（动物遗传育种与繁殖专业论文）PIT1基因对京海黄鸡生长性状的遗传效应研究.pdf

pl 卜1 基因对京海黄鸡生长性状 的遗传效应研究 专业：动物遗传育种与繁殖 研究生：胡玉萍 导师：王金玉教授 摘要 垂体特异转录因子p i t - 1 ( p i t a r y s p e c i f i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) 是家禽垂体前叶 特异表达的一种具有重要功能的转录因子，它与p r l 基因、g h 基因、t s h b 基因 以及自身的启动子结合，调控这些基因的转录，通过调节这些基因的表达而对家禽 的生长发育、繁殖等很多方面起着重要的作用。本研究采用p c r - s s c p 和测序的方 法检测了京海黄鸡p i t - 1 不同基因片段的多态性，对其单核苷酸多态性进行了群体 遗传学分析和基因多态位点与相关性状的关联分析。结果如下： 1 p i t - 1 基因引物p 1 、p 6 和p 1 1 在京海黄鸡中均检测到a a 、a b 、b b 三种不同 基因型，共发现4 处多态位点。引物p 1 检测到的等位基因a 和b 的频率分别为 o 9 2 4 9 5 和0 0 7 5 0 5 ；引物p 6 检测出的等位基因a 和b 的频率都为0 5 ；引物p 1 1 检测到的等位基因a 和b 的频率分别为o 3 9 6 4 和0 0 6 3 6 。卡方检验表明在p 6 和 p 1 l 检测到的基因位点上，基因频率和基因型频率都达到了h 莉y w e i n b e 唱平衡状 态，而引物p 1 不符合。 2 就引物p 1 而言，测序结果表明，在d n a 的第1 8 7 6 b p 处和1 8 8 2 b p 处分别发生 了a _ g 和t _ c 两处碱基突变，并且前一个碱基突变导致了p i t - 1 从丝氨酸到天 冬氨酸改变；对引物p 6 ，测序发现在d n a 的第3 6 8 4 b p 处发生了a _ t 的突变；引 物p 1 1 测序结果显示在d n a 的第4 5 7 3 b p 处发生了t c 的突变，并导致了p i t - 1 从蛋氨酸到苏氨酸的改变。 3 对p i t _ l 基因引物p 1 扩增片段的基因型与各群体的生长性状的统计分析显示： 在京海黄鸡公鸡群体中，a a 型基因型在1 日龄和8 周龄体重性状上与其它基因型 差异显著( p 0 0 5 ) ；母鸡群体中，a a 型基因型在1 日龄体重性状上显著高于a b 型和b b 型( p o 0 5 ) ；a a 型在公母鸡其它各个阶段的体重性状上都是优势基因型。 a a 型基因型在公母鸡胸宽性状上与其它基因型差异显著( p o 0 5 ) ，且在大部分体 尺和屠宰性状上都表现为优势。由此可以做出如下推测；a 等位基因可能与京海黄 鸡体重和体尺性状呈正相关。 4 对p i t _ 1 基因引物p 6 扩增片段的基因型与各群体的生长性状的统计分析显示： 京海黄鸡公鸡群体中，a b 型在各阶段体重性状上均优于其它基因型，但差异不显 著；母鸡群体中，a b 型在1 、8 、1 2 和1 6 周龄时的体重都显著高于a a 型和b b 型( p 0 0 5 ) 。在体斜长和胫围等体尺性状上，a b 型高于其它基因型，但差异不显 著。母鸡群体中，a b 型在半净膛重、全净膛重、腿肌重和胸肌重等屠宰性状上均 高于a a 型和b b 型，且显著高于b b 型( p 0 0 5 ) 。由以上结果可以做出如下推测： 该位点对京海黄鸡母鸡体重性状和屠宰性状产生的影响大于公鸡，且该位点表现出 一定的杂和效应。 5 对p i t - 1 基因引物p 1 1 扩增片段的基因型与各群体的生长性状的统计分析显示： 该位点仅对京海黄鸡母鸡1 6 周龄体重有显著影响，b b 型高于a a 型( p 0 0 5 ) ；对 公母鸡其它体重和体尺性状均无影响。屠宰性状上，公鸡a b 型的腹脂重和腹脂率 都显著高于b b 型( p 0 0 5 ) ；公母鸡中，b b 型的胸肌和腿肌重显著高于a a 和a b 型( p o 0 5 ) 。总的说来，b 等位基因可能与京海黄鸡屠宰性状呈一定正相关。 本研究结果提示p i t - 1 基因可能是控制京海黄鸡体重性状和屠宰性状的主效基因或 是与之存在紧密联系。可以尝试将p i t 1 基因作为体重性状和屠宰性能的分析标记 用于标记辅助选择。 