（分析化学专业论文）表面分子印迹技术在生物分子色谱分离中的应用.pdf

南开大学硕士研究生学位论文 中文摘要 本论文利用表面分子印迹技术水相中分别印迹了色氨酸和溶菌酶，考察了 它们的色谱分离特性。具体来讲，本论文的工作包括以下三个方面： 一、综述了分子印迹技术的基本理论，分子印迹色谱固定相研究进展及蛋 白质分子印迹的研究现状及发展前景。 二、水相中合成了一种新型的分子印迹聚合物，用来选择性识别色氨酸 ( t r p ) 。实验中采用表面分子印迹的方法，以功能化的硅球( f s i l i c a g e l ) 为载 体，制备了以l t r p 或者d t r p 为模板分子的分子印迹微球。首先用制备好的分 子印迹微球对模板分子及其相似物进行了吸附实验。然后进一步将其装填色谱 柱，用高效液相色谱考察其色谱分离能力。结果表明，印迹色谱柱在水相流动 相的条件下不但成功地分离了色氨酸及其芳香族氨基酸相似物，而且还可以分 离色氨酸的对映异构体。本方法为手性氨基酸分离和纯化提供了一条新思路。 三、采用表面活性自由基聚合法( s i p ) 在水相中成功制备了溶菌酶 ( l y s o z y m e ) 分子印迹微球( m i pb e a d s ) 。通过上述方法得到的印迹微球有很好 的孔分布并且没有溶液聚合副产物，与传统方法合成的不规则印迹微球相比有 更好的特性。我们用红外光谱、元素分析、氮气吸附和扫描电镜对分子印迹微 球进行了表征。同时还将溶茵酶分子印迹微球( l y s o z y m e m i p b e a d s ) 填装色谱 柱，溶菌酶印迹柱能使模板蛋白( l y s o z y m e ) 与其竞争蛋白牛血红白蛋白( b h b ) 、 牛血清白蛋白( b s a ) 、卵清白蛋白( o v a l b u m i n ) 或细胞色素c ( c y tc ) 得到 分离。 关键词：表面分子印迹技术色氨酸溶菌酶聚丙烯酰胺凝胶引发转移终止剂 南开大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t i i lt h et h e s i s ，w e m a i n l yg oi n t ot h ea r e ao fs u r f a c em o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r st oc h r o m a t o g r a p h i c a l l ys e p a r a t ea n dr e c o g n i z et r y p t o p h a na n dl y s o z y m e t h e r ea r et h r e ep a r t s ，a ss h o w ni nt h ef o l l o w i n g ： 1 t h eb a s i ct h e o r yo fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，t h ed e v e l o p m e n to f m o l e c u l a ri m p r i n t i n gc h r o m a t o g r a p h i cs o l i d p h a s ea n dp r o t e i ni m p r i n t i n gw e r e r e v i e w e di nt h ei n t r o d u c t i o n 2 an o v e lm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) s e l e c t i v ef o rt r y p t o p h a n ( t r p ) w a s d e s c r i b e dw h e r ep o l y m e r i z a t i o nw a sp e r f o r m e di n a q u e o u sm e d i aw i t hs u r f a c e m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u eo nf u n c t i o n a l i z e ds i l i c ag e l t h em i p sw e r ef i r s t e v a l u a t e d t h r o u g ha d s o r p t i o n e x p e r i m e n t s ， a n dt h e nw e r e p a c k e d i n t o c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nt os t u d yt h es e p a r a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s t h em i pc o u l dn o t o n l ys e p a r a t et r pf r o mo t h e ra r o m a t i ca m