（植物学专业论文）蓝猪耳精、卵细胞中央细胞助细胞以及原胚细胞的分离.pdf

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蓝猪耳卵细胞和合子分离：在准确掌握了蓝猪耳胚囊发育的时期和授粉 至受精时i b 的基础上，分离出大量生活状态良好的卵细胞与合子；观察了体内 卵细胞与助细胞受精前后的一些细胞学变化；对于体内合子从受精起始到分裂 为二胞原胚的一系列变化也进行了观察。同时还发现花粉管进入胚囊后，在蓝 猪耳胚珠内部形成了一条淀粉粒带，而在受精前的胚珠中完全不存在这条淀粉 粒条带，这是由受精引起的雌性器官内部营养物质的变化。我们首次对高等植 物分离后的卵细胞与合子进行电泳，发现卵细胞与合子表面都带正电荷。在电 场作用下，细胞的移动速度主要取决于其表面电荷的多少。在实验中，合子的 移动速度比卵细胞快，暗示受精后，合子所带的表面电荷增加。卵细胞与合子 的大量分离为高等植物受精机理的研究创造了条件。 3 蓝猪耳中央细胞和助细胞分离：在对以上分离技术不断完善和改进的基 础上，我们分离出了受精前后的中央细胞以及不同时期的助细胞。结果发现，受 摘要 精前后的中央细胞在体积与细胞状态均有很大差异，受精前的中央细胞体积较 小，含有很多大液泡，且细胞内部的淀粉粒较少；而受精后的中央细胞体积变大， 液泡减少，细胞内部充满了淀粉粒。通过比较不同发育时期的助细胞，发现两个 助细胞只是在体积上略有差异，而在细胞状态上看不出任何差异。 4 蓝猪耳二胞原胚的顶细胞和基细胞分离：随着对高等植物受精机理以及 胚胎发生研究的不断深入，近几年来，高等植物早期的胚胎发生机制引起了一 些学者很大的兴趣。顶细胞和基细胞的分化机制是一个非常有吸引力的研究领 域，但目前还很少报道。因而，我们首次分离了蓝猪耳二胞原胚的项细胞和基 细胞，并收集到一定数量，为将来开展比较合子与二胞原胚的分子生物学研究 打下了基础。 关键词：蓝猪耳；精、卵细胞；助细胞；中央细胞；原胚细胞：分离 2 a b s t r a c t a b s t r a c t o u ru n d e r s t a n d i n go ff e r t i l i z a t i o nm e c h a n i s mo fh i g h e rp l a n t si sv e r yl i m i t e d b e c a u s eo ft h e i rc o m p l e x i t yo ft h er e p r o d u c t i v es t r u c t u r ei nw h i c ht h em a l ea n d f e m a l eg a m e t e sa r ee m b e d d e dd e e p l yi nv a r i o u ss o m a t i ct i s s u e s f o l l o w i n gt h e s u c c e s s f u li s o l a t i o no fm a l ea n df e m a l eg a m e t e sf r o mh i g h e l p l a n t s ，t h ei nv i t r o f e r t i l i z a t i o nc a nb ec o n d u c t e d ，w h i c hm a k e si t p o s s i b l et os t u d yt h ef e r t i l i z a t i o n m e c h a n i s mw i t h o u tt h ei n f l u e n c eo fs o m a t i co v a r ya n do v u l et i s s u e i s o l a t i o no fe g g c e l l ，c e n t r a lc e l l ，s y n e r g i dc e l l ，z y g o t e ，a n dp r o e m b r y oa l s om a k e si tp o s s i b l et os t u d y t h ef u n c t i o n sa n ds t r u c t u r e so ft h e s ec e l l sb yu s i n gm o d e mc y t o l o g i c a la n dm o l e c u l a r m e t h o d s t o r e n i af o u r n i e r ii sag o o dm o d e lp l a n tf o rs t u d y i n gi t sf e r t i l i z a t i o nb i o l o g y b e c a u s ei t se m b r y os a cp a r t i a l l yp r o t r u d e so u