（分析化学专业论文）硅基强阳离子交换色谱填料的研制.pdf

摘要 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 专业：分析化学申请者：刘金燕导师：左雄军副教授 本文通过在硅胶表面化学改性制备了硅基键合丙磺酸基强阳离子交换色谱 固定相和硅基含氮强阳离子交换色谱固定相。研究了这两种固定相的色谱性能。 全文共分四部分。 第一章：综述了离子交换色谱填料基质中无机基质、有机基质以及有机无 机复合基质的优缺点，阳离子交换色谱固定相国内外研究概况，离子交换色谱流 动相有关因素对分离的影响，以及本论文的选题意义及主要工作。 第二章：以5 m 硅小球为基质，通过硅烷化反应在硅胶表面键入巯丙基， 用过氧乙酸温和氧化剂将巯基氧化为磺酸基两步主要反应，制得了硅基键合丙磺 酸基强阳离子交换色谱固定相；以碱基物质为测试溶质评价了其一般色谱性能； 并用苯胺类及吡啶、脂肪胺及铵盐、季铵型阳离子表面活性剂作为测试溶质考察 了其色谱性能，对这些测试溶质表现出良好的分离效果；并系统地考察了流动相 缓冲盐浓度、p h 值、有机溶剂添加剂对苯胺类及吡啶在该色谱柱上色谱行为的 影响。结果表明该色谱柱具有典型的阳离子交换柱的特性，可以用来进行碱性物 质的分离。 第三章：参考国外文献，依据静电屏蔽原理，以5 9 m 的硅小球为基质，对 其表面进行化学改性，制得“内嵌”极性官能团胺基的硅基含氮强阳离子交换色谱 固定相；用红外光谱对该固定相结构进行了表征；以碱基物质为测试溶质评价了 其一般色谱性能；考察了该固定相对咪唑类离子液体的色谱分离性能，并系统讨 论了流动相p h 、盐种类及浓度、有机添加剂等因素对分离的影响，并与硅基键 t 合丙磺酸基强阳离子交换柱分离离子液体进行比较。实验结果表明：该硅基含氮 强阳离子交换剂可以有效改善离子液体的峰形，对咪唑类离子液体具有很好的分 离效果；具有良好的稳定性和重复性，且对类似碱性化合物分离十分有益。并初 步探讨了该固定相分离咪唑类离子液体的机理。 第四章：将硅基键合丙磺酸基强阳离子交换色谱填料应用于强阳离子交换色 谱分析测定液态奶伊利纯牛奶中三聚氰胺，该方法效果良好，表明所制备的固定 相具有一定的实用性。 关键词：硅胶；硅基强阳离子交换色谱固定相；过氧乙酸；静电屏蔽；咪唑类 离子液体；制备；分离 s t u d yo nsil lc a - b a s e ds t r o n gc a tio n e x c h a n g e s t a tio n a r yp h a s ef o rhlg h p e r f o r m a n c e liq uidc h r o m a t o g r a p h y m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r yn a m e ：j i n y a nl i u s u p e r v i s o r ：x i o n g j u nz u o a b s t r a c t i n t h i s p a p e r , t h ep r o p y l s u l f o n i c a c i db o n d e ds i l i c a - b a s e d s t r o n g c a t i o n 。e x c h a n g e ra n dt h es i l i c a - b a s e dn i t r o g e nc o n t a i n i n gs t r o n gc a t i o n e x c h a n g e r w e r ep r e p a r e db yt h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fs i l i c a t h e i rs e p a r a t i o np e r f o r m a n c e w a si n v e s t i g a t e d t h e r ea l ef o u rc h a p t e r si nt h i sp a p e r c h a p t e ro n e ：r e v i e wo fa d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e si nt h es t a t i o n a r yp h a s eo f i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( i e c ) ，i n c l u d i n gi n o r g a n i c ，o r g a n i c a n d o r g a n i c i n o r g a n i cc o m p o s i t em a t r i c e s ，a n dr e v i e wo ft h er e c e n ta d v a n c e si nt h e s t a t i o n a r yb a s eo fc a t i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya th o m ea n da b r o a d a n a l y s i so n i n f l u e n c i n gf a c t o r si nt h em o b i l ep h a s eo ns e p a r a t i o n , a n dn a r r a t i o no ft h et o p i c s e l e c t i o no ft h i sp a p e ra n dt h em a i nw r o k c h a p t e r t w o ：ap r o p y l s u l f o n i ca c i db o n d e ds i l i c a - b a s e d s t r o n g c a t i o n 。