（蔬菜学专业论文）四倍体厚皮甜瓜植株形态特征和果实品质性状的研究.pdf

l u g l m l c m n u n i l i n m n b a v c h c l n a o h p n m 2 m 3 f w m i c r o g r a m微克 l i t e r 升 m i l l i l i t r e 毫升 d e g r e ec e n t i g r a d e摄氏度 c e n t i m e t r e厘米 m i l l i m e t r e 毫米 n a n o m e t r e 纳米 m o l e 摩尔 e q u i v a l e n tc o n c e n t r a t i o n当量浓度 b e n z y l a m i n o p u r i n e细胞分裂素 v i t a m i n c维生素c h y d r o c h l o r i ca c i d盐酸 s o d i u mh y d r o r i d e 氢氧化钠 p h o t o s y n t h e t i cr a t e净光合速率 s q u a r em e t r e平方米 c u b i cm e t r e 立方米 f r e s hw e i g h t 鲜重 11川iiiiili 目录 1 3 5 5 5 5 化特性：一6 应性一6 6 1 3 多倍体产生途径7 l - 3 1 物理方法诱导7 1 3 2 化学方法诱导8 1 3 3 有性杂交获得多倍体1 0 1 3 4 体细胞杂交获得多倍体1 1 1 3 5 遗传转化途径获得多倍体1 1 1 4 多倍体鉴定方法研究l l 1 4 1 形态学鉴定法1 1 1 4 2 细胞学鉴定法1 2 1 4 3 染色体计数法13 1 4 4 生理生化鉴定1 3 1 4 5 分子鉴定法1 3 1 5 蔬菜多倍体育种与应用研究1 4 1 6 蔬菜多倍体育种中存在的问题1 5 1 6 1 多倍体的适宜倍性问题15 1 6 2 多倍体的低育性问题1 5 1 6 3 多倍体诱导过程中的嵌合体问题1 5 1 6 4 秋水仙素的毒害问题1 6 1 7 提高蔬菜多倍体育种水平的对策1 6 1 7 1 选择适宜的诱变材料16 1 7 2 提高蔬菜多倍体的孕性1 6 1 7 3 尽量扩大多倍体原始材料的选择范围1 7 1 7 4 完善多倍体诱导技术1 7 1 7 5 多倍体育种与其它育种手段相结合：1 7 1 8 秋水仙素简史及诱导原理1 7 1 8 1 秋水仙素简介1 7 1 8 2 秋水仙素的诱导机理1 8 1 8 3 秋水仙素处理材料的方法1 9 1 8 4 秋水仙素对多倍体诱导率的影响2 0 1 9 本研究的目的与意义2 0 2 试验材料与方法2 2 2 1 试验材料及试剂2 2 2 1 1 试验材料2 2 2 1 2 试剂2 2 2 2 试验方法2 2 2 2 1 四倍体甜瓜的诱变方法2 2 2 2 2 四倍体甜瓜的鉴定方法2 2 2 2 3 流式细胞仪测植株倍性2 3 2 2 4 四倍体与二倍体植株生长势指标测定2 3 2 2 5 植株生长发育期日均光合速率的测定2 4 2 2 6 叶绿素含量的测定2 4 2 2 - 7 叶片超微结构的分析2 4 2 2 8 四倍体与二倍体果实形态与品质指标测定2 5 2 2 9 果实种子指标调查2 7 3 结果分析2 8 3 1 秋水仙素诱变处理结果2 8 3 2 染色体计数法和细胞形态学鉴定四倍体材料2 9 3 3 流式细胞仪对植株倍性分析3 0 3 4 四倍体与二倍体植株形态指标的比较3l 3 5 四倍体植株的生长动态3 l 3 5 1 植株生长发育时期生长势指标的动态变化3 2 3 5 2 植株生长发育期净光合速率的动态变化3 3 3 6 四倍体与二倍体植株叶片结构和叶绿素含量的差异3 4 3 6 1 四倍体与二倍体植株植株功能叶叶片结构差异3 4 3 6 2 染色体加倍对植株功能叶片超微结构的影响3 4 3 6 3 叶绿素含量的测定3 6 3 7 染色体加倍对果实品质的影响3 7 3 7 1 四倍体的果实品质3 7 3 7 2 四倍体的果实指标3 8 3 8 染色体加倍对种子品质的影响3 8 4 讨论4 0 4 1 秋水仙素的毒害作用4 0 4 2 秋水仙素对甜瓜四倍体诱变的影响4 0 4 3 压片制作对试验的影响4 0 4 4 诱导过程中的嵌合体问题4 1 4 5 诱变当代植株性状变异生理学原因探讨4 l 4 6 试验结果与前人的比较4 2 4 7 四倍体种子的可育性4 2 4 8 四倍体厚皮甜瓜的应用4 2 5 结论4 4 参考文献4 5 致谢5 6 攻读学位期间发表论文5 7 i - ， 山东农业大学硕士学位论文 摘要 本文以二倍体厚皮甜瓜m 0 1 3 ( c u b u m i sm e ll ) 自交系为试验材料， 用0 1 、o 3 、0 5 和0 7 的秋水仙素溶液通过涂抹法分别对子叶期和 一叶一心期幼苗进行处理。通过染色体计数法、细胞学鉴定法和流式细胞 仪分析鉴定倍性，得到了四倍体株系，并测定了四倍体植株的生长势、生 理生化指标以及果实的品质指标。 主要结果如下： 1 用秋水仙素诱导厚皮甜瓜二倍体m 0 1 3 ，通过卷须压片和流式细胞仪 进行倍性鉴定，成功获得同源四倍体厚皮甜瓜株系。 2 染色体加倍改变了植株的形态学特征。调查结果表明，四倍体植株比 二倍体植株高大，茎增粗；叶片面积增大，完全展开的四倍体功能叶 要比二倍体叶片面积大3 0 。另外，四倍体植株生长发育前期净光合 速率变化趋势与二倍体的相近，后期明显比二倍体的净光合速率高。 3 用光学显微镜和电子显微镜观察四倍体植株与二倍体植株的叶肉细 胞及叶绿体超微结构。镜检发现，四倍体与二倍体叶肉细胞的表皮细 胞和和海绵组织均没有差异，但四倍体叶肉细胞的的栅栏组织比二倍 体的长，且四倍体叶片明显比二倍体的厚，四倍体叶片厚7 0 6n l l l l ， 而二倍体叶片只有6 7 0 衄厚。