tt h em i c r o p y l e ，a n di t se g gc e l l ，t w o s y n e r g i d sa n dp a r t o ft h ec e n t r a lc e l lc a nb e c l e a r l y o b s e r v e db yu s i n gl i g h t m i c r o s c o p e i np r e s e n ts t u d i e s ，w ew e r ea b l e t os u c c e s s f u l l yi s o l a t es p e r mc e l l s ， m a t u r ea n dl i v i n ge g gc e l l s ，z y g o t e s ，c e n t r a lc e l l s ，s y n e r g i dc e l l s ，a p i c a lc e l l sa n d b a s a lc e l l sf r o mp r o e m b r y oo ft o r e n i af o u r n i e r i ，w h i c hm a k e st h eb a s i sf o ri nv i t r o f e r t i l i z a t i o no ft o r e n i af o u r n i e r i ，a n do p e n sa na c c e s st ou s em o l e c u l a rm e t h o d st o s t u d yf e r t i l i z a t i o nm e c h a n i s mo ft o r e n i af o u r n i e r i 1 i s o l a t i o no fs p e r mc e l l s ：t h ep o l l e no fzf o u r n i e r ii sb i c e l l u l a rt y p e c o n t a i n i n gag e n e r a t i v ec e l la n dav e g e t a t i v ec e l l i nap o l l e ng r a i na ta n t h e s i s t h e d i v i s i o no ft h eg e n e r a t i v ec e l la n dt h ef o r m a t i o no ft w os p e r mc e l l so fzf o u r n i e r i o c c u ri nag r o w i n gp o l l e nt u b ew i t h i nt h es t y l ea t2ha f t e rp o l l i n a t i o n w eu s e da s e m i i nv i t r ot e c h n i q u ei nw h i c ht h es t i g m aw a sp o l l i n a t e da n dt h ep o l l e nt u b e sg r e w i nv i v of o r5h ，t h e nt h es t y l ew a se x c i s e da n di m m e r s e di n t oc u l t u r es o l u t i o n w h e n p o l l e nt u b e sg r e wo u to ft h ec u te n do ft h es t y l ea f t e r2 - 3h ，ap a i ro fs p e r mc e l l sc o u l d b er e l e a s e db yb u r s t i n gt h ep o l l e nt u b e ap a i ro ft h es p e r mc e l l so fzf o u r n i e r i d i s p l a y e das i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p ：e spr e s e l _ | ti r l 加e s tc , i - i i , 口s i m i l art c 咐f - t h e t i - = a l1 5r c ，t e i n sa n de s t s is i n - d l are - n + p 5 t l , e t l = a lpr o t i n s 。n b 口n _ - e lt r a n s ：r i l ：t t s 2 有关蓝猪耳的研究 蓝猪耳( t o r e n i af o u r n i e r i ) 系玄参科蓝猪耳属植物，是一种盆栽观赏花卉，一 年生直立草本，多分布亚洲和非洲的热带及亚热带地区。