（植物病理学专业论文）红树内生细菌抗菌活性物质基因定位及功能分析.pdf

红树内生细菌抗菌活性物质基因定位及功能分析摘要利用从红树中分离到一株对多种病原物具有最强活性的解淀粉芽孢杆菌c 1 ，通过质粒消除确定具有抗菌活性的物质在染色体上。分析抗菌活性的物质及用生物信息学的方法预测解淀粉芽孢杆菌基因组中的基因，根据这些结果设计多对引物从c 1 菌株中克隆出了5 条序列，其中4 条为目的基因。选择其中的2 个基因l c i 和b a c e在原核表达系统中表达，测定了表达产物的抗菌活性。采用s d s 法反复多次处理菌株来消除质粒，比较质粒消除前后抗菌活性的变化，来确定抗菌活性物质基因的位置。用0 0 0 5 的s d s 反复多次处理后，质粒被完全的消除掉了。比较质粒消除前后的抗菌活性，发现基本无变化。说明产生活性物质的基因在染色体上，而不在质粒上。测定了蛋白类抗菌活性物质的耐热性和蛋白酶敏感性，表明抗菌活性物质为耐热的，对蛋白酶不敏感的蛋白质，因此确定为抗菌肽。利用6 种广谱抗生素抗生素筛选c 1 菌株的抗生素抗性，氨苄青霉素、红霉素、氯霉素、头孢霉素、利福平、四环素对c 1 菌株的m i c 分别为0 4 肛g m l 、1 6 肛g m l 、2 0l x g m l 、3 0i r t e c m l 、0 4i - t g m l 和3 0p e c m l 。利福平和氨苄青霉素对c h i - 1 菌株有较好的抑菌活性，可选作为基因敲击中的筛选标记。头孢霉素和四环素有可能与c 1 菌株一起用于病害的防治。通过抗菌肽数据库及信号肽的分析软件s i g n a l 3 0 、s e c r e t o m e p l 0 、t m h m m 2 0等对解淀粉芽孢杆菌f z b 4 2 全基因组进行分析，预测结果显示，其基因组中存在大量编码抗菌肽和分泌蛋白的基因，选择s p s a 、b a c e 、s r f a d 、f e n a 和l c i 等基因。根据预测的基因保守序列设计引物，用p c r 的方法从解淀粉芽孢杆菌材料中扩增出了抗菌肽和分泌蛋白基因并测序。从菌株c 1 中扩增出了5 条片段，分别为2 0 0 b p 、1 6 0 0 b p 、1 0 2 7 b p 、6 9 8 b p 和8 0 2 b p 。克隆到t 载体后，通过菌落p c r 进行鉴定后，选取阳性菌落测序，除s p s a 基因为非目标片段外，另外的4 个片段均为目标基因，其中的三个基因具有完整读码框。与解淀粉芽孢杆菌f z b 4 2 基因组中相应基因相比，它们均存在碱基突变和相应的氨基酸变化。选取其中的2 个基因l c i 和b a c e 在原核生物中进行蛋白融合表达。将l c i 和b a c e基因克隆到表达载体p e t 3 2 a 中，经测序分析，读码框架正确。经i p t g 诱导表达后，l c i 基因表达出约3 0 k d 的蛋白质，成功地表达出l c i 基因。而b a c e 基因表达没有成功。测定l c i 基因表达产物对多种病原物的抑制活性，结果表明它对病原细菌具有抑制活性，对病原真菌没有抑制活性。关键词：内生菌，抗菌肽，分泌蛋白，基因表达l o c a l i z a t i o na n df u n c t i o n a la n a l y s i so fa n t i m i c r o b i a lm a t e r i a lg e n ei ne n d o p h y t i cba c t e r i ao fm a n g r o v ea b s t r a c to n eo fe n d o p h y t i cb a c t e r i ac i i i - 1w h i c hi d e n t i f i e da sb a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n sh a dt h em o s ta n t a g o n i s t i ca c t i v i t yt os e v e r a lp a t h o g e n sa m o n gt h ei s o l a t e ds t r a i n sf r o mm a n g r o v ew a ss e l e c t e d t h ea n t a g o n i s t i cg e n ew a sl o c a t e di nc h r o m o s o m eb u tn o ti np l a s m i db yt h em e t h o do fp l a s m i dc u r i n g t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ea c t i v em a t e r i a lw a sa n a l y s e da n dt h eg e n e si ng e n o m eo fb a m y l o l i q u e f a c i e n sw e r ea n a l y s e db yt h em e t h o do fb i o i n f o r m a t i o r t , p r i m e r e sw e r ed e s i g n e da n d5g e n e