（作物遗传育种专业论文）特异水稻的细胞胚胎学研究及其杂交后代的遗传分析.pdf

附件 论文独刨性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：磁h 才，年7 月尹日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全帮或部分内容。 研究生签名 导师签名 摘要 水稻育种从常规育种到杂交育种方式的转变，大大提高了水稻的产量和质量。但 是杂交种子只能在生产上用一季，必须年年制种，这样浪费了大量的人力和物力。为 了简化杂交育种的过程，广大育种工作者进行了很多的尝试，并取得了很大的进步。 水稻早世代稳定现象是近年来在水稻育种过程中发现的一种特殊现象。由于这种现象 可以在早世代固定基因型，培育成可以多代使用的新型杂交稻，对水稻杂交育种意义 重大。目前，早代稳定育种已在四川农业大学水稻所应用，但对早代稳定机制还很不 清楚，较多基础性工作还需要进行。本文以早稳型水稻4 2 9 、3 8 4 、4 0 7 、4 0 8 、4 0 9 为研究材料，进行了以下几方面的研究：早稳型水稻的减数分裂行为和成熟胚囊的 结构；早稳型水稻与栽培稻杂交的传粉受精过程；早稳型水稻与栽培稻杂交后代 的遗传分析。主要结果如下： 1 对早稳型水稻x 栽培稻杂交的受精过程和胚胎发育过程观察，结果表明：它们 的传粉受精过程与栽培稻相似，虽有单受精现象，但并不影响整体成胚率( 7 5 5 9 ) 。 我们推测，早代稳定现象可能发生在合子休眠时期。合子在休眠时期是一个高度极性 化和代谢活跃的细胞，为以后的分裂积累所需要的物质基础和提供信息，如关闭与台 子有丝分裂有关的基因，而开启减数分裂的基因，因而产生f l 纯合子。 2 早稳型水稻花粉母细胞减数分裂观察表明：减数分裂终变期构型为1 2i i ，中期 联会构型为1 2 i i ，其它时期每个细胞也都正常，末见异常现象。颖花成熟时，用1 1 2 1 ( i 溶液染色，检查花粉育性，育性在9 5 以上，与减数分裂的结果一致。f l 稳定 植株与其它植株不存在任何差别，减数分裂与普通水稻相似。 3 对早稳型水稻成熟胚囊结构观察结果表明：正常蓼型胚囊占9 0 8 ，异型胚囊 占9 3 。在异型胚囊中可观察到多卵、多极核、多群反足细胞等现象。 4 对早稳型水稻白花传粉受精过程观察表明：早稳型水稻形成胚必须通过双受精 完成，为了一步验证早稳型水稻是否有其它生殖性状，进行定位颖花去雄后套袋结实 性检验，结实为零，没有胚自发产生现象。 5 经农艺性状观察和统计结果分析：f 2 有两个群体的生育期、穗长和株高与对照 汕优6 3 相比，差异不显著，i t i 间农艺性状稳定一致。微卫星标记进一步验证f 2 群体 的稳定性，结果表明：这两个群体的每个单株在父母有差异的所有位点上，都表现为 纯合带型，既有和母本一致的带型，也有和父本一致的带型。因此它们是早世代稳定 l 群体。早世代稳定特性在某种条件下可以遗传，且与双亲有关系。 关键词：水稻；早世代稳定；染色体；胚囊；受精；农艺性状；微卫星标记 s i n c er i c eb r e e d i n gc h a n g e df r o mt h ec o n v e n t i o n a lt ot h eh y b r i d ，r i c ep r o d u c t i o na n d q u a l i t yh a v eb e e ng r e a t l yi n c r e a s e d b u th y b r i ds e e d su s e do n l yo n c e ，s e e d sp r o d u c i n g y e a rb yy e a ri st i m e - l a b o u rc o n s u m i n g m o s tb r e e d e r sh a v et a k e ng r e a te f f o r t st oe x p l o r ea w a y t os i m p l i f yt h ep r o c e s so f h y b r i db r e e d i n ga n ds o m ep r o g r e s s e sh a v ea l s ob e e nm a d e s t a b i l i t yi ne a r l yg e n e r a t i o n ( f lo rf 2p r o g e n e ) w a so b s e r v e di nh y b r i d i z a t i o ni n r i c e r e c e n t i y t h ee a r l yg e n o t y p ew e r ef i x e da n dt r u eb r e e d i n gh y b f l de a r lb eu s e dm a n yt i m e s ， s oi t sm e c h a n i s m sa r ei m p o r t a n tt oh y b r i db r e e d i n g a l