关键词：京海黄鸡，p i t - 1 ，单核苷酸多态性，生长性状 a n a l y s i so fi n h e r i t a n c ee f f e c to ft h ep i t 一1g e n e a s s o c i a t e dw i t hg r o w t h1 y a i t si nj i n g h a iy e l l o w c h i c k e n m s c a n d i d a t e ：h u l p i n g a d v i s o r ：p r o fw m g j i n y u a b s t r a c t a v i a np i t u i t a r ) r - s p e c i f i ct m s c r i p t i o nf i a c t o r ( p i t - 1 ) i so n eo fi i n p o r t a n t 仃a i l s c r i p t i o n f a c t o r so fg h ，p i 也，a n dt s h pg e n e p i t _ lp l a y sa ni 1 ：n p o n a mr o l e i na v i a i lg r o w t h ， d e v e l o p m e n ta i l dr e p r o d u c t i o nv i ar e g u l a t i n gm e ee x p r e s s i o no ft 1 1 e s eg e n e s t 1 1 i ss t u d y w a st 0d e t e c t 1 ep o l y m o 印l l i s m so fm ep i t - 1g e n e si nj i a n 曲面y ：l l o wc l l i c k e nb yd n a s e q u e n c i l l ga n dp c r - s s c pm e t h o d s t h es n p sw e r ed e t e c t e d 谢t 1 1p o p u l a t i o ng e n e t i c m e 也o d s m e a i 】w h n e ，：l ec o n e l a t i o nb e t w e e nd i 虢r e n tc k c k e ng e n o t y p e sa n dm e p r o d u c t i v e 仃a i t sw e r ei i e s t i g a t e d t h em a i l lr e s u h s 、v e r ea l sf o l l o 、s ： 1 i nj 通g h a iy e l l o wc k c k e n 证1 r e eg e n o t ) ，p e s ( a a a b b b ) 、e r ed e t e c t e d 谢t hp 血l e rp 1 ， p 6a 1 1 dp 1 1 o fp i t - 1 t o t a l y4s n p sw e r ef o u n di n 虹l i ss t u d y w i t l lp 1m eg e n e 舶q u e n c i e sf o ra l l e l eaa 1 1 dbw e r e0 9 2 4 9 5a i l do 0 7 5 0 5 w 池p 6t 1 1 eg e n e 肌q u e n c i e s f o ra l l e l eaa 1 1 dbw e r eo 5e 池e r a n d 晰t 1 1p r i i i l e rp 1 1 ，t 1 1 eg e n e 丘e q u e n c i e sf o ra l l e l ea a n dbw e r eo 3 9 6 4a i l do 6 0 3 6 t h eg e n e 丘e q u e n c i e sa n dg e 咖e 舶q u e n c i e sb o t h r e a c h e d l eh a r d y - w e 讪e r ge q u i l i b r i ma tp 6 ，p 1 11 0 c i 砌i c a t e d b yt h ex2t e s t ，b u tp 1 l o c in o tr e a c h e d 2 舡f o r 舭r e s u no fs e q u e n c ea i l a l y s i so f 皿m e rp 1 ，咖dm u 锄0 1 1 ss i t ei nm ep i t l d n as e q u e n c ew e r ef o u n d 、) l d l i c h 、v e r e18 7 6 b p ( a g ) a i l d18 8 2 b p ( t c ) a m dm e m 删i o n ( g a ) l e a d st oac h a i l g ei i l 锄i n 0a c i d 舶ms e rt oa s n am 此旺i o n ( a d s i t ea tp o s i t i o n3 6 8 4 b po ft 1 1 ep i t - 1d n as e q u e r l c ew a si d e m i f i e d 谢t 1 1p 6 a n d 谢t h p r i i i l e rp 1 1 ，o n em u t a t i o n ( t - c ) s i t ea t4 5 7 3 b po fp i t 一1d n as e q u e n c ew a l sd e t e c t c d w m c hm a d eac l 啪g ei i la m i n oa c i d 舶mm e tt o 硼也 3 t 0p r i