（分析化学专业论文）芯片毛细管电泳原子荧光在线联用新技术.pdf

南开大学博士学位论文 摘要 本论文旨在发展微流控芯片毛细管电泳( c h i p c e ) - 原子荧光( a f s ) 、流动注射( f i ) 进样微型毛细管电泳a f s 在线联用新技术，为元素形态分析建立简便快速、经济 可靠的新技术平台，扩大c h i p c e 的应用范围。内容包括以下五章： 第一章为绪论。简要介绍了芯片毛细管电泳，并就当前微流控分析中常用的光 谱检测方法做了简要综述。同时讨论了f i 进样微流控毛细管电泳联用技术、接口 技术以及在形态分析中的应用。 第二章成功实现了将具有分离速度快、分离效率高的c h i p c e 与高灵敏度的元 素选择性检测器a f s 在线联用。为解决c h i p c e 和a f s 流速的不匹配，将修饰液 通道直接刻蚀在芯片上。通过设计新颖的“管套管”式的套管流接口，保证了后续 挥发性物种发生( v s g ) 、氢化物发生( h g ) 和及时传输，消除了整个体系可能产生的 反压对微芯片分离的影响。考察了芯片结构、气液分离器大小以及原子化器内径大 小等因素对分离的影响。 第三章建立了c h i p c e v s g - a f s 在线联用技术应用于h g ( i i ) 和m e h g ( i ) 快速形 态分析的新方法。选用3 0m m o ll h 3 8 0 3 + 8 v vc h 3 0 h ( p h9 - 3 6 ) 缓冲体系，采 用夹流进样，3 0 0 0 v 分离电压( 7 0 抑流电压) 下实现了h g ( i i ) 和m e h g ( i ) 的基线分离。 2m gl 。1 h g ( i i ) 和4m gl 。m e h g ( i ) 混合物迁移时间、峰高和峰面积的精密度( r s d ，n = 5 ) 范围分别为o 7 0 9 ，1 5 1 8 ，2 1 一2 9 。h g ( i i ) 和m e h g ( i ) 的检出限( 3 g ) 分剐为5 3 芦g l “和1 6 1 芦g l 。 第四章提出了c h i p c e h g a f s 在线联用新技术进行无机砷物种a s ( i i i ) 和a s ( v ) 快速形态分析的新方法。为实现a s ( i i i ) 和a s ( v ) 的进样、分离，采用阳离子表面活 性剂溴化十六烷基三甲铵( c t a b ) 动态修饰芯片通道以使电渗流( e o f ) 反向。选择2 5 m m 0 1l 1 h 3 8 0 3 + o 4m m o ll 以c t a b ( p h8 9 ) 缓冲体系、夹流进样和“反极性”分 离，实现了a s ( i i i ) 和a s ( v ) 的基线分离。无机砷物种浓度为3 om gl “时，迁移时间、 峰高和峰面积的精密度( r s d ，n = 5 ) 分别为1 4 1 9 ，1 8 2 - 3 ，2 1 一2 7 ，检 出限( 3 0 ) 为7 6 1 1 2 gl 。 第五章提出了f i 进样微型毛细管电泳a f s 在线联用新技术。通过设计简单新 李峰：芯片毛细管电泳一原子荧光在线联用新技术 颖的f i 微型c e 和微型c e v s g a f s 两个接口，将高效率进样及在线溶液处理手段 f i 、快速分离的微型c e 和高灵敏度元素选择性检测器a f s 联用于一体。使用8c m 长，5 0 f m 内径的毛细管，选择2 5m m 0 1l 。1h 3 8 0 3 + l o v vc h 3 0 h ( p h9 3 5 ) 缓冲 体系，试样区带通过接口时电动分流，在进样与分离阶段均施加3 0 0 0v 恒定电压 实现了h g ( i i ) 和m e h g ( i ) 的基线分离。该方法样品通量为6 0h ，2m gl 。h g ( i i ) 和4 m gl 。1m e h g ( i ) 混合物迁移时间、峰面积和峰高的精密度( r s d ，疗= 1 2 ) 分别为 o 7 o 9 ，3 8 4 2 ，2 1 3 5 ，检出限( 3 a ) 分别为1 0 0 gl 。和2 0 0 gl 。 关键词：联用技术；形态分析：芯片毛细管电泳；原子荧光光谱法：流动注射；汞；砷 i l 南开大学博士学位论文 a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nr e p r e s e n t st l l ef i r s ts t l l d yo nd i r e c ti n t e r f k i n go fm i c r o f l u i d i c c h i p - b a s e dc 印i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c h i p c e ) t oas e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ed e t e c t o r ，a t o m i c f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y ( a f s ) f o rr a