e x c h a n g e r ( s c x s p ) w a sp r e p a r e dc o n v e n i e n t l yt h r o n g ht w om a j o rs t e p s ，f i r s t b y b o n d i n g t h e m e r c a p t o p r o p y lg r o u p o n t os i l i c as u r f a c ew i t h m e r c a p t a o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n et h r o u g hs i l a n i z a t i o n t h e nt h em e r c a p t o p r o p y lg r o u p w a so x i d i z e di n t os u l f o n i ca c i du s i n gp e r a c e t i ca c i dw h i c ht a k e sp l a c eu n d e rar e l a t i v e m i l dc o n d i t i o na n dw o r k e du pb ye n d - c a p p i n gl l s i i 培h e x a m e t h y l d i s i l o x a n e ( m m ) i i i c o m m o nc h r o m a t o g r a p h i cp e r f o r m a n c eo fb o n d e d p h a s ew a se v a l u a t e db yu s i n g b a s e s t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ec h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nw e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n g a r o m a t i ca m i n e sa n dp y r i d i n e ，a l i p h a t i ca m i n e sa n da l i p h a t i c a m m o n i u ms a l t s ， q u a t e r n a r ya m m o n i u ms u r f a c t a n t s t h e s t r o n gc a t i o n e x c h a n g es t a t i o n a r yp h a s e p r o d u c e se f f e c t i v es e p a r a t i o n so f t h e s ec o m p o u n d s e f f e c t s o fs a l tc o n c e n t r a t i o n ，p h a n do r g a n i cm o d i f i e ri nt h em o b i l ep h a s eo nr e t e n t i o no fa r o m a t i ca m i n e sa n d p y r i d i n e w e r ed i s c u s s e d t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h ec o l u m nh a dt y p i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fs t r o n gc a t i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n i tc o u l db eu s e d f o rs e p a r a t i o no fb a s i cc o m p o u n d s c h a p t e rt h r e e ：o nt l l e b a s i so fl i t e r a t t a ea n dr e l a t e dr e s e a r c h ，as i l i c a b a s e d n i t r o g e nc o n t a i n i n gs t