在我国主要分步于浙江、 台湾、广东、广西、贵州等。蓝猪耳别名又蝴蝶花、蚌壳草、散胆草、老蛇药、 夏堇等，属于药用植物，全草可入药。在分类系统中其隶属于双子叶植物的合瓣 花亚纲，玄参科蝴蝶草属( 蓝猪耳属) 。由于蓝猪耳的花期长达2 3 月，近年来 在日本以及我国南方一些城市作为地被型花卉广泛种植，且花色改良在日本也得 到了广泛的研究。蓝猪耳的表皮层能诱导出各种器官而且生长发育都很快【8 5 】， 一直以来作为离体器官发育研究的实验材料，多研究其花芽的形成和分化及衰 老。目前对其研究主要集中于花朵形态的改变和受精生物学的研究两个方面。前 者如改变花的寿命、花形和花色等方面的工作 8 6 , 8 7 , 8 4 】。后者的工作主要集中在受 精过程中卵器细胞及雄性细胞的研究 8 8 , 8 9 , 7 4 , 9 0 拼】。蓝猪耳是典型的蓼型胚囊，最 终形成七胞八核的成熟胚囊9 6 1 。从花的形态可以判断蓝猪耳胚囊发育的各个阶段 以及胚囊从珠孔外突出的时驯9 7 1 。其最大的生物学特征是它的成熟胚囊部分伸出 珠孔，整个卵器和半个中央细胞在显微镜下可清楚观察到【8 9 1 。蓝猪耳胚囊部分裸 露的特征有助于原位观察卵细胞以及助细胞在受精前后的变化，对高等植物体内 受精机理的研究也很有利。这种特征还有利于卵细胞以及合子分离。因此，近年 来以蓝猪耳为材料进行受精生物学问题的研究已有大量报告，已成为研究高等植 物受精机理的模式植物。 2 1 体内受精的研究 第一章前言 蓝猪耳胚囊半裸露的特征，是进行植物生殖生物学研究的一种比较理想的 材料。钙作为第二信使在植物信号转导中的作用，一直是植物生理学、细胞生 物学和发育生物学研究的热点，对高等植物双受精的研究也不例外。k r i s t 6 f 等 采用焦锑酸钾沉淀法研究了蓝猪耳从授粉到受精期间胚珠中钙分布变化。蓝猪 耳受精前，大量的钙主要分布在胚囊表层、胚囊内粘质和卵器细胞间的胞外区 域，胞内钙仅在胚囊周围的珠心细胞和中心柱及珠柄的表皮细胞内有；授粉后， 珠孔表层处由珊瑚状细胞壁构成的迷路结构中含有大量的钙，花粉管进入胚囊 后退化助细胞中钙含量增加且主要分布在退化助细胞的液泡中【9 8 】。h a n 等将蓝 猪耳精细胞提取物注入成熟的中央细胞中发现游离钙浓度明显增加，这种钙浓 度的增加延续2 0r a i n 达到最高峰，接着平稳下降，高水平的钙可持续4 0m i n ： 同时他们将玉米精细胞提取物和三磷酸肌醇分别注入蓝猪耳中央细胞中，发现 玉米精细胞提取物不能诱导蓝猪耳中央细胞中 c e + c 增加，而三磷酸肌醇则可 诱导 c a 2 + 】c 增加，但波峰出现快，高水平的钙仅持续3 0 0 s 。这些结果说明精细 胞内可能存在某些因子专一地诱导钙的增加，并暗示精细胞提取物引起钙增加 可能与肌醇三磷酸途径有判9 3 】。 针对花粉管是否随机进入胚囊这一问题，h i g a s h i y a m a 等人以蓝猪耳为材料， 将其萌发的花粉管与胚珠共培养发现：半离体培养的花粉管比离体萌发的花粉管 更能精确有效地通过助细胞丝状器进入胚囊；没能进入胚囊的花粉管在珠孔处打 个卷后继续向同一丝状器生长；花粉管只进入完整、未受精的胚囊，而不会进入 受热处理或助细胞己损坏的胚囊。从而得出结论：在离体条件下，花粉管只进入 未受精胚囊的生活助细胞【8 9 1 。在具有助细胞的高等植物中，花粉管都是从助细胞 进入胚囊，将两精细胞释放。助细胞与雄配子的运输载体花粉管之间存在怎样的 关系? h i g a s h i y a m a 等人对蓝猪耳用激光消除胚囊内细胞的方法证实了助细胞对 花粉管具有特异吸引的功能。利用激光把蓝猪耳卵器中的卵细胞，中央细胞以及 一个助细胞都破坏，剩下的一个助细胞仍然能吸引花粉管的进入；相反，将两个 助细胞同时破坏后，和精细胞发生受精过程的中央细胞和卵细胞均不能产生这种 信号，再一次证明了是助细胞产生了吸引花粉管进入胚囊的信号物质。但已受精 的胚囊内虽然仍有一完整的宿存助细胞，可不再具有吸引花粉管的能力。因此， h i g a s h i y a m a 提出宿存的助细胞可能停止分泌引导花粉管生长的信号物质阻止了 多个花粉管进入胚囊 7 4 , 9 0 。蓝猪耳的助细胞在短距离内吸引花粉管进入胚囊已经 1 9 第一章前言 被证实。但助细胞吸引花粉管的信号物质是什么还有待进一步研究。 m h r t o n 等( 2 0 0 5 ) 从玉米未受精的卵细胞c d n a 文库中，筛选到一个z m e a l ( z e am a y se g ga p p a r a t u s l ) 基因，z m e a l 编码带有一个跨膜结构域、9 0 个氨基酸组成的高度疏水的小蛋白。z m e a l 在受精前的卵器细胞( 卵细胞和两 个助细胞) 中专一高度表达，而在合子以及二胞原胚时期只有很少量的表达。在 后面的胚胎发生阶段则不再表达。很可能z m e a l 是由卵器细胞产生的短距离内 吸引花粉管的一个信号分子，并在成熟的卵细胞中表达量很高m 】。