sw e r ea m p l i f i e df r o m ，4o ft h e mw e r et a r g e tg e n e s 2g e n e s ，l c ia n db a c e , w e r es e l e c t e dt oe x p r e s si nec o l i ，t h ea c t i v i t i e st op a t h o g e n so fe x p r e s s i o np r o d u c tw g r et e s t e d t h em e t h o do fs d sw e r eu s e dt ot r e a tc i i i - 1s t r a i n ss e v e r a lt i m e st oc u r ep l a s m i d s ，t h ea c t i v i t i e st op a t h o g e n sw e r ec o m p a r e dt od e t e r m i n et h el o c a t i o no ft h ea c t i v eg e n e s o 0 0 5 s d sw a su s e dt oc u r et h ep l a s m i ds e v e r a lt i m e s ，t h ep l a s m i d sw e r ed i s a p p e a r e dc o m p l e t e l y t h ea c t i v i t i e sb e t w e e nc i i i - ls t r a l n sb e f o r ea n da f t e rt h ec u r i n gw e r ea l m o s tt h es a m ei n d i c a t i n ga c t i v eg e n ew a sl o c a t e di nc h r o m o s o m eb u tn o ti np l a s m i d h e a tr e s i s t a n c ea n dp r o t e i n a s er e s i s t a n c ew e r ed e t e r m i n e d ，i tw a sf o u n dt h a tt h ea c t i v ep r o t e i nw e r er e s i t a n tt oh e a ta n dp r o t e i n _ a s e ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep o t e i nm a y b ea n t i p e p t i d e 6b r o a d - s p e c t r u ma n t i b i o t i c ，a m p i c i l l i n ,e r y t h r o m y e i n ，c h l o r a m p h e n i c o l ，c e p h a m y c i n ，r i f a m p i c i n ，t e t r a c y c l i n e ，w e r eu s e dt ot e s tt h er e s i s t a n c eo fc - 1s t r a i n t h e i rm i cw e r e0 4i x g m l ，1 6p g m l ，2 0 肛g m l ，3 0i _ t g m l ，0 4 牡g m la n d3 0 斗g m lr e s p e c t i v e l y r i f a m p i c i na n da m p i c i l l i nc o u l dc o n t r o lt h eg r o w t ho fci i i 一1s t r a i ne f f e c t i v e l ya n dc o u l db eu s e da ss e l e c t i v em a r k e ri ng e n ek n o c k - o u t c e p h a m y c i na n dt e t r a c y c l i n ec o u l db eu s e dc o l l e c t i v e l yw i t hc i i i 一1s t r a i nt oc o n t r o lp l a n td i s e a s e t h eg e n o m eo f 丑a m y l o l i q u e f a c i e n sw a sa n a l y s e db ya n t i p e p e t i d ed a t a b a s ea n dt h es o f t w a r e so fs i g n a la n a l y s i s ，s i g n a l 3 0 、s e c r e t o m e p l 0 、t m h m m 2 0 ，t h eg e n o m eh a dm a n yg e n e so fa n t i p e p t i d ea n ds i g n a lp e p t i d e s e v e r a lg e n e s ，s p s a 