i n oa c i d s ，b u ta l s os e p a r a t et h et e m p l a t e f r o mi t se n a n t i o m e ri na q u e o u sm o b i l ep h a s e t h i ss t u d yd e v e l o p e dan e wm e t h o df o r c h i r a la m i n oa c i ds e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n 3 s u r f a c ei n i t i a t e d r i v i n g - r a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ( s i p ) w a su s e dt op r e p a r e m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) b e a d sf o rl y s o z y m ei na q u e o u sm e d i a t h es i p a l l o w e da ne f f i c i e n tc o n t r o lo ft h e g r a f t i n gp r o c e s sa n ds u p p r e s s e ds o l u t i o n p r o p a g a t i o n t h e r e f o r e t h eo b t a i n e dm 口b e a d sh a dal a r g eq u a n t i t yo fw e l l d i s t r i b u t e dp o r e so nt h es u r f a c ew i t h o u ta n yv i s i b l eg e lf o r m a t i o ni ns o l u t i o na n d w e r e m o r ea d v a n t a g e o u sc o m p a r e dt oi r r e g u l a r l ys h a p e dt r a d i t i o n a lm i p s t h e r e s u l t i n gc o m p o s i t e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yf o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y , e l e m e n t a la n a l y s i s ，n i t r o g e ns o r p t i o na n a l y s i sa n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y c h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o r so ft h ec o l u m np a c k e dw i t hl y s o z y m ei m p r i n t e db e a d s ( l y s o z y m e - m i pb e a d s ) e x h i b i t e dc o n s i d e r a b l es e p a r a t i o na b i l i t yo fl y s o z y m ef r o m c o m p e t i t i v ep r o t e i n s ( b o v i n eh e m o g l o b i n , b o v i n es e r u ma l b u m i n , o v a l b u m i no r c y t o c h r o m ec ) g e n e r a l l y , t h ed e s c r i b e dm e t h o dm a ym a k et h ep o l y m e ru s ea san o v e l b i o s e p a r a t i o na n db i o s e n s o rm a t e r i a lf o rm o n i t o r i n gt h ep u r i t yo ft h ep r o t e i n k e y w o r d s ：s u r f a c em o l e c u l a r i m p r i n t i n gt e c h n o l o g y , t r y p t o p h a n , l y s o z y m e ， p o l y a c r y l a m i d eg e l ，i n i f e r t e r 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：掘 如8 年j 月刃e t 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年 月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：拓 鲫8 年r 月。