玉米卵器细胞 吸引花粉管的结果和蓝猪耳助细胞吸引花粉管的结果有很大的不同，很可能在蓝 猪耳和玉米中吸引花粉管的信号物质来源不同。这两个实验结果的差异也说明了 在高等植物中吸引花粉管进入胚囊的调控机制具有多样性，是否表现了单子叶植 物和双子叶植物的受精机制的差异? 需要在更多植物中进行探索。 最近，h i g a s h i y a m a 对蓝猪耳三个种和其近源的两个种( t f o u r n i e r i ，z b a i l l o n i i ，zc o n c o l o ，l i n d e r n i ac r u s t a c e a ，a n dl i n d e r n i am i c r a n t h a ) 调查中发 现助细胞吸引花粉管的不同。当蓝猪耳的胚珠与另一个种的胚珠一起和蓝猪耳的 花粉管共培养时，花粉管表现出更容易被同一种的助细胞吸引，表明助细胞吸引 花粉管的功能具有物种特异性。钙离子一直以来被认为是一个潜在的吸引信号， 但钙离子并不是单独起作用的一个吸引信号，因为在该实验中发现，钙浓度的升 高并不影响这些种间的吸引。体外交叉实验还发现当不同种的花粉管到达同一个 胚囊附近时，胚囊对花粉管的吸引会减弱，表明种间优先吸引可能是作为有性生 殖障碍的最后一步来控制花粉管的方向【9 1 1 。 大多数植物的胚囊深藏于胚珠珠心组织内，难以直接观察雌配子的生命活 动。目前，植物细胞骨架领域的研究多集中在花粉管方面，对受精过程中卵细 胞的微管、微丝骨架研究较少。然而，蓝猪耳胚囊半裸露的特征提供了借助荧 光反应物直接观察细胞骨架动态分布的可能。对蓝猪耳受精过程的细胞骨架研 究也取得了一些成果。蓝猪耳胚囊的珠孔端有大量的微丝分布，且微丝呈帽状， 这个帽状的微丝结构在开花前两天出现，但花粉管进入胚囊时就消失。因此推 测丝状器附近的微丝可能与分泌吸引花粉管的向化性物质和花粉管进入有关 1 1 0 0 。同时还发现蓝猪耳助细胞的合点端和卵细胞中的微丝多随机分布，而中央 细胞的微丝呈网状分布，且在其膜下有很多的微丝束【1 鲫。但卵细胞的微丝在授 粉后发生很大的变化，首先是珠孔端的膜下微丝片段化和解聚，最后聚集成一 第一章前言 条明显的肌动蛋白带。在花粉管释放内含物后，肌动蛋白带变得更浓密【1 0 0 j o u 。 近来在中央细胞也发现类似的变化，这种肌动蛋白的动态变化可能涉及次生核 的移动。对蓝猪耳中央细胞受精过程中的微丝动态变化研究表明，成熟的中央 细胞在开花后微丝分布成网状，而许多的微丝束环绕在次生核周围并连接着次 生核膜，延伸到珠孔端的膜下，认为这与次生核在受精时向珠孔端移动有判1 0 2 1 。 h a n ( 2 0 0 0 ) 等通过把带有荧光标记的不同分子量大小的物质注入蓝猪耳的 中央细胞中，发现随着肘i 囊发育的成熟，卵器细胞和中央细胞之间的膜渗透性 降低；而受精后，即使很小的分子也无法从早期的胚乳中进入到合子，说明此 时合子和早期胚乳之间膜渗透性已减小【9 2 】。 2 2 体外受精的研究 八十年代末，k e i j z e r 等尝试用显微操作技术将分离出的精细胞注射到胚囊 中，期望探索离体条件下的受精过程。他们选用胚囊半裸露的蓝猪耳为实验材料， 直接萌发花粉粒，将花粉管中分离的精细胞从中央细胞一侧注射到胚囊中，注入 的精细胞很少与卵细胞融合，实验结果不理剧1 0 3 1 。这条途径虽未成功，但k e i j z e r 提出了发展和运用显微操作技术研究受精过程的三点意义：( 1 ) 研究显微注射后 损伤细胞的生理变化：( 2 ) 研究种内或种问分离的精细胞被注射到完整胚囊后与 卵细胞融合的命运；( 3 ) 开辟了应用显微操作技术探索高等植物离体受精的方法 1 0 3 。自此，近二十年来，试图应用显微操作技术在蓝猪耳受精上的研究也有报 道。在雄配子体分离方面，最初k e i j z e r 从蓝猪耳萌发的花粉管中分离出精细胞； 而后p d l 在研究雄配子体发育过程中运用活体离体法分离出了精细胞【9 5 】；陈素红 等从全长花柱长出的花粉管中分离到大量的成对精细胞【2 5 1 。 雌配子体分离方面，m 6 1 首先运用酶解法分离蓝猪耳胚囊，但没有检验分 离卵细胞的活性【1 0 4 1 。k r i s t 6 f 和i i t i t e 用酶解法成功地分离了蓝猪耳的生活胚囊 1 0 5 】；此后，他们根据渗透压与发育阶段的相关性，利用适宜于各个时期渗透压 的酶液分离出蓝猪耳各个发育时期雌配子体，并从中发现大孢子母细胞渗透压 最低，到四核胚囊阶段渗透压升高，然后到完全成熟胚囊阶段渗透压又逐渐降 低【9 7 】。目前分离蓝猪耳卵细胞的方法主要是酶解法，虽此法比较奏效，但较高 浓度的酶液对卵细胞的生活力可能会产生较大影响。 离体受精作为一种技术平台在高等植物有性生殖的研究中具有重要意义， 它不仅可排除体细胞组织的干扰，重现了体内的受精结果，还可能作为单倍体 2 l 第一章前言 育种、远缘杂交，以合子作为转基因的受体细胞等应用领域的技术手段 1 0 6 】。