、b a c e 、s r f a d 、f e n aa n dl c i ，w e r es e l e c t e d t h ep r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f ya n t i p e p t i d eg e n e sa n ds i g n a l p e p t i d eg e n e s 5f r a g m e n t so f2 0 0 b p 、1 6 0 0 b p 、1 0 2 7 b p 、6 9 8 b pa n d8 0 2 b pw e r eo b t a i n e df r o mc i i i 一1s t r a i n sa n dc l o n e dt otv e c t o r c o l o n yp c rw a su s e dt oi d e n t i f yt h ep o s i t i v ec l o n e t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r es e q u e n c e d ，4g e n e sw e r et a r g e tg e n e se x c e p ts p s a t h e r eo ft h e mh a di n t a c to r et h es e q u e n c e sw e r ec o m p a r e dw i t ht h o s ei nf z b 4 2a n df o u n dt h a tt h e yh a dd i f f e r e n c ei nn u c l e o t i d ea n da n l i n oa c i d s 2g e n e s ，l c ia n db a c ew e r ee x p r e s s e di nec o l ia sf u s i o np r o t e i n t h eg e n e so fl c ia n db a c ew a sc l o n e di ne x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 2 a s e q u e n c ea n a l y s i sp r o v e dt h a tt h eo r fw e r ec o r r e c t 。a3 0 k dp r o t e i nw a se x p r e s s e d 甜= e ri p t gi n d u c i n g ，i tw a st h ep r o d u c tl c ig e n e i tw a su n s u c c e s s f u lt oe x p r e s sb a c e t h ep r o d u c tw a sa n t a g o n i s t i ct op a t h o g e n so fb a c t e r i ab u tn o tt of u n g ip a t h o g e n st e s t e d k e yw o r d s ：e n d o p h y t i cb a c t e r i a ，a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，s e c r e t e dp r o t e i n , g e n ee x p r e s s i n gl l i英文缩写b pr a i ns e cr m i na m pk dp c rs d sc t a be d t at ee bt r i si p t gx g a lb l a s tn c b ip a g e缩略词及英文对照英文全称中文名称b a s ep a i r碱基对m i n u t e分钟s e c o n d秒r o u n d sp e rm i n u t e每分钟转速a m p c i l l i n氨苄青霉素k i l o d a i t o n千道尔顿p o l y e t h y l e n ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e 十六烷基三甲基嗅化铵e t h y l e n e d i a m i nt e t r a e e t i c a c i d已二胺四已酸t r i 班d t ab u f f e rt r i s e d t a 缓冲液e t h i d i u mb r o m i d e溴化已锭t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) m e t h a n a m i n三羟基甲基氨基甲烷i s o p r o p y l 1 3 - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e异丙基硫代- p - d 一半乳糖苷5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 3 i n d o l y l - d - g a l a c t o s i d e5 - 溴- 4 一氯一3 - 