t h o u g h3 0 0e a r l ys t a b l ev a r i t i e s h a v eb e e ns e l e c t e do u t ，t h em e c h a n i s mo fs t a b i l i z i n gi ne a r l yg e n e r a t i o ni ss t i l lu n c l e a r s o m a n yu n r e s o l v e db a s i cr e s e a r c h e ss h o u l db ei n v e s t i g a t e d i nt h i sr e s e a r c ht h r e er e s u l t s w e r ee x p l o r e db yu s i n ge a r l ys t a b l er i c e s ，4 2 9 ，3 8 4 ，4 0 7 ，4 0 8a n d4 0 9 c h r o m o s o m e b e h a v i o rd u r i n gm e i o s i sa n de m b r y os a cs t r u c t u r eo fe a r l ys t a b l er i c e s e m b r y o d e v e l o p m e n to f p o l l i n a t i o np r o c e s so f e r o s s i n ge a r l ys t a b l er i c ew i t hc u l t i v a r s g e n e t i c a n a l y s i so fp r o g e n i e sf r o mt h ec r o s s i n go fe a r l ys t a b l er i c et oe u l t i v a r s t h em a i nr e s u l t s a r ea sf o l l o w i n g 1 t h ep r o c e s sa st h ep o l l i n a t i o na n de m b r y o3 a cd e v e l o p m e n to f e a r l ys t a b l er i c e c r o s s i n gc u l t i v a r sw e r es a m e 舾c r e s s e sb e t w e e nc o m m o n s s o m es i n g l ef e r t i l i z a t i o n s w e r eo b s e r v e dd u r i n gp o l l i n a t i o n ，b u tt h e yd i dn o ti n f l u e n c et h ep e r c e n t a g eo fe m b r y o s ( 7 5 5 ) a l lt h e s ei n d i c a t e dt h a te a r l ys t a b l em e c h a n i s mm a yb eo c c u r r e di np r o e m b r y o s l e e p i n gt i m e t h ep r o e m b r y ot h a ti sa na c t i v ec e l ld u r i n gs l e e p i n gt i m es u p p l yf o rm a t t e r s a n di n f o r m a t i o nf o rl a t t e rm i t o s i s i tn e e d ss o m eg e n e si n i a t i o n ，s u c ha sc l o s i n gt h em i t o s i s a n do p e n i n gt h em e i o s i s 2 t h ee a r l ys t a b l er i c ep m c sw e r eo b s e r v e da n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ea v e r a g e p a i r i n gf i g u r a t i o nw a s1 2 i la td i a k i n s i sia n d1 2i la tm e t a p h a s ei e v e r yp m c sw a s n o r m a li no t h e rs t a g e st h ep o l l e ns t a i n i n ga b i l i t yw a sc o n d u c t e db yu s i n gl 1 2 - k i t h e p o l l e ns t a i n i n ga b i l i t yw a s9 5 a c c o r d i n gt ot h ep m c gr e s u l t s