离 体受精过程中最关键的精、卵细胞分离、单细胞操作以及单细胞的培养都已在 玉米，小麦和水稻中获得成功。但目前离体受精也只是在玉米和水稻中获得了 完全成功以及在小麦中获得了部分成功，这三种都是单子叶禾本科植物。作为 高等植物的大都数，双子叶植物的离体受精技术一直没有成功的报道。要想全 面认识高等植物的受精机理问题，双子叶植物离体受精技术的建立迫在眉睫。 为此，本论文以双子叶植物蓝猪耳为实验材料，开展分离蓝猪耳的精、卵细胞、 合子和早期原胚细胞，为建立蓝猪耳的离体受精体系和开展蓝猪耳受精机理研 究提供条件。 3 本论文的研究内容及意义 1 1 采用活体一离体培养法，体外培养蓝猪耳的花柱长出大量的花粉管，利用渗 透压冲击法爆破花粉管，收集了具有生活力的两个精细胞群体。经过多对精细 胞进行单因素方差分析发现蓝猪耳的两个精细胞在体积上差异显著，而在我们 的实验中还发现两个精细胞在体外的生活力也有差异。两个精细胞群体的收集 为用分子生物学方法研究蓝猪耳精细胞二型性问题提供了必要的材料。 2 ) 在高等植物个体发育中，卵细胞受精后被激活，启动了合子的发育。对卵细 胞受精前后的变化一直足植物生殖生物学家研究的热点，而要深入研究卵细胞 与合子的差异及其激活的机制，只能从其分子水平的研究入手。因而，就需要 分离得到大量的卵细胞与合子。我们利用酶解结合解剖的方法分离到大量的有 生活力的蓝猪耳卵细胞及受精后的合子，为探索卵细胞激活的分子生物学研究 创造了条件。卵细胞和合子的差异不仅表现在其体积和表面积以及内部的一些 生理状态上，在电泳的实验中，发现二者的电泳速度也有差异，合子的速度比 卵细胞快，暗示合子的表面可能带有更多的正电荷。对于受精后卵细胞表面电 荷的改变以及电荷改变所导致的结果做进一步的研究是一个有趣的新课题。 3 ) 高等植物的双受精是发生在被体细胞组织层层包裹的雌配子体内，因而对其 双受精过程的研究造成很大障碍。要克服这种障碍进行高等植物受精机理的研 究需要建立离体双受精技术，其中最关键步骤是精、卵细胞与中央细胞的分离。 因此我们除了分离了蓝猪耳的精、卵细胞外，也分离了蓝猪耳受精前后的中央 细胞。为研究胚乳的发育提供了条件。同时，我们还对被子双受精过程的一个 第一章前言 重要参与者助细胞进行了分离，为研究助细胞的功能打下了基础。 4 ) 在上述分离技术建立的基础上，通过技术上的改进，我们分离了蓝猪耳的二 胞原胚，并收集了顶细胞和基细胞群体。为研究合子发育以及顶细胞和基细胞 的分化机制打下了基础。 第三章蓝猪耳卵细胞、合了的分离 第二章蓝猪耳雄配子体发育以及精细胞的分离 高等植物花药成熟时可能形成两种花粉：三胞型花粉或二胞型花粉。三胞 型花粉由一个营养细胞和两个精细胞构成。二胞型花粉则由一个营养细胞和一 个生殖细胞组成，它的两个精细胞需要在花粉萌发长入花柱中的花粉管里形成。 根据花粉成熟时的状态，需采用不同方法分离精细胞。 主要有两种方法分离三胞花粉的精细胞，c a s s ( 1 9 7 3 ) 首次利用渗透压冲击法 将大麦花粉粒放到2 0 蔗糖b k 溶液中获得了精细胞1 0 7 1 。这种利用渗透压冲击 的方法获得的精细胞不仅操作简便，且分离出的精细胞可保持数小时的生活力， 以后大多数分离三胞花粉的精细胞实验都采用这种方法，如白花丹、玉米、甜 菜等植物的精细胞【1 0 8 。1 1 0 1 。此外是利用物理研磨的方法也可直接分离三胞花粉 的精细胞，主要采用玻璃匀浆器将精细胞从花粉粒中挤压出来，如油菜、紫菜 薹等的精细胞用此方法分离1 1 1 , 1 1 2 1 。 对具二胞花粉的植物，因开花时成熟花粉粒中仅含生殖细胞和营养细胞， 精细胞是在花粉萌发后的花粉管里形成，因此只能诱导二胞花粉萌发出花粉管 后才能分离出精细胞。常用方法亦又两种： ( 1 ) 花粉离体培养法 将花粉置于人工培养基中萌发出花粉管，待精细胞在花粉管中形成后，用 渗透压冲击或研磨使花粉管破裂，释放出精细胞。此法曾在百合、蓝猪耳中应 用【1 1 3 , 1 0 3 。 ( 2 ) 活体离体法 这是一种比较接近于体内分离精细胞的方法。s h i v a n n a ( 1 9 8 8 ) 成功地开创 了分离二胞花粉植物精细胞的先例，他们将授粉后体内生长一段时间的花柱培 养在含硼和钙的培养基上，从花柱切口端长出的花粉管中己形成了一对精细胞， 然后将花粉管转移到低渗透压溶液中应用渗透压冲击花粉管或用酶液处理花粉 管，使花粉管顶端爆破释放出一对精细耐1 14 1 。莫永胜与杨弘远( 1 9 9 2 ) 用此法 在5 科8 种具有二胞花粉的植物如鸢尾、棉花、朱顶红、烟草、黄花菜、萱草、 玉帘等分离出精细胞【1 1 5 】。t i a n 与r u s s e l l ( 1 9 9 7 ) 亦沿用该法分离烟草精细胞【6 8 】。 8 0 年代末，9 0 年代初分离精细胞的试验主要集中在探索分离方法和保存精 细胞的条件等方面。