o 日 第一章前言 第一章前言 第一节分子印迹技术概述 1 1 1 分子印迹技术的发展概况 分子间相互作用( m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n s ) 是一个非常古老的概念，早在古希 腊和罗马帝国开始就有人使用。到十九世纪后半叶，现代分子问相互作用的概念 才开始出现。例如，范德华( v a nd e rw a a l s ) 提出处于蒸汽状态的原子之间存在着 范德华相互作用力( v a nd e rw a a l si n t e r a c t i o nf o r c e s ) 。又如，1 8 9 4 年菲歇尔 ( f i s c h e r ) 提出了他著名的“锁匙 ( l o c k - a n d k e y ) 比喻，用来形容酶( e n z y m e ) 和底物( s u b s t r a t e ) 之间的相互作用。在这个假设中，他认为分子相对较大的酶与 分子相对较小的底物之间的作用就好象锁和钥匙的关系，底物就好象一把钥匙一 样牢牢地镶嵌在酶这把锁上( 见图1 1 ) 。 图1 1 菲歇尔的酶( 锁) 底物( 匙) 复合结构示意图 长期以来，许多科学家对自然界中分子间相互作用非常感兴趣，因为人类对 第一章前言 这些自然复合作用的研究，可以用来模拟识别分子，从而为人类服务。由此而产 生了一个新的研究领域仿生化学( b i o m i m e t i cc h e m i s t r y ) ，专门研究象酶和 抗体之间的结合的特性。“仿生”一词本身就包含了生物化学反应过程的化学模 仿之意。随着人们对生物化学系统的结构和机理的逐渐认识，科学家们正试图将 这些已知的机理转入化学合成阶段。通常，这些合成方法的目的在于将这些复杂 的生物系统变得简单和微型化。例如，酶模型虽然缺乏大分子肽的骨架，但却含 有催化活性基团，而具有与酶同样的几何定位功能。一个研究和模拟天然分子识 别的最吸引人的生物模拟方法分子印迹技术便由此而产生了。 19 4 0 年p a u l i n g 在研究抗体和抗原相互作用时，提出了以抗原为模板合成抗 体的设想。在后来的几十年中，s c a t t e r d 在这方面作了一些尝试。但直到二十世 纪七、八十年代，现代分子印迹技术( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dt e c h n o l o g y ，m i t ) 才有了真正的突破，特别是m o s b a c h 1 】等人在非共价型分子印迹技术和w u l 讲2 1 等人在共价型分子印迹技术上的开拓性工作的开展，分子印迹技术领域才得到了 蓬勃的发展。自从m o s b a c h 等人在( ( n a t u r e ) ) 上发表有关茶碱分子印迹聚合物 ( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m i p s ) 的报道后，每年公开发表的论文几乎 直线上升。1 9 9 7 年，分子印迹协会( s o c i e t yo f m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ，s m ih t t p ： w w w s m i d u - b e r l i n d e ) 正式成立。根据分子印迹协会互联网的登记表明，到目 前为止，全世界至少有1 0 0 个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合 物的研究及开发工作。目前主要从事分子印迹聚合物研究工作的有美国、英国、 瑞典、日本、德国、中国、西班牙、加拿大、意大利、法国、荷兰、印度、韩国、 澳大利亚、新西兰、爱尔兰和以色列等四十多个国家和地区，而从事这方面研究 最多的是美国、英国、瑞典和日本。m p 之所以发展如此迅速，主要是因为它 有三大特点：即预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、识别性( r e c o g n i t i o n ) 和实用性 ( p r a c t i c a b i l i t y ) 。预定性决定了人们可以根据不同的目的制备不同的m i p s ，以满 足各种不同的需要；识别性是因为m i p s 是根据印迹分子( i m p r i n t e dm o l e c u l e ) 定 做的，它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子；其实用性表 现在它与天然的生物分子识别系统，如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比， 具有抗恶劣环境的能力，表现出高度的稳定性和长的使用寿命，且制备过程简单 p j 。