p i ds p e c i a t i o na r l a l y s i s ah y p h e n a t e ds y s t e mc o u p l i n g n o w 屿e c t i o n ( f i ) ，c 叩i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) a n da f si sa l s op r o p o s e d i tc o n s i s t so ft h e f o l l o w i n gf i v ec h a p t e r s i nc h a p t e r1 ，也er 印i da c c e p t a i l c eo fm i c r o n u i d i cc h i ps y s t e mw a sr e v i e 、v e dw i t h e m p l l a s i s o nt h et h r c ep o t e m i a l卸d p o w e r f u ls p e c o m e 啊c d e t e c t i o nm e t l l o d 0 1 0 9 y ： i a s e r i n d u c e dn u o r e s c e n c e ( l i f ) ，c h e m i l u m i n e s e n c e ( c l ) a i l dm a s ss p e c t m m e 信y ( m s ) h y p h e n a t e ds y s t e mc o u p l i n gf ia n dc ew a sa l s or e v i e w e di nl i g h to ft h ei n t e 嘞c ed e s i g f la n d i t s 印p l i c a t i o n i nc h a p t e r2 ，an e wo n l i n eh y p h e n a t e dt e c h n i q u eb 髂e do nc h i p c ea n da f sw a s d e v e l o p e d t of a c i l “a t et h ec h i p c ee m u e n td e l i v e r ya n dt op r o v i d et h en e c e s s a r ym e d i u m f o rs u b s e q u e n tv o l a t i l es p e c i e sg e n e r a t i o n ，d i l u t e dh c ls 0 1 u t i o n 、硼si n t r o d u c e do n l ec h i pa s t h em a k e u ps o l u t i o n t h ec h i p - c e a f s 锄：e r f k e 、v a sc o n s 虹u c t c do nt h cb a s i so fac o n c e n 廿i c “t u b e - i n t u b e ”d e s i g l lf o ri i n r o d u c 遍gak b h 4s 0 1 u t i o na r o l l n dt h ec h i pe m u e n ta ss h e a t hn o w a 1 1 dr e d u c t a l l tf o rv o l a t i l es p e c i e sg e n e r a t i o n 越w e l l t h eg e n e r a t e dv o l a t i l es p e c i e sr e s u l t i n g f r o m 血er e a c t i o no ft h ec l l i p - c ee m mm dt h es h e a t hn o w 、v e r es c p a r a t e df 沁mt l l e r e a c t i o nm i x t i l r emag a s l i q u i ds 印戤a t o r 锄ds w e p ti n 加t h ea f sa t o m i z e rb ya 1 1a r g o nn o w f o ra f sd e t 咖i n a t i o n s o m ei m p o r t a n tp f a c t i c a la s p e c t sf o rm eo n l i n ec o u p l i n go fc h i p - c e t oa f sw e r ec r i t i c a l l yd i s c u s s e d 1 h e s ci n c l u d ea d a p t a t i o no fc o n v e n t i o n a la t o m i c n u o r e s c e n c es p e c t r o m e t e rf o rc h i p - c e ，d e s i g no ft h ec 1 1 i p ，c h i p a