t h e r ew e r en od i f f e r e n c e b e t w e e ne a r l ys t a b l er i c ef la n do t h e rf l e e si nm e o s i s 3 t h er e s e a r c hf o rt h ee m b r y os a cs t r u c t u r eo fe a r l ys t a b l er i c es h o w e dt h a t9 0 8 e m b r y os a c sw e r en o r m a la n d9 3 w e r en o t a n di nt h el a t t e r , m u l t i e g g s ，m u l t i - p o l a r 3 n u c l e ia n dm u l t i 。a n t i p o d a lc e l l sw e r eo b s e r v e d 4 t h ep r o c e s so fs e l fp o l l i n a t i o na n de m b r y os a cd e v e l o p m e n ti ne a r l ys t a b l er i c e s h o w e dt h a ti t se m b r y od e v e l o p m e n tm u s tb ec o m p l e t e dt h r o u g hd o u b l ef e r t i l i z a t i o n i n o r d e rt ot e s ti ft h e r ew e r eo t h e rp a r e r n so fr e p r o d u t i v et r a i t s ，s e e ds e t t i n gi n v e s t i g a t e db y e x c i s e ds t a n m e n t h es e e ds e t t i n gw a s z e r o ，n oe m b r y of o r m e d 5 t h ea g r o n o m i ct r a i t sw e r ec o n s t r u c t e di nt h ef 2p o p u l a t i o n a sar e s u l t ，t h e r ew a s n o n s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei np l a n th e i g h t ，p a n i c l el e n g t h ，h e a d i n gd a t eb e t w e e nt h ef 2 p o p u l a t i o na n dt h ec ks h a n y o u 6 3 t h es t a b i l i t yp o p u l a t i o nw a sf u r t h e rv e r i f i e dt h r o u g h m i c r o s a t e l l i t em a r k e rt e c h n i q u e t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l li n d i v i d u a l sp l a n t sw e r e h o m o z y g o u sa t a l ll o c ia tw h i c ht h eb a n d ss h o w e dd i f f e r e n tl e n g t hb e t w e e nt h e p 赶e m s , a n de i t h e rs o l l a eb a n d sw e r ei d e n t i c a lt om a l ep a r e n t , o ri d e n t i c a lt of e m a l ep a r e n t a te a c hl o c i i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h ef 2p o p u l a t i o nw a s r e a l l ys t a b l e s oe a r l ys t a b l el a a i t s m a y b ei n h e r i t e di ns o m ec i r c u m s t a n c e s ，b u tr e l a t et oi t sp a r e n t s k e yw o r d s ：r i c e ；s t a b i l i t yi ne a r l yg e n e r a t i o n ；c h r o m o s o m e ；e m b r y os a c ；f e r t i l i z a t i o n ； a g r o n o m i ct r a i t s ；m i c r o s a t e l l i t e 4 文献综述 1 前言 杂种优势是生物界的一种普遍现象，通过利用杂种优势来改良和提高农作物的产量、 品质和抗性等重要的农艺性状已广泛应用于农业生产，并显示出巨大的经济和社会效益。 