m e r l ，m er e s u l to fd i 虢r e n tg e n o t ) ，p e sa i l dc b j c k e ng r o w c l l 仃a i t so fj i n 曲a i y e l l o wc l l i c k e ns h o w e dt l l a t ：i i lm a l e s ，a ag e n o t y p eh a ds i 龇f i ca i l _ te 1 1 l l a n c ee 能c to n m eb o d yw e i 咖o n1d a ya 1 1 d8w e e k s 口 o 0 5 ) ；i nf e m a l e s ，a ag e n o t ) ，p e 、懈s i 鲥f i c 觚t 1 1 i 曲e rt l l a nb bg e n o 咖eo nt l l eb o d yw e i g h to n1d a y ( p o 0 5 ) ；a ag e n o t ) ，p e 、瑚m o r e s u p e r i o r i t ) rt l l a na b a n db bo nb o d yw e i g h ti 1 1m eo 廿1 e rs t a g e si nm a l e sa i l df e m a l e s a a g e n o t ) ，p eh a ds i 鲥f i c a n ti n n u e n c ei 1 1s t e m l 】m 谢d m ( p o 0 5 ) ，a l l dw a sb e 仕e r 协a 1 1a b a n db bi i lm a n yb o d ys i z ea n dc a r c a s s 仃如w eg o tt l l em e s s a g et l l a t t l l ea 1 1 e l ea o f t l l i s s i t e m i g h th a de n b a n c e m e n to nt h eb o d yw e i g h ta 1 1 db o d ys i z e i i lj i n g 城y e l l o w c 1 1 i c k e n 4 n l es t a t i s t i c a lr e s u l to f p r i m e r6b e 觚e e nd i 彘r e n tg e n o t ) ，p e sa i l dc 1 1 i c k e ng r o w 吐l 仃a i t s o fj i l l g h a iy e l l o wc 1 1 i c k e ns h o 、v e du st l l a t ：a bg e n o t ) ，p ew a sb e t t e rt l 姗a aa 芏l db bo n t h eb o d y 忙i g h ti i lm a l e s ( p 0 2 ) ；i i lf e m a l e sa b g e n o t ) ，p eh a ds i 鲥f i c a n te 1 1 1 1 a n c ee 虢c t o n 舭b o d yw e i 出o n1 ，8 ，1 2a i l d 1 6w e e k s ( p o 0 5 ) b o d y1 e n g t ha n ds h a n k c i r c 啪f e r e n c e 证g e n o t y p ea b 、r e1 0 n g e rt 1 1 a nm a ti i la a a n db b ( p o 2 ) i i lf e m a l e s a bg e n o t y p e 、v a sb i g g e rm a na aa n db b ( p 0 0 5 ) o nc a r c a s s 砌t si nw e i g h to f s e m i e v i s c e r a t e dy i e l d ，w e i g h to fe v i s c e r a t e d 廿a i t s ，、) ，e i g h to fl e ga n db r e a s tm u s c l e ( p 0 0 5 ) 1 kr e s u l ti n d i c a t e sm a ta bg e n o t y p ew a st h es u p e r i o r i t ) ，g e n o t ) ，p eo nc 1 1 i c k e n b o d y 、v e i g h ta i l dc a r c a s s 僦t sa i l d 廿l ee f f e c ti nf e m a l e sw a sb i g g e rt 1 1 a i li i lm a l e s 5 a st 1 1 er e s u l to fa n a l y s i so fp r i m e r1 1b 咖e e nd i 丑f e r e n tg e n o t y p e sa 1 1 dc l l i c k e ng