r o n gc a t i o n - e x c h a n g e s t a t i o n a r yp h a s e ( s c x s p ) e m b e d d e d w i t h i np o l a rf u n c t i o n a lg r o u p a m i d i n ew a sp r e p a r e db yt h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o no f 5 p ms i l i c aa c c o r d i n gt oe l e c t r o s t a t i cs h i e l d i n gt h e o r y , a n dc h a r a c t e r i z e dw i t hi n f r a r e d s p e c t r aa n ds e p a r a t i o np e r f o r m a n c e e f f e c t so ft y p eo fs a l t sa n dt h e i rc o n c e n t r a t i o n s ， p ha n do r g a n i cm o d i f i e ri nt h em o b i l ep h a s eo nr e t e n t i o no fi o n i cl i q u i d sh a db e e n 目录 摘要i a b s t r a c t ii i 第一章绪论1 1 1 前言1 1 2 离子交换色谱综述3 1 2 1 离子交换色谱分离原理3 1 2 2 离子交换色谱固定相3 1 2 3 离子交换色谱固定相基质5 1 2 4 离子交换色谱流动相n 5 伽1 2 1 2 5 离子交换色谱固定相的问题及展望1 4 1 3 阳离子交换填料国内外概况1 5 1 4 本论文选题意义与主要工作1 7 1 4 1 本论文的选题意义1 7 1 4 2 本论文的主要工作2 2 第二章硅基键合丙磺酸基强阳离子交换色谱填料的研制2 3 2 1引言2 3 2 2 实验部分2 3 2 2 1实验试剂与仪器2 3 2 2 2 方法原理：2 4 v 2 2 3 硅基键合丙磺酸基强阳离子交换色谱填料的制备2 4 2 2 4 色谱柱装填2 5 2 2 5 色谱性能考察2 5 2 3 结果与讨论2 6 2 3 1固定相的一般色谱性能2 6 2 3 2 对苯胺类及吡啶的分离2 7 第四章硅基键合丙磺酸基强阳离子交换色谱填料的典型应用 一三聚氰胺检测5 5 4 1 引言5 5 4 2 实验部分5 6 4 2 1 仪器与试剂5 6 4 2 2 色谱条件5 6 4 2 3 样品前处理方法一5 7 4 2 4 样品前处理方法二5 7 4 2 5 标准曲线的建立5 7 4 2 6 加标回收实验5 7 4 2 7 精密度5 8 4 3 结果与讨论5 8 4 3 1 标准曲线。5 8 4 3 2 样品前处理5 9 4 3 3 精密度和最低检出限6 0 4 3 4 加标回收实验6 0 4 4 小结6 1 结论6 2 致谢6 3 发表论文情况6 4 参考文献6 5 v i i 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 第一章绪论 1 1前言 色谱法，又称色层法或层析法，是一种物理化学分离和分析方法。这种分离 方法是基于物质溶解度、蒸气压、吸附能力、立体结构或离子交换等物理化学性 质的微小差异，使其在流动相和固定相之间的分配系数不同，而当两相作相对运 动时，组分在两相间进行连续多次平衡，从而使各组分达到相互分离。 色谱学是一个比较年轻的分析化学分支学科。虽然1 9 世纪就有人在滤纸和 吸附剂上分离无机离子和石油醚烃类化合物，但直到1 9 0 3 年，才由俄国植物学 家t s w e t t ( 茨维特) 提出色谱这一概念，他在研究植物叶片的色素成分时，在一根 细长的玻璃管中装入碳酸钙粉末，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻 璃管内，然后加入纯净的石油醚使其自由流下，随着淋洗进行，样品中各种色素 向下移动的速度不同，结果色素中各组分相互分离形成一圈圈的连续色带，这种 连续色带称为色层或色谱，由c h r o m a ( 色彩) g r a p h o s ( 图谱) 构成“色谱”一词， 色谱法由此而得名。此法所使用的玻璃管称为色谱柱，管内的碳酸钙填充物称为 固定相，淋洗液称为流动相或淋洗剂。后来色谱法不断发展，普遍用来分离无色 物质，并不存在色带，但色谱法这个名称一直被沿用下来【l 】。 t s w e t t 发明的经典液相色谱方法，由于分离速度慢，分离效率低，长时间内 未引起广泛重视。直到2 0 世纪6 0 年代末，在经典液相色谱基础上发展成高速、 高效的现代液相色谱法，一般称为高效液相色谱( h p l c ：h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ) 。