f si n t e r f a c e ，g a s - l i q u i d s 印a r a t o f ，a f s 呦啦z e ra n de l i m i n a t i o no f 血eb a c k p r c s s w eo nc h i p c es e p 姗n o n i nc h a p t e r3 ，t h ed “e l o p e d h y 蜥dt e c l l n i q u e 啪sa p p l i e dt or a p i ds p e c i a t i o na i l a l y s i so f t w oe n v i r o n m e n t a l l ya n dt o 菇c o l o g i c a l l yi m p o n a n ts p e c i e si i l o 唱a 1 1 i cm e r c u r y ( h g ( i i ) ) a n d m 咖l m e r c u r y ( m e h g ( i ) ) t h ee l e c 订o p h o r e s i sb u 行e rc o i l s i s t e do f3 0m m o ll - ib o r i ca c i d a n d8 v vm e t 啪o l ( p h = 9 3 6 ) s 锄p l ei n 打o d u c t i o nw a sa c h i “e db ye l e c t r o k i n e t i c 岫e c t i o n b o t l lm e r c u r ys p e c i e sw e r eb a s e l i n es e p 甜砷阳鹊m e i rc y s t e i n ec o m p l e x e sw i t h i n6 4 su s i n g3 0 0 0va sm es e p 踟t i o nv o l 诅g e ( 7 0 o f 龇s 印a r a t i o nv o l 协g ea sp u l lb a c kv o l t a g e ) i 李峰：芯片毛细管电泳一原子荧光在线联用新技术 1 1 1 ep r e c i s i o n ( r s d ，n = 5 ) o f i i l i 耐i o nt i m e ，p e a ka r c a ，a n dp e a kh e i g h tf o r2m gl “h g ( i i ) a n d4m gl 叫m e h g ( i ) ( 嬲h g ) r 觚g e dn 砌0 7t o0 9 ，2 ，1t o2 9 ，a | 1 d1 5t o1 ，8 ， r e s p e c t i v e l y t h ed e t c c t i o n1 i m i t ( 3 a ) w a s5 3a n d1 6 1m gl “( 船h g ) f o rh g ( i i ) a r i dm e h g ( i ) ， r e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r i e so ft h es p i k e so fm e r c u r ys p e c i e si nf o u rl o c a i l yc o l l e c t e dw a t e r s a m p i e sr a i l g e d 舶m9 2 10 8 i nc h 印t e r4 ，an o v e lm e t l l o df o rs p e c i a l j o na n a l y s i so fi n o 唱a 】1 i ca r s e n i cw a sp r o p o s e d u s i n gt h ed e v e l o p e do n 一1 i n eh y p h e n a 刚t e c h n o l o g y b a s e l i n es e p a r “o no fa s ( i i i ) a n da s ( v ) 、v a sa c l l i e v e dw i 也i n5 4sb yt h ec h i p c ei na9 0i n mu n c o a t e dc h a 衄e la t2 5 0 0vu s i n ga m i x t u r co f2 5m m 0 1l 1h 3 8 0 3a 1 1 d0 4m m o ll c t a b ( p h8 9 ) a se l e c t r o l y t eb u f r e lt h e p r e c i s i o n s ( r s d ，n = 5 ) m g e d 舶m1 9 t o1 4 f o r m i g 枷o n t i m e ，2 it o2 7 衙p e a k a r c a ， a n d1 8t o2 3 f o rp e a kh e i g h tf o rt h et w o8 r s e n i cs p e c i e sa t3 0m gl 1 ( a sa s ) l e v e l t h e d e t e c