可以采用微卫星标记来鉴别同种间的不同种群，尤其是亲缘关系较近 的种群间的遗传距离，绘制系统发育树，进行种质资源的评估和鉴定，以及用其进 行基因定位和分子标记辅助育种。a a r o ne ta 1 口7 】使用一对微卫星标记对来自不同地 区的两个物种的墨角藻( 凡c 淞螂f c “，傩淞和砒淞印妇凰) 进行了遗传分析，结果 表明适应性种群比附着种群的杂合度高2 3 倍。在等位基因频率和基因型组成方面， 墨角藻的两个物种之间存在过渡的适应性。 一系列的研究结果表明微卫星研叮a 标记是进行物种亲缘研究及遗传多样性分 析的有力工具。微卫星等位基因数目与重复单位数目有明显的正相关，它能更加有 效的揭示遗传多样性，而特别适用于揭示变异水平低的物种。由于微卫星d n a 在1 个位点上重复单位的数量在居群内和居群间可以产生有意义的改变，所以微卫星 d n a 标记技术受到居群遗传学家的普遍关注。在缺乏其他自然变异的特征时，微卫 星等位基因频率的数据可以用来探讨解决亲缘关系、同频概率【2 3 1 和居群结构【2 9 1 等问 题。 3 2 遗传图谱的构建 随着分子生物学实验技术的进步以及微卫星的高度自动化定型和测序的应用， 越来越多的微卫星不断地从不同物种的基因组中检测出来。微卫星的高度变异性、 在整个基因组中均匀分布，共显性遗传及易于分析等特点使其成为构建完整基因组 连锁图的最佳选择。在一些生物中，由于遗传基础差，在利用i 江l p 作图时，往往 需要采用多次杂交甚至亚种间杂交的方法，以便得到双亲间等位基因的差异。而利 用微卫星作图时，极易获得双亲间等位基因的差异，使得利用微卫星进行图谱构建 极具诱惑力。 在植物中，科学家们已经将微卫星标记添加到了大豆、大麦、水稻、玉米等作 物的以i 心l p 为基础的连锁图上【3 1 1 ，同样在一些海洋动物中，如罗非鱼、长牡蛎 等，也已经利用微卫星标记构建了遗传连锁群图谱。与这些农作物和海洋经济动物 相比较，大型经济海藻的育种还处于初级阶段，目前主要依赖于自然种群，而没有 选育得到各种经济性状优化的良种。因此绘制出与重要经济性状，如生长速度、高 蛋白、抗病性等相连锁的遗传图谱对于品种选育、种系评估都具有重要意义，同时 为经济海藻的良种选育提供可靠的理论依据。 然而，水产动物基因组的研究工作已经起步，而经济海藻方面的工作还处在萌 芽期。坛紫菜，作为我国特有的重要海产养殖种类，对其基因组图谱的研究是非常 必要的，它将对我国紫菜养殖业的良种化打好坚实的基础。 3 3 种质资源的保护 在种质资源保护方面，微卫星d n a 标记技术为种质资源保护提供了有力的工 具。由于生态环境的破坏和恶化，许多物种已经或正在消失，还有一些物种由于长 期进行移植和杂交，其原产地及不同性系之间的界限用传统方法很难确定。借助分 子标记，通过物种遗传图谱的构建、群体遗传结构和多样性分析、物种演化和亲缘 关系研究。能够对不同物种进行精确的系统学的区分。精确确定物种的进化途径和 分类学地位，进而对种质资源、基因库进行有目的的保护。微卫星d n a 分子标记 技术将成为生物进化、分类学研究和种质资源保护的主要手段。 3 4 系谱认证 在动植物良种选育过程中，必须要搞清楚种群的系谱关系，这样做有利于防止 种群的近交。但对于大型经济海藻来讲，由于个体标识、品系标识甚至群体标识一 直是难以解决的问题。所以很大程度上限制了遗传育种工作的进程。微卫星妊 标记相对于其他分子标记而言，更适合于亲缘关系较近、多态性相似的个体之间的 鉴定，因此使用微卫星标记进行系谱认证是一种较好的选择。当然，要获得较为精 确的系谱关系还要足够数量的微卫星标记。 