经过几十年的发展，从技术到理论，到各种分离模式，以及 在各个科学领域内的应用，得到了突飞猛进的发展，是化学、生物化学、生物工 程与分子生物学、医药学、农业、临床检验、食品分析、环境监测、精细化工、 商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、 生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具，按 分离过程物理化学原理可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、离子对色谱、 凝胶色谱、络合色谱和亲和色谱【l 】。 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 离子色谱是高效液相色谱的一种模式，主要用于阴离子、阳离子的分析。离 子色谱最早是在1 9 7 5 年由美国d o w 化学公司的h s m m i 等人首先提出的。通常 所说的离子色谱是以离子交换树脂为固定相，以电导检测器为检测手段，采用抑 制器来提高灵敏度的一种色谱分析方法。在分离柱和检测器之间增加了降低背景 电导、提高检测灵敏度的抑制器，使得利用电导检测的应用范围大大扩大，不仅 可以用于常规含量离子的测定，也可以用于痕量离子的定性、定量分析。1 9 7 9 年，j s f r i t z 等人提出了非抑制型电导检测的离子色谱技术，他们采用低交换容 量的离子交换树脂作为离子交换柱，采用弱酸及其盐类作为流动相对不同的离子 进行淋洗分离，在控制一定p h 值的条件下，背景电导比较低，可以不加抑制器 进行直接电导检测。该方法使用的仪器设备比较简单，但是这种不加抑制器的离 子色谱方法，其应用范围和灵敏度都不及抑制型电导检测的离子色谱法。 对于难以用其他仪器和方法分析的常见阴离子( 长期以来缺乏快速灵敏的方 法，一直是沿用经典的容量法、重量法和光度法等，这些方法大都是操作步骤冗 长费时，需用多种化学试剂，灵敏度低而且有干扰) 、阳离子( 虽有一些快速而 灵敏的分析方法，如原子吸收、高频电感耦合等离子体发射光谱和x 射线荧光 分析法等，但是难以同时检测样品中的多种成分) 、有机酸和有机胺类等组分的 分析，离子色谱法具有选择性好，灵敏度高、快速、简便，可同时测定多组分的 突出优点。近几年来，随着新型高效的色谱分离柱、灵敏的光化学和电化学检测 器、梯度泵和耐腐蚀的全塑系统、微机处理控制仪器系统以及智能系统的发展， 离子色谱系统又得到了快速发展。离子色谱固定相的主要缺点硅胶基质填料对 p h 的不稳定性以及有机高聚物离子交换固定相对有机溶剂的不匹配性已经被一 一克服。现在的离子色谱可分析各种类型的离子型化合物，包括极性有机物的分 析，可以对含有大分子和有机溶剂的多种复杂样品直接进样分析。应用范围从分 析水中的常见阴、阳离子和有机酸，发展到分析极性有机化合物以及生物样品中 的糖( 单糖、寡糖) 、氨基酸、多肽、蛋白质等。同时，离子色谱联用技术的发 展，使得离子色谱的应用范围和应用领域得到了进一步扩大。 离子交换色谱是离子色谱的一种重要分离方式，是最早得到广泛应用的液相 色谱方法之一。同离子色谱一样具有选择性好，灵敏、快速、简便，可同时测定 多组分，特别是难以用其它仪器和方法分析的组分等优点。对于离子或者易于离 2 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 予化的物质来说它是一种灵活的分离和分析技术，几乎所有的阳离子和阴离子通 过选择一种适当的离子交换剂都能得到分离，已在环境监测、食品、石油化工、 医疗卫生和生化等领域得到了广泛应用。本章主要综述了离子交换色谱填料法中 主要基质的优缺点，阳离子交换色谱固定相国内外研究概况，离子交换色谱流动 相有关因素对分离的影响，以及本论文的选题意义及主要工作。 1 2 离子交换色谱综述 1 2 1 离子交换色谱分离原理 离子交换色谱是离子色谱最主要的一种分离模式，其色谱峰的迁移和扩展仍 用柱色谱理论进行描述，常用术语的定义与高效液相色谱相同。离子交换色谱法 是基于离子交换色谱固定相表面离子交换基团与流动相中具有相同电荷的溶质 离子( 样品离子) 之间的离子交换过程的色谱方法。分离机理主要是离子交换作 用，其次是非离子性的吸附过程。离子交换过程有两个阶段一吸附和解吸附( 也 称洗脱) 。离子交换反应本身是平衡反应，但是在层析柱上进行时，如果条件控 制的好可以使反应完全。在吸附过程中，当一定量的溶液通过交换柱时随同流动 相不断向前运动的待分离离子的浓度总是比固定相上要高，使平衡不断向正方向 进行，离子不断被交换，浓度逐渐减少直至交换完全；同理，在解吸附过程中， 洗脱液中的洗脱离子与吸附在固定相上的待分离离子竞争固定相上的电荷位置， 使之从固定相上解吸附。洗脱液中洗脱离子的浓度比固定相上大的多，而且新鲜 的流动相不断补充，使吸附在固定相上的待洗脱离子不断被洗脱下来直至交换完 全。如果有两种以上的成分被交换吸着在固定相上，不同成分与固定相之间的静 电作用力大小有差异，用洗脱液洗脱时，被洗脱的能力决定于各自洗脱反应的平 衡常数，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达 到分离纯化的目的。主要用于分离亲水性阴、阳离子。对于高极化度的离子，分 离机理中还包含离子一偶极作用或吸附【1 2 1 。 