t i o nl i m i t s ( 3 a ) f o ra s ( i i i ) a n da s ( v ) b 船e do np e a kh e i g h tm e a s u r e m e n tw e r e7 6a n d 1 1 2 掣gl q ( 觞a s ) ，r e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r i e so f 也es p i k e s ( 1m gl - 1 ( a sa s ) o f a s ( i i i ) a 1 1 d a s ( v ) ) i n 南u ri o c a l i yc o i i e c t e dw a t e rs a m p l e sr a n g e df 0 m9 3 7 一1 0 6 i nc h 印t e r5 ，ah y p h e n a t e d s y s t e mc o u p l i n gf i ，c ea n da f sw a sd e s c 曲e d 了1 w o i n t e r f k e sw c r ed e v e l o p c dt oc o u p l ea l lt h r c es y s t e m s ：t h ef i r s tt oc o u p l ef it oc ea n dt h e s e c o n dt oc o u p l ec et oa f s n e6 r s ti n t c 以c ew a sam o d i f i e df l o wt 1 1 r o u 曲c h a r n b e r 谢t h m i c r o c h a n n c l ( o 5m mi d ) c o n n e c t i n gt 1 1 ef is y s t c r nt ot h ec a p i l l a r yi n l e t t h ec a p i l l a r y o u t l e tu 毽sc o u p l e dt 0 1 ea f sb yu s i n gt 1 1 es e c o n dc o n c e n t r i c “t u b e i n t u b e i n t e r f 2 l c e s p l j l s a n l p l i n gw a sa c h i e v e di nm ee l e c t r o k i n e t i cm o d ew h e ns a m p l ez o n ep a s s e db yt h ec a p i l l a r ) t i n l e t av o l a t i l e s p e c i e sg e n e r a t i o n ( v s g ) t e c h j d q u ew 船e m p l o y e dt oc o n v e r tt h ea n a l y t e s 丹o mt h ec ee m u e n ti m om e i rr e s p e c t i v ev o l a m es p e c i e s s e p a r a t i o no fi n o 嘻a n i cm e r c u r y a i l dm e m y l m e r c u r y 忸sp e r f 0 彻e d 讯t ha i l8c ml o n gc 印i l l a r y ( 5 0 胛i d ) 、i t h3 0 0 0v w i t l l i n6 0s t h ep r e c i s i o n s ( r s d ，n = 1 2 ) w e r ci nt h e 舢g eo f0 7 0 9 f o rm i 掣a t i o nt i m e ， 3 8 4 2 f o rp e a ka r e a ，a n d2 1 - 3 5 f o rp e a kh e i g h t n l ed e t e c t i o n1 i m i t s ( 3 a ) w e r e0 1a n d o 2 gm l “f o ri n o r g a n i ca i l dm e t h y l m e r c u r y t h er e c o v e r i e so f b o n lm e r c u r ys p e c i e si nt h e w a t c rs 锄p l e sw e r ei nm cr 鼬g eo f 9 3 1 0 6 k e ”，o r d s ：h y p b e n a t e dt e d m i q u e ；s p e c i a t i o na i 】a 】y s i s ；c b i p - b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o 砷o r e s j s ； a t o m i cn u o r e s c e n c es p e c 仃o m e 廿y ；f l o wi n j e 嘶o n ；m e r c u r y ；m s c n i c i v 南开大学博士学位论文 第一章绪论 1 1 引言 2 0 世纪9 0 年初，由瑞士的m a n z 和w i d m e r 首次提出了“微型全分析系统” ( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，或m i c r ot o t a la j l a l y s i ss y s t e m ，t a s ) 【1 2 1 概念。 