吲哚- p - d - 半乳糖苷b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l局部相似性比对搜索工具n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c l m o l o g yi n f o r m a t i o n 美国国家生物技术信息中心p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶广东海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：巷信印2 0o7 年莎月1 8 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1 、保密口，在年解密后适用本授权书。2 、不保密团。( 请在以上相应方框内打“”)作者签名：套1 吝串聊徘。嘲瞒2 0o9 年舌月g 日2 0p7 年b 月，善日广东海洋大学硕士学位论文i 上j l -刖吾1 植物病害生防的意义及目前研究的状况植物病害是影响农业生产，造成农业减产的主要因素之一，目前植物病害防治仍主要依赖化学农药，大量的化学农药的使用，不仅易造成环境和食品污染，还易诱发病原菌的抗药性。为寻求安全有效的防治措施，植物病害的生物防治越来越引起人们的关注。植物体内存在大量对植物病原菌具有拮抗作用的内生细菌，这些内生细菌由于存在植物体内，不易受外界环境的影响，可长期发挥生物学作用，是植物病害生物防治的天然资源菌，某些内生细菌还具有促生、抗虫等广泛生物学作用( 谈家金，2 0 0 3 ；易龙，2 0 0 4 ；卢镇岳，2 0 0 6 ；周岗泉，2 0 0 7 ) 。因此，可以认为植物内生细菌在植物病虫害生物防治领域，具有十分广泛的理论研究和开发应用价值。国内外已从许多陆生植物中分离出大量的内生菌( d o n g ，1 9 9 4 ；s t e e n h o u d t ，2 0 0 0 ；何红，2 0 0 2 ；崔林，2 0 0 3 ；邱思鑫，2 0 0 4 ) ，从中筛选出一些能拮抗植物病原菌的细菌，其中最为主要的类群为芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 。海洋占地球表面的7 1 ，其中蕴藏着大量的微生物，能在特殊环境中生长，可产生许多与陆源微生物不同的抗菌物质，目前，海洋微生物及其抗菌物质已成为近年最热门的研究领域之一。我国海域辽阔，海洋微生物资源极为丰富，但目前关于海洋微生物拮抗植物病原物基因及其功能的研究，与世界先进国家相比，还存在相当差距。因此，利用我国丰富的海洋微生物资源，开展海洋微生物抗菌物质基因及功能的研究，意义十分重大。红树植物是一种生长在热带、亚热带海岸潮间带、具有海陆两大生态系统特性、可海陆两栖的特殊植物群落，在海岸防护、净化沿海环境、维护沿海湿地生物多样性等方面具有重大作用。何红教授提供了多株对植物病原真菌和细菌具有较强拮抗作用的红树内生细菌( 陈振明，2 0 0 6 ) ，其中c i i i 1 菌株对多种植物病原菌具有强烈抑制活性，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌( b a c i l l u sa m y l o 均u e f a c i e n s ) ，可以在辣椒、番茄等陆生植物体内及其根际土壤中长期定殖，对多种植物病害具有良好防治效果，并对植物生长具有良好促进作用( 张兴锋，2 0 0 7 ) 。2 抗生素抗性筛选许多抗生素来源于微生物的次极代谢产物，在病害防治、人体医药以及家畜饲料的添加剂中发挥了重要的作用，但是这些微生物在发挥作用的同时也造成了新的病害。放线菌中的链霉菌家族，可产生高达一千多种的抗生物质，许多重要的抗生素如放线菌素、链霉素、四环霉素、保米霉素、维利霉素、嘉赐霉素及康霉素等，都可由链霉菌生产，在防治病害的过程中发挥了重要的作用。但是链霉菌在植物上却引起病红树内生细菌抗菌活性物质基因定位及功能分析害部位木栓化、粗糙稍隆起，导致马铃薯疮痂病和甘蓝根瘤病的发生。由于许多的拮抗菌对抗生素十分敏感，对于这类病害无法进行防治。在医学上，由于大量抗生素的使用，导致耐药性菌株的大量出现。并且这些菌株寄居的环境中含有大量的抗生素，普通的拮抗菌或者拮抗药物根本无法发挥作用。为了解决这些问题，迫切需要寻找新的拮抗菌和抗菌物质。抗生素抗性筛选方法很多，通常选用抗菌机制比较清楚地进行筛选，如氨苄青霉素、利福平、四环素、氯霉素和红霉素等及微生物自产抗生素。筛选的原则也由原来的一种抗生素筛选，发展到多种抗生素筛选，以及与其它物理化学方法相结合的筛选方法。通过综合筛选对广谱抗生素如氨苄青霉素，氯霉素等的抗药性，不仅可以筛选出抗抗生素拮抗菌株，还可以筛选出抗生素选择性标记，在基因改造和转基因植物中广泛应用。胡丽华等( 2 0 0 2 ) 通过卡那霉素作为抗生素标记将b t 杀虫基因转入棉花中，产生了抗卡那霉素的植株；黄健等( 2 0 0 0 ) 将红霉素、氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素作为抗生素标记，应用于海洋微藻的基因工程研究。在病害防治的措施上还可以采取综合防治的方法，将抗生素和拮抗菌混合使用，既减少了抗生素的用量，减小对环境的危害，还可以提高防治的效果。