r 0 、础 仃a i t so fj i n 曲a iy e l l o wc 1 1 i c k e ns h o w e du st h a t ：c o n l p a r e d 谢也o t h e rg e n o t ) ，p e s ， g e n o 咖e sb b h a d 位b i g g e s t b o d yw e i g b to n16w e e k si nf e m 2 l l e s ( p o 0 5 ) ；t h j ss i t e h a dn oe 丘- e c to nb o d yw e i g h ti i lo t h e rs t a g e sa n db o d ys i z ei i l1 1 e i 1 e rm a l e sn o rf e m a l e s i nm a l e sg e n o t y p ea a 、v a u s1 1 i 曲e rt h a nb bi i lb o mw e i g h ta i l dr a t eo fa b d o m i n a lf a t ； 、e i g h to fl e ga n db r e a s ti i m s c l emg e n o t y p eb bw e r eb i g g e rt 1 1 a i l 也eo t h 髓g e n o t ) ，p e s ， a n dh a ds i 嘶f i c a mi n n u e n c e 晰t 1 1a a ( p 0 0 5 ) 1 1 1o n ew o r d ，t 1 1 ea 1 1 e l ebo f l i ss i t e m i g b th a de i l l l a n c 锄e n to n 也eb o d yw e i 出a i l dc a r c a u s s 佩t si 1 1j i n 曲a iy e l l o wc m c k e n t h er e s l l l t so f t h ec u r r e n ts t u d ys h o 、w d 恤tm ep i t 1g e n em a yb eam 萄o rg e n e a b o u t l eb o d y 、e i g h ta n dc a r c 嬲s 缸a i t so rl i r 心dw i mt h ei n 萄o rg e n e s 1 1 1 ep i t 1g e n e m a yb eap o 缸1 t i a lm a r k e ri i lm o l e c m a rm 矗k e r a s s i s t e ds e l e c t i o np r o g 龇r e l a t e d 谢也 m eb o d yw e i g h ta n dc a r c 懿s 删t s 1 畸w o “：j 证曲a iy e l l o wc k c k e n ，p i t - 1g e n e ，p c r - s s c p ，g r o w c l ln a i t s 胡玉萍：p i t - 1 基因对京海黄鸡生长性状的遗传效应研究 4 7 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导f 独立进行研冤工作所取得的研 究成果a 除享中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人零集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：师城 签字日期：毯年易月s 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名：毫龠函、 签字日期：双年易月i 烟签字日期：跳年切月i 归 v 导师签名： 签字日期：谚年易月l 乌日签字日期：谐年匕月l 岛日 胡玉萍：p i t 一1 基因对京海黄鸡生长性状的遗传效应研究 1 文献综述 1 1pit 一1 基因简介 p i t - 1 基因在最初被以为是生长激素因子，在1 9 9 8 年，b o d e l 等人从一个来源 于大鼠垂体前叶腺瘤表达生化激素的细胞系的细胞提取物中分离和纯化了 g h f 1 ，根据其氨基酸序列合成了两个不同的寡核苷酸的杂交探针，用这个两个探 针筛选了牛垂体及大鼠的g c 细胞系的c d n a 文库，得到了它们的c d n a 片段。 序列分析表明这二个c d n a 都只有一个大的开放阅读框( o p e m n gr e a d i i l go i 疆) ， 由这个开放阅读框预测的蛋白质分子量与纯化的g h f 1 的相同( 都为3 3 k d ) ，因 此断定它为完整的p i t - 1 的删 矾a 编码区【1 】，同年c h e s t i a l ln e l s o n 等人在研究垂 体前叶中两种不同细胞( 生长激素细胞和催乳细胞) 的表型决定时发现这两种细 胞类型的基因具有一个共同的激活发育信号，经证明它是一种组织特异性转录因 子【2 ，s t e i n f e l d e r 命名它为p i t - 1 。 