由于分子印迹聚合物具有以上这些优点，它在许多领域，如色谱中对映体和 异构体的分离、固相萃取、化学仿生传感器、模拟酶催化、临床药物分析、膜分 离技术等领域展现了良好的应用前景。 2 第一章前言 11 2 分子印迹聚合物的制备过程 分子印迹技术是制各具有分子识别作用的客体化合物的技术，将模板分子 与功能单体相互作用形成超分子复合物，在交联剂作用下形成聚合物。然后在一 定条件下除去模板分子，得到带有与模板分子空间结构互补的识别位点的分子 印迹聚合物，如图1 2 所示。该识别位点具有“记忆”功能，可以选择性地键合 待分离混合物中的模板分子，从而达到分离、纯化的目的。 分予印迹聚合物制各过程可分为三步：第一步，模板分子与带有烯键的功 能单体( m o n o m e r ) 在溶剂中通过各自的功能基团形成在空间结构上互补的复合 物；第二步，在复合物溶液中加入带有两个或两个以上烯键的交联剂 ( c r o s s l i n k e r ) 和引发剂( i n i t i a t o r ) ，通过光或热的作用引发聚合反应，使功能 单体与交联剂在模板分子周围形成网状高分子聚合物：第三步，通过一定手段 ( 如抽提，解离) 使模板分子与聚合物分离，在聚合物上留下与印迹分子在三 维空间上匹配且具有特定识别位点的孔穴。 p 警车 孛n 文1 膏j p 心 图1 2 制备分子印迹聚合物的示意图 在整个合成过程中模板分子与烯类单体间结合力的大小决定着聚合物的 识别能力。根据印迹分子与功能单体之间形成配合物时作用力的性质，分子印 迹聚合物的制各过程分为共价键型、非共价键型( 图1 3 ) 和半共价键型三种。 第一章前言 t e m p l a t e n o a l e n t # _ 4 _ _ _ _ _ o 魄 i c o v a l e n ta p p r o a c hl t e m p l a t eh a v i n g p o l 脚b l cg r e u p z ( c e v a l c n l l ya t t a c h e d ) 图1 3 共价键型和非共价键型分子印迹聚合物的制备 共价键型m i p s 4 5 j ，模板分子与聚合物单体在交联聚合前先形成共价键结 合的化合物，交联聚合反应完成后再将共价键打开，除去模板分子得到分子印 迹聚合物，这类聚合物识别位点的形状、功能基的精确排列与模板分子是互补 的，这是其高亲和性和高选择性的基础。m i p s 在形成预聚物和识别目标分子的 过程中均依赖共价键作用，共价键的较强作用使m i p s 获得了较高的特异性识别 能力，但同时也导致了模板分子难以洗脱，且所得m i p s 结合和解离的速度也慢， 不适合用于快速识别。若模板分子能以高百分比除去则是一类很好的功能材料， 对用于催化剂的聚合物来说，其内部结合基团的方向和孔穴中起催化作用的活 性基团极为重要，此情况下共价键结合作用较为有利。 在非共价型m i p s 中【1 1 ，模板分子与聚合物单体间预先自组织排列，通过非共 价键结合( 如氢键作用、静电作用、兀兀作用、疏水作用、金属一配体结合作用、 4 - h 第一章前言 电荷转移等超分子作用) 形成多点相互作用，聚合后这种作用被固定下来，然后 通过淋洗的方法除去模板分子，得到分子印迹聚合物。在形成预聚物和识别目 标分子的过程中依赖非共价键作用，它是通过超分子作用制备的仿生模型，其 分子识别特性主要决定于模板分子与印迹聚合物内功能基团间的离子键、氢键、 疏水作用等，结合机理类似于天然生物分子。由于非共价键作用强弱适中，容 易去除模板分子且识别速度很快，因而应用范围最为广泛。但是由于几种非共 价键作用的共同参与，会导致m i p s 形成不均匀的结合位点，降低m i p s 的特异性 识别能力。 半共价键型m i p s l 6 , 7 是先通过共价键相互作用形成空间精确排列的预聚物， 聚合后采用水解等方法破坏共价键后得到非共价型识别位点，识别过程中仅仅 依赖非共价键作用，该型m i p s 兼具了前两者的优势，它的制备有望成为新的研 究热点。 第二节分子印迹色谱固定相研究进展 在液相色谱中，填料颗粒的大小及均一程度是制约柱效的关键因素，而对 m i p 固定相而言，因其分离机理有别于传统固定相，分离性能的优劣除取决于 聚合物粒径大小及均一性之外，还与结合位点的均一性密切相关。液相色谱柱 的柱压降是评价柱的可行性的一个重要指标，一般情况在不影响柱的选择性和 柱效的条件下，柱压降越小越好【8 9 1 。固定相颗粒的大小不一会影响传质，导致 柱压降增大、柱效降低、寿命缩短；而结合位点不均一，即特异性和非特异性 结合位点同时存在，不仅会造成色谱峰拖尾，还会因基质中干扰物的非特异性 吸附致使定量分析不准确【l o 1 1 】。m i p s 的制备方法直接影响到聚合物粒径与结合 位点的均一性，因此，开创和优化m i p s 的制备方法是获得高效分子印迹固定相 的重要前提。 目前，制备m i p s 的方法有很多，如本体聚合法 1 2 】、沉淀聚合法 1 3 1 7 1 、原位 聚合法【1 8 之3 1 、悬浮聚合法【2 4 _ 2 7 1 、多步溶胀聚合法 2 8 - 3 2 1 、表面聚合法 3 3 4 0 】和溶胶 凝胶聚合法 4 5 】等。