电子显微镜观察分析表明，四倍体叶 肉细胞的叶绿体数、线粒体数和基粒数均比二倍体的多，四倍体的叶 绿体和线粒体的长度明显大于二倍体的，但宽度无显著差异。 4 对果实大小和品质进行了测量分析，结果表明，染色体加倍使四倍体 果实明显变大，果实加重，四倍体果肉比二倍体果肉厚0 9c m ，但是 四倍体与二倍体的果型指数无差异。四倍体果实的中心可溶性固形物 含量、可溶性糖含量显著提高，分别比二倍体果实的含量增加2 0 和 3 0 ；尤其是四倍体果实的v c 含量是二倍体果实的5 倍。另外，四 倍体果实果皮的颜色变深。 5 四倍体与二倍体果实在授粉后3 0 天同时成熟。二倍体平均单个果实 产生约3 1 5 粒种子，而四倍体单个果实平均仅产生1 7 9 粒正常饱满种 子。四倍体种子与二倍体种子相比较大，千粒重为2 5 5 6g ，而二倍体 种子的千粒重仅为2 4 7 4g 。 四倍体厚皮甜瓜植株形态特征和果实品质性状的研究 关键词：厚皮甜瓜；秋水仙素；四倍体；二倍体；生长势：果实品质。 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t f o u rk i n d so fc o n c e n t r a t i o no fc o l c h i c i n e s ，0 1 ，0 3 ，0 5 a n d0 7 ，w e r eu s e dt o t r e a tt h eg r o w i n gp o i n to fm u s k m e l o ni n b r e dl i n em o1 - 3t h r o u g ht h es m e a rm e t h o d c h r o m o s o m en u m b e r so ft h et e n d r i lc e l l sa n dc y t o l o g ya n a l y s i sw e r eu s e dt od e t e r m i n e p l o i d yl e v e l t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h et e r a p l o i dp l a n t sa n d f r u i tq u a l i t i e sw e r em e a s u r e d t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t e t r a p l o i dm u s k m e l o np l a n t sw e r ei n d u c e ds u c c e s s f u l l yf r o md i p l o i d c u c u m i sm e l oi n b r e dm 0 1 3 ( 2 n = 2 4 ) b yc o l c h i c i n e s ，c h r o m o s o m en u i i l - b e r so ft h et e n d r i lc e l l sa n dc y t o l o g ya n a l y s i sw e r eu s e dt od e t e r m i n e p l o i d yl e v e l 2 m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sh a sb e e nc h a n g e db yc h r o m o s o m ed o u b l i n g t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ep l a n th e i g h to ft h et e t r a p l o i dp l a n t sw a sh i g h e r ，t h es t e md i a m e t e rw a s t h i c k e r ，t h el e a fa r e aw a sm u c hb i g g e rt h a nt h o s eo ft h ed i p l o i dp l a n t st h r o u g h o u t p l a n td e v e l o p m e n ta n dt h ef u l l ye x p a n d e dm a t u r el e a fa r e aw a sa p p r o x i m a t e l y3 0 b i g g e rt h a nt h a to ft h ed i p l o i dp l a n t m o r e o v e r , t h en e tp h o t o s y n t h e t i cr a t eo ft h e t e t r a p l o i dp l a n t sw a ss i m i l a rt ot h ed i p l o i dp l a n t s a te a r l ys t a g e so fp l a n td e v e l o p m e n t , b u ts l i g h t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h ed i p l o i dp l a n t sa tl a t e rs t a g e s w ea n a l y z e dt h el e a f c e l l u l a ra n ds u b c e l l u l a rs t r u c t u r e so ft h et e t r a p l o i da n dt h ed