之后更多深入的研究表明，垂体特异性转录因子p i t 1 基因，又称p o u l f l ( p i t u i t a 巧s p e c i f i ct r a i l s r i p t i o nf a c t o r - 1 ) ，是一种d n a 结合蛋白，也是p o u 结构 域( p i t - 0 c t - u n cd o m 咖) 中几种同源( 异型) 蛋白之一【3 。它参与调节机体 细胞的生长与发育，并对垂体激素分泌细胞的基因转录起重要调节作用【l 们。垂体 特异性转录因子包含两种，即p i t - 1 和p i t - 2 ，两者互为蛋白异构体，均存在于人 和动物的垂体细胞内。基因组d n a 分析表明：p i t 1 和p i t - 2 起源于同一个基因， 其第2 个内含子经选择性剪接产生p i t - 1 和p i t - 2 基因。在大鼠的研究中发现，p i t - 2 保留了p i t - 1 与g h 基因启动子d n a 结合的能力，但却失去了激活p i 也基因启动 子的功能，这可能是由于p i t - 2 的稳定性较差所致。p i t - 2 蛋白对垂体前叶g h 细 胞的发育、增殖有一定的作用，但正常垂体前叶细胞p i t - 2 心a 的表达量仅是 p i t 1m r n a 表达量的七分之一【1 卜1 3 1 。 在禽类，催乳素是就巢发生和维持的关键激素之一，适宜水平的p r l 浓度还 对家禽的生长发育、脂类代谢、调节体内电解质平衡以及调控禽类的神经行为有 重要作用【1 4 ，1 5 】。生长激素和促甲状腺素同样对动物的生长发育、免疫调控等非常 关键。p i t - 1 与垂体中g h 、p i 也、t s h 以及p i t - 1 自身的启动子结合，调控这些基 因的转录，通过调节这些基因的表达而对家禽的生长、发育、繁殖和免疫【1 7 】等 多方面起着重要的作用。 扬州大学硕士学位论文 2 1 2pit 一1 的结构及定位 1 2 1pi 卜1 基因的蛋白结构 p i t 1 基因在猪、人类及大鼠上的研究较多，下面以人类p i t 1 基因为例介绍 p i t 1 基因的蛋白结构。p i t - 1 基因m r n a 编码的蛋白( p i t - 1 蛋白) 由2 9 1 个氨 基酸组成，分子量3 3 k u ，包括一个n 端转录激活区，一个p o u 特异区 ( p o u h o m o e o d o m a i n ，p o u h d ) 和一个p o u 同源区( p o u s p e c i f i cd o m a i l l ， p o u s d ) 【1 8 】。n 端转录激活区( s t a 区) 由7 5 个氨基酸组成，p i t - 1 蛋白对于靶 基因的转录激活作用依靠此区，而其第1 0 4 0 氨基酸对于转录激活作用尤其重要 【1 9 刎。p o u 蛋白区负责与靶d n a 的识别和结合，从而启动靶基因转录。p o u 特 异区长约7 0 个氨基酸，含有4 个0 【螺旋，它比p o u 区更保守。p o u 同源区有6 0 个氨基酸，包含3 个仅螺旋，最后两个0 【螺旋可构成螺旋一转折一螺旋基序，第 三个a 螺旋又称识别螺旋，可以特异地结合于靶d n a 结合。保持c 【螺旋的空间构 象极为重要，如果0 【螺旋被破坏，则p o u 同源区完全不能与靶d n a 结合 2 1 2 2 】。 由2 0 个氨基酸组成的c 端区对p i t - 1 蛋白也很重要，它与s t a 区相对应，形成下 游转录激活区幽j 。 1 2 2pi 卜1 基因的定位及分子结构 0 h t a 等人最早报道了有关人p o u l f l 基因的研究，将人的p i t 1 基因定位在人的 3 号染色体的3 p 1 1 区域，全长约1 4 k b ，包括6 个外显子，其m r n a 序列全长1 2 6 2 b p ， 编码2 9 1 个氨基酸【2 4 1 。随后，自1 9 9 3 年起，对于猪p o u l f l 基因的研究也渐有报道。 已知猪的p i t 1 基因被定位于1 3 号染色体上的q 4 6 区域，已知其c d n a 序列全长 8 7 6 b p ，编码2 9 2 个氨基酸，由调控区、6 个外显子和5 个内含子组成【2 5 婀。其中p o u 特异区为第1 2 8 个氨基酸至第1 9 8 个氨基酸，而p o u 同源区为第2 1 4 个氨基酸至2 7 3 个氨基酸，约包含6 0 个氨基酸。 与哺乳动物不同，禽类如火鸡和鸡的p i t _ 1 基因却由7 个外显子和6 个内含子 构成，全长约1 2 i 曲。禽类p i t - 1 基因位于相当于哺乳动物外显子2 、3 之间的外显 子是禽类特有的，被命名为外显子2 a ，它编码哺乳动物中不存在的3 8 个氨基酸残 基的肽段【2 刀。家禽外显子2 a 在小鼠外显子2 和3 之间的内含子能找到其同源序列， 这表明哺乳动物和禽类p o u l f l 的进化方式不同。家禽的p i t 1 基因的结构如图1 胡玉萍：p i t 一1 基因对京海黄鸡生长性状的遗传效应研究 3 所示。 