在短短的十几年里，t a s 已发展成为当前世界上最前沿的科技领域之一，而微流控 芯片( m i c r o n u i d i cc h i p s ) 是t a s 中当前最活跃的领域和发展前沿 3 酣。 微流控分析是当前十分活跃的领域，代表着二十一世纪分析仪器走向微型化 ( m i n i a t u r i z a t i o n ) 、集成化( i m e g r a t i o n ) 与便携化( p o r t a b l e ) 的发展方向，即把整个实验 室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在可多次使用的微 芯片上。近年来，以毛细管电泳为核心技术、以芯片为操作平台的微流控芯片毛细 管电泳( c h i p c e ) 技术迅速崛起，成为一个极为活跃的热点f ”。 微流控芯片分析系统具有分离效率高、分析速度快、试剂消耗量少、易于微型 化和便于携带等优点，为其在细胞培养及操纵【引、临床诊断【射、免疫分析1 、蛋白质 分析【l l 】、d n a 测序【1 2 1 和聚合酶链反应【1 3 。4 】等方面的应用提供了广阔的前景。目前， 微流控芯片分析系统遇到的一个主要困难是检测。由于进样量少，因而要求检测器 具有很高的检测灵敏度。因此，寻求高灵敏度的检测技术成为微流控芯片分析系统 发展的关键问题之一。 由于本工作的主要内容是有关微流控芯片毛细管电泳原子荧光联用技术以及其 在元素形态分析中的应用研究，因此以下简单介绍芯片毛细管电泳，并就当前微流 控分析中常用的光谱检测方法、接口技术以及在形态分析中的应用做一简要综述。 1 2 芯片毛细管电泳 芯片毛细管电泳( c h i p - b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c h i p c e ) 是在玻璃、石 英、硅、塑料等芯片的微细通道或色谱柱中，以电场为驱动力，借助于离子或分子 在电迁移或分配行为上的差异，对复杂试样中的多种组分进行高速分离分析的技术 ”。c h i p c e 与常规毛细管电泳的区别在于c h i p c e 以芯片为核心，在平面芯片的微 细通道中进行高效、快速的电泳分离是其特殊性所在。 李峰；芯片毛细管电泳原子荧光在线联用新技术 芯片毛细管电泳具有很多突出的优点。首先，微机电加工技术( m i c r o e l e c t r o - m e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 已经成熟，为在芯片上加工出微米级的分离通道及各种 分析单元提供了坚实的基础。其次，芯片通道截面积小、比表面积大的特点使其具 有良好的散热性能，可以有效地散除电泳分离时产生的焦耳热，从而可以在通道中 施加常规毛细管电泳难以达到的高场强从而实现高效、快速的分离。再次，它能与 激光诱导荧光、化学发光及质谱等高灵敏度的检测器联用。因此，结合芯片的小体 积进样( p l n l ) ，芯片毛细管电泳分析具有微型、快速、低耗的特点，可以方便地进 行各种复杂试样中的微痕量成份的分离与测定。 常见的芯片毛细管电泳分离模式主要包括毛细管区带电泳( c z e ) 、胶束电动毛细 管色谱( m e c c ) 、毛细管凝胶电泳( c g e ) 、毛细管等电聚焦( c i e f ) 、毛细管等速电泳 ( c i t p ) 等。其中，芯片毛细管区带电泳( c z e ) 由于操作简单、多样化，是目前c h i p c e 中最基本也是应用最为广泛的一种方式。尤其是在有关小分子量离子型化合物的 分离分析中，这一分离模式目前仍占主要地位。 关于c h i p c e 的理论基础、样品的引入等知识，方肇伦等 6 l 已经在其专著中做 了详实阐述，在此不再赘述。 1 3 微流控芯片毛细管电泳检测方法 与传统的仪器分析系统相比，由于微流控芯片分析系统中，可供检测物质的进 样量仅为纳升甚至皮升级，且检测的区域一般非常的小，而且分析检测多在秒级甚 至更短的时间内完成故对其检测的灵敏度和响应速度要求很高。有关检测方法的 研究已成为微流控研究领域中的重点和热点。虽然电化学检测器可集成于芯片上， 但当前微流控分析中应用最广泛、最有效的是光谱检测方法。其中，又以激光诱导 荧光、化学发光及质谱三种检测方法的应用最为突出郾15 。2 。 1 3 1 激光诱导荧光法 激光诱导荧光法( 1 a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 是目前公认的最灵敏的方法之 一，具有良好的选择性和较宽的线性范围，可进行单分子检测，这恰好与t a s 对检 测方法的要求相匹配。因此，l i f 检测成为川t a s 中应用最早、至今仍然应用较多的 检测方法【22 1 。