但从离体受精的角度看，对分离精细胞的数量要求很小， 2 4 第三章蓝猪耳卵细胞、合了的分离 而在质量上则要求具有生活力。玉米、薏苡、高粱和油菜的精细胞在融合液中 可保存3 0 分钟，大麦可保存2 0 分钟，而小麦仅能保存3 5 分钟。超过保存极 限的精细胞用于电融合时，在电场下很易破裂【1 1 6 】。另外，在8 0 年代中后期对 精细胞发育的研究中，许多植物都显示出一对精细胞在形态和结构方面有明显 差异( 精子二形型) 。在白花丹受精过程中，一对精子中含质体较多的精细胞基 本上与卵细胞融合，而含线粒体较多的精细胞主要是与中央细胞融合【1 8 】。精细 胞的倾向受精现象开辟了高等植物受精中配子识别研究的新领域。因此分离成 对的精细胞是进行上述研究的前提。目前随着技术手段的提高，分离成对精细 胞以探索两个精细胞之间的差异己有报道【2 2 2 3 1 。为了进行精细胞c d n a 文库的 构建，已大规模地分离出数量上千的两个精细胞群体2 6 1 。 1 材料与方法 1 1 材料 蓝猪耳种子于三月中旬播种在厦门大学温室花盆中，土壤由比较疏松的腐 质土与蛭石4 ：1 混合，出苗一个月后，大约4 片真叶，分苗于花盆中。开花前 置于温室中生长，六月中旬植株可开花。其生长条件控制在2 2 2 8 ，人工光照 1 4 h d 。 1 2 试剂及配制 1 2 1 半离体花柱培养花粉管的培养基： c a c l 2 2 h 2 0 0 0 1 h 3 8 0 3 0 0 1 k h 2 p 0 4 o 0 1 蔗糖5 p h5 4 - - 5 6 新鲜双蒸水配制 1 2 2 花粉管爆破液： 甘露醇 5 纤维素酶( c e l l u l a s er 1 0 ) 0 0 0 2 5 果胶酶( p e c t o l y a s ey 一2 3 ) 0 0 0 2 5 2 一n 一吗啡啉乙磺酸( m e s ) 2m m 1 2 31m g m l 荧光素- - e ；酯( f l u r o s c e i nd i a c e t a t e ，f d a ) 母液： 第三章蓝猪耳卵细胞、合了的分离 1m g f d a 溶解于1m l 丙酮中。 1 2 41m g m l4 , 6 一二氨基- - 2 - - 苯基吲哚( 47 。6 - d i a m i d i n o 一2 一p h e n y u n d o l e ， d a p i ) 母液： 1m gd a p i 溶解于1m l 的双蒸水中。 1 3 实验方法 1 3 1 去雄、授粉 蓝猪耳是虫媒传粉植物，但也可进行自花传粉。每朵花内有4 枚雄蕊，雄蕊 由花丝相连着生于花瓣上，4 根花丝彼此分开，花丝两长两短，花药两两联结， 每对花丝围绕着花柱。每朵花内有4 枚雄蕊。花朵开放后的最初几天内，位于上 部的花药，相对于柱头会发生明显伸长，可作为花朵开放后早期的形态指标。在 开花当天，两对花药均位于柱头之下，但柱头的两个裂片没有张开。开花后1 天， 上部花药明显抬高，移至柱头同一高度的位置，柱头两裂片略微张开。在开花后 2 天，上部花药继续抬高，明显位于柱头之上，而下部花药高度变化不大。此时 柱头两裂片完全张开，为传粉做好准备。把即将开花的蓝猪耳去雄，套袋。在开 花后第2 天，其柱头两裂片完全张开后，用新鲜成熟的花粉进行人工授粉，方可 保证授粉的成功。 1 3 2 半离体培养花粉管 授粉后的花柱在体内生长约5h 后，将其从基部切下，立即插入新配制的培 养基中培养。将花柱切下时，尽量用较锋利的双面刀片把花柱基部切平滑，有 利于花粉管长出花柱。在体外培养大约2 3h ，肉眼可见从花柱基部的切口处有 花粉管长出。 1 3 3 花粉管爆破 将长出花粉管的花柱置于含有一定量爆破液的载玻片上，放于l e i c ad m i r b 倒置显微镜上观察。可见粗细均匀的花粉管内有很活跃的胞质环流，5 1 0 m i n 后一些花粉管爆破，一对精细胞与相连的营养核从花粉管破裂处喷出。喷 出的精细胞随着花粉管内含物移动一段时间后会沉在载玻片的底部。一对相连 的精细胞在爆破液中少量的酶液作用下分开。 在花粉管爆破后，每毫升爆破液中加入1 l1m g m l 的f d a 染色液，染色 3 5m i n 后在荧光显微镜下观察精细胞的荧光并照相。 第三章蓝猪耳卵细胞、合了的分离 1 3 4 精细胞群体的收集 沉在载玻片的底部的成对精细胞经过酶液处理，就可用l e i c ad c 一1 8 0 显微 操作仪将两个精细胞分别挑选成与营养核相连s v n 群体和不与营养核相连的 s u a 两个群体。将两个精细胞群体分别收集，放入离心管中，置于液氮中保存， 为进一步的分子生物学研究做好准备。 1 3 5 花药压片观察花粉的发育 取不同发育时期的花药置于玻片上，滴一滴1 5 蔗糖溶液，用解剖针将花 药内含物挤出，盖上盖玻片，置于显微镜下观察花粉的发育时期并拍照。 