i p l o i dp l a n t s m i c r o s c o p e o b s e r v a t i o ns h o w e dt h a tt h e r ew e r en od i f f e r e n c e si nt h ee p i d e r m a lc e l l sa n dt h e s p o n g yc e l l so ft h et e t r a p l o i da n dt h et h e d i p l o i dl e a v e s ，b u tp a l i s a d ec e l l so ft h e t e t r a p l o i dl e a f w e r el o n g e rt h a nt h o s eo ft h ed i p l o i dl e a fa n dt h et e t r a p l o i dl e a f ( 7 0 6 r a m ) w a st h i c k e rt h a nt h ed i p l o i dl e a f ( 6 7 0m m ) t h ee l e c t r o n i cm i c r o s c o p ea n a l y s i s r e v e a l e dt h a tt h en u m b e r so fc h l o r o p l a s t , g r a n u l ea n dg r a n a , c h l o r o p l a s tl e n g t ha n d g r a n u l el e n g t ho ft h et e r a p l o i dl e a v e sw e r es i g n i f i c a n t l ym o r eo rb i g g e rt h a nt h o s eo f t h ed i p l o i dl e a v e s h o w e v e r ，n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e di nt h ew i d t h so f c h l o r o p l a s ta n dg r a n u l eb e t w e e nt h et e t r a p l o i da n dd i p l o i dl e a v e s t h ee l e c t r o n i c m i c r o s c o p ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h en u m b e r so fc h l o r o p l a s t ，g r a n u l ea n dg r a n a , c h l o r o p l a s tl e n g t ha n dg r a n u l el e n g t ho ft h et e r a p l o i dl e a v e sw e r es i g n i f i c a n t l ym o r e o rb i g g e rt h a nt h o s eo ft h ed i p l o i dl e a v e s h o w e v e ln os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a s o b s e r v e di nt h ew i d t h so fc h l o r o p l a s ta n dg r a n u l eb e t w e e nt h et e t r a p l o i da n dd i p l o i d 3 四倍体厚皮甜瓜植株形态特征和果实品质性状的研究 l e a v e s 3 t e t r a p l o i df i u i tw a sb i g g e ra n df r u i tq 砌i t yw a ss u p e r i o rt od i p l o i df i u i t 硼1 er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt e t r a p l o i df r u i tw a sd i s t i n c t l yb i g g e ra n dh e a v i e r t h a nt h a to fd i p l o i df r u i t a n dt h e t e t m p l o i d f r u i t m e s o c a r pw a s a p p r o x i m a t e l y0 9c m t h i c k e rt h a nt h a to fd i p l o i df r u i t b u t ，t h e r ew a sn o d i f f e r e n c ei nf r u i ts h a p ei n d e xb e t w e e nt e t r a p l o i da n dd i p l o i df r u i t s i n t e r e s t i n g l y ，f r u i tq u a l i t yo ft e t r a p l o i dm u s k m e l o ni m p r o v e da p p a r e n t l y c o m p a r i n gt od i p l o i df r u i t , t h ec o n t e n t so fs o l u b l es o l i d ，s o l u b l es u g a ra n d ， v i t a m i nci