（作物遗传育种专业论文）荧光原位杂交技术在大白菜染色体基因定位中的应用研究.pdf

摘要 大白菜不仅是起源于中国的重要的蔬菜作物，而且是多国芸薹属基因组计 划的主要研究对象之一。基因定位是基因鉴定、克隆和利用的基础和前提。在 分子细胞遗传学研究领域，利用非整倍体材料和荧光原位杂交技术手段进行基 因的物理定位，日益成为基因定位研究的热点，这对物理图谱的绘制、建立遗 传连锁群和特定染色体的对应关系以及遗传图谱和物理图谱的整合具有重要的 意义。本研究以大白菜二倍体和本课题组创制的一套大白菜初级三体为材料， 采用染色体核型分析的方法对继代繁殖多代的不同三体和二倍体的遗传稳定性 进行了细胞学鉴定，采用f i s h 技术对两个r d n a 重复序列基因和通过p c r 扩 增、克隆获得的几个功能基因片段进行了物理定位。主要研究结果如下： 1 通过对f i s h 的相关技术参数的研究，建立了大白菜染色体制备和制片 预处理、探针杂交、杂交后洗脱以及信号检测的技术体系。以重复序列4 5 sr d n a 为探针，利用该体系在大白菜中期和问期染色体上成功检出了1 0 个荧光强度强 弱不同的杂交信号，为荧光原位杂交技术在大白菜上的利用奠定了基础。以幼 嫩子叶为材料，采用低温刀切的方法，改进了f i b e 卜f i s h 技术过程中细胞核的 提取方法，成功的制备出了平滑伸展的d n a 纤维，大白菜基因组探针在d n a 纤维上杂交，杂交信号为非连续的念珠状长链。 2 核型分析表明，大白菜染色体核型公式为2 n = 2 x = 2 0 = 1 0 m + 8 s m + 2 s t ( s ， 核型类型为2 b 。1 号、2 号、4 号、5 号、7 号为中部着丝点染色体；3 号、6 号、 8 号、9 号染色体为近中部者丝点染色体；1 0 号染色体为近端部着丝点染色体。 d a p i 显带结果表明深染区多集中在着丝粒两侧附近，同源染色体的带纹数目、 分布位置基本一致。 3 通过对大白菜组培苗根尖细胞有丝分裂染色体数目观察，发现长期继代 保存的一些材料存在着染色体数目的变异；但对不同三体进行核型分析可知， 染色体数目未变异的三体株系仍为最初确定的三体，没有发生染色体的置换。 4 拟南芥2 5 sr d n a 在二倍体大白菜中期染色体上的f i s h 定位表明存在 着5 个2 5 sr d n a 的同源区段，它们分别位于1 号、2 号、3 号、4 号和1 0 号五 对染色体上。杂交信号在不同染色体上的荧光强度不同。利用d n af i b e r - f i s h 技术确定了2 5 s r d n a 在大白菜基因组中的拷贝数约为5 6 6 1 3 7 。但2 5 s r d n a 在大白菜不同初级三体上检出的杂交信号的个数在7 1 2 个之间变化，分布于4 7 个同源区段上。综合分析可以看出，在不同三体的1 4 号染色体的长臂及1 0 号染色体的随体( 包括次缢痕处) 上均存在相应的2 5 sr d n a 的同源区段，但杂 交信号在不同三体同一染色体上检出的频率不同，荧光信号强度也有变化，最 强的信号出现在不同三体的# 1 0 随体染色体上( t r i p l 0 4 ，t r i p l 0 5 除外) 。 5 5 sr d n a 在二倍体大白菜检出了6 个杂交信号，分别位于2 号染色体的 长臂、9 号和1 0 号染色体的短臂三对同源染色体上；在t r i p l 0 2 、t r i p l 0 3 和t r i p l 0 9 三个三体上分别检出了7 个、6 个和7 个杂交信号，这些信号所属的染色体和在 染色体上分布的位置与二倍体相同。利用d n a f i b e r - f i s h 技术确定了5 sr d n a 在大白菜基因组中的拷贝数约为6 7 9 。 6 利用2 5 s 和5 sr d n a 为探针，可以准确识别大白菜1 号、2 号、3 号、 4 号、9 号和1 0 号染色体。 7 通过p c r 扩增、克隆获得了1 4 个大白菜功能基因同源片段，根据其片 段长度分别命名为e p s p l 4 0 9 、r g a 9 4 4 、s l g 7 7 3 、b c c l h 9 0 4 、r p s 2 6 7 l 、s a l m 7 4 2 、 v d a c 9 9 4 、c y p 9 5 4 、b c n c e d l 4 5 3 、b c g r 8 0 3 、m e 7 2 5 、s i l l 4 4 5 、b i d 7 3 3 、f l c 9 0 9 ； 序列比对结果表明所获的这些基因同源片段的核苷酸序列与供选基因的核苷酸 序列高度同源( b c g r 8 0 3 除外) ，范围在8 9 9 9 。e p s p l 4 0 9 、r g a 9 4 4 、r p s 2 6 7 1 和c y p 9 5 4 四个探针各在二倍体大白菜一对染色体上检出了f 1 s h 杂交信号，分 别位于3 s 中部、3 l 中部、2 l 末端以及1 l 中部，尽管四个探针信号检出率都 较低，平均为6 4 8 ，但低拷贝基因在大白菜染色体上的定位尚属首次，为大 白菜单低拷贝功能基因的定位和与其它物种的比较研究奠定了基础。 