尤其在水稻生产中，杂交水稻的育成和大面积推广为农民经济收入的增加和我国的粮食 产量保持稳步增长做出了巨大贡献。据资料显示，杂交水稻种植面积已占据水稻总播种面 积的8 0 。但是由于杂交水稻利用的是杂种一代的优势，以后多代都会发生性状和育性 的分离，杂交育种过程中总要面对一个难以回避的难题一杂交种子只能利用一代，这样杂 交种需要年年制种，浪费了大量的人力物力和地力资源。于是广大育种学家开始了简化杂 交育种过程，缩短育种程序的探索“】。2 0 世纪7 0 年代我国水稻界讨论固定杂种优势可能 性，赵世绪首先提出了用无融台生殖固定杂种优势想法口j1 9 8 7 年袁隆平就提出了杂交水 稻育种发展的三个战略阶段，即从三系法为主的品种间杂种优势利用到两系法为主的亚 种间杂种优势利用，再到系法为主的远缘杂种优势豹利用，并认为一系法固定杂种优势 以培育无融合生殖最有前途“。在研究无融合生殖的过程中，四川农业大学水稻研究所 发现了一个奇特的现象：利用来自双胚苗中的多倍体与二倍体杂交时，在二倍体后代中有 些具有早世代稳定群体，经微卫星标记鉴别，其染色体确实来自两个亲本，为真实杂种， 而且田间表现一致，这种稳定机制可能在f 代就稳定下来，因为f 2 均表现一致无分离。后 学者利用这些早世代稳定群体与栽培稻做杂交，在其杂交后代中又发现了早世代稳定群 体，这说明早世代稳定特性可以遗传n 7 ”1 。 早世代稳定特性遗传机制的研究在固定杂种优势有重大意义。本文以来自多倍体与 二倍体杂交得来的早稳型水稻材料，进行以下几方面的研究：1 、早稳型水稻在减数分裂中 染色体配对行为、染色体分离方式：2 早稳型水稻成熟胚囊的结构：3 、早稳型水稻白花传 粉受精行为；4 、早稳型水稻与栽培稻杂交的传粉受精过程：5 、早稳型水稻与栽培稻杂交 后代的遗传分析。进彳亍以上几方面的研究其目的在于研究早稳型水稻与裁培稻在减数分 裂、胚囊、传粉受精方面有何差异，再次验证早代稳定特性是否能遗传，以便从生殖生 物学方面和遗传方面为早代稳定做出解释，为它们在育种和遗传研究方面提供实验依据。 2 固定水稻杂种优势的研究 水稻杂种优势的利用是提高水稻产量的根本有效途径之一，因而寻求改进杂种种子 的生产方法，免去繁殖制种的烦琐程序，显得特别重要。国内外遗传学家已广泛重视固定 水稻杂种优势的研究。早在1 9 5 2 年，霍尔丹就提出了固定作物杂种优势的可能性，认为获 得异源四倍体，可以保持永久杂合状态，而固定杂种优势“。1 9 6 0 年越海的研究重申了霍 尔丹关于多倍体水稻固定杂种优势的见解“。1 9 7 1 年苏联的巴拉诺夫、杜比宁等的研究 认为：无融合生殖体、多倍体、无性繁殖等能把杂种优势传递于后代中 1 2 o1 9 7 3 年以来， 我国开展了广泛的研究。从目前报道的资料看，国内外在固定水稻杂种优势的研究方面已 取得了可喜的进展，认为比较有效的途径有以下几种： 2 、1 组织培养 组织培养是利用杂种f 。的器官、组织以及细胞和原生质体为培养物，用特定的培养 基进行培养，诱导植株再生。其中除花药培养等，经加倍后成为纯合二倍体，其遗传基因 型与杂种f ，不同外，其它培养物的植株基因型都与杂种f 。相同，故能把杂种f 。的优势传于 后代。美国、日本、苏联、国际水稻所等在水稻组织培养上，取得了巨大的成就。自 n i c e s ( 1 9 5 1 ) 、天宫( 1 9 5 6 ) 的胚乳培养开始，先后在种子、子房、花粉等方面，均诱导出再 生植株。 我国自1 9 7 0 年获得花药培养植株外，还利用籼型或粳型杂交稻进行组织培养“。复 旦大学、中国科学院、中国水稻所及许多省农科院，先后用幼穗、种子、叶片培养，均诱 导出完整植株，验证了杂种f ，细胞的全能性，取得了研究成果。如复旦大学遗传所蔡以欣 等的悬液培养“钉：广东省农科院赖来展等的原胚期的幼胚培养，均获得了再生植株“。 关于杂种f 。组织培养的基础研究，据上海市农科院、复旦大学遗传所、中国水稻所 等报道，综合有下述几点：( 1 ) 杂交稻愈伤组织的诱导和分化频率高于常规品种，且生长速 度快，白化苗率也低，而粳型又高于籼型。( 2 ) 再生植株当代即t i 代与同组合f ，种子栽培 比较，在株叶形态、穗粒性状上表现一致。证明组织培养能保持杂种优势。未成熟胚乳培 养的少数再生植株t 】代的染色体数目发生变异，出现多倍体和非整备体。( 3 ) 再生后代自 交t 。代中所表现的突变性状，在大部分株系中能迅速稳定地遗传给后代，说明在二倍体组 织中出现了纯合突变，在少数株系中突变性状在t 3 、l 代才能稳定，也有极少数株系( 1 左右) 其后代在株高、叶型等个别性状上产生分离。 6 2 2 无融合生殖法 无融合生殖法是不经过受精作用丽产生胚和胚乳的过程，是一种不发生性细胞融合 的无性过程。在应用上可分为单倍体与二倍体无融合生殖两类。前者由于基因重组而成 为纯合体。不是杂种优势的固定。