张亚平等【3 2 】曾用1 0 个微卫星座位引物分析了1 3 只大熊猫的系谱关系，澄清了 两组未知的父系关系，从而为建立各地大熊猫系谱和制定有效的繁殖计划提供了有 力的帮助。w 狐i e re ta 1 发现4 个微卫星座位在所研究的5 种江蓠中具有保守性，其 中2 个高度多态性的微卫星标记可以鉴别出一个种群中9 3 的亲子关系。n o 玎i se t a 1 【3 3 】在大西洋鲑( 勋砌。册厶驴) 中使用8 个微卫星标记在1 2 0 0 0 种可能的关系中为 2 0 0 个子代中9 5 6 的个体找到它们的亲代。 另外，微卫星在其他方面，比如物种进化演变过程分析，杂种优势预测、濒危 物种保护等，都有实际的用途。尽管微卫星标记在初始开发阶段耗费巨大，但一旦 开发工作完成，将一直受益。现在微卫星标记在遗传多样性研究中，特别在群体遗 传学中的广泛使用已经形成一个较为完整的体系。然而对于微卫星遗传分化的量化 方法目前具有争议，在遗传多样性研究中通常使用统计学方法如遗传距离【3 4 j 、聚类 6 分析3 5 1 、p i c 值3 6 1 、基因多样性【3 7 1 等来做进一步分析和讨论。 4 紫菜属微卫星标记研究现状 紫菜是红藻门、红毛菜科、紫菜属( 尸d 研砂阳) 大型海藻的总称，全世界约有 一百三十余种，广泛分布于寒带到亚热带海域潮间带。中国约有1 9 种，其中，主要 养殖种有南方的坛紫菜( p 加打册p 珊括) 和北方的条斑紫莱( 尸弦羽e 船捃) 。在世界 水产养殖业中占有举足轻重的地位。 紫菜分子遗传学研究随着分子生物技术的不断进步已经取得了长足的进展，集 中体现在种质鉴定、遗传多样性和系统分类方面，这些研究结果对紫菜的品种选育 和改良非常具有参考价值。但对我国具有重要经济价值的海藻养殖物种紫菜来说， 主要还是是利用i s s r 【3 8 】、凡心d 【3 争蚓、a f l p 【4 3 】等分子标记。尽管微卫星标记的研 究已应用于海带【非4 5 1 、江蓠【4 “7 1 等海藻的遗传研究中，但国内对紫菜微卫星标记的 研究工作还鲜见报道。本研究根据胡则辉等【4 8 】筛选的坛紫菜微卫星d n a 序列，设 计特异性引物，运用s s r 分子标记技术对紫菜的种质鉴定和遗传多样性进行分析， 以更有效地推动坛紫菜种质资源评估并协助种质的遗传改良。然而相对紫菜如此丰 富的遗传背景，仅靠分子生物技术远远不够，而且相关的研究成果得不到充分应用， 因此有必要将传统研究方法和分子生物技术相结合，对紫菜的遗传背景进行更广泛 和深入的研究。 7 第一章运用微卫星标记技术鉴定坛紫菜的种质 微卫星标记技术几乎同时由三个研究小组( t a l 】t 9 1 、w 曲e r 和m a y 【铡及l i t t 和l u 5 l 】) 独立发展起来，并且被证实在位点特异遗传标记方面研究具有极大的潜 力，是继r f l p 之后的第二代分子标记技术。它具有多态性高、共显性遗传、孟德 尔遗传、重复性好、操作简单等优点【5 2 1 ，并已应用于海带【4 纠5 1 、江蓠4 7 1 等海藻的 遗传研究中。本研究根据胡则辉等【4 8 】筛选的坛紫菜微卫星d n a 序列，设计特异性 引物，运用s s r 分子标记技术分析并鉴定坛紫菜的种质，以更有效地推动坛紫菜种 质资源评估并协助种质的遗传改良。 微卫星标记的获得是需要大量的微卫星序列作基础的，因为在1 0 0 条微卫星序 列中一般只有4 0 5 0 条能够适合引物设计，2 p 3 0 条可能有多态性的p c r 产物。最 后真正有用的微卫星标记可能只有1 0 条左右。如此低的比例使微卫星标记的筛选和 获取具有较高的成本，也使微卫星标记成为比较昂贵的一种分子标记。 