这对于减小病原物的抗性，以及生防制剂的开发和产业化具有十分重要的意义。3 植物拮抗细菌的生防机理研究进展许多植物的拮抗细菌对真菌、细菌和病毒等农业病害有显著的抑制作用，其抗病的机理主要有拮抗作用、促生作用、生态位竞争和诱导抗病性。顾真荣等( 2 0 0 4 ) 从芽孢杆菌中分泌出伊枯草菌素、生物表面活性素，具有破坏芽管和新生菌丝，抑制孢子萌发的作用；m a u g e n e s t 等( 1 9 9 9 ) 研究枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌d s l l 促生作用时，发现这两种根际菌分泌的肌醇蛋白六磷酸酶，促进了根部对磷的吸收；郭荣君等( 2 0 0 3 ) 报道了在大豆根际定殖的芽孢杆菌b h l 与尖孢镰刀菌相互竞争根部的营养物质和生存空间，间接抑制大豆根腐病的发生；杜立新等( 2 0 0 5 ) 研究灰霉病防治的过程中发现：经过拮抗菌株b s 2 0 8 诱导，番茄获得了抵御灰霉菌侵入的能力。但目前研究比较多的是细菌的拮抗作用，主要通过次级代谢产生抗菌物质，抑制或直接杀灭病原菌；其次，形成不利于病原菌生长的环境而间接抑制病原菌，达到抑制植物病害发生的效果。芽孢杆菌产生的抗菌物质，主要有细菌素( b a c t e r i o e i n ) 、脂肽( l i p o p e p t i n ) 和多肽( p o l y p e p t i d e ) 等肽类抗生素( 陈中义，2 0 0 3 ) 。抗生素分为核糖体和非核糖体合成二大类。非核糖体合成的抗生素包括脂肽类抗生素、多肽类抗生素和次生代谢产生的其它抗菌活性物质。脂肽类抗生素一般对真菌具有强烈拮抗作用，目前报道的有枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 合成的伊枯草菌素o t u r i na 、0 和抗霉枯草菌素( m y c o s u b t i l i n ) 等。多肽类抗生素有线状、环状和分支环状多肽类抗生素三类。短杆菌肽( g r a m i e i d i n ) 和伊短菌素( e d e i n e ) 是短芽孢杆菌2广东海洋大学硕士学位论文b r e v i s ) 产生的线状抗真菌短肽；短杆菌肽s 和短杆菌酪肽( t y r o e i d i n e ) 是短芽孢杆菌产生的环状短肽抗生素；分支的环肽抗生素主要有多粘菌素( p o l y m y x i n ) 和八肽霉素( o c t a p e p t i n s ) ，它们主要作用于细菌。细菌素是由核糖体合成的抗菌肽，其中研究最为广泛的是革兰氏阴性菌产生的细菌素，如肠杆菌科细菌产生的大肠杆菌素( c o l i c i n s ) 和小菌素( m i c r o c i n ) 。与革兰氏阴性细菌相比，革兰氏阳性细菌产生的细菌素，是一类分子量小于6 k d 的多肽，它们含有阳离子，可透过细胞膜，在皮摩尔或纳摩尔浓度下便对敏感细菌有抗菌活性。由革兰氏阳性细菌产生的细菌素可分为以下几种：( 1 ) 羊毛硫抗生素( 1 a n t i b i o t i e s ) ，是由核糖体合成，并经过翻译后修饰产生的小分子量多肽，如尼生素( n i s i n ) 和枯草杆菌素( s u b t i l i n ) ；( 2 ) 热稳定的不含修饰氨基酸的细菌素，分子量小、对热稳定，它可分为p e d i o e i n 样细菌素和两个不同的多肽组成的细菌素；( 3 ) 分子量较大( 分子量大于3 0 k d )不耐热的细菌素。如乳酸菌( l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ) 产生的h e l v e t i nj ；( 4 ) 含有脂或碳水化合物的复杂的细菌素，这类细菌素了解较少。这些细菌素在生物防治过程中发挥了巨大的作用。4 抗菌肽的研究概况抗菌肽又称为肽抗生素，是在外源性病原微生物入侵时，生物体内产生的具有抗菌活性的小肽类物质( i z a d p a n a h a ，2 0 0 5 ) ，具有分子量小，两亲性好，热稳定性好和广谱抗茵等特点。b o m a n 等人( 1 9 7 5 ) 诱导惜古比天蚕蛹产生了世界上第一个抗菌肽一天蚕素( c e c m p i n s ) ，随后在昆虫、两栖类、水产动物、哺乳动物甚至植物及细菌中发现了至少1 7 0 0 余种抗菌肽，构成了宿主抵抗外来病原菌的第一道防线。天然的抗菌肽氨基酸数目都小于1 0 0 ，大部分为5 - - 6 0 个碱性保守氨基酸，带阳性电荷( h a n c o c k , 2 0 0 2 ；s c o t t ，2 0 0 0 ；b r a d s h a w , 2 0 0 3 ) 。n 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型强碱性氨基酸，带正电荷，亲水；c 端则富含丙氨酸和甘氨酸等中性或弱酸性强疏水性氨基酸，并且酰胺化，不带电或带少量负电荷，疏水。大部分抗菌肽具有热稳定性，在1 0 0 时加热1 0 1 5r a i n 抗菌活性保持不变；多数抗菌肽的等电点大于7 ，对较大的离子强度和较高或较低的p h 值，均具有较强的抗性。