1 2 2 离子交换色谱固定相 3 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 离子交换色谱固定相通常称为离子交换剂或者离子交换填料，通常离子交换 剂是通过在一定的基质表面化学改性得到不同性质的离子交换官能团，根据固定 相表面所带官能团的不同，离子交换剂可被分为阴、阳离子交换剂，其中这两种 离子交换剂根据所带官能团电离能力的不同又可分为强、弱阴离子以及强、弱阳 离子交换剂4 种。离子交换色谱固定相的交换官能团是一些带电荷的基团，这些 带电荷基团通过静电作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相 反电荷的离子，这些离子将与结合在固定相上的带有相同电荷的离子进行交换。 固定相的带电基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为 阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳 离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。表1 1 列出了离子交换剂的四种类型。 离子交换剂强弱的划分并不是以固定相与样品相互作用的强弱为标准，而是基于 它们所带官能团电离能力。通过离子交换剂的p k a 值可以判断其强弱、适用p h 范围以及洗脱剂的选择等。对阳离子交换剂而言，p k a 越小，酸性越强；阴离子 交换剂p k a 值越大碱性越强。在低p h 值时( p h 1 0 ，宜用强碱性固定相而不宜用弱碱性固定 相【3 4 】。烷基化的氨基是最常用的阴离子交换宫能团，而羧基、磺酸基以及磷酸 基是最常用的阳离子交换官能团。表1 2 所示为一些常用官能团的缩写、化学结 构式以及它们的p k a 值。高效离子交换剂应具备- f y d 基本性质i l 】： ( 1 ) 高机械强度，在5 0 - - 2 0 0 k g c m 。2 高压下不出现变形或破坏； ( 2 ) 填充剂为多孔型，最好呈球形，粒径小，粒度分布范围窄； ( 3 ) 填料表面结构要求溶质扩散距离短，传质速率快； ( 4 ) 交换容量大。 除了固定相表面官能团外，载体基质的结构和性能也会影响色谱分离过程。 载体的化学性质和三维结构决定官能团的有效密度以及固定相的有效结合点。填 料的粒度、平均孔径及其分布、孔隙率等物理参数是影响色谱分辨率的几个关键 因素。通常填料微粒的直径越小，分布范围越窄，色谱柱的柱效就越高，峰形也 越好，但柱压也会随之升高。目前用于离子交换色谱的载体包括无孔材料，微孔 材料以及大孔材料3 种。无孔基质分辨率高，分析速度快但柱负载低。对于多孔 填料，其孔结构决定这种基质的比表面积及对某种蛋白吸附量的大小。通常，多 4 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 孔材料的外表面积仅占全表面积的5 或更少，孔内的表面积占9 5 以上。为了 能够更多地利用内表面积，孔径必须足够大，以便分离的生物大分子可以在孔内 自由出入，3 0 n m 5 0 n m 孔径对相对分子质量为3 0 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 0 的蛋白比较适合， 当相对分子质量超过1 0 0 0 0 0 时，选用填料孔径5 0 n m , - 一l o o n m 较好，孔径再大， 填料的比表面积会降低而且基质的耐压性也会降低。 表1 1 高效离子交换剂的基本类型 表1 2 常用的离子交换官能团 1 2 3 离子交换色谱固定相基质 5 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 离子交换色谱固定相是离子交换色谱分离系统的核心和基础，被称为离子交 换色谱仪的“心脏”。和其它色谱法一样，离子交换色谱发展的技术核心也是研制 和开发新型的固定相填料。离子交换色谱分离柱的填料由基质和功能基两部分组 成。功能基是可离解的无机基团。基质具有一定的刚性，能承受一定的压力，作 为功能基的载体，对分离不起明显作用。作为填料的基质可分为两大类，即无机 基质和有机基质，同时，最近还新出现了有机一无机复合基质。无机基质主要包 括硅胶、金属氧化物等，以此类物质为基体的固定相具有在任何介质中呈现良好 的可压缩性的特征，因此是色谱填料研究和应用的主流。有机基质主要包括有机 聚合物和改性多糖，由于具有化学稳定性好，适用p h 范围宽，基体效应小等特 性，因此正获得飞速的发展。有机一无机复合基质结合了无机基质的高效性，优 良的机械强度以及有机基质的耐热性，宽的p h 使用范围等特点，也受到人们的 重视【5 】o 1 2 3 1 无机基质 1 2 3 1 1 硅胶基质 硅胶基质载体具有机械稳定性好，多孔结构，比表面积易于人为控制，可在 较高的温度( 8 0 ) 下使用，并且，合成时易于控制粒度，可较容易地得到小 粒径且粒度分布均匀的硅胶粒子，同时，硅胶表面存在着足够的可反应的硅羟基 易于进行衍生化等优点，因而是目前应用最为广泛的一类无机填料。硅胶填料由 于溶质易于通过相对较大的大孔与固定相上的活性位点接触，因此传质速率快、 柱效高( 理论塔板数可达15 0 0 0 2 0 0 0 0 ) ，且价格便宜。近年来对硅胶填料的研究 较为活跃。