其在芯片上的检测与在一般毛细管电泳中的用法基本相同，按照光学 系统分为共聚焦和非共聚焦l i f 两种。图1 1 为微流控毛细管电泳芯片中摄常用的典 2 南开大学博士学位论文 型共聚焦l i f 示意图，由共聚焦显微镜作为光学系统，主要由二向色镜、聚光透镜、 干涉滤光片等构成。先用显微镜物镜把入射激光光束聚焦在微通道检测区域，激发 所产生的荧光用同轴且共焦的显微目镜聚焦到光电倍增管( p m t ) 上完成检测。而非共 聚焦l i f 【2 3 】是将激光从与芯片平面成4 5o 夹角并垂直于微通道的方向照射检测区域， 产生的荧光信号与激发光成1 3 5o 夹角的方向收集。 f i g u r el 1 c o f o c a le p i n u o r e s c e n c es e t u po fl i fd e t e c t i o no nc h i p l 2 引 利用高灵敏度的激光诱导荧光检测，人们做了大量的工作口3 4 叭。j a c o b s o n 等f 2 3 ，2 4 1 利用氩离子激光器为激发光源，较早开展了芯片上罗丹明b 和荧光黄的分离、d n a 限 制片断的分离和l i f 检测。e f f c n h a u s e r 等【2 5 】采用光子计数技术提高l i f 灵敏度，检测 d n a 限制片断，检测限达1 0 2 1m o l 水平。d a s g u p t a 等【2 6 l 和w a n g 等【2 7 】报道了液芯波导 技术，分别用于两种染料、荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) 标记的氨基酸的分离和高灵敏 度的l i f 检测。f i s t e r 等 2 8 】报道了在芯片分离荧光素罗丹明6 g 和罗丹明b ，并实现了 小分子的超高灵敏度的l i f 检测。s h i 等【2 9 】采用多通道扫描荧光检测技术，实现了阵 列毛细管电泳中的核酸的高效分离l i f 检测。z u g e l 等【3 0 j 首次利用双光子激发荧光检 测器在芯片上检测荧光素标记的卢奈胺，其检测限为6 1 0 。8m o ll 一。c h a b i n y c 等 将微型雪崩光电二极管和多模光纤预埋在聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 芯片上，实现了集 成化半导体二极管荧光检测。l a n d e r s 等阢圳报道了基于声一光交流装置，对芯片多通 李峰：芯片毛细管电泳原予荧光在线联用新技术 道、全通道的l i f 检测，并利用等电聚焦分离检测了三种荧光蛋白质。r o u l e t 等【3 4 l 报 道了集成化l i f 检测系统，将微通道和微光学装置集成在芯片上，并将待测物质预沉 积在微化学芯片上，用于基础生物化学分析的研究。m o g e n s e n 等【3 5 1 集成波导电子束 分裂器于芯片流体通道网络上，实现了l i f 多点检测，通过傅立叶变换，测定流动粒 子的速度。q i n 等3 6 1 以测定食品和i 临床中常见的重要的四羟酮醇衍生物为例，证明了 在电泳微流控芯片上用波长可调的l i f 和增强电荷耦合器件( c c d ) 检测的可行性。l i 等他】报道了集成在电泳微流控芯片上结构紧凑型l l f 检测装置，他们用标准的光刻、 蚀刻将流体通道和光纤通道加工在玻璃芯片上，采用光电二极管作为激发光源，在 检测区的正下方由光纤接收头收集荧光信号，光纤导出的荧光信号由直接放置在芯 片下面的p m t 接收，并用p d m s 膜覆盖密封芯片下面以消除散射激发光对检测的干 扰。使用该套集成装置在3 0s 内实现了f c 标记的精氨酸、苯基丙氨酸、甘氨酸和 f i t c 的基线分离。徐章润等【3 7 】采用自行设计的结构紧凑型光纤式激光诱导荧光检测 器用以检测荧光染料。陈洪等p 列采用自组建的c h i p c e l i f c c d 检测系统在数十秒 内满意地分离了曙红和荧光素两种荧光物质。周小棉等【3 9 】等设计和研制了一种灵敏 度高，检测限低和线性范围宽的通用型l i f 微流控芯片分析仪。检测部分按共聚焦检 测原理设计，采用c c d 检测通道，三维自动调节聚焦，发射波长滤光片可方便地更 换以适应多种染料选择。最近n a m a s i v a y 啪等【4 0 】发展了一种用光电二极管作激发光 源的l i f 检测器，将其集成在刻有微反应器、微分离柱和流体通道的电泳微流控芯片 上用于d n a 分析，检测限达o 9n g l 。 虽然l i f 检测优点较多，但并非所有的化合物都能产生荧光，大多数试样需经衍 生才能进行分析，同时激光器体积大，不易实现微型化和集成化，价格高，严重地 限制了其实际应用。 1 3 2 化学发光和电致化学发光法 化学发光法( c h e m i l u m i n e s e n c e ，c l ) 【4 1 ，4 2 1 是人们公认高灵敏度的检测方法之一， 已广泛地用于无机物及有机物的分析。它不需要光源，避免了背景光及瑞利散射等 杂散光的干扰，具有仪器结构简单、操作方便、灵敏度高、线性范围宽、分析速度 快等优点。