而后者所形成的种子，它的胚是由未受精的二倍体的细 胞所形成的，它的种子能长成植株，其基因型与亲体( f 。) 一样，能保持亲体( f ，) 的杂种优 势。1 9 7 6 年以来，我国不少单位通过远缘花粉蒙导、延迟处理以及四倍体与二倍体两端 授粉等方法诱导孤雌生殖。取得了初步成果。广西南宁地区农校( 1 9 7 8 ) 报道，诱导杂交稻 南优1 号等1 5 4 个组合，平均诱导率在3 8 以上。部分材料t 。代才稳定，其中5 个组合小 区折合亩产4 0 0 公斤以上，较当地良种增产6 4 以上“”。广东省农科院( 1 9 8 1 ) 对由汕优2 号孤雌生殖育成的单生2 号生产力鉴定，表现矮秆、多抗、稳产、高产，比桂朝2 号增产 显著“”。据中国科学院遗传所海南站( 1 9 8 0 ) 、湖南省益阳地区农科所( 1 9 8 1 ) 、日本新关 宏夫( t 9 8 5 ) 等对杂种f i 孤雌生殖后代植株性状的研究表明：( 1 ) t 。代的分离性。如同有性 杂交f 2 代一样，染色体数目发生变异，绝大部分为n = 1 2 ，少数出现非整倍体n = 1 4 2 0 ，个别 为n = 2 4 。( 2 ) 1 2 代的遗传稳定性。染色体加倍后，大部分株系性状整齐一致，不再分离。 ( 3 ) 后代的超亲现象。多数株系在分蘖力、有效穗、每穗粒数等性状上有超亲现象。 2 3 双二倍体法 双二倍体法又称四倍体法或多倍体法，系用理化因素处理杂种f 。由于“同源联会” ( a u t o s y n d e s i s ) 的关系，使杂种f ，来自双亲的全部杂合染色体加倍，而成为同质的 对。这样杂种便可商“纯”。后代不再分离，而成为“永久杂种”，使杂种优势长期保存。 据报道，目前国外有日本、朝鲜、印度、苏联等国进行细胞遗传学理论研究，但未在生 产上应用。日本研究稻、稗的细胞杂交，朝鲜研究稻、稗的远缘杂交，均己获得双二倍 体，其杂交后代正进行选育中。日本中岛等( 1 9 5 8 ) 利用胚乳培养技术，已获得四倍体 杂种植株“”。印度的多倍体水稻育种工作已获得了同源四倍体材料汹1 。苏联( 1 9 8 3 ) 用 秋尔仙素处理获得了一批同源四倍体材料，又用组织培养法得到了几十个再生双二倍体 材料，有的已经参加品种比较试验 2 1 o 我国北京市农科院育成“四倍体粳籼1 6 号”、“四 倍体香糯”等两个同源四倍体水稻品种，小面积种植亩产4 4 0 5 0 0 公斤，干粒重均达4 0 多克，品质好，抗稻瘟病”1 。 贵州省黔南州农科所谭协和( 1 9 7 9 、1 9 8 2 、) 报道，该所用秋水仙素处理杂交稻f 。 秧苗，获得了“难优3 号”等一批同源四倍体杂种e 2 3 o 选育了“1 2 3 矮”( 4 n ) 不育系和 保持系及恢复系，初步实现同源四倍体三系配套和转育。从测配的杂种( 1 2 3 矮a 早优 恢) f 。看，单株有效穗8 9 个，每穗粒数8 3 4 粒，结实率7 0 ，千粒重3 3 9 克，初步 显示了四倍体水稻杂种的大粒特性。目前因四倍体杂种分离世代长和营养体的“巨体性” 是获得良好株叶型的阻碍，尚未投入实际应用。福建省福州市农科所( 1 9 7 8 ) ，用秋水仙 素处理v 硝圭6 3 0 f o 的发芽种子，获得了四倍体变异体，结实率高达8 7 ，千粒重达5 0 克 2 4 o 2 4 核质杂种法 核质杂种是通过核置换杂交法，( 即连续回交法) ，把一种植物的细胞核导入另一种 植物的细胞质里，获得一个核质不同源的杂种。日本著名学者木原均认为，核质杂种的 核基因型是纯合的后代不再分离，而同时核染色体组和异细胞质之间可能有杂种优势， 选育出强优势的核质杂种乜“。核质杂种实际上早已应用，水稻不育系就是核质杂种， 如野败型不育系是野( 野生稻) 质栽( 栽培稻) 梭杂种，包台型不育系是籼质粳核杂种。 1 9 8 7 年，我国著名的杂交水稻育种家袁隆平首先提出了培育优势核质杂种的设想阻1 。1 9 7 8 年他所在的湖南安江农校开始了这一研究。1 9 8 1 年育成“卡勒罗( c o l o r o ) 湘矮早9 号”和“巴尔多( b a l d o ) 湘矮早9 号”两个粳质籼核的核质杂种。它们在株高、有效 穗、每穗粒数、单株生产力上均比核父本高。1 9 8 4 年生产示范，折合亩产5 9 1 5 公斤， 杂种与核父本的生育期、性状基本相同，产最高1 0 ，丑产量高达5 5 公斤。湖南农学 院( 1 9 8 2 ) 0 7 1 报道用籼稻卡拉杜玛作母本，温选青作父本，育成了比核父本早熟高产的 核质杂种卡青，在产量、单株叶面积、地上部干物质积累、发根力等方面均高于核父本， 伤流量强度在分蘖盛期和孕穗期大于核父本。随着世代的提高，核成分日趋完全纯合， 不再分离。这些都说明核质杂种已显示了杂种优势的稳定。 2 5 平衡致死法 平衡致死法系用理化因素处理杂种，引起染色体易位突变，使同质结合体致死，产生 所谓平衡致死效应，故后代为异质结合体，永远保持杂合性而获得所谓永久杂种优势o ”。 我国广东省农科院啪1 ，从1 9 7 5 年开始了系统研究，至1 9 8 4 年，已建立了一套染色体易位 个体选育程序。他们采用钴射线照射杂种f 。