其中，本体聚合法是制备分子印迹聚合物的传统方法，它 是把印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂以一定的比例溶解于溶剂中，密封 5 第一章前言 后聚合得到多孔、刚性的块状聚合物，通过研磨、筛分和漂洗后得到不规则颗 粒( 通常粒径为2 5p m 左右) 。这种制备方法简单易操作，且设备要求不高；但 该方法的后处理步骤过于冗长，不利于大规模的生产，不仅浪费了原料，而且 得到的颗粒也不规则。由该法制备的m i p s 用作色谱柱固定相时，柱压降较高， 不利于快速分析，所以它已经逐渐被其它方法所取代。 分子印迹固定相的应用不仅有效解决了生物及环境等复杂分离体系中的基 质干扰问题，而且也为手性分离和直接进样检测技术提供了广阔的发展空间。 因此，高效液相色谱( h p l c ) 固定相是m 1 p s 的重要用途之一。m i p s 用作色谱 固定相必须具备三个条件：高选择性、高容量和良好的流体力学行为，而这些 性能很大程度上取决于制备方法和工艺的严格控制。本节详细阐述了国内外分 子印迹h p l c 固定相在制备方法和工艺流程上的最新进展情况，同时指出了各 种方法的亟需改进之处，并概括介绍了该领域的发展趋势。 1 2 1 沉淀聚合法 为获得预期特征的分子印迹聚合物微球，沉淀聚合是最容易和最适合的方 法之一。该法的基本操作步骤是在大量的致孔剂中，将模板、单体和交联剂混 在一起，然后聚合。在该法中，致孔剂的用量要远超过通常的本体聚合法，由 于反应体系较稀，未长成的聚合链无法占据容器的整个空间，从而导致了溶剂 中微溶胶颗粒的适度分散，同时所得的颗粒也具有较均匀的结合位点分布。该 法通常制备的颗粒直径大约为1i n n 左右，并不真正适用于h p l c 。最近相继有 不少研究使用该法制备了直径稍大的印迹微球，并获得了较理想的色谱分离效 果。w a n g 等【l 列采用沉淀聚合法合成了3 5 岬的印迹颗粒。印迹过程中交联剂 对最终颗粒尺寸会有很大的影响，y o s h i m a t s u 等【1 4 j 发现通过改变二乙烯苯( d v b ) 和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r i m ) 交联剂的比例，可精确控制聚合颗粒尺 寸，所制备的直径为1 2 - 2 4p , m 的印迹微球能用作h p l c 固定相。值得一提的是， 该法中两种不同交联剂组合使用的成功也为改变其它制备体系的颗粒尺寸提供 了新的可能性。w d 等【l5 j 通过严格控制聚合温度、交联剂种类及单体浓度等沉淀 聚合条件，制备了直径为3g m 的单分散1 71 3 雌二醇m i p s 微球，该微球用于 h p l c 固定相的分离效果要优于本体聚合法和多步溶胀聚合法制备的材料。据 6 第一章前言 c a c h o 掣1 6 】报道，沉淀聚合法所用模板会直接影响聚合物的几何形态，甚至能阻 止微球的形成。在相同的实验条件下，分别以非草隆和扑灭津为模板，通过沉 淀聚合法制备的聚合物在扫描电子显微镜下非草隆印迹聚合物呈分散的均一微 球状 1 岬) ，而扑灭津印迹聚合物则发生了颗粒的凝块。此外，s a m b e 等【1 7 】的 研究结果显示：功能单体也会影响沉淀聚合所得m i p s 的颗粒分散性。研究者使 用m a a 制备( s ) - 尼古丁m i p s 可获得直径为4 岬的单分散微球，非常适合用作 h p l c 固定相。而且，c a c h o 1 6 等通过l a n g m u i r - f r e u n d l i c h 等温线对m i p s 进行 表征后得出结论，沉淀聚合法更容易获得均匀一致的结合位点分布以及高亲和 能力。然而，该方法所得m i p s 的颗粒分散性仍然需要进行进一步的研究。 1 2 2 原位聚合法( 整体柱法) 2 0 世纪9 0 年代初期，m a t s u i 等【1 8 】提出原位聚合技术来制备用于色谱固定相 的分子印迹聚合物整体柱材料。该法的简便之处在于一步合成材料，即把分子 印迹过程中所用的试剂同时填装到不锈钢管内，在水浴加热情况下形成连续的 多孔棒状聚合物，无需传统方法中的研磨、分筛和柱填装等程序。该m i p s 的大 孔结构具有很好的流体动力学性质，分析重现性高，且对模板分子所需量很低， 因此较为经济。 在原位聚合法中，致孔剂的致孔效果决定了m i p s 多孔结构的性能优劣，因 此它的选择成为制备过程中的关键因素。作为致孔剂需要满足以下3 个条件 2 0 】： ( 1 ) 能溶解模板分子和功能单体；( 2 ) 能形成大的通孔和小的微孔，从而确保 流动相能在较低的压力下流过色谱柱，降低涡流扩散；( 3 ) 对模板分子与功能单 体之间的相互作用干扰小，反应过程中保持其化学稳定性。极性大的致孔剂会 严重干扰印迹过程中模板分子与功能单体间的氢键和静电作用，导致印迹效果 下降，色谱峰形较差，分离度降低；因此致孔剂的极性必须足够低才能保证不 影响模板和功能单体之间的相互作用。因而，致孔剂种类及其用量的精心筛选 是至关重要的。目前应用最多的致孔剂是甲苯、环己醇、正十二烷醇、四氢呋 喃、异辛烷等的混配液【1 9 - 2 3 1 。这种混配液通过调整比例，可满足不同整体印迹 聚合物对溶解性、极性、致孔效果的各种要求。