此外，部分抗菌肽还具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力( 于健，2 0 0 4 ；刘建涛，2 0 0 6 ) 。抗菌肽除了非特异性地抑杀细菌、真菌、某些寄生虫和病毒等病原体外，还具有抑制肿瘤细胞生长、加速免疫和伤口愈合的作用( g o r d o r t , 2 0 0 5h o s k i n , 2 0 0 8 ) 。由于其应用前景广阔，现已成为生命科学领域的一个研究热点。研究主要集中在抗菌肽的分离与纯化、氨基酸序列分析、蛋白质构型与功能的关系、抗菌肽的作用机理、基因工程克隆与表达抗菌肽基因、改造合成抗菌肽基因及动植物的转抗菌肽基因工程等领域。目前，对抗菌肽的分类有多种方法，根据抗菌肽的来源，可以将其分为昆虫类抗菌肽、植物类抗菌肽、微生物类抗菌肽、两栖类抗菌肽、哺乳动物类抗菌肽、水产类红树内生细菌抗菌活性物质基因定位及功能分析抗菌肽等。随着抗菌肽研究的逐渐深入，开始根据其化学组成、二级或三级空间结构以及功能进行分类，曾简单的将抗菌肽分为线肽和环肽( h o f f m a n n ，1 9 9 5 ) ，之后在此基础上进一步分为3 大类( b a r r a , 1 9 9 8 ) ：( 1 ) 单链不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素；( 2 ) 具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素( d e f e n s i n s ) ；( 3 ) 富含某种氨基酸但不含半胱氨酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的蛙皮素( m a g a i n i n s ) 以及富含甘氨酸的蜂毒素( m e l i t t i n s ) 等抗菌肽。近年来由于圆二性色谱和核磁共振技术在抗菌肽空间结构上的应用，将抗菌肽分为5 种类型( r e d d y , 2 0 0 4 ) - ( 1 ) 螺旋类抗菌肽，如两栖类的蛙皮素和天蚕素等；( 2 ) 富含半胱氨酸抗菌肽，女l l d r o s o m y e i n 、h b d 1 ；( 3 ) d 一折叠类抗菌肽，如短杆菌肽s 和t a c h y p l e s i n ；( 4 ) 富含某种氨基酸而不含半胱氨酸的抗菌肽，如富含组氨酸( h i s ) 、脯氨酸( p r o ) 和色氨酸( t r p ) 等氨基酸，其中h i s t a t i n 富含h i s ( x u ，1 9 9 1 ) ，c a n t h e l i c i d i n s 富含p r o ( m a r g h e r i t a , 19 9 5 ) ，i n d o l i c i d i n s 和t r i t r i p t i e i n 富含t r p ( l a w y e r ,1 9 9 6 ) ；( 5 ) 含稀有被修饰氨基酸的抗菌肽，这类抗菌肽大多数是从微生物中发现的，如格氏乳球菌( l a c t o c o c c u sg a r v i e a e ) d 尸的尼生素、串珠菌( l e u c o n o s t o cg e l i d u m ) d p 的l e u e o c i n a 。这类抗菌肽的一些氨基酸经过特殊修饰，如3 甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸和脱氢丁酸甘油酯等。4 10 【螺旋类抗菌肽a 螺旋类拮抗肽是天然抗菌肽最大的一类( b o m a n ，1 9 9 5 ) ，在自然界中广泛存在，具有典型的0 【一螺旋抗菌结构( d u r e l l ，1 9 9 2 ) ，具有代表性的是天蚕素和蛙皮素。天蚕素最早在惜古比天蚕蛹中被发现，后来在许多昆虫和猪的小肠中也陆续被发现，共发现了2 0 多种高度同源的天蚕素。天蚕素对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原性细菌均有拮抗作用，其中对革兰氏阴性菌抗菌活性较强( 肖业臣，2 0 0 4 ) 。天蚕素通常具有3 5 3 9 个保守氨基酸，具有两亲性，其n 端和c 端均为a 螺旋，受到任何破坏都会影响其抗菌活性，即使发生氨基酸的替换或者插入都会导致抗菌活性的明显下降，甚至丧失( h u a m e i ，2 0 0 4 ) 。n 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，其中的5 2 1 个氨基酸形成带正电的亲水螺旋，对抗菌活性十分重要；c 端富含丙氨酸和甘氨酸等非极性氨基酸，其中的2 4 3 7 个氨基酸形成带负电的疏水螺旋区，酰胺化决定了插入磷脂双分子层的深度及在细胞膜上形成通道的大小。两段螺旋由i + a g p ( 丙氨酸一甘氨酸一脯氨酸) 的短链连接( h o l a k ，1 9 9 8 ) ，在细胞膜毒素( 如p a r a d a x i n 、m e l i t t i n 、a l a m e t h i c h ) 中普遍存在，与天蚕素的抗菌活性密切相关( b o m a n ，1 9 8 1 ) 。