关键词：大白菜：荧光原位杂交；初级三体；f i b e r f i s h ；r d n a 基因；基因克隆 a p h 毛a t i o ns t u d i e so ff l u o r e s c e n c e 伽s f m 协6 r 以拓口“d ，l - i e c h n i q u ei ng e n e s l o s a 2 a t i o no nl b ec h r o m o s o m e so fc h i n e s ec a b b a g e r 口对f c 口开妒韶f r 妇l s s p p 彦艇牲e 以工括o l s s o n ，s y n 且“驴nl s s p p e 七讯e n 5 如) a m h o r ：x u a ns h u x i n m a j o r ： c r o pg e n e t i c s 柚db r e e d i n g s u p e i s o r ：p r o f s h e ns h u x i n g ( c o l l e g eo f a g r o n o m y ，a 鲈i c u l t u r a lu n i v e r s i t yo fh e b e i ，b a o d i n g ，0 7 1 0 0 1 ，c h i n a ) a b s t r a c t c h i n e s ec a b b a g ei sn o to n l ya ni m p o r t a n tv e g e t a b l ec r 叩o r i g j n e df r o mc h i n a b u ta l s oo n eo ft l l em o s ti m p o n a tr e s e a r c h f u lo b j e c t so fm u l t i n a t i o n a lb r a s s i c a g e n o m ep r o j e c t g e n e1 0 c a l i z a t i o ni st h eb a s i sf o rj d e n t i f y i n g ，c l o n i n ga n du t i l i z i n g c h i n e s ec a b b a g cg e n e s 1 nt h ef i e l do fm o l e c i l l a fc y t o g e n e t i c s ，g e n ep h y s i c a l o r i e n t a t i 咖w j t hn o n e u p l o i d 柚dn u o f c s c e c e 加“m 毋6 ，妇f 如一 t e c h n i q u ej s i n c f e a s i n 醴yb e c o m i n gt h eh o t s p o to fg e n el o c a l i z a t i o nr e s e a r c h ，w h i c hi sv e r y i m p o n a n tt ot h ec h r o m o s o m a lp h y s i c a lm a p p i n g ，a s s o c i a t j n gt h eg e n e t i cl j n k a g e g r o u p sw i t ht h es p e c i f i cc h r o m o s o m e s ，a n dc o m b i n i n gg e n e t i cm 印w i t hp h y s i c a l m a p w i t ht h cd i p l o i da n das e to fp r i m a r yt r i s o m i c ss e l f 二e s t a b l i s h e da sm a t e r i a l s ，i n t h i s r e s e a r c h ，c y t o l o g i c a li d e n t i f i c a t i o no fg e n e t i cs t a b i l i t yo ft h ed i p l o i da n d d i f f e r e n tt r i s o m i c sv i aa s c x u a lm u l t i g c n e r a t i o nw a sm a d ew i t hc h r o m o s o m a l k a f y o t y p e髓a l y s i s ， 栅or d n ar e p e a t s e q u e n c ea n ds e v e r a lf u n c t i o n a lg e n e 舶g m e n t s0 b t a i n e db yp c r 锄dd 曲j n gw e r ep h y s j c a l l yi o c a l j z e d t h es p e c j f i c c l l r o m o s o m c so fc h i n e s ec a b b a g ew i t hf i s ht e c h n i q u e t h es t u d yf e s u l t sw e r ea s f 0 1 l o w s ： 。 