对于某些分子印迹聚合物来说， 弱极性甲苯的存在大大增加了聚合物的比表面积。以不同比例的甲苯和正十二 7 第一章前言 烷醇为致孔剂，制备成的金鸡纳碱【1 9 】、氨基酸衍生物【1 9 】、辛可 【1 8 1 、士的宁【2 1 】 和烟酰胺【2 2 】分子印迹整体柱，都获得了较好的分离效果。其中，辛可宁分子印 迹整体柱在流速为2 0m l m i n 。时，背压降至1 0 8m p a ：烟酰胺分子印迹整体柱 还实现了烟酰胺与烟酸在2m i n 内的快速分离。l i 等【2 3 】以体积比为1 ：3 的异辛 烷和四氢呋喃制备了绿原酸的分子印迹整体柱，成功地分离和纯化了杜仲叶提 取液中的绿原酸。周杰等【9 】选用正十二醇和环己醇作致孔剂制备了连续棒型( i 萘基) 己胺印迹整体柱，与化学组成相同的非模板聚合物的柱压降相比，模板聚 合物的柱压降明显要低3 , - - , 4 5 倍。在原位聚合中，功能单体的筛选对m i p s 也有 重要影响。s e e b a c h 等【2 4 研究证明模板和功能单体之间的强烈相互作用并不能自 动导致m i p s 的高选择性。他们发现乙烯基咪唑( 1 - v i ) 与模板z l 苯丙氨酸 ( z l p h e ) 之间的相互作用比乙烯基吡啶( 4 v p y ) 强烈，但以1 为功能单 体的聚合物对两种z p h e 对映体的分辨率却较低。 尽管某些整体填料的应用获得了较好的分离效果，但是峰形却并未得到预期 的改善，这可能是由于无法精确控制整体柱材料孔隙的尺寸所致。而且，有些 制备整体柱材料遇到了高柱压、低效率的难题，这就限制了它在实际分离过程 中的应用。 1 2 3 悬浮聚合法 悬浮聚合法是制备球形聚合物普遍采用的方法。该法通常是将加入单体的 有机介质与过量4 l o 倍的悬浮稳定剂( 如聚乙烯醇) 的水介质混合。两相通过 搅拌充分混合，形成悬浮于水相的有机液滴，聚合物的最终球形尺寸就取决于 这些液滴的尺寸。目前，使用悬浮聚合法在水相中制备印迹微球还较为少见， 这是由于水的存在干扰了模板分子和单体间的非共价相互作用( 如氢键作用) 。 为了克服由水产生的相关问题，m a y e s 等【2 5 】提出了使用液相碳氟化合物来分散印 迹混合物的液滴。该法通过加入不同量的稳定剂，得到的聚合物颗粒尺寸可被 控制在大约5 5 0 岬之间。进一步的色谱研究证实了它们在5m l r a i n 。1 的高流速 下具有良好的预期效果，这是传统的研磨分筛聚合物所不能达到的。在液相碳 氟化合物作为分散介质的聚合体系中，a n s e l l 等 2 6 】还研究了致孔剂对印迹固定相 分离效果的影响，结果发现1 ，2 二氯乙烷致孔剂所形成的直径大约1 5 1g m 的微球 第一章前言 可以实现b o c l p h e 的基线分离。虽然该法是合成球形印迹聚合物的通用方法， 但由于聚合时球形表面的氟表面活性剂层发生了共价接枝，所得聚合物有大量 的非特异性结合位点，从而在目标分析物的再结合过程中出现了非特性吸附。 l a i 等【2 刁的研究表明，如果模板与单体的非共价键作用足够强烈，尤其是静 电和疏水作用的参与，悬浮聚合法完全可以在水相中制备出印迹微球，这样就 避免了液相碳氟化合物产生的一系列负面问题。该法制备的非共价键微球己被 成功地应用到4 氨基吡啶、2 氨基吡啶的色谱分离和检测中。根据同样的机理， 利用模板和功能单体之间形成离子键相互作用和疏水性作用，他们为酸性的吲 哚美辛药物模板分子选择碱性的4 乙烯基吡啶作为功能单体，在水溶液中成功地 获得了5 1 8 岬的印迹固定相微球【z 8 j 。 影响悬浮聚合法成球粒径和识别效果的因素极其复杂，其中表面活性剂起 着尤其重要的作用，因此设计与开发新型表面活性剂将可能成为该法在水相中 印迹的一个新突破。 1 2 4 多步溶胀聚合法 多步溶胀聚合法是将一定粒径的聚苯乙烯种粒加到大量水中，形成水分散 体系，然后通过逐阶加入不同的微乳液在搅拌条件下令种粒发生多步溶胀，最 后在氮气、氩气等惰性气流的吹扫保护下经光、热等引发方式完成聚合，经水、 甲醇、四氢呋喃等洗涤后去除模板则获得球形m i p s 。功能单体、引发剂、致孔 剂和模板分子分别在不同的溶胀步骤中以微乳液的形式加入到种粒的分散体系 中，为使这些物质充分的反应必须经过长时间的搅拌过程。同时，为了保持微 乳液的高度分散，需要加入适当的稳定剂( 如邻苯甲二酸二丁酯) 和活化剂( 如 聚乙烯醇) 。同时可以通过改变实验条件( 如调整各分散相的体积比) ，可以控 制印迹微球的尺寸大小。女l l s a m b e 等【2 9 】研究调整苯乙烯种粒和邻苯甲二酸二丁酯 的体积比，分别得到了5 5p , m 和9 帅的印迹微球。多步溶胀聚合法获得的m i p s 结合位点更趋于在印迹微球的表面分布，有利于提高色谱传质和进行表面修饰。 郭天瑛等口o j 采用该法制备7 n 苯甲氧羰基色氨酸f n c b z l t a p ) 单分散m i p s ，经 表征该m i p s 的手性识别空穴更多地分布在微球的表面上，有利于色谱分离的应 用。