蛙皮素最早是从非洲爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 皮肽分泌物中分离得到，随后在蛙的肠道中也得到了这种抗菌肽( m o o r e ，1 9 9 1 ) ，对真菌、细菌和病毒表现出广谱抗性，并有促进伤口快速愈合防止感染，甚至还有溶解肿瘤细胞而不杀死健康细胞的作用( b e c h i n g e r ，1 9 9 7 ) 。蛙皮素含有2 1 2 7 个氨基酸残基，但不含半胱氨酸，具有典型地两亲性仅螺旋结构，然而与天蚕素相比，蛙皮素抗菌活性的发挥并不需要与酶、受体及4广东海洋大学硕士学位论文膜蛋白的手性中心相互作用( w i e p r e c h t ，1 9 9 6 ) 。a 螺旋抗菌肽杀死病原体的作用机理存在很多争议，其中被认为最有可能的是：通过扰乱病原体细胞膜的屏障作用而导致病原物死亡( m a l o y , 1 9 9 5 ) 。a - 螺旋结构被认为是抗菌活性的先决条件，a 螺旋上带正电荷的氨基酸残基与细胞膜带负电荷的磷脂之间通过静电吸引，结合在细胞膜上( s a b e r w a l ，1 9 9 4 ) 。其中天蚕素则覆盖在磷脂双分子层的表面，使外层细胞膜的磷脂双分子层变形，破坏了质膜的稳定性形成离子通道而导致病原物死亡( g a z i t ，1 9 9 5 ) 。而蛙皮素抗菌肽分子通过借助水分子中连接结构的柔性，随即插入质膜中，使抗菌肽单体或双体分子也插入到质膜中，打乱了细胞膜原有的排列顺序，然后通过膜内分子间的相互移位，使抗菌肽分子聚合形成短暂的离子通道，致使病原物不能保持正常的渗透压而死亡( y a n g ，1 9 9 8 ) 。4 2p 折叠类抗菌肽p 折叠类拮抗基因编码的抗菌肽肽链分子中含有p 发卡结构，通过一个或多个二硫键来稳定具有两亲性反向平行的p 发卡结构。芽孢杆菌中主要有短杆菌肽、伊短菌素、短杆菌肽s 、短杆菌酪肽、多粘菌素和八肽霉素。短杆菌肽s 是由两个完全相同的五肽头尾相连组成的十环肽【c y c l o ( v a i o m - l e u - d p h c p r o ) 2 】，不仅具有抗细菌和真菌活性，而且具有溶血作用( l l a m a s ，2 0 0 7 ) ，肽环上部分氨基酸的改变将直接影响其抗菌活性( n a g a m u r t h i ，1 9 8 5 ) 。多粘菌素来源于多粘芽孢杆菌旧p o l y m y x a ) ，具有抑制革兰氏阴性细菌活性，由一个环和疏水性尾巴构成，其中环与多粘菌素的穿透性相关，疏水性尾巴则与多粘菌素的抗菌活性相关。鲎体内主要含有t a c h y p l e s i n si 和p o l y p h e m u s i ni 。从美国鲎( l i m u l u sp o l y p h e m u s )体内分离的p o l y p h e m u s i n 是一组阳离子肽，与日本鲎( t a c h y p l e u st r i d e n t a t u s ) 体内分离的t a e h y p l e s i n s 非常相似( p o w e r s ，2 0 0 5 ) 。通过核磁共振等技术分析发现：这些肽由1 如1 8个保守氨基酸组成，肽链骨架中的反向平行p 折叠与p 转角通过两个二硫键相连o a m e s ，2 0 0 2 ) 。这些抗菌肽的抗菌机理相同，与细胞膜上的脂多糖( l p s ) 之间具有很强的结合力，引起磷脂分子在细胞膜中的翻转及侧移等运动，通过膜转位进入脂质体的内部而杀细菌( m i y a t a ，1 9 8 9 ) ，说明此类抗菌肽能破坏磷脂分子的有序排列，在不形成稳定性孔洞或通道的前提下，使多肽分子穿过脂双层但不破坏细胞膜的完整性( p o w e r s ，2 0 0 4 ) 。4 3 富含半胱氨酸类抗菌肽这类拮抗肽富含半胱氨酸残基，形成一个或者多个二硫键的p 折叠结构。其中来源于芽孢杆菌的表面活性素( s u r f a c t i n ) 、伊枯草菌素、抗霉枯草菌素、芬荠素( f e n g y c i n ) 、b a c m o m y c i n 和c o r y n e b a e t i n 等脂肽类化合物，对真菌、细菌、病毒、支原体具有拮抗活性，甚至还有溶解红细胞作用( p e y p o u x ，1 9 9 9 ；z h i m o n ，1 9 9 5 ；红树内生细菌抗菌活性物质基因定位及功能分析v a n i t t a n a k o m ，19 8 6 ) 。伊枯草菌素家族成员包括i t u r i na 、b 、c 、d 、e ，芽孢菌素d 、f 、l 以及抗霉枯草菌素等( m a g e t d ，1 9 9 4 ；s t e i n ，2 0 0 5 ) ，由1 4 1 7 个氨基酸组成，都含有7 个氨基酸残基组成的肽环，其中包括一个不变的d 妒以及一个稳定的手性顺序l d d l l d l ，最后连接1 3 1 5 个与抗菌性密切相关的p 羟基脂肪酸，对大多数的致病酵母和霉菌具有强烈的抗菌能力( l e c l e r e 。2 0 0 5 ) 。芽孢霉素d 与伊枯草菌素家族其它成员具有相同的a s x t y r - a s x 顺序，通过在细胞膜上形成小囊泡和穿过细胞膜，释放电解质和高分子聚合物来降解磷脂，从而破坏细胞膜( m a g e t ，1 9 9 4 ) 。芬荠素主要能够抑制丝状真菌生长，对酵母和细菌无作用( v a n i t t a n a k o m ，1 9 8 6 ) 。