干种子或减数分裂期的杂种f l 活体，再选择 半结实的植株进行染色体镜检鉴定，依据花粉母细胞减数分裂期终变期或中期i ，出现四 价环或染色体的个体，即可判定易位杂合体，目前已将一些易位杂合体育成新品种。如早 诱i 号农艺性状稳定，谷粒饱满，后期不早衰，小区测产折合亩产4 8 6 公斤。上述事实表明， 可应用人工引变法诱发具有平衡致死效应的易位体，借以获得异质杂合体，固定杂种优 势。 2 6 一种新型方法 在无融合生殖的研究中，多倍体的研究成为热点，蔡得田、袁隆平等也将多倍体列为 2 1 世纪水稻育种新战略“。四川农业大学水稻研究所很早就开始了水稻多倍体的研究， 在研究过程中，1 9 9 1 年，周开达、汪旭东等发现具有无融合生殖特性的三倍体s a r 一3 与 栽培稻w 2 5 5 ( 2 n ) 杂交的后代f 。代，部分株系是稳定的“；1 9 9 6 年，吴先军用s a r 一3 与生4 7 杂交，其r 也出现稳定的株系；1 9 9 5 年另一份三倍体材料s a r i i i 。与抗3 9 1 ( 2 n ) 的杂交后代获得了相同的结果n 3 ；1 9 9 7 年刑少辰、周开达等用从双胚苗中选出的同源四 倍体株系5 9 与籼稻品种南京l l 杂交，发现部分f 2 代群体稳定一致，经选得到稳定品系 9 5 0 “1 。2 0 0 0 年谢兆辉、吴先军利用田间自然突变的三倍体材料d b l 0 2 与生产上常用栽 培稻太平3 6 9 和中作5 9 杂交，也得到了f 2 代稳定群体t 5 2 01 9 9 8 年周开达、汪旭东用选 育成的稳定株系5 4 0 、5 3 2 与目前四川大量应用的栽培稻明恢6 3 、d 6 2 b 等杂交也得到了 稳定的f 。株系n “。稳定株系经受精生物学和形态学观察以及微卫星和r f i , p 标记检测， 结果表明，f 一是经卵细胞受精形成的，包含了两个亲本遗传物质的、具有双亲特性的二 倍体杂种，其f z 以及后世代群体的各个植株间遗传上是同质的。这种特殊的现象被称为 早代稳定。这是一种新型的固定水稻杂种早世代基因型的方法。它育种周期短、制种简 便、集杂交稻遗传上杂合的特性和常规稻表型上稳定的特点与一体。这种方法诞生至今 仅三年多的时间，它是世界上罕见的一种新型固定杂种优势的方法。1 9 9 9 年周开达、汪 旭东等已从4 9 0 个稳定株系中选出4 个高产优质的水稻品种：e 优5 4 0 、e 优5 3 2 、e 优 5 1 2 和e 优5 4 4 ，以及若干有色稻和香稻品系，前二者为优质籼稻，e 优5 1 2 和e 优5 4 4 为籼型糯稻。虽然对这一新的研究领域研究还处于初始阶段，但它对水稻的研究和发展 具有十分重要的学术价值和指导意义。 9 另外还有许多固定杂种优势的方法，如利用人工种子、营养突变体等。 3 早稳型水稻的特点 3 1 早代稳定材料起源于远缘杂交 四川农业大学利用s a r 系列与栽培稻杂交得到了稳定株系。栽培稻与多倍体之间， 由于各自染色体的倍性差异，两者在分类学上被有些学者视为不同的物种唧1 。所以我们 所做的栽培稻和多倍体水稻杂交属于远缘杂交。陈建三所做的非洲长雄蕊野生稻与栽培 稻的杂交o ”，蔡得田所做的籼稻和粳稻之间的杂交c 3 13 由于父母本亲缘关系较远，等也 都属于远缘杂交。稳定株系5 4 0 、5 3 2 、8 4 1 5 与栽培稻杂交，也得到稳定株系，从父母 本的遗传背景看，这些杂交也是远缘杂交。两个父母本可能是由于亲缘关系相差远，二 者的基因组在杂交过程中不相适应，要破坏原来的核质关系，这一过程中要发生一系列 变化。1 ，可能正是这些变化使我们得到了稳定株系。其机理正在研究中。 3 2 早代稳定现象的可遗传性 由水稻多倍体与栽培稻之间的杂交得到的稳定株系5 4 0 、5 3 2 与栽培稻明恢6 3 、属 恢8 8 1 、d 6 2 b 等杂交又得到了稳定的株系。早代稳定水稻8 4 一1 5 与水稻喜峰杂交，在 杂交后代出现了稳定株系中新一号c 2 4 这些现象说明在丰富的稻种资源中，可能存在控 制早代稳定的因子，而且这些因子能通过杂交传递给其杂交后代中。研究发现，来自同 一杂交组合的f 。群体，有的群体稳定不分离，而有的则严重分离。s s r 标记证明两个f 。 之间的差别特别大，且差异分布于多个染色体上。我们对我们发现的8 个早代稳定材料 进行微卫星分析时，发现了一些出现频率较高的微卫星标记，如r m 2 0 2 和r m 2 4 0 ，但没 有发现各个早代稳定材料均出现的微卫星标记或都丧失的父母本标记。这些在早代稳定 群体中出现频率较高的微卫星标记是否与早代稳定因子有关。需作进一步研究。 3 3 早稳型水稻是纯合的真杂种 一般远缘杂交f 。代都会发生疯狂分离，我们所做的远缘杂交f 2 代却稳定一致。不仅 形态上整齐，而且进行微卫星分析对，f ，带型是纯合一致的，没有出现一般杂交种的杂 合带，且含有两个亲本的遗传物质。f 。群体的每个单株完全和f - 带型一样，没有分离现 象。这说明我们所得到的群体是真正的稳定群体。这在遗传方式上和盂德尔定律不同， 这种特殊的现象值得我们进一步研究。 4 早稳型水稻的稳定性分析 4 1 从外观判断杂交后代的稳定性 从群体的整齐度、株叶形态、色泽、籽粒特征、抽穗期等直观性状可判断后代的稳定 性。