离子交换剂可通过静电作用【6 7 1 或疏水性作用【8 】动态涂敷，在硅胶基 质上，也可键合在硅胶基质上【9 】。硅胶基质离子交换固定相主要特点是刚性好、 耐压，没有树脂那种固有的溶胀和收缩现象，因而同一根柱上可以按照分析对象 的具体要求在一较宽范围内任意改变流动相的离子强度、p h 值以及有机成分的 种类和含量，不会对柱性能带来任何损伤。其次，由于硅胶基质粒度细、均匀、 离子交换键合相表面传质过程快，因而一般柱效比树脂类高。第三，大多数情况 下，离子交换键合相柱在室温下操作即可获得良好的分离。但硅胶基质的缺点也 很明显，其表面未被改性的残留硅醇基和金属杂质的存在，会对碱性化合物产生 6 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 “亲硅醇基效应”，并易使生物大分子，特别是多肤，蛋白质等样品产生变性和非 特异性吸附，产生变形色谱峰和低回收率，大大限制了它们在生物体系分离分析 中的应用【l o l 。同时，以硅胶为基质的离子交换固定相化学稳定性差，其适用的 p h 范围窄( 2 8 ) ，酸度过高( p h 8 o ) 时，硅胶本身不稳定，即使表面包覆一层聚合物，o h - 也可以扩散通过聚 合物表面，进而腐蚀硅胶颗粒使硅胶溶解【5 】。因此不能用于弱酸性化合物的分析， 因为弱酸性化合物只有在强碱性介质中才能以阴离子形式存在，才能用阴离子交 换分离。但是，相对于碱性介质而言，硅胶基质在酸性介质中比较稳定，比较适 合做阳离子分离的固定相。虽然存在一些缺陷，但硅质材料已成为色谱填料一种 不可替代的基质【1 卜1 5 1 。 1 2 3 1 2 金属氧化物基质 目前研究较多的以金属氧化物为色谱填料基质的类型主要为舢2 0 3 ，z r 0 2 和 t i 0 2 。与硅胶基质相比，它们的化学稳定性更好，具有较好的耐高p h 值，而且 具有优异的机械稳定性，可制得耐高压( 直至5 0 0 - 6 0 0 p a ) 和极端p h 条件 ( p h = l 一- - 1 4 ) 的颗粒，可在高p h 值流动相( p h 1 0 ) 对碱性物质进行良好分离 而受到人们的重视【1 6 1 引。氧化铝的多孔结构往往不均匀，柱效比硅胶低，所以 不常用，氧化锆和氧化钛作为新型色谱填料引起人们的重视。与舢2 0 3 和t i 0 2 为基质的填料相比，z r 0 2 除了有更强的耐碱性c b ( 可达p h = 1 4 ) ，还有很好的耐酸 性和耐高温【1 9 捌，c a r t 和b l a c k w e l l 最早研究了使用z r 0 2 作为离子交换色谱填 料。这类填料的主要优点是不用键合，可直接使用。在直接使用时，它的分离机 理包括阳离子、阴离子、配基交换同时存在的混合机理，若经适当改性，分离模 式也会改变。例如1 9 9 1 年，s c h a f e r 研究了磷酸盐改性的氧化锆作为阳离子交换 色谱填料的色谱特性，这种填料由于磷酸根与氧化锆的l e w i s 酸的酸碱作用相当 强，牢固结合在氧化锆的表面，很难被其他离子交换，因而只剩下阳离子交换作 用。但是此填料在高p h 条件下磷酸根容易被洗脱而导致填料的不稳定，使其应 用受到限制【2 3 1 。单层及多层键合t i 0 2 具有与s i 0 2 相同的分离性质，但适宜p h 值在l 到1 4 之间1 2 4 。t i 0 2 基质键合固定相除了烷基链产生的疏水作用外，由于 其结构的特点还存在阴离子和阳离子交换性质【2 5 1 ，多重分离机理对极性物质的 7 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 分离不利，但可在p h = l , - 一1 4 调节流动相p h 值而实现良好分离，同时其孔结构 分布不均，粒度大小不一而影响了其柱效。 除此之外，复合氧化物作为一种固体酸碱也已广泛用作离子交换剂，1 9 9 3 年，k a n e k o 等曾采用共沉淀法制备了复合氧化物s i 0 2 t i 0 2 、s i 0 2 一a 1 2 0 3 、 s i 0 2 一z r 0 2 和s i 0 2 m g o 2 6 ，在环境保护、痕量富集、氨基酸分离等方面取得较 好效果，预示了复合氧化物作为h p l c 填料的应用前景，但是作为高效离子交换 色谱填料的复合氧化物目前还未见报道。 1 2 3 2 有机基质 有机固定相基体主要包括各种高聚物和多糖型凝胶。与无机基质的填料相 比，有机基质固定相具有以下几个特征【2 7 3 1 】： 有机基质微球大都容易进行化学改性处理，所得的填料普遍有良好的色 谱选择性。 有机基质填料的结构特点，使它们对于被分离样品有较强的负载能力， 有较高的色谱容量，这适合于不同规模的制备色谱。 有良好的耐酸、碱性和耐溶剂处理的化学稳定性，可以在宽的p h 值范围 内( 0 1 4 ) 使用，这有利于在酸度和碱度较大的某种苛性条件进行的分离，并且 有较好的柱寿命和较强的再生能力。 不易产生不可逆的非特异性吸附作用，特别对于生物大分子的分离有较 好的相容性，能有效地保持样品的生物活性。 诸多优点决定了有机基质类型固定相的广泛应用前景。但其颗粒耐压性不如 无机基质填料好，孔结构比较复杂，在流动相冲洗过程中易产生溶胀或收缩现象， 这些影响色谱性能的因素仍需进一步研究解决。 