1 、i t ht h es t u d y0 fc o r r e l a t i v ep a r a m e t e r sd u r i n gf i s h ，t h et e c h n i q u es y s t e m o nc h i n e s ec a b b a g ew a sf o u n d ，i n c l u d i n gc b m m o s o m ep r e p a r a t i o n ，c h r o m o s o m e p f e t r e a t l n e n t ，p r o b eh 州d i z a t i o n ，w a s h i n g 蛆ds i g i l a l8 u n r e y i n g u t i l i z i n gt h en e w s y s t e m ， 1 0s i g n a l s ，w h i c hh a dd i f f c f e tn u o r e s c e n c ei n t c n s i t y w a so b s e r v e d s u c c e s s f i l l l yo nm e t a p h a s e吼di n t e l p h a s e c h m m o s o m e so fc h i n e s ec a b b a g e r e s p e c t i v e l y ，w h i c hh e l pt ot h eu t i 王i z a t i o no ff l s h0 nc h i n e s ec a b b a g e n em e t h o d o fo b t a i n i n gn u d e id u r i n gf i b e f - f i s hw a si m p r 0 v e db yc h o p p i n gt h ef r e s hy o u n g t y l e d o nw i t has h a r ps t c r i l es c a l p e l ，锄dt h es m o o t hd n a f i b e r sw e r ed r a g g e da n d e x t c n d e dw i t had e a nc o v e r s l i p t h eb y b f i d i z a t i o s i g n a l sw e r ci b c o n s e c u t i v cl o n g c h a i nl i k ep r a y e r b e a d s1 ) l r i t hc h i n e s ec a b b a g eg e n o m ed n aa sap r o b e r 2 t h ek a r y o t y p ef o f m u l ao fc | 1 i n c s ec a b b a g ec h r o m o s o m e s2 n = 2 x = 2 0 = 1 0 m + 8 s m + 2 s t ( s ：d ，a 1 1 dt h ek a r y o t y p et y p ei s2 b c h r o m o s o m e1 ，2 ，3 ，4 ，5a n d7a r e a l l c e n t r a lc e n t m m e r ec h r o 舶o s o m c s ，t h ec e n t r o m e r eo fc h r o m o s o m e3 ，6 ，8a n d9l i et h e a p p r o x i m a t ec e n t r a lc e n t r o m c r ec h r o m o s o m e s ，a n dt h ec e n t r o m e r eo fc h r o m o s o m e 1 0i i e sn e a rt h ec h r o m o s o m ee n d i ng e n e r a l ，t h eb r i g h tr e 舀o ns l a i n c o b yd 心l c o n t a i n sr j c h e rh e t e m c h r o m a t i n ，w h i c hm