1 3 6 精细胞大小的测量 利用显微操作仪吸取一对或几对精细胞，转移至一滴精细胞保存液中( 5 甘露醇，3 m m o l lm e s ) ，盖上盖玻片后，在显微镜( l e i e ad m r 一6 0 ) 下利用测微 尺测量其直径的大小。 2 结果与分析 2 1 小孢子的发生和雄配子体发育 蓝猪耳的花芽小于4r l l i n 时，整个花芽呈白色，为小孢子母细胞形成时期。 4i n n l 左右，花芽变为淡绿色，为小孢子母细胞减数分裂时期。花芽5m i l l 左右 时，转变成绿色，内部形成了四分体。 d a p i 是一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链d n a 结合而发挥 标记的作用，可以产生荧光，且对活细胞无毒副作用，因此可用于标记细胞的核。 通过对花药间以及不同药室间小孢子发育的观察发现，同一药室中的小孢子母细 胞减数分裂基本能同步，但有时也有不同步的现象。不同花药和不同药室中减数 分裂表现为明显不同步。蓝猪耳的小孢子母细胞第一次减数分裂后不形成细胞壁 ( 图1 ) ，在减数分裂i i 完成后同时合成细胞壁形成四分体，d a p i 染色后可以明显 看n d , 孢子母细胞内被拉向两极的两个核，有个别小孢子母细胞还没有分裂，只 有一个核( 图1 ，2 ) 。接着被拉向两极的两个核同时进行第二次分裂，形成四个 核，然后形成四分体( 图5 ) 。四分体的4 个小孢子被共同的胼胝质包被，各个小 孢子之间也有胼胝质分割，d a p i 染色可看到四分体细胞中明亮的核，同时看到 核外也有少量的荧光( 图6 ) 。因此，蓝猪耳的小孢子母细胞减数分裂类型为同时 型，四分体大多数是四面体型，也有少数为左右对称型( 图3 ，4 ) 。 2 7 第三章蓝猪耳卵细胞、合子的分离 随着胼胝质的逐渐溶解，小孢子从四分体中释放出来，刚从四分体释放出来 的小孢子体积较小，细胞壁较薄，细胞质浓厚，细胞核位于中央，液泡不明显， 且含有很多的淀粉粒( 图7 ，9 ) 。f d a 染色发现，刚从四分体释放出来的小孢子 内部类似淀粉粒的物质呈现出特别明亮的绿色荧光( 图8 ) ；而当小孢子变成圆形 后，整个小孢子内部呈比较均匀的绿色荧光( 图1 0 ) ，表明小孢子有良好的生活 力。随后小孢子进一步发育出明显的花粉壁( 图1 1 ) 。随着小孢子的发育，小孢 子的细胞质发生液泡化，逐渐形成许多小液泡( 图1 2 ) 。小孢子晚期时，由小液 泡融合形成的大液泡将细胞质和核推向细胞边缘形成明显的极性( 图1 3 ) 。随后 小孢子进行一次不等有丝分裂，产生一个体积较大的营养细胞和一个体积较小的 生殖细胞，随着雄配子体的发育，液泡逐渐减小，最后生殖细胞发育成长纺锤体 形被包裹在营养细胞中。 蓝猪耳是二细胞型花粉，生殖细胞在花粉管中分裂形成精细胞。因此可用 d a p i 染色确定花粉管中的精细胞，一般情况下花柱在体外培养2 3h 长出的花粉 管中，生殖细胞均已分裂形成了两个精细胞，d a p i 染色后可清晰看到花粉管中 一大一小的两个精细胞( 图1 4 ，1 5 ) 。在花粉管中两个精细胞呈现细长，表现出 适应花粉管内狭小空间的特征( 图1 4 ) 。两个精细胞从花粉管释放出的一瞬间， 是从一种细长、折叠的形态，很快张开、变大，成为直线排列的两个椭圆形精细 胞。从花粉管释放的内含物中常难以看到营养核，只可见一对精细胞( 图1 6 ) 。 但d a p i 染色仍可见营养核发出的荧光，并且由于精细胞的细胞质稀少，细胞核 占据精细胞的绝大部分空间，所以精细胞内大部分区域都发出明亮的蓝色荧光 ( 图1 7 ) 。 2 2 花粉管的半离体培养 经人工授粉，一些花粉粒在柱头上萌发，长出的花粉管穿过柱头进入花柱。 由于蓝猪耳的花粉和柱头不是同时成熟，两片柱头在开花后第2 天才完全张开， 因此，选择柱头完全打开的花以及用新鲜成熟的花粉进行授粉是半离体培养花粉 管的关键所在。开花后第1 天，两片柱头略微张开，即使用新鲜成熟的花粉授粉， 往往也不会长出花粉管。一般选择花药刚刚开裂的新鲜花粉给开花后第2 天的柱 头授粉效果最好。蓝猪耳的花柱长约1 5 1 8c m 。柱头被授粉后在体内保持5h 左 右，然后从花柱基部切下，插入渗透压及钙和硼含量适宜的培养基中，培养2 3h ， 第三章蓝猪耳卵细胞、合了的分离 许多均匀且较直的花粉管从花柱切口处长出( 图1 8 ) 。在实验中，授粉后切下花 柱时间过早或过晚都会影响花粉管的生长。授粉后花柱在体内生长时间少于4h 就进行离体培养，很少有花粉管长出，即使有数量也很少，状态也很差，在显微 镜下观察胞质环流很缓慢，花粉管的直径不均匀且顶端膨大( 图1 9 ) 。授粉后3h 就切下花柱进行离体培养，即使培养时间超过1 2h 也没有花粉管长出。而授粉 后花柱在体内生长超过7h 再进行离体培养，也很少有花粉管长出。 半离体培养花柱的培养基渗透压因植物种类而异。在蓝猪耳花柱半离体培养 中，在1 0 1 5 蔗糖的培养基中，没有花粉管长出。