貔黼霪 麓翻荔嚣辔 图1 1家禽的p i t 1 基因的结构模式图 f i g 1o 曙a 1 1 i z a t i o no f m ea v i a j lp i t 一1g e n c 1 2 3p i 卜1 基因分子结构在各物种间的同源性比较 人、猪、小鼠、牛的p i t 1 基因具有高度的保守性，滕勇等 2 8 ，2 9 1 将人的p i t 1 基因第四外显子，p o u 同源区核苷酸编码序列和氨基酸序列，分别与猪、小鼠、 牛的p i t 1 基因相应的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较，结果发现：人与 猪、小鼠、牛的p i t 1 基因第四外显子的核苷酸同源性分别高达9 3 9 、8 6 7 、9 2 1 ，而由第四外显子编码的部分p o u 特异区的氨基酸序列完全一致；人与猪、小 鼠、牛p o u 同源区的核苷酸同源性分别为9 1 4 、8 5 1 、8 7 9 ，氨基酸同源性 分别为9 6 6 、9 4 8 、9 0 2 。这说明在哺乳动物中，p i t 1 蛋白的p o u 同源区和 第四外显子编码的p o u 特异区部分是高度保守的。 1 3plt 一1 基因的表达 1 3 1pit 一1 基因在各物种间的表达 人【3 0 】、牛p 1 1 、大鼠阢3 2 1 、小鼠【3 3 1 、羊 3 4 】、猁3 5 1 和裂3 6 】等哺乳动物以及某些鱼 类口7 】【4 3 】的p i t - 1 c d n a 序列已被克隆，发现存在不同的c d n a 变异体。在哺乳动 物中，p i t - 1 倒刚a 以p i t - 1 a 、p i t - 1 b 和p i t - 1 t 3 种形式存在，这由p i t - 1 基因不 同的转录起始导致，所以它们仅在5 端有差异，其中p i t - 10 【是主要的表达形式。 不同的转录变异体翻译的产物也不同，并可能作用于不同的靶基因的启动子。实 验表明，哺乳动物p i t - 10 【强烈的作用于p i t 1 自身的启动子【删，p i t - 1 p 偏向于作 用基因的启动子，而p i t - 1 仅仅促进t s h p 基因的转录【4 5 j 。 与哺乳动物相似，火鸡【4 6 l 中发现3 种p i t 1 i i 汛n a ，分别为t p i t - 1 幸，t p i t - 1 p 幸 和t p i t - 1 w 宰，t p i t 1 水表达量最多，其次是t p i t - 1 w 幸，再次p i t 1 d 木【4 7 1 。t p i t - 1 木、t p i t - 1 p 从结构上看分别相当于哺乳动物中的p i t - 10 【，p i t - 1 p 。t p i t _ 1 p 幸和t p i t - 1 w 牛在n 端 x 序列不同于t p i t - 1 木。t p i t - 1 p 包含一个外显子1 和外显子2 之间2 8 氨基酸的插入 扬州大学硕士学位论文 4 片段，t p i t _ 1 w 木转录没有外显子1 但是有2 8 氨基酸的插入。t p i t - 1 w 奉缺乏外显子1 是禽类独有的。家禽和哺乳动物的表达差异见表1 1 。 表1 1 哺乳动物和家禽p r r 1 基因及表达比较 ( 以小鼠和火鸡为例) 1 随b l el - 1c o m p a r i s o n0 fp 1 1 1 - 1g e n ea n di t se x p r e s s i o nb e t w e e nm a n m m a l sa n da v i a n ( m o u s ea n dt u r k e yf o ri n s t a n c e ，m s p e c t i v e l y ) t a n a k a 【4 8 j 等从鸡的垂体c d n a 文库中克隆了两种p i t - 1 c d n a ，记做c p i t 10 c 和 c p i t 1 丫，并用5 r a c e 法获得了它们的序列。这两种c d n a 5 区序列不同。d n a a 和cp i t _ 1 y 的5 端序列分别与火鸡的t p i t 1 幸、t p i t - 1 w 拳相当。c p i t - 1 a 、c p i t _ 1 丫分 别为3 2 5 和3 2 7 氨基酸的多肽，它们n 端不同，c 端相同。c p i t - 10 【和c p i t - 1 丫的 氨基酸序列与t p i t - 1 宰、t p i t 1 w 宰具有很高的同源性。c p i t - 1 y n 末端s 1 a 区包含一 个2 6 个氨基酸的序列，与大鼠的p i t - 1 p 相似。 在蛋白水平上，鸡和小鼠在p o u 区域具有高度同源性，p o u s 区9 5 同源， p o u h d 区9 1 7 同源，这些区域是与特定的d n a 结合的重要部位，在物种间呈 现高度保守。对于蛋白质全序列来说，火鸡的t p i t - 木与小鼠p i t - 10 【同源性为8 4 【5 引。鸡的两个插入肽段在哺乳动物均没有。