o s t l vc o n c e n t r a t eo nt h et w a j ns i d e 最缸t n e c e n t f o m e r e t l l en u m b e ra n dt h ep o s i t i o no fd a p ib a n da r eb a s i c a l l yc o s i 羲m b e t w e e nt h et w oh o m o l o g o u sc h r o m o s o m e s 3 t h en u m b e rv a r i a t i o no fc h f o m o s o m ew a s0 b s e e di ns o m ec e i l so fc h i n e s e c a b b a g er 0 0 tc o n s e r v e dm u l t i g e n e r a t i o nr e c u rt ot i s s u ec u l t u r e b u tc h ek a r y o t y p e a n a l y s i s0 fd 主】弛r e n tt r i s o m i c si n d i c a t e dt h a tc h r o m o s o m er e p l a c e m e n td i dn o tt a k e p l a c ea m o n g1 0t r i s 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7 ，6a n d7f i s hs i g n a l sw e r ea l s o o b s e n r e di nt r i p l 0 2 ，t 邱1 0 3 柚d 岫p 1 0 9r e s p e c t i v e l y f u n h e r m o r c ，t h 9 吐m m o s o m e s a 1 1 dt h ep o s i t i o nt h a tt h e s es i 驴a l sw e r el o c a l i z e do nw e r et h es a m ea so nt h ed i p l o i d n en u m b e ro f5 sr d n ac o p i e si nc h i e s ec a b b a g eg e n o m ew a sc o n f i r n l e da s6 7 9 w i t hd n af i b e 卜f i s ht e c h n i q u e 6 f i s h0 m e t a p h a s ec o m p l 锄t s ，u s i n gt h e2 5 sa i l d5 sr d n a ，p r o d u c e d g o o dd i a g n o s t i cm a r k e r sf o ri d e n t i f y i n gc h f o m o s o m e1 4 ，9a n d 1 0 7 1 4f u n c t i o n a lg e n ef f a 胂c n t sw e r eo b t a i n e du s j n gp c ra n dg e n ec l o n i g ， w h i c hw e r en a m e de p s p l 4 凹、r g a 9 “、s l g 7 7 3 、b c c l h 9 0 4 、r p s 2 6 7 1 、s a l m 7 4 2 、 v d a c 9 9 4 、c y p 9 5 4 、b c n c e d l 4 5 3 、b c g r s 0 3 、m e 7 2 5 、s i l l 4 4 5 、b l d 7 3 3 、f l c 9 0 9 r e s p e c t i v e l ya 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st 1 1 e f i r s to ff i s h1 0 c a l i z a t i o no nt h ec h r o m o s o m e so fc h i n e s ec a b b a g eu s i n gl o wc o p i e s g e n ea st h ep r o b e r ，w h i c hw o u l de s t a b l i s ht h eb a s i sf o rt h e1 0 c a l i z a t i o no ff u n c t i o n a l g e n ew i t hs i 西ec o p ya n dl o wc o p i e si nc h i n e s ec a b b a g ea n dt h es t u d j e sc o m p a n g w i t h0 