常规毛细管电泳与c l 检测器的接口较为复杂，容易引入死体积和湍流现 象而造成分离效率下降。在芯片上利用m e m s 能够制做零死体积柱后反应器以避免 这些问题，因此微全分析系统的出现为c l 开创了一个新的应用领域，c l 成为微流控 4 南开大学博士学位论文 芯片最具吸引力的检测方法之一，1 5 ，1 6 ，1 9 2 。 m a n g m 和h a r r i s o n 【4 3 设计了如图1 2 所示的通道结构的芯片，首次实现了在玻璃 芯片上进行毛细管电泳分离后的c l 检测，将取样、电泳分离、c l 检测池以及样品 试剂缓冲废液池等集成在玻璃芯片上，无需复杂的接口。该系统利用了辣根过氧 化氢酶( h r p ) 催化鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 和过氧化氢( h 2 0 2 ) 的化学发光反应，通过检测免疫 反应产物中的h r p 标记羊抗一鼠免疫球蛋白g ( i g g ) 间接测定了鼠i g g 。发光试剂 l u m i n o l 加在分离缓冲液中，而h 2 0 2 在分离通道出口汇入，c l 信号用p m t 检测。 ww 一 b 一墨 ， f i g u r e1 2 s c h e m “i cc h i pl a y o u to fc l o nm i c r o c h i p b ：b u f f e ra n di u m i n o i s ：s a m p l er ：h 2 0 2r e a g e n tw ：w a s t ed ：d e t e c t o rs c ：s e p a r a t i o nc h a n n e i r c ：r e a c t i o nc h 矗n n e l i 叫 聂舟等在微流控芯片上实现了l u m i n 0 1 h 2 0 2 c 0 2 + 化学发光反应，c 0 2 + 的检测 限为2xl o 6m o il ，同时实现了c 0 2 + 与c u 2 + 的快速分离及检测。h a s h i m o t o 等4 列在 芯片上实现了赖氨酸和甘氨酸的电泳分离并使用过氧草酸盐c l 体系进行了检测。 y a k o v l e v a 等【4 6 】在硅芯片上固定了抗体，采用c l 法检测，进行了酶免疫测定。x u 等 4 8 】将c l 检测用于流动注射体系的微加工混合，反应器，测定水溶液中的c r 3 + 。他们 采用的微反应芯片如图卜3 所示，在5m m 1 0m m 的芯片上，通道总长6c m ，宽1 6 0 m ，深5 8 m ，通道内部体积约o 5 3 声l ，发光检测区域的长度为2m m ，发光信号用 p m t 检测。通过c ，+ l u m i n 0 1 h 2 0 2c l 体系测定水样中微量的c r 3 + ( 1 0 1 0 4m o ll 1 ) 、酶催化c l 在线测定葡萄糖( 5 l o 一l 1 0 。2m o ll 。1 ) 。 l i u 等h 9 1 通过p d m s 芯片上金属离子催化l u m i n o i h 2 0 2c l 体系、丹磺酰物种与 共轭的过氧草酸盐h 2 0 2c l 反应，展示了c l 集成在电泳芯片并应用于化学和生物化 学分析。他们成功地在lm i n 内实现了c u ”、c 0 2 十、c r 3 + 的分离以及月磺酰苯丙氨酸 对映异构体的手性识别。最近，x u 等【5 0 】报道了顺序注射样品引进，在复合型p d m s 李峰：芯片毛细管电泳一原子荧光在线联用新技术 玻璃微流控芯片上刻蚀出固定酶床反应器，实现了芯片上在线固相酶反应和c l 反应 测定葡萄糖。c h e e k 等川报道了将d n a 分子固定在玻璃微通道中进行杂交，经酶促 c l 反应进行高灵敏度检测。 2 m f i g u r el 一3 s c h e m a t i cs t r u c t l i o ft h em i c m c h i pw i t hm i c r o m i x e r l 4 7 1 d a v i d s s o n 等阮5 3 】连续报道了基于微流控芯片上生物传感器的酶c l 法，他们将 葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶以及h r p 一起固定在多孔硅流通微流控芯片上，葡萄糖 和乙醇在各自氧化酶的作用下产生h 2 0 2 ，l u m i m 0 1 和h 2 0 2 在h r p 的催化下产生强的 c l ，从而实时检测葡萄糖、乙醇的产生和释放。最近，林金明课题组【5 4 5 6 】集成流通 式c l 检测于微玻璃芯片上，用自制的微流泵将l u m i n o l 、h 2 0 2 等溶液输送至分离管 道末端的反应检测池，与待测物在反应检测池中发生发光反应。成功实现了电泳 蕊片上分离，k m n 0 4c l 体系测定多巴胺和儿茶酚、过氧草酸盐h 2 0 2 c l 体系测定丹 磺酰苯丙氨酸和丹磺酰肌氨酸、l 啪i n 0 1 h 2 0 2c l 体系检测过渡金属离子c u 2 十、 c o ”、n i ”。 g r e e n w a y 等【5 7 】利用三联毗啶钌r u ( b p y ) 3 2 + 的c l 体系，以电渗流驱动试剂，在微 流动注射系统中测定可待因。