在哺乳动物中p i t - 1 b 的表现量约为 p i t 10 【转录量的1 5 【47 1 。火鸡中t p i t - 1 p 宰的表达量比t p i t 1 宰低3 1 0 倍。由此可 见禽类p i t - 1 的表达情况与哺乳动物相类似，说明p i t _ 1 在种间虽然结构存在差异， 但功能却很相近，禽类p i t 1 n 端的一些插入片段在激活目的基因转录时发挥了重 要作用，表明p i t - 1 在种间虽然结构存在差异，但禽类和哺乳动物p i t - l 发生生物 胡玉萍：p i t 一1 基因对京海黄鸡生长性状的遗传效应研究 5 学效应的机理可能不尽相同。 1 3 2p it 一1 基因对g h 、p r l 和t s h 基因表达的调控 鸡的g h 基因在孵化结束后表达量增加，与p i t - 1 的表达变化平行。孵化结束 后，c p i t 10 【、c p i t - 1 丫表达量同时上升，直到第四周、第五周时有略微下降。鸡在 前期生长迅速，p i t 1 在g h 表达中的促进作用才使得机体产生足够的g h 适应鸡 高速生长的需要。c p i t - 1 丫m 砒叮a 表达水平在垂体尾叶( c a u d 2 l ll o b e ) 和头叶( c e p h a l i c l o b e ) 差不多，而c p i t - 1 a m r n a 在尾叶中的表达量是头叶中的1 5 倍。产生生长 激素的细胞在垂体尾叶，产生催乳素的细胞存在于垂体头叶中，n o m l e m 杂交表明 g h m r n a 偏向于在尾叶表达，而p r i 枷r n a 则只是在头叶中检测到。孵化期间， c p i t - 10 【m r n a 的表达水平是c p i t 1 删a 的3 倍【4 8 】：以上事实说明，c p i t - 10 【可 能更偏向于对g h 的表达调控。孵化期间和孵化结束后，血浆和垂体组织均检测 到g h 和p r l ，在火鸡和鸡胚胎发育过程中p r l i l l 】附a 和血浆p r l 水平一直较低， 直到孵化结束前几天才显著升高【4 9 1 ，且g h 的表达水平比p r l 高，而且，来自牛 和猪的资料显示，胚胎g h m r n a 表达先于p r l 表达【5 0 ，5 1 1 ，对火鸡研究表明，t p i t _ 1 和g h 一起调节p r l 和t s h 的表达，这些事实说明p i t - 1 是通过g h 而对p r l 起 调控作用的1 5 2 j 。 1 3 3pit 一1 基因的激活转录 p i t 1 基因的转录主要受p i t - 1 蛋白的正向自我调控，在垂体发育过程中，p i t - 1 基因转录激活比p i t - 1 蛋白出现要早，如在小鸡胚胎发育的第1 3 天垂体前叶中即 可检测到p i 1 i i 心a ，第1 5 天p i t - 1 蛋白已经开始在细胞内汇聚，因此至少存在 另一种核转录因子来参加p i f l 基因最开始的激活过程【5 3 ，5 4 】。 p i t 1 基因正向自我调控p i t - 1 基因的表达的机制一般认为它主要作用于p i t - 1 基因的起始部位，从而调节基因转录，p i t 1 启动子含有o 2 k b 的t a t a 盒【5 5 】，位 于基因的一6 0 至4 5 区作为p i t - 1 i 矾a 的起始a 位点，它与其基因启动子之间共同 形成一个比较稳定的复合物。 在p i t - 1 基因的远端和近端结合位点之间，发生d n a 折叠并产生高敏感位点 区，把p i t - 1 转录因子带到基因上游的增强子区，故p i t - 1 基因一旦转录开始，其 自身的调控机制，足以保证p i t - 1 始终处于激活状态，直至细胞死亡。 扬州大学硕士学位论文 6 外界因素亦可以通过影响细胞内c a m p 水平调节p i t - 1 基因的转录【5 6 1 ，这种 调节作用由c a m p 反应元件结合蛋白( c r e b ) 介导，c r e b 与p i t - 1 启动子2 0 0 和1 5 5 处的两个c r e b 反应元件结合后，促使蛋白激酶a ( p k a ) 催化亚单位与 调节单位分离，导致催化亚单位移入核内，位于p i t - 1 转录启动子区内的c r e b 磷 酸化，其磷酸化位于c r e b 第1 3 3 位丝氨酸，另外细胞内c a 2 + 浓度的高低也直接 影响p i t - 1 的转录激活瞪7 j o 1 4pit 一1 基因的生物学效应 1 4 1pl 卜1 基因的两种作用方式 p i 1 可以促进p i 也基因、g h 基因【5 9 ，6 0 1 、t s h b 基因【3 3 】以及p i t 1 【6 1 ，6 2 】自身的 转录，通过调节这些基因的表达而对动物的生长，发育繁殖和免疫等多方面起着 重要的调控作用。 鱼类类似禽3 8 a a 的保守插入片段是鱼类催乳素基因表达所必须的【6 3 ，4 2 1 。，该 插入片段位于p o u l f l 的s a r 区域，该区域的功能主要是促进p o u l f l 与其他蛋 白因子的互作【2 刀。