t h e rs o c c i e s k e yw o r d s ：c h i n e s ec a b b a g e ；f 1 u o r c s c e n c em “抛h y b r j d i z a t i o n ；p r j m a r yt r j s o m i c ； f i b e r - f i s h ；r d n ag e e s ；g c n ec l o n i n g a m p i p t g p c r x g a l c 瑚 b l a s t b a c b c i p b p b s a c m e d i a d a p i f i t c f i s h g i s h n b t p b s p i s s d n a m # 1 群1 0 t r i p l 0 1 1 0 缩略词表 a m p i c i l l i n i s o p r o p y l t h i o b - d g a l a c t o s i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 5 一b r o m o - 4 一c h l o r o - 3 一i n d o l y l - b - d g a l a c t o s i d e c e t y l t r i m e t h y l a m m o l l o n i u mb r o m i d e b a s i cl 0 c a l 舢i g n m e n ts e a r c ht o o l b a c t e r i a la i t i f i c i a lc h r o m o s o m e 5 一b r 锄】撕l o 静3 如由l y p 蛔6 p h a t e删d i l l e 翻1 t b a s ep a i r s b o v i n es e r u ma l b u m i n c e n t i m o f g a n d i s o d i u me t h y l e n e d i 锄i n et e t r a a c e t a t e 4 6 一d i a m i d i n 0 2 - p h e n y l i n d o l e f l u o r e s c e i ni s o t h i o c v a n a t e r u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n g e n o m i ci ns i t uh y b r i d i z a t i o n n i t r o b l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e p h o s p h a t e - b u 蠡f e r e ds a l i n e p r o p i d i u mi o d i d e s a l m o ns p 锄d n a f o 咖a m i d e 氨苄青霉素 异丙基硫代b d 半乳糖苷 聚合酶链式反应 5 溴4 氯3 吲哚b d 半乳 糖苷 十六烷基三甲基溴化胺 基本局域联配搜索工具 细菌人工染色体 5 溴4 氯3 吲哚磷酸盐 碱基对 小牛血清白蛋白 厘摩 乙二胺四乙酸二钠 4 ，6 二氨基2 苯基吲哚 异硫氰酸荧光素 荧光原位杂交 基因组原位杂交 氮蓝亚唑 磷酸盐缓冲液 碘化丙啶 鲑鱼精子d n a 去离子甲酰胺 1 1 0 号染色体 1 1 0 号三体 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭塞些盘鲎或其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：夺f 箍k签字日期：p 彳年f 月叫日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解氲垫盛些盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权塑韭壅些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) l 学位论文作者签名：寺争酶砭导师签名：膨d 乡 签字日期：6 年6 月工 日签字日期：协“年月“日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 荧光原位杂交技术在大白菜染色体基因定位中的应用研究 引言 1 芸薹属作物分子标记和基因组研究进展 芸薹属但阳船把口) 属于十字花科，其中许多植物是重要的蔬菜、饲料、油料、 工业用原料作物和调味品i ”，同时世界四大油料作物( 大豆、向日葵、油菜、花 生) 之一的油菜也属于芸薹属。芸薹属作物的基因组大小为4 0 0 6 0 0 m b ，大约 为双子叶模式植物拟南芥的3 倍，约有8 0 9 0 的外显子序列和7 0 的内含子 序列与拟南芥是保守的忙j 。