枯草芽孢杆菌m 4 菌株产生的芬荠素类脂肽，对带伤口苹果上的灰霉病菌有抑制作用，在减少病害方面起重要作用( o n g e n a , 2 0 0 5 ) 。芬荠素家族脂肪酸链碳原子数目与抗菌性密切相关，c 1 7 同系物的抗真菌性比c 1 4 同系物强2 0 倍( l e e l e r e ，2 0 0 5 ) 。此外，多肽抗生素和次生代谢产生的其它抗菌活性物质对真菌也有抗性作用。表面活性素是被证明具有表面活性能力的唯一的脂肽，可以从被污染的土壤和沉积物中除去重金属，增加疏水化合物的溶解和生物降解( l i m ，2 0 0 5 ) ，可与伊枯草菌素混合，来增强伊枯草杆菌素对真菌的抗菌活性( t h i m o n ，1 9 9 2 ) 。近年来则被采用增加细菌定殖和强烈的抗真菌活性来综合进行生物防治( l e c l e r e ，2 0 0 6 ) 。在其它生物体内，防御素是先天性免疫系统的重要组成部分( o a n z ，2 0 0 1 ；l e h r e r , 2 0 0 2 ) 。防御素存在于许多植物和动物体内，按照6 个半胱氨酸间的间隔和二硫键的形成方式分为0 【防御素、p 一防御素和0 防御素三类( h u t t n e r , 1 9 9 9 ) 。具有抗真菌和细菌活性，某些a 防御素甚至还具有抗病毒的活性( w e i ，2 0 0 4 ) 。以人类血液中的p 防御素抗菌肽h b d 1 分子为例，有3 6 个氨基酸组成，x 2 - 1 0 c x s - 6 ( g a ) x c x c x 9 - 1 3 c x c c x n 代表任意氨基酸) ( b e n s c h ，1 9 9 5 ) ，含有6 个半胱氨酸分子，在c y s l c y s 5 ，c y s 2 - c y s 4 ，c y s 3 - c y s 6 位置处，通过分子内二硫键形成一个螺旋和两个稳定的反向平行d 折叠片层结构，其中一对二硫键连接n 端的p 折叠片层与a 一螺旋和中间的p 折叠片层，另外的一个二硫键将分子的非折叠部分和c 端的b 折叠片层连接。a 防御素和0 -防御素空间结构类似，但d 防御素比它们多了个a 螺旋结构。不同之处是由于防御素分子太小而不能以单聚体的形式造成膜穿孔，但其分子结构和电生理研究提示，防御素分子能以低聚物的形式形成通道作用于胞膜( h o o v e r ，2 0 0 1 ) 。富含半胱氨酸类抗菌肽抗菌作用机理与q 螺旋类抗菌肽基本相同，都是通过阳性抗菌肽和细菌的阴性细胞膜相互吸引，穿透细菌的细胞膜，引起胞内水溶性物质大量渗出，从而最终导致细菌死亡( p a z g i e r a , 2 0 0 6 ) 。此外，还可以提高机体的先天性抗微生物防御反应。如人的0 【防御素能增强巨噬细胞的吞噬能力和增多中性粒细胞来抵抗感染的能力( w e l l i n g ，1 9 9 8 ) 。6广东海洋大学硕士学位论文4 4 富含某种氨基酸而不含半胱氨酸类抗菌肽富含某种氨基酸而不含半胱氨酸类抗菌肽在二级结构上缺少a 螺旋和p 一折叠，通常呈线型，富含一种或多种特殊氨基酸，如脯氨酸、组氨酸和甘氨酸等。其抗菌活性结构是通过肽与膜脂间的氢键或范德华力形成的，不依赖于残基间的氢键。从昆虫中分离出的多种富含脯氨酸的抗菌肽分为长链和短链两种，长链抗菌肽在2 6 3 9 个氨基酸残基之间，短链抗菌肽在1 5 - - - 2 0 个氨基酸残基之间。1 9 8 9 年，c a s t e e l s等从意大利蜂发现的a p i d a e c i n ，由1 5 3 4 个氨基酸残基组成，其中p r o 含量占2 5 以上，它们都带有正电荷，含有a r g p r o 或l y s - p r o 氨基酸对，有些带有典型的a r g p r o - a r g 结构。来源于昆虫的富含甘氨酸的抗菌肽是近年来才发现的，其共同特点是富含甘氨酸。有些是某一结构域中富含甘氨酸，如a t t a e i n s 和s a r e o t o x i n si i ，有些是全序列中富含甘氨酸，如鞘翅肽( c o l e o p t e r i c i n ) 和半翅肽( h e m i p t e r i c i n ) 。这些抗菌肽所含的甘氨酸比例最高，常在1 0 以上，半胱氨酸含量很少或不含，不形成分子内二硫键，氨基酸残基上也不具有修饰基团( 卢其能，2 0 0 7 ) 。s a r c o t o x i n si i 来源于麻蝇，是目前昆虫中发现的分子量最大的抗菌肽，共2 6 5 个氨基酸，c 端富含甘氨酸。c o l e o p t e r i c i n ( s a g i s a k a , 2 0 0 1 ) j 通：过诱导非洲象甲( t e n e b r i o n i db e t t l e ) 血淋巴细胞产生，具有抗细菌的活性。c o l e o p t e r i e i n a 由7 4 个氨基酸组成，甘氨酸所占的比例为1 1 1 ，抗革兰氏阴性细菌；c o l e o p t e r i c i nb 和c o l e o p t e r i e i nc 均由4 3个氨基酸组成，含6 个半胱氨酸，同防御素同源，抗革兰氏阳性细菌( b u l e tp , 1 9 9 1 ) 。其作用模式不是在细胞膜上形成离子通道，导致细菌死亡。而是通过抑制细菌分裂导致细菌死亡。来源于猪白细胞的c a t h