在3 8 蔗糖的培养基中， 以5 蔗糖培养效果最好，长出的花粉管数量多，不仅直且粗细均匀，而且在显 微镜下可清晰看到花粉管内的胞质环流( 图2 1 ) 。通过f d a 染色发现花粉管呈现 明亮的绿色荧光，表明其生活力很强( 图2 2 ) 。由于花粉管生长状态好，爆破出 的花粉管细胞质随着爆破瞬间的冲力而散开，释放出的一对精细胞表面干净( 图 2 3 ) 。此时，可以将成对差异明显的精细胞分别收集成两个群体( 图2 4 ) 。 在合适的渗透压条件下，花柱在体外培养2 3h 后长出的花粉管的爆破数量 较多，且花粉管内含物是以较快的速度从顶端喷出；而在体外培养超过8h 的花 粉管，虽然长得粗细也很均匀，但一般这些花粉管项端开始弯曲生长，并缠绕在 一起，胞质环流也很缓慢( 图2 0 ) 。置于爆破液中很少有花粉管爆破，即使爆破 释放出的花粉管细胞质也很浓厚，像挤牙膏一样缓慢地被挤出花粉管，精细胞包 裹在浓厚的花粉管细胞质中，很难区分。 2 3 精细胞的分离 花柱在适宜的培养基中培养2 3h 后，长出大量生活状态较好的花粉管。当 把这种花柱置于爆破液中1 0 1 5m i n 后许多花粉管都可爆破，而且花粉管内含物 以很快的速度喷出，并很快扩散，一对精细胞和营养核很容易区分。爆破后的花 粉管顶端由圆形变尖。刚从花粉管爆破出的精细胞是长条形，但很快变成椭圆形 ( 图2 5 ) ，随着被释放时间的延长，营养核逐渐胀大、破裂，最后完全消失，而 两个精细胞则变成两个清晰的球状体( 图2 7 ) 。刚释放出的一对精细胞常与营养 核相连，保持着完整的雄性生殖单位结构( 图2 3 ，3 1 ) 。通常大的精细胞与营养 核相连( s v n ) ，小的只与大精细胞相连( s u a ) ( 图2 3 ，3 1 ) 。有时可看n d , 精细 胞产生的无核细胞质体( e c b ) ，通过排除部分细胞质减小其体积( 图2 9 ) 。f d a 2 9 第三章蓝猪耳卵细胞、合了的分离 染色显示细胞质体无荧光产生( 图3 0 ) 。大多数成对的精细胞都显示出明显的体 积差异，大的精细胞在体积上比小的精细胞大很多( 图3 7 ) ，但也有少数释放出 的两个精细胞很难从外形上区分其大小( 图3 6 ) 。还有极个别花粉管爆破出的不 是两个精细胞，从外形看好像是一个大的精细胞和两个小的精细胞( 图3 5 ) ，可 能是生殖细胞有丝分裂过程中出现了异常而导致了这种状况的发生。 f d a 是一种不产生荧光的非极性物质，很容易透过细胞膜进入细胞质，然后 在细胞内酯酶的作用下去酯化产生具绿色荧光的荧光素。由于荧光素是极性物 质，很难透过细胞膜扩散出细胞。细胞内绿色荧光的强弱和有无取决于细胞内酯 酶活性的高低和细胞膜完整性的程度，从而可以反映细胞的生活力的强弱。我们 对蓝猪耳精细胞进行f d a 染色检测，结果显示，刚从花粉管释放出的椭圆形精细 胞，呈现明亮的绿色荧光( 图2 5 ，2 6 ) ，表明精细胞生活力很强；在释放后一段 时间变为圆形的精细胞，大多数也呈现比较明亮的绿色荧光，但比刚释放出的精 细胞弱了一些，表明随着被释放时间的延长精细胞的生活力有所下降( 图2 7 ，2 8 ) 。 精细胞的f d a 荧光衰退的很快，一开始荧光很强，但几十秒钟后基本上就观察不 到了。在本实验中还发现，爆破出的两个精细胞的生活力是有所差异的，有些成 对的精细胞中，经f d a 染色发现和营养核相连精细胞( s v n ) 的荧光明显弱于另 一个精细胞( s u a ) ( 图3 1 3 4 ) ，这可能和两个精细胞中的质体和线粒体含量不 同有关。 2 4 精细胞群体的收集 一对精细胞从花粉管释放后的一段时间内，虽然看不到两个精细胞有任何花 粉管细胞质包裹，但在用显微操作仪挑选精细胞时两个精细胞往往一起移动，说 明两个精细胞之间还是有一些联系，并且这种联系在体外可能持续3 0r a i n 后，两 个精细胞才会分开，此时精细胞的生活力已经明显下降。这对于用显微操作仪将 大量成对的精细胞挑选成大、小两个具有生活力的群体是不利的。因此，我们采 用在花粉管爆破5m i n 后，成对的精细胞都沉淀到爆破液的底部时，加入极少量 的酶液，精细胞之间的联系很快消失，这样就可进行两个群体的收集。根据一对 精细胞体积大、小的差异，挑选出s v n 和s u a 两个群体。 挑选的两个精细胞群体可作为分子生物学研究的材料，为了获得较为纯净的 精细胞，我们将第一次从爆破液中吸取的精细胞在新鲜的精细胞保存液( 爆破液 第三章蓝猪耳卵细胞、合了的分离 加入一定量的牛血清白蛋白) 中洗涤一次，用微量移液枪迅速转移到离心管中即 可储藏到液氮中备用。有时从一个花柱长出的花粉管经爆破可在3 0m i n 内挑选 出上百个精细胞。也可同时放2 3 根花柱一起爆破，这样就可一次得到更多的精 细胞。酶液加入时间不宜太早，否则可能使正在移动的一对精细胞在移动中分开， 有可能与其他精细胞混合而难以区分。 2 5 精细胞的二型性 从花粉管爆破出的一对精细胞在体积上大都具有明显差异。由于精细胞很快 变成圆形