因此对芸薹属基因组序列与己完成的拟南芥基因组序 列的比较有助子对拟南芥缺乏注解基因的高度序列保守区进行鉴别。目前，对 芸薹属植物各方面的研究很多，不同物种分子遗传连锁图谱的构建、比较作图 研究、以及重要农艺性状的分子标记等方面取得了重大进展，芸薹属植物的起 源、演化研究也有了新的突破。 1 1 芸薹属作物分子遗传图谱的构建 通过遗传重组所得到的基因线性排列图称为遗传图或连锁图。遗传图谱 ( g e n e t i cm a p ) 构建的基础是染色体的交换和重组，它是通过计算连锁的遗传 标志之间的重组频率确定标记间相对距离的，其单位为里摩( c e n t i m o r g a n ，c m ) 。 构建一个高密度和高分辨率的分子遗传图谱，对于数量性状的定位( q t b ) 、分 子标记辅助选择育种( m a r k e r a s s i s t 柚ts e l e c t j 加，m a s ) 、功能基因克隆及基因 组比较研究等具有重要的意义。 芸墓属作物具有广泛的形态变异，三套染色体组分布于六个种中。建立遗传 图谱将有助于理解芸薹属染色体的起源与进化关系，有利于进步应用于遗传 育种实践中1 3 1 。1 9 9 0 年，s l o c t l m 等1 4 】首次利用r f l p 标记构建了甘蓝( 且。胁口c ) 的第一张分子遗传图谱，图中含2 5 8 个标记数目，覆盖基因组长度的8 2 0 c m 。 甘蓝中包含标记种类最多的一张遗传图谱是由c h e u n g 等【习1 9 9 7 年构建的，该图 覆盖基因组长度为1 6 0 6 c m ，包括2 7 0 个r f l p s 标记、3 1 个r a p d s 标记、1 个 s t s 标记、1 个s o 讯标记和4 个同工酶标记。至今，芸墓属6 个种中，已有包 括芸薹( 丑m p 口) 睁1 、甘蓝【1 2 。14 1 、黑芥( a 甩i g 阳) 【15 1 、芥菜( 且加捍c 日口) 【1 6 1 引、 甘蓝型油菜僻露印“s ) l 捞m 】等5 个种的近4 0 多份分子图谱发表，其中，c h e u n g 等1 2 2 】1 9 9 7 年用芥菜的双单倍体群体构建的r f 标记连锁图，含有标记数目3 8 4 个，覆盖基因组长度的2 0 7 3 c m ，是芸薹属已构建的连锁图谱中所含标记数目最 多的一个。 河北农业大学博士学位( 毕业) 论文 纵观芸薹属分子连锁群，所用标记中，r f l p 标记偏多，而且大多是利用亚 种间及品种间f 2 群体构建的，但是af i _ t 和s s r 标记及构建遗传分离偏态小的 d h 和r i l s 等永久性群体已日益获得重视。n o v a l 【0 v ae ta l 【”j 、k o l ee ta l l “j 、于 拴仓等【2 5 】已经报道过利用永久性作图群体r i l s 构建的遗传图谱，且a f l p 标记 多态性水平高、检测位点数量大等高效性优点在芸薹属的遗传多样性研究和遗 传连锁图谱的构建中逐渐被证实【弘1 0 巧2 9 j 。 1 2 芸薹属作物利用分子标记进行的基因定位研究 植物遗传图谱的功能之一是鉴定与重要性状紧密连锁的遗传标记，发现新的 质量或数量性状位点或相关基因。分子标记连锁图是进行基因定位、基因克隆 和辅助选择育种的技术平台，在遗传学理论、功能基因组学以及遗传育种等领 域已显示出了十分重要的作用。在构建图谱的基础上，芸薹属作物重要性状的 分子标记研究取得了很大进展。 1 9 9 2 年，h n d r ve ta 1 率先开展了芸薹属甘蓝根肿病抗性基因的定位分析【3 0 】， 之后其它芸薹属作物的基因定位研究相继开展。在质量性状方面，对脂肪酸含 量基因f 3 1 。2 】、根肿病【3 3 _ 3 5 l 和黑胫病抗性基因【3 6 3 7 1 、o g u c m s 的不育性基因、自 交亲和性基因【3 8 l 和矮杆基因1 3 9 】等进行了研究，并找到了一些相应的分子标记。 在数量性状方面，通过q 点分析，数量遗传研究也取得了突破性进展。在芸薹 属作物上，主要从形态特性【1o 柏。4 1 】、开花控制【4 2 1 、春化要求【4 3 l 、耐热性1 2 5 4 4 l 以及品质等方面进行了q 1 1 鼻定位。这些重要性状的分子标记为芸薹属作物育种 提供了有力的帮助。 1 3 芸薹属作物的比较基因组研究 比较基因组学是基于基因组图谱和测序，对已知的基因和基因组结构进行比 较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。在相近物种间进行基因 共线性的比较是证实基因组进化的有力工具，遗传图谱的比较有助于分析基因 组遗传片段的重排、重复、缺失、插入和移位【靠舶】。在建立饱和图谱基础上， 比较芸薹属不同种、亚种间染色体的同源性，可以确定各染色体的起源和进化。 