1 9 9 7 年夏在四川温江对5 3 个来自不同组合的f 2 代株系进行考察，稳定的有三个， 即4 2 2 、4 2 9 、4 3 0 。1 9 9 8 年春海南种植的n 代株系，4 2 2 、4 2 9 、4 3 0 衍生的株系仍然稳 定，且同一株系后代的姊妹系问没有表现出差异。 4 2 从变异系数分析杂交后代的稳定性 可从抽穗期、株高、有效穗、穗长、千粒重等农艺性状对早代稳定群体进行考察。 表1 是对稳定群体4 2 2 、4 2 9 、4 3 0 的考察结果“”。从表中可知，4 2 2 、4 2 9 、4 3 0 抽穗期、 株高、穗长的变异系数较小，其余性状的变异系数稍大一些，这可能是试验环境的变异 造成的。f 2 代在重要的农艺性状如抽穗期、株高、有效穗等的变异系数均比同期播种的 汕优6 3 小或与之相当，表明至少这三个主要性状确属稳定。 表l早代稳定群体变异系数分析 t a b l e1t h ec va n a i y s i so fe a r l yg e n e r a t i o ns t a b i l i t yp o p u l a r i o n 、 组音$ a r 3 ( 3 0 ) 生4 7s a r - 3 ( 撕) 科1 5s a r - 3 ( 3 8 ) x 轴1 2c k 性状f 2 ( 4 2 2 ) f 2 ( 4 2 0 ) f 2 ( 4 3 0 ) l | i 优6 3 4 3 利用s s r 标记分析杂交燔代的稳定性 首先利用微卫星标记对2 个亲本筛选多态性引物。在所表现多态性的引物中，将稳 定株系的f 。单株和双亲放在一起电泳。结果f 。单株的带型不是和母本带型一致，就是和 父本的带型一致，而不是一般杂交种所出现的杂合带。同时把f 2 稳定株系的多个单株和 2 个亲本及f 放在一块凝胶上电泳，结果表明，r 群体的每个单株完全和f 的带型一样， 整齐一致，没有分离现象。从而以大群体在分子上证明了f 2 群体的稳定性。 经过s s r 标记表明，稳定株系确为双亲的真实杂种，因为稳定株系既有父本标记有， 又有母本标记；稳定株系出现是由于f 。基因型纯合引起的，其农艺性状的整齐一致是在 f 。就被确定下来了。 5 早代稳定机理的研究 关于早代稳定的现象，以前就有报道，8 4 1 5 曾被认为存在无融合生殖，并是早代 稳定的结果。但持异者认为该材料不存在无融合生殖，是正常的有性生殖”。谢国生等 在研究以8 4 1 5 ，a 6 7 为主体亲本的9 个不同类型的组合后，发现f 3 代存在一定频率的 稳定体系m 1 。这种现象与经典的遗传理论矛盾。经典遗传学理论认为，杂交后代在减数 分裂时严重分离，在f 5 或f 6 代以后才有可能稳定下来。有关学者从不同角度对此提出了 如下假说； 5 ，1 染色体特殊分离方式造成杂合性丧失 r i c h a r d ，w a n g 在利用中国水稻品种中新一号( 8 4 1 5 的后代) 与两个美国水稻品种 m 2 0 2 和l 2 0 2 进行杂交时，发现了一些田闻表现一致的穗行，r a p d 检测发现一些来自亲 本的r a p d 标记严重偏分离，并且一些r a p d 标记消失，他认为这是由于体细胞在有丝分 裂过程中，发生了类似减数分裂的同源染色体配对，以后复制的同源染色体随有丝分裂 被分到两个子细胞，在染色单体分开后细胞恢复二倍性，产生纯合的体细胞，则会产生 纯合稳定的后代。r i c h a n d ，w a n g ( 1 9 9 8 ) 在第1 8 界国际遗传学大会上公布了自己的研 究成果，称之为染色体的“杂合性丧失”。b u s k i n ( 1 9 9 4 ) 在研究脱氧核糖核酸钠对 洋葱的根尖作用时，第一个描述了这种现象，但他称之为“体细胞的减数分裂”。a l l e n ( 2 0 0 0 ) 等发现秋水仙素也可以引起与此相类似的细胞学现象，他称之为“定群分 离“。s y b e n g a ( 2 0 0 0 ) 在g e n o m e 上发表评论同意r i c h a r d ，w a n g 的观点，且提出了 他自己的说法，即“染色单体延迟分离的定群分离“。这种现象在肿瘤细胞中经常发 生，被认为是致癌的原因，在植物中发现较少，且植物中这种现象都是在根尖或茎原基 中发现的，并且多出现在化学药物( 尤其是秋水仙素) 处理之后，有时外界条件( 如低 温) 也能引起这种现象的发生。另外，体细胞中同源染色体配对也有可能并非发生杂 合性丧失的必要原因。关于体细胞同源染色体发生类似减数分裂的同源染色体配对现象 的原因，f ，w e n ( 1 9 8 9 ) 等认为是由于体细胞中高浓度的r a n 引起“。p a i n t e r ( 1 9 4 0 ) 发现在紫万年青花药绒毡层细胞或孢予发生组织的细胞中的r a n 含量极高，在减数分裂 过程中其浓度极低“”。在一些实验中也表明r a n 是诱导体细胞减数分裂的最好药物1 。 一些生物激素，如生长素、细胞分裂素等由于可以诱导r a n 的产生也可以诱导体细胞减 数分裂的发生。 5 2 染色体消除 孙敬三等利用小麦和大麦与其它的禾本科作物玉米或高粱杂交，结果发现来自玉米 或高粱的染色体被消除，但大都形成单倍体，没有发现染色体自然加倍形成二倍体。