通过加入非离子表面活性剂( t r i t o n x 一4 5 ) 来增强c l 效率 及改变电渗流，检出限为8 3 x1 0 7m o ll 一。g r e e n w o o d 等【5 8 】以负压泵驱动试剂采用 r u ( b p y ) 3 2 + c l 体系在玻璃芯片上测定阿托品和杜冷丁，线性范围达到三个数量级， 检测限分别为3 8 1 0 4 和7 7 1 0 4m o ll 。 电致化学发光( e l e c t r o c h e m i l 啪i n e s e n c e ，e c l ) 是化学发光与电化学检测的结合。 a r o r a 等【5 9 1 首次将e c l 检测器集成在一块5c m 2c m 电泳芯片上，提出了利用无线 e c l 检测器，采用胶束电动色谱模式分离了r u ( b p y ) 和r u ( p h e n ) ，并以氨基酸为样品 初步证实了电泳芯片上e c l 间接测定的可行性。如图1 4 所示，他们将u 形悬浮铂电 南开大学博士学位论文 极( 电极宽5 0 岸m ，电极间距5 0 m ) 置于分离通道上，u 形电极的两个脚分别作为电化 学反应的工作电极和对电极，靠电泳分离时通道内的电场在u 形电极两端产生电化学 反应所需的电位，在柱发生电化学反应，实现e c l 测定。在此之前，同一课题组【6 0 】 用聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 中间夹两片铂薄膜电极的方式制作了体积为纳升级的 e c l 检测池，用光电倍增管进行光检测，在l o on l 的体积下，对三丙胺的检测限为5 x 10 1 3m o li 。一。 f 噜u r el 一4 ( a ) s c h e m a t i cd i a g m mo ft h eb o n d e dg l a s sc h i p t h es h o r ts e p a r a t i o n e h a n n e ls t r u c t i l r e ( s h o w ni nd a r ki i n e s ) w a su s e df o ra l im e a s u r e m e n t s ( b ) c h a n n e l l a y o u t l ( e y ：1 ，s a m p l er e s e r y o i r ；2 ，b u f f e rr e s e r v o i r ；3 ，s a m p l ew a s t e ，av a c u u mt u b ew a s c o n n e c t e dt ot h i sr e s e r v o i rt om ls 叠m p l ei t h ed o u b b ti n j e c t o r 4 ，b u f f e rw a s t e ；5 ， d o u b l e - ti n j e c t o r ；6 ，s e p a r a t i o nc h a n n e l ；7 ，n o 曩t i n gp l a t i n u me i e c t r o d e ；8 ，s a m p l ef i n e d i n t ot h ed o u b l e - ti j e c t o r ( s a m p l ev o l u m e9 0p l 髓t i m a t e df h mv i d e oi m a g e s ) ；9 ， v a c u u m ；1 0 ，d i r e c t i o no fp l u gd u r i n gs e p a r a t i o n l 5 叭 z h a n g 等【6 l 】使用三通道、两电极微流控体系，通过电化学氧化e c l 检测电活性 物质r u ( b p y ) 3 2 + 和丙三醇。l h o s t i s 等f 6 2 1 报道了在硅芯片上利用e c l ，经酶反应后测 定葡萄糖的浓度，同时测定了未经处理药物样品中的可待因。最近，k o u d e l k a h e p 等在微流控芯片上研究了r u ( b p y ) 3 2 + 的电化学激发和染料c y 5 在杂交分析中的相互 作用。结果表明，寡聚核苷酸的杂交对r u ( b p y ) 3 2 + 的e c l 淬灭效率达7 8 。并讨论了 能量转移、电子转移和静态淬灭机理。 汪尔康研究小组【似6 7 1 在c h i p c e e c l 检测方面做出了令人瞩目的工作。l i u 等 设计了并考察了适于f i 和c e 两种模式的芯片型r u ( b p y ) 3 ”的e c l 检测池。该池是用两 块玻璃( 2 0 15 1 7m m ) 加工而成，其中p t 盘作为工作电极，不锈钢导管作为对电 7 李峰：芯片毛细管电泳一原子荧光在线联用新技术 极，银丝作为参比电极。该检测池具有多功能、灵敏、精确的优点，成为胺类和草 酸盐常规分析中颇具吸引力的r u ( b p y ) 3 2 + e c l 检测的装置。q i u 等【6 5 1 报道了基于铟锡 氧化物( 1 t o ) 电极的r u ( b p