s a m b e 等四一l j 用二甲基丙烯酸甘油酯( g d m a ) 、单甲基丙烯酸甘油酯 9 第一章前言 ( g m m a ) 对i r g a r o l ( 杀藻剂) 和同位素标记双酚a ( b p a ) 的m i p s 进行了亲水外 层选择表面修饰，获得了均一尺寸的限进介质分子印迹聚合物( r a m m i p s ) ，该 r a m m i p s 可排除样品中大分子蛋白质干扰物，能实现h p l c 的直接进样检测。 e 等 3 2 , 3 3 用极性单体甲基丙烯酸3 丙磺基酯( m a s ) 修饰1 7 b 一雌二醇替代模 板6 k e t o e c r a d i o l 和b p a 替代模板4 ，47 亚甲基双酚的m i p s ，应用于h p l c 直接进样 检测江水中的b p a 时，防止了水中阴离子干扰物对痕量分析的严重影响。 一般来说，该方法适合用于单分散印迹微球的大量合成，但是其制备工序 也是最繁琐费时的，大多要经过数十小时的搅拌才能完成。在不影响印迹微球 的性能的前提下，缩短该方法耗用时间的相关研究还未见报道。 1 2 5 表面聚合法 表面聚合法目前有两种基本形式：一是聚合过程发生于预制颗粒( 如硅胶， 硅烷，三氟甲基苯，树脂) 的孔隙内；二是在硅胶颗粒等支撑材料的表面进行 接枝共聚。预制颗粒的孔内聚合是把孔隙当作微反应器，在这个反应器内发生 的是微型的本体聚合过程。市售硅胶粒子因其尺寸均一、多孔隙的特点而获得 了普遍的应用。2 0 0 2 年，y i l m a z 等j 首次报道了该法制各的异丙肾上腺素m i p s ， 其简要过程是：首先，用聚合混合物( 模板、单体、交联剂、引发剂和溶剂) 通过适度的真空、超声、或者轻微的搅拌来填充预制颗粒的孔隙；然后，加热 引发聚合，所生成复合颗粒的大小和形状将会与预制硅胶颗粒相同；硅胶被h f 酸溶解去除后，即得到仅由m i p s 构成的印迹微球。与传统方法相比，新法获得 的球形分子印迹聚合物用作液相色谱的固定相，显著降低了柱压降，提高了传 质和理论塔板数，但是，峰展宽和拖尾现象仍然存在。 以硅胶为支撑体的分子印迹薄膜接枝技术虽然提出的时间不长，但在制备 色谱固定相的应用上却获得了较迅速的发展。用偶氮引发剂或二乙基二硫代氨 基甲酸酯引发转移终止剂来修饰印迹薄膜的表面，能够改善球形m i p s 的动力学 性质 3 5 ，3 6 1 。该法对价格昂贵的模板分子和功能单体的需要量比传统方法低很多， 因此比较经济。该法还适合在水相中进行印迹，并且使用硅胶作为支撑体解决 了水相中m i p s 刚性不足的技术难题，使所得m i p s 能更理想地应用于h p l c 。 日本k o m i y a m a 研究小组一直致力于该类m i p s 的研究工作，并取得了很大的成 1 0 第一章前言 功3 ”。制备0 - 环糊精印迹聚合物的简要过程如图1 4 所示 e 鼍壁 分匾 一 詈譬透 图1 4 环糊精印迹聚合物在硅胶表面上的固定 首先将硅胶用三氯乙烯基硅烷f f c v s ) l 烯化，然后加入乙烯化的环糊精模 板复合物和m b a a m 以及引发剂进行处理，去除模板则得到需要的分子印迹聚 合物。由于三氯乙烯基硅烷修饰剂的使用存在下面两个主要问题：其一是三氯 乙烯基硅烷的低聚合反应活性导致了环糊精聚合物不能以共价键的形式被固化 于硅胶表面，在逐渐流失的过程中引起柱压升高；其次，由于三氯乙烯基硅烷 的高疏水性，水将会被从修饰粒子的表面捧出，在失去水可溶性的前提下，无 法在硅胶表面引入足量乙烯基。因此k o n l i y a m a 研究小组选择了反应活性更高的 3 一甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷( t p a a m ) 作为表面修饰剂，使印迹聚合物 被更牢固的固定于硅胶的表面。 表面聚合法可谓是获得球形分子印迹颗粒的捷径，该方法制各的色谱固定 相性能优良，而且充分显示了在对映体分离方面的优势，有望成为制备分子印 迹色谱固定相的一种最普遍的方法。 126 溶胶凝胶聚合法 溶胶凝胶聚合法”是利用溶胶凝胶技术，将模扳分子引入到无机网络结构 中的方法。该法可形成剐性较好的无机或无机- 有机杂化的分子印迹材料，其无 第一章前言 机基体网络是由原硅酸四乙酯( t e o s ) 等金属醇盐在水溶液中通过酸或碱催化 水解和缩聚而形成的，这与前面的有机印迹聚合法有显著的差别。将三烷氧基 硅烷基引入到有机聚合物中需要选择合适的乙烯基硅烷衍生物，l j j l 等【4 3 】利用乙烯 基三甲氧基硅烷删o s ) 制备了咖啡因的印迹聚合物，并且通过六甲基二硅氮烷 ( h m d s ) 和三甲基氯硅烷( c t m s ) 对m a a m v t m o s m i p s 进行了封端处理( 如图 1 5 所示) ，获得的m i p s 经过分析可作为h p l c 的固定相。 人，r ，删i ! i o 一l 。一 l l o 器。 、i a - 衅。- c 冒 i 潞 t e o 图1 5 有机无机复合体m i p s 的合成流程 溶胶凝胶聚合中的各参数对m i p s 性能影响很大，w e i 等 4 4 1 研究发现在溶胶 凝胶过程中，以乳酸为致孔剂可提高咖啡因m i p s 的孔隙率；以碱为催化剂可增 强m i p s 对咖啡因的选择性，被优化的两种m i p s 均可用于h p l c 固定相。