以下是微卫星引物设计的一些原则【5 3 】： 1 ) 引物所处位置不应有未确定的序列； 2 ) 引物即不能离核心序列太近又不能太远( 大约1 0 6 0b p ) ； 3 ) 引物序列由1 8 2 7 个核苷酸组成，不应有明显的重复序列，产物应该在 1 0 0 3 0 0b p 之间； 4 ) 引物序列应富含g 忙( 2 0 8 0 ，最好是5 0 左右) 。g c 规则分布，尤其要 注意避免连续胴超过5 个核苷酸； 5 ) 引物应该在5 和3 端至少含有一个g c ； 6 ) 引物的解链温度( t m ) 值应该控制在5 确8o c 之间，如果不行可以考虑控 制在4 5 6 5o c ； 7 ) 引物之间应该是低互补性或无互补性的； 8 ) 两条引物的长度和解链温度( t m ) 值不应该差别太大，并且引物之间尽量 避免二聚体。 引物在设计与合成之后，要进行引物可用性和多态性的检测，有些引物可能根 本就扩增不出产物来( 根据e s t s 来源的微卫星序列，出现这种可能性较大) ，或者 有些引物仅有单态性的扩增产物( 在微卫星核心序列较短的情况下几率较大) ，真正 多态性的引物要经过一定数量的群体检验。 1 1 材料与方法 1 1 1 实验材料 8 本实验选用的材料( 图1 1 ) 为坛紫菜( p o 仞砂阳而口f 幻玎口，2 j 如) 高蛋白、生长快 2 个优良群体和野生种群体，其中野生种采自福建连江海区，2 个优良群体是该野生 种群体经6 0 c o 诱变后筛选出来的。样品采取后，阴干带回实验室，2 0 。c 保存。实 验前对坛紫菜的叶状体进行复苏培养。 图1 1 坛紫菜叶状体的形态 f i g 1 - l m o r p h o l o g yo fv a r i o u ss 缸a i n sa 1 1 dw i l d t y p eo fp d 咖厅口打册p 瑚括t h a l l u s 1 1 2模板d n a 的提取纯化 1 1 2 1d n a 的提取 坛紫菜叶状体d n a 的提取参考w a t t i e r 等【”】的方法，并加以优化。取复苏培养 的个体( 约1 0 0m g ) ，液氮磨成粉末后放入1 5m l 完全提取缓冲液( 含1 0 0l l u l l o 儿 t r i s h c l ，5 0m m o l le d t a ，5 0 0i n m o l ln a c l ，1 8 s d s 和3 3p g lp r o t e i n a s ek ) ， 3 7o c 温浴4 0m i n ，期间每5m i n 上下颠倒摇匀1 次；室温离心( 1 3o o o 印m ) 1 5m i n ， 上清液转至另一离心管中，冰浴3 0m i n ；4o c 高速离心( 1 30 0 0 印m ) 1 5m i n ，上 清液转移至另一离心管中，用苯酚氯仿异戊醇( 2 5 2 4 1 ) 和氯仿异戊醇( 2 4 1 ) 各抽提一次；加入2 3 体积的异丙醇混匀，_ 2 0o c 放置过夜；4o c 高速离心( 1 3 0 0 0 r p m ) 3 0m i n ，用7 0 乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于2 0 0 此的t e 缓冲液；加入r n a s e a 至终浓度1 0 “m l ，3 7o c 温浴3 0m i n 后，4o c 保存。 1 1 2 2d n a 纯化 在d n a 溶液中加n a c l 至终浓度o 7m o l l 后，加入1 1 0 体积6 5 。c 预热的 c t a b n a c l ( 1o c t a b 0