而 资料表明。白菜种间b c ：群体发生染色体消除，细胞仍保持二倍性。有学者认为这是杂种 合子在发育过程中，选择性的消除来源于某一亲本染色体，通常是来源于父本的染色体， 形成单倍体，在染色体消除过程中，被消除的染色体有的片段或整条染色体渗入未被消除 的染色体中，以后染色体自然加倍，恢复倍性，形成纯合的二倍体“。染色体消除在远缘杂 交中出现较多，但是，染色体自然加倍的现象极为罕见。发生染色体消除的原因，可能是由 于来自不同基因组的染色体着丝点受激发的时间不同，引起中期染色体排列到赤道板上 的时间差别非常大，赤道板被先到的染色体占据，落后的染色体被挤到细胞周围，不能排 列到赤道板上，在以后的细胞分裂过程中被消除 4 s o 这种现象在幼胚发育过程中发生较多， 因为这时细胞分裂迅速，而细胞的迅速分裂要求染色体的高度同步化，否则，一些染色体 在分裂过程中会落后而被丢失。也有人认为，染色体消除现象是由于多级纺锤体的形成产 生了不平衡细胞而后被消除1 。毛龙等( 1 9 9 4 ) 在用r f l p 分析野生稻( 2 n = 4 x ) 与二倍体栽 培稻杂交过程中，发现合子在发育过程中，野生稻与栽培稻染色体相匹配的染色体保留， 而不匹配的染色体或片段被消除”。 5 3 促稳定因子 陈建三认为非洲长雄蕊野生稻8 0 - - 0 0 0 1 具有系统分离、系统遗传的特性。他在利用 8 0 0 0 0 1 与其它的二倍体杂交过程中选择得到了一些具有早代稳定的材料，如8 4 一1 5 ，开 始认为是无融合生殖，后来被否定。但是因为野生稻8 0 0 0 0 1 与栽培稻无论正反交，其杂 种后代均能以株群为单位进行分离，且这种分离可以遗传。为了区分于常规水稻杂种后代 以个体为单位进行分离和多代自交纯合的现象，陈建三称之为系统分离、系统遗传。谢 国生等在利用8 4 1 5 、a 6 7 与其他的二倍体杂交过程中，在n 代也得到了一定频率的早 代稳定株系“3 。证明了陈建三的论点，也说明早代稳定特性可以遗传，推测原因之一可能 存在控制早代稳定的因子。这种稳定因子可能在细胞自然或诱导多倍化的过程中产生， 但是这种因子可能比较复杂。我们利用由水稻多倍体与二倍体之间杂交得来的早世代稳 定水稻同栽培稻作过大量的杂交，发现早世代稳定特性在一些组合中是可以遗传的。我们 研究了来自同一组合的两个f ：代之间的差别很大，且差异分布于多个染色体上。我们在 对我们发现的8 个早代稳定材料进行微卫星分析时，发现了一些频率较高的微卫星标记， 如r m 2 0 2 和r m 2 4 0 。但没有发现各个早代稳定材料均出现的微卫星标记，另外，上述出现频 率较高的微卫星标记是否与早代稳定因子有关，也需要作进一步的研究。 6 早稳型水稻的细胞学和胚胎学研究 早稳型水稻对于水稻杂种优势的固定及育种实践具有重大意义，引起了胚胎学和育 种学者的兴趣，他们对此多倍体材料进行了研究，研究情况如下： 6 1 细胞学研究 试验所用的三倍体材料均表现出植栋较高、颖花大、长芒、叶片宽大、育性较低、 结实很差、而尤以穗部特征最为明显，区分多倍体要报尖染色体数鉴定。对其花粉母细 胞减数分裂过程进行研究，表踞租线期染色体配对形成各种交叉，有时可以看至n 三个同 源染色体的局部联会，双线期染色体呈现各种形式的交叉和交叉端化。染色体的联会形 式在终变期十分复杂，有数十种之多，三价体的变化范围在2 - 1 1 个之间，二价体为0 1 3 个，单价体为卜8 个，没有发现1 2 个的三价体的细胞。中期i 有可能存在三价体联会消 失形成单价体和二价体，单价体数目增多。后期发生染色体不均等分离，并且在大多数 情况下伴随有落后染色体。张静、吴先军等( 1 9 9 9 年) 对s a r 一3 的细胞学研究发现，s a r 一3 减数分裂后期i 二分体细胞的染色体数n = 1 6 、1 7 、1 8 、1 9 占绝大多数。有一定数量的 n = 1 2 、1 3 、1 4 、1 5 ，而很少有n = 2 1 、2 2 、2 3 、2 4 ，观察的6 0 0 个二分体细胞中，产生n = 1 2 的单倍性配子的频率1 ，形成2 n 配子的频率为0 1 7 。这说明通过假受精的无融合生殖 方式形成二倍体的频率显著低于单倍性配子通过受精形成的二倍体。减数分裂时几乎都 能形成四分体，在后期i i 染色体继续丢失，束期i i 能观察到四分体之间有由落后染色体 形成的微粒。而对其幼穗分化致开花前后3 天的颖花胚胎发育观察表明，s a r 一3 在大孢 子发生方面遵循正常的发育途径，即都能通过大小孢子母细胞减数分裂形成二分体和四 1 4 分体，大小孢子母细胞在进入减数分裂前均形成胼胝质壁，大孢子四分体也有胼胝质壁 包被，功能大孢子向合点端其胼胝质壁减少，有利于进一步发育“删。s a r 一3 的败育主 要表现在雌雄配子的进一步发育。 6 2 胚胎学研究 用三倍体s a r 一3 与普通二倍体杂交，授粉后。隔时取材固定，观察受精全过程和胚 胎发育：授粉后8 0 的花粉能在柱头上萌发，花粉管顺利穿过花柱，2 小时后伸入胚珠基 部，少数正常胚囊完成双受精，形成胚和胚乳，大