然而，随 机聚合会使功能单体及其官能团被包埋在基体内部，导致结合位点的可及度很 差，这对吸附解吸动力学是非常不利的。有效的解决办法是发展溶胶凝胶表面 聚合，即令结合位点尽可能分布在m i p s 的表面。h a r t 等【4 5 】将五氯苯酚( p c p ) 模 1 2 第一章前言 板与 ，氨丙基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅先后混合，在酸催化的情况下令聚合物 在活化的硅胶表面接枝，从而制得了分离p c p 的分子印迹溶胶凝胶材料，用作柱 切换h p l c 的预柱固定相后，当分离1 0p g m l d 的p c p 时，r s d 为3 8 。溶胶凝 胶聚合法制备的m i p s 刚性较强，对目标分子有极高的亲和力和选择性，并且有 利于识别一些过渡金属离子及金属络合物【4 刮，这是有机聚合所不具备的优势。 但目前该法在h p l c 中的应用并不多见。 1 2 7 展望 目前为止，各种见诸文献的m i p s 都是通过不同的方法并以不同的模板单体 复合体制备而成，这就给筛选不同形式的m i p s 造成了困难。最近，o x e l b a r k 等 m r 通过本体聚合法、沉淀聚合法、表面聚合法和原位聚合法制备成不同形式的 布比卡因m i p s ，并比较了这些m i p s 固定相在色谱性能上的优劣。该研究结果 表明：尽管本体聚合法繁琐费时、浪费原料、具有较多的非特异性吸附位点， 但在以水为流动相的h p l c 分析中，本体聚合获得的不规则印迹颗粒仍然具有 很高的印迹因子；而沉淀聚合法制备的印迹微球，用作h p l c 无法满足尺寸大 小和分子识别性能上的要求，需要进一步精细的优化制备条件才有望实现h p l c 应用；表面接枝聚合和表面封端聚合得到的m i p s 微球及毛细管整料具有很快的 色谱分离速度和良好的分析重现性，相对于本体聚合来讲还大大降低了非特异 性吸附，但是硅胶微球支撑体和毛细管材料支撑体的制备使这两种形式的m i p s 在合成工艺上略显复杂。虽然该研究中不同形式m i p s 性能优劣上的比较未必适 合其它单体模板系统，但却证明了常见的单体模板组合可以通过不同形式进行 印迹。 分子印迹固定相的应用使h p l c 在手性分离和直接进样检测方面的优势得 到了显著的发挥和延伸。最近几年内，环糊精功能单体的应用和各种印迹技术 的迅速发展使m i p s 正逐渐突破了难以在水中进行印迹和识别的局限性，这为水 中肽、抗生素或蛋白等天然纳米级大分子靶标物的识别提供了有利条件。同位 素标记技术与分子印迹技术的结合，提高了痕量检测的灵敏度和重现性 2 9 , 3 1 j 。此 外，各种各样的表面修饰技术【2 9 , 3 1 - 3 3 不仅使聚合物表面结合位点更为均一，而且 还能排除复杂基质的严重干扰，可实现直接进样检测。人工神经网络技术对m i p s 1 3 第一章前言 印迹因子的定量预测能力可以更敏锐地洞察模板和功能单体之间相互作用的可 行性，从而为评价m i p s 和筛选合适的功能单体提供了迅捷的途径【4 8 】。随着各种 制备m i p s 技术的相继涌现以及相关理论研究的不断深入，分离包含几个手性中 心的手性化合物的难题借助于高选择性的m i p s 将有望解决。h p l c 分子印迹固定 相的色谱性能的进一步提升将依赖于m i p s 技术在热力学和动力学理论上的日趋 完善。目前对分子印迹固定相的蛋白质分离机制还缺乏系统的探讨，急需蛋白 质印迹固定相在制备方法上和理论研究上出现新突破。 第三节蛋白质分子印迹 1 3 1 蛋白质分子印迹概述 近几十年来生化分离技术有了飞速的发展，人们根据不同的原理开发出了 很多新型的分离技术，如根据分子大小进行分离的凝胶过滤层析和s d s p a g e 电 泳，根据分子等电点进行分离的等电聚焦电泳，根据分子带电性质进行分离的 离子交换色谱，根据分子疏水性质进行分离的疏水色谱和反相色谱，根据生物 分子亲和性进行分离的亲和分离技术等等。其中生物亲和分离的特异性最好， 但由于生物亲和物质的发现和分离十分困难，人们一直希望能够人工合成具有 类似生物分子亲和识别能力的介质，而根据分子的大小、空间结构和电荷分布 进行分离的分子印迹技术使得这一希望很可能得到实现。 从2 0 世纪7 0 年代开始，随着w u l f f f l 】和m o s b a c h 【2 】等人在分子印迹技术领域的 开拓性工作，这一技术得到了蓬勃发展，分子印迹技术由于其卓越的分子识别 性能已成为一个热门研究课题。许多期刊【4 9 5 仉5 3 1 和系列丛书1 5 4 - 5 刀都对分子印迹 做过综述，与分子印迹相关的原始文章和专利还在不断增加【5 8 1 。一般地，带有 多功能基团的小模板分子( m w s l o o o ) 能获得亲和性和特异性都较高l 拘m i p s l 5 9 】： 尽管目前分子印迹总体上发展态势比较好，但是具有重要商业价值的蛋白质印 迹研究却仍处于起步阶段。 1 。3 1 1 蛋白质分子印迹研究的意义 1 4 第一章前言 特异性分子识别是掌控生物形状和功能的基本过程，但这种重要而普遍存 在的生物现象在蛋白质印迹中出现了问