大量研究表明，芸薹属不仅三个二倍体基本种间存在着部分同源性，而且与 三个复合种间也存在着保守区段，具有部分同源性。t c u t o n i c o 等【4 7 j 比较了芸薹 和甘蓝的分子连锁图谱，发现了被保留的连锁重排的许多区域，结果表明芸薹 的9 个连锁群与甘蓝型油菜连锁图谱存在保守连锁区域，同时比较了芸薹和甘 蓝的a 和c 染色体组，也发现了部分相同的连锁区域，再次证明了三个染色体 组的保守性【4 8 j 。m c g r a t h 等【4 9 】也发现了两者在碱基序列和基因拷贝数的相似性。 h g e r c r a n t z 和l y d i a t e t 在对三个基本种的研究中发现，三个不同的染色体组具 2 荧光原位杂交技术在大白菜染色体基因定位中的应用研究 有明显不同的染色体重排，但不同片段之间又具有非常明显的共线性关系，且 三个物种的基因含量极为保守，其中，芸薹和甘蓝的基因组同源性程度较高， 而黑芥与它们的同源性程度低1 5 0 j 。芸薹的a 染色体组与甘蓝型油菜的a 染色体 组比较研究揭示了两者含有至少4 个共同位点的1 1 个保守连锁片段f 5 1 】。a n i a n 等【5 2 】对甘蓝型油菜和芥菜的比较发现，有1 0 个连锁群同源。c h e u n g 等【5 】的研究 结果揭示了甘蓝是甘蓝型油菜c 基因组的供体。基于芥菜品种与人工合成的芥 菜( 芸墓黑芥) 杂交产生的f 2 群体和两个芥菜品种杂交产生的分离群体建立的 两个r n j 连锁图比较分析表明，两个图谱高度线性保守，不但b 染色体组同 源，芸薹与黑芥的a 染色体组也高度同源l ”】。 模式植物拟南芥似阳6 l 如雎括m 4 露积口) 与芸薹属植物同属十字花科，因此拟 南芥与芸薹属基因组的比较研究令人关注。r o b e n i “】报道，芸薹属a 、b 、c 三 个基因组的大小分别表现为是拟南芥基因组3 倍的复合体，复合体的每一个组 成部分不仅在基因组大小上和拟南芥相似，且r f l p 分子标记的排列也相当接 近。k o w a l s k 等【5 5 】研究表明拟南芥和甘蓝基因组之间存在着1 1 个保守区域，分 别覆盖了拟南芥和甘蓝基因组的2 4 6 和2 9 9 。s a d o w s k 等1 5 6 j 研究了拟南芥 第三条染色体上的5 个基因家族( 彳玎4 巧) 在芸薹、黑芥、甘蓝中的分布情况， 发现这三个基因组中都存在一个与拟南芥中排列顺序一致的单一连锁群，同时 也发现在同一连锁群或其它连锁群的一些区域上存在a i 的重复或复合。【删o j s l u k e n s 等【5 7 】在用拟南芥基因组与甘蓝的遗传图谱进行比较时，发现拟南芥3 4 个区段和甘蓝遗传图谱的2 8 具有共线性关系，他认为，甘蓝是从拟南芥分化 后在多倍化过程中发生了重捧的结果。还有资料表明，芸薹和拟南芥分别在控 制开花时间【5 8 删、自交不亲和位点f 眈l 和抗白锈病相关基因1 6 3 】存在共线性区域。 拟南芥与甘蓝型油菜、甘蓝物种的r f i j 图谱o t l 位点也有同源区域1 4 ”。2 0 0 4 年m u a n g p r o m 和o s b o m 定位于芸薹第6 遗传连锁群的末端的矮杆基因d 惭f 2 ， 与拟南芥2 号染色体顶端区域同源，并发现了7 8 4 k b 的拟南芥2 号染色体共线 性片剧3 9 1 。 1 4 芸薹属作物的亲缘关系与进化研究 关于芸薹属植物3 个基本种和3 个复合种的种间亲缘关系可以用禹式三角形 来表示。人们经过研究基本可以确定，荠菜的细胞质来源于芸薹，埃塞俄比亚 。芥的细胞质来源于黑芥，而甘蓝型油菜的细胞质来源比较复杂。宋克明等的研 究表明黑芥与甘蓝、芸薹遵循了不同的演化途径，且黑芥与芸薹属的共同祖先 更为接近【体6 5 】。w a 刑i c k 用c p d n a 探针对芸薹属植物进行了r f l p 分析，结果 将芸薹和甘蓝归为一个进化谱系，并发现黑芥与白芥o 加口p 括口z 妇) 亲缘关系更近 【6 6 1 。 在分子遗传图谱构建的基础上，通过比较不同种、亚种问染色体的同源性， 3 河北农业大学博士学位( 毕业) 论文 可以确定各染色体的起源和进化，甚至同一种上的复制位点也可提供染色体进 化线索。芸薹属基因组在c d n a 水平上有较高比例重复，重复不仅发生在异源 四倍体的不同染色体组之间，也大量发生在同一染色组内。同一染色体组内重 复位点的数目可高达3 0 以上，许多位点都可以观察到2 3 次重复。应用荧光 原位杂交技术比较芸薹和拟南芥的物理图谱，揭示了染色体重复区域在芸薹的 进化中的重要作用| 6 ”。在对甘蓝的研究中还发现在同一染色体组内重复序列主 要有3 种分布方式：随机分布、连锁的基因家族、非同源染色体间的区段重复。 分析芥菜图谱基因组织结构，其中有1 5 的探针涉及群内复制，而3 4 的探针 涉及到连锁群间复制，甘蓝型油菜也如此。分析黑芥图谱发现，至少6 0 的探 针有多于1 个多态性位点，不同连锁群间的复制部分总是同时出现在三个完全 不同的连锁群体上，而且顺序相似 6 8 j