p o u 区域在p o u l f l 与d n a 的结合中起了关键作用。p o u l f l 作用于d n a 的保守序列具有a t g 朋渔( 朋) ( 朋) ( t ) 的特征，大多数情况 下，p o u l f l 以同型二聚体的形式作用，其中一个p o u l f l 分子与八聚体a t g n 触隗 结合，另一个富含a t 区结合。此外p o u l f l 还可以以异型二聚体或单体的形式发 生作用。p i t - 1 基因异常导致多种垂体激素缺陷症( c o m b i l l e dp i t u i t a r ) rh o m o n e d e f i c i e n c y ，c p h d ) 。在多种垂体激素缺陷而导致侏儒的鼠和人类中，均可发现缺 少p i t - 1 基因的活性【6 4 6 8 1 。因此，p i t - 1 基因的突变可以导致垂体的发育不全和阻 碍g h 、p i 也、t s h 三种激素的分泌，引起矮小现象的出现 6 9 】。1 9 9 0 年，l i 等 6 9 】 研究发现，在d w 矮小性小鼠中存在一个p i t - 1 基因的点突变，这个突变就发生在 p i o u 同源区内，引起了一个g t 的碱基突变，从而导致第2 6 1 号密码子编码的 氨基酸由色氨酸变为半胱氨酸。1 9 9 2 年，d o v i c k 等【7 0 】对一个患有g h 、p r l 和 t s h 缺陷症病人进行研究，该病人表现为一系列精神发育阻滞和身材短小，而患 者母亲的体格和垂体激素水平均正常。利用等位基因特异性扩增p o u 同源区发现， 在密码子2 7 1 处有一个c t 的突变，从而导致2 7 l 密码子编码的氨基酸由吨 转为耶，而正常的母亲却没有。这表明p i t 1 在调节这些基因的表达中有重要作 用。其p o u 区域突变导致垂体前叶发育不全、明显的垂体细胞( 催乳素细胞、生 胡玉萍：p i t 一1 基因对京海黄鸡生长性状的遗传效应研究 7 长激素细胞、促甲状腺素细胞) 缺少【7 1 7 2 1 ，表明p i t 1 在这三类细胞的发生学上有 重要的意义。p i t - 11 1 1 矾a 在鸡5 日龄胚胎的垂体中表达【5 3 】，并抑制维持到出雏， 先于g h 、p r l 、t s hb 的表达，类似情况在大鼠【7 3 】、小鼠【7 卅中也有报道。p o u l f l 先行表达为其靶基因的表达做好准备，但也许p o u l f l 在鸡和哺乳动物的胚胎发 育过程中还有其他重要功能。 p i t - 1 起作用的另_ 种方式是与其它转录因子协同作用。c c 删增强子结合 蛋白a ( c c aa t e n b a n c e r b i n d i n gp r o t e 血，c e b p 0 【) 是一种亮氨酸拉链蛋白，与p i t - 1 一起调节垂体催乳素细胞中基因的转录。c e b p a 的短暂表达诱导p i u 基因在垂体 g h f t l 5 细胞中转录，而p i t 1 和c e b p a 在h e l a 细胞的共同表达表明它们对p r l 启动子的作用有协同性。荧光蛋白融合检测表明，p o u l f l 或c e b p 0 【在垂体细胞 的不同部位表达。共同表达时，p o u l f l 使得c e b p 0 【从无转录活性的着丝粒异染 色质区转移到p o u l f l 所在的区域，p o u h d 是使c e b p 0 【发生转移所必须的【7 5 j ， 这说明p o u l f l 和c e b p 0 【在细胞中的密切协作调节调节垂体特异基因的表达。 p o u l f lp o u 编码区突变导致c e b p 0 【不能被p o u l f l 转移，反而在c e b pa 作用 下使p o u l f l 转移到着丝粒异染色质区【7 6 1 。以上结果表明，这些转录因子在细胞 核内的位置决定了目标基因是否表达。p i t - 1 与雌激素受体( e s 仃o g e nr e c e p t o r ， e r ) 协同促进p r l 的转录是p i t - 1 与其它转录因子协同促进目标基因的转录的另 一个很好的例子，实验表明，只有当p r l 基因增强子和启动子上结合p i t _ 1 后， e r 才能很好的发挥对p r l 基因转录的增强作用。p o u l f l 能使p i u 基因启动子 和增强d n a 序列暂时脱离核小体，以使e r 和其它转录因子结合其上。e r 也可 能与p o u l f l 形成复合物来协同激活转录。产蛋母禽体内迅速发育的卵泡产生的 大量雌激素，同时也刺激了e r 的增加，在e r 和p o u l f l 的作用下，促进p i 也 的表达。鸡体内高的p r l 浓度可以诱发产蛋鸡的就巢行为。鸡在产蛋中后期就巢 发生率升高，可能p o u l f l 和e r 起了重要的作用。 1 4 2pit 一1 基因的多态性及其应用 l i 等【3 3 】将p i t - 1 基因定位于鼠的1 6 号染色体上，并证明p i t - 1 基因与小鼠的 矮小形状基因( d w ) 存在紧密连锁关系，可作为矮小性状基因