1 2 3 2 1 有机聚合物基质 有机聚合物离子交换色谱填料应用较广，是目前商品化分离柱的主要填料， 在离子交换色谱中，应用最为广泛的离子交换剂是以苯乙烯二乙烯基苯 ( p s d v b ) 共聚体位骨架，在苯环上引入磺酸基团形成的强酸型阳离子交换树 脂，或者引入叔胺基团形成的季铵型强碱性阴离子交换树脂。与无机硅胶基质相 8 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 比，刚性聚苯乙烯基体表现出离子自由和在整个p h 范围内稳定、容易再生处理、 使用寿命长等优点。另外，此类交换树脂具有大孔或薄壳型或多孔表面层型的物 理结构，能快速达到交换平衡，使分离速度大为加快。但这种离子交换树脂一般 机械稳定性差，在流动相冲洗过程中易产生溶胀或收缩现象，易受有机溶剂污染， 限制了其应用。虽然目前通过晶种聚合已能制备高度交联，耐3 0 0 p a 压力的刚性 聚合物微球，成功的解决了基体强度差的缺点【3 2 l ，使其具有足够的机械稳定性 和化学稳定性，但交联的有机聚合物骨架会使柱效不高，并且填料的粒径难以控 制且大小不均匀，不利于色谱固定相性能的进一步提高。此外，p s d v b 基体的 疏水特性严重限制了将其直接用于生物色谱，必须对其进行表面修饰以增加极 性。 近年来又开发了交联聚乙烯醇为载体的离子交换剂，能耐酸、耐碱，且抗微 生物的能力强，目前已广泛应用于生物大分子的分离中，如白蛋白和肌红蛋白的 脱盐【3 3 】，以及血红蛋白的纯化【3 4 】等。许立中等人就以大孔乙酸乙烯酯异氰尿酸 三烯丙酯共聚物树脂( p v d 为原料合成了含- - 7 , 基氨基羟丙基的阴离子交换剂， 成功的用于蛋白质的分离纯化，如牛血清白蛋白、溶菌酶、卵清蛋白、血红蛋白 和细胞色素c 的分离【3 5 】；随后陈政等人又采用分散聚合法将乙酸乙烯酯( v a c ) 和三烯丙基异氰尿酸酯( t a i c ) 共聚制得多孔聚合物珠体，皂化后制得交联聚乙烯 醇( p v a ) 渗透色谱柱填料，成功的用于去除生物来源的小分子药物中的杂蛋白， 使之分离纯化【3 6 】。 聚丙烯酸酯基质的离子交换剂也是目前应用较为广泛的一类有机聚合物固 定相。其采用的功能单体有甲基丙烯酸酯、2 丙烯酰胺2 甲基1 丙磺酸( a m p s ) 、 甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 、n 烯丙基二甲基胺、烯丙基缩水甘油醚( a g e ) ， 交联剂主要为7 , - - 醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 、二丙烯酰哌嗪( p d a ) 、三聚异氰 尿酸三烯丙酯( t a i c ) 等。通常将单体、交联剂、致孔剂、引发剂按比例混合，经 过热引发、自由基引发或紫外光引发聚合而成，然后根据需要进一步衍生处理成 各种类型的离子交换剂。常用的致孔剂为烷醇、烷烃、苯及甲苯等，常用的引发 剂为偶氮二异丁腈( a i b n ) 。该类离子交换剂在p h 为2 1 2 范围内均具有较好的 稳定性。 9 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 1 2 3 2 2 多糖型凝胶基质 多糖型凝胶基质是生物大分子分离纯化中应用最早也是最为广泛的一类基 质。多糖型凝胶基质材料主要包括葡聚糖系凝胶( s e p h a d e x ) 和琼脂糖系凝胶 ( s e p h a r o s e ) ，凝胶基质材料也已商品化。 交联葡聚糖离子交换剂是将交换基团连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因 而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。 交联葡聚糖的亲水性极强，且在0 0 2t o o l l d 的盐酸以及多数碱性介质中稳定， 但在强酸或氧化剂存在条件下不稳定。其热稳定性良好，在1 1 0 的反应釜中处 理4 0 r a i n 不会产生任何变性，干胶可在1 2 0 c 的反应釜中进行消毒灭菌处理。在 溶液中会发生溶胀，溶胀的程度随交联度和孔径的大小而不同。常用的s e p h a d e x 离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有d e a e s e p h a d e x a 2 5 ，a 5 0 和q a e s e p h a d e xa 2 5 ，a 5 0 ；阳离子交换剂有c m s e p h a e t xc - 2 5 ， c 5 0 和s e p h a d e xc 2 5 ，c 一5 0 3 7 3 引。 琼脂糖琼是由d 一半乳糖残基和3 ，6 脱水l 哥l 糖单元交替连接的链状多糖， 糖链间通过氢键形成稳定的多糖螺旋束网状结构。琼脂糖可先与含多环氧基长链 交联剂( 如聚乙二醇) 进行交联，然后再用短链交联剂( 如2 ，3 二溴丙醇) 进 行第二次交联以增加其机械强度和化学稳定性，改善反应性能。琼脂糖凝胶是亲 水、疏松的。具有良好的化学惰性，可在0 - 一4 0 c 和p h 斗9 的条件下使用。它 的机械强度高于葡聚糖。琼脂糖凝胶的不足之处是它不宜干燥和反复膨胀使用， 若长期保存应添加无害的抑菌剂( o 2 叠氮钠、甲苯) ，并在8 c 以下不结冰的 环境下保存，若冰冻会导致凝胶球的结构产生不可逆的破坏3 7 9 1 。 纤维素包括天然和人工合成两大类。纤维素具有良好的机械和热稳定性，能 与大多数有机溶剂兼容。但它在碱性溶液中会溶解，此外其分子上可利用的活性 反应基团( 轻基) 的数量和比例也比琼脂糖少。而且由于其结构中存在结晶区和非 结晶区，使其表面化学改性相对较难。 多糖型凝胶含有丰富的可反应的轻基，易进行化学改性，生物兼容性好，所 纯化的产品回收率高，且价格低廉。但这类基质的机械稳定性差，只能在低压下 使用，且生物大分子在孔内的传递以分子扩散为主，传质速度慢，限制了其在生 物大分子的快速分离分析中的应用。 1 0 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 1 2 3 3 有机无机复合基质 有机- 无机复合基质微球( o i h s ：o r g a n i c i n o r g a n i ch y b r i ds p h e r e ) 是近些年由 美国w a t e r s 公司开发出来的新基质材料，其中最常见的是聚合物包覆硅胶材料， 聚合物包覆硅胶是针对无机氧化物基体材料硅胶的缺点而研制出来的。硅胶在 p h 8 0 的碱性条件下会溶解不稳定；在其孔隙中大分子难于扩散而降低柱效； 硅胶表面的硅羟基具有离子交换作用会影响分离。为了改善硅胶的不足，并将其 制成非极性固定相，人们就在硅胶表面包覆聚丁二烯( p b d ) 、聚苯乙烯( p s ) 、 苯乙烯二乙烯基苯共聚物( p s d v b ) 、聚乙烯( p e ) 等聚合物。早期的制各是 采用物理包覆法，现多采用将硅胶表面改性后，再用引发剂与单体进行化学键合。 与普通的s i 0 2 微球相比，单位体积中的硅羟基减少，相应减弱了“亲硅醇基效应”。 o i h s 基质结合了无机基质和有机基质材料的优点，具有高机械强度，高柱效， 宽的p h 值使用范围和较好的耐热性。这些特点有利于对待测物质的快速良好分 离。1 9 9 8 年，杨瑞琴、蒋生祥、陈立仁m 】等人把马来酸酐和苯乙烯共聚于带有 双键的硅基键合相表面，制备出一种新型马来酸酐的弱阳离子色谱柱填料，并利 用该类固定相分离了n 矿，m 9 2 + 和c a 2 + ，随后又用大孔硅胶与乙烯基硅烷反应后， 再与甲基丙烯酰胺和二乙烯基苯共聚成一种新型分离蛋白质的色谱柱填料，并考 察了这种色谱填料对蛋白质的分离能力。在近年来，国内外很多研究者采用聚合 物包覆硅胶的方式合制备阳离子交换色谱填料，改善了硅胶的化学稳定性，扩大 了其p h 使用范围( 2 1 1 ) ，国外g e m o th u h n 4 l 】等人分别在硅胶表面包覆聚苯 乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯等两种不同的有机聚合物，再在表面进行修饰得到 两种强阳离子交换色谱填料，并用于分离分析自来水和葡萄汁中的碱金属和碱土 金属，表现出良好的色谱性能。m i n n e s o t a 大学的罗浩【4 2 】等人制备了一种硅胶基 质包覆高交联芳香环的磺酸化的强阳离子交换色谱固定相( 记作s 0 3 - h c c 8 ) ， 该填料的抗水解性增强，表现出良好的色谱性能。e k o l l a 4 3 】等人将丁二烯和顺式 丁烯二酸共聚于硅胶表面，制的一种聚合物包覆的弱阳离子交换色谱固定相，a y a o l l l ( u b o j 等人制备了聚合物包覆硅胶的强阳离子交换色谱固定相，用于分离了 包括生物碱基物质、水溶性维生素和阳离子表面活性剂三类阳离子化合物，表现 出良好的色谱性能及稳定性和重复性。用近年还报道使用a 1 2 0 3 ，z r 0 2 和t i 0 2 等氧化物来制备包覆前述聚合物固定相。以o i h s 为基质的固定相也有商品出售， 硅基强阳离子交换色谱填料的研制 但由于该基质微粒制备较复杂，因此这些固定相的价格比普通的硅质色谱填料来 得高。以有机无机为复合基质的固定相将是以后色谱填料的一个重要发展方向。 1 2 4 离子交换色谱流动相【4 5 稿l 离子交换色谱中选择性的改变主要取决于固定相的性质，固定相可引起选择 性较大范围的改变，但在固定相选定之后，流动相的选择在控制和改善离子交换 选择性上也起很重要作用。离子交换色谱流动相是进行离子交换必需的各种盐溶 液、缓冲剂，它们对分离样品具有合适的溶解度。流动相的组成、离子强度和 p h ，影响溶质保留和分离选择性。水具有良好溶剂化和离子化特性，大多数流 动相是含有淋洗离子的盐水溶液，以提供用以离子平衡的反离子，并使流动相保 持一定的离子强度和p h 值。有时添加与水互溶的有机溶剂如乙腈、甲醇等，提 高某些化合物的溶解度和分离选择性。溶剂强度决定于淋洗离子、缓冲离子、其 他盐的种类和浓度、p h 值以及有机改进剂的种类及浓度。 1 2 4 1 流动相离子强度和离子性质 离子交换选择系数决定溶质从固定相上取代淋洗液离子的程度，当淋洗离子 与固定相之间相互作用的程度改变时，保留和选择性也在改变。离子交换分离是 基于淋洗离子和样品离子对固定相有效交换容量的竞争，为了得到有效的竞争， 样品离子和淋洗离子对固定