nt e t r a p l o i df r u i tw e r ea p p r o x i m a t e l y2 0 3 0 a n d5t i m e s h i g h e r ，r e s p e c t i v e l yt h a nt h o s ei nd i p l o i df r u i t i na d d i t i o n ，t h es k i nc o l o r o ft h et e t r a p l o i df i u i tw a s d e e p e rt h a nt h a to f d i p l o i df r u i t 4 t e t r a p l o i df r u i t sp r o d u c e df e w e rp l u m ps e e d s ( a v e r a g e17 9p l u m ps e e d s p e rs i n g l ef r u i t ) t h a nt h ed i p l o i df r u i t ( a v e r a g e315p l u m ps e e d sp e rs i n g l e f a m i t ) a n dt h es e e d sf r o mt e t r a p l o i df i u i tw e r eb r o a d e ra n dt h i c k e rt h a n t h o s ef r o mt h ed i p l o i df r u i t k e yw o r d s ：m u s k m e l o n ：c o l c h i c i n e ：t e t r a p l o i d ：d i p l o i d ；g r o w t h p o t e n t i a l ：f r u i t sq u a l i t y 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 甜瓜简述 甜瓜( c u c u m i sm e l ol ) 果实香甜，营养丰富，外观美丽，香气浓郁， 性寒止渴，是深得世界各地人们喜爱的园艺作物之一。甜瓜属于葫芦科 ( c u c u r b i t a c e a e ) 黄瓜属( c u c u m i s ) 的- - 个亚属( 甜瓜亚属s u b g e nm e l o ) ， 按生态学特性分为厚皮甜瓜与薄皮甜瓜两种，都属二倍体物种，其体细胞 染色体数目为2 n = 2 4 。 1 2 蔬菜多倍体效应 自从1 9 3 7 年b l a k e s 和a r e n y 提纯出秋水仙素生物碱，并发现它具有 诱导植物染色体数目加倍作用，人工诱导多倍体引起了世界各国科学家的 关注，并掀起了多倍体育种的高潮。 染色体是遗传物质的载体，每个物种的染色体数目是相对稳定的，且 体细胞染色体数为性细胞的二倍，即体细胞中含有2 个染色体组，通称为 二倍体。多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的生物体。根 据染色体组的来源不同，多倍体又可分为同源多倍体和异源多倍体。染色 体组全部来自同一物种的多倍体称为同源多倍体；染色体组来自不同种、 属的多倍体叫做异源多倍体。由于染色体数目加倍，多倍体最明显的特征 是相对的“巨大性 。植株生长健壮，叶大、花大、茎粗、色深，细胞内 含物较多，营养成分含量高，抗病抗逆能力增强，并具高产、优质等特点， 在生物进化与育种上有重要意义，因而育种学家自3 0 年代开始就热衷于 多倍体诱导育种的研究。 由于蔬菜作物大多数是染色体数较少的二倍体，很适宜采用多倍体育 种：同时蔬菜多倍体可提供给人们比二倍体更多或更优良的蔬菜类型，对 于促进人们身体健康、丰富“菜篮子”起了很大的作用。当生物的染色体 组成倍增加后，基因的剂量效应和互作效应等都会破坏原有的生理生化功 能的平衡，致使植株发生一系列的变化。 1 2 1 生物学特征 多倍体植株不一定很大，但一般是植株粗壮，叶片宽且厚、叶色深， 四倍体厚皮甜瓜植株形态特征和果实品质性状的研究 花器较大、花色浓艳，花粉粒、果实和种子也都比二倍体的大。伴随多倍 体效应的“巨大性 ，多倍体蔬菜的产量和质量也有大幅提高，但这种随 倍性递增而变大的关系并不绝对相关，如柴兴容等( 柴兴荣，1 9 9 8 ) 通过秋 水仙素诱导薄皮甜瓜、厚皮甜瓜和哈密瓜等，得到的四倍体果实反而比二 倍体小。近年来，随着对转基因和基因互作的深入研究提出了基因沉默和 共抑制假说，可为植物的性状并不一定随倍性的增加而增大作出解释。 1 2 2 生长发育及生理生化特性 多倍体蔬菜生长发育迟缓，如种子发芽迟、开花晚、成熟也较迟，分 枝能力也有所减弱。同时其生理生化方面也相应发生很多变化：首先，因 细胞体积增大，细胞内的含水量增多，引起细胞渗透压的下降，从而引起 一系列相关代谢过程的变化，如呼吸强度、蒸腾作用降低，从而使发育延 缓。其次，多倍体蔬菜往往含有较多的淀粉酶和蛋白酶，其多酚氧化酶的 活性也有较大提高。第三，随着代谢强度的改变，多倍体蔬菜的化学成分 如碳水化合物、蛋白质、维生素，植物碱和单宁物质的合成也有所增加。 刘文革等( 刘文革，2 0 0 8 ) 研究，同基因型西瓜中多倍体西瓜的番茄红素等 物质含量比二倍体西瓜高3 0 0 o - - 4 0 。王镇等( 王镇，2 0 1 0 ) 对不同倍性小 型西瓜分析研究，结果表明与对应二倍体小型西瓜相比，同源四倍体植株 完全成熟果实中可溶性固形物和番茄红素含量均随着倍性的增加而增加。 e d w a r d s 等( e d w a r d sa j ，2 0 0 3 ) 研究发现，西瓜中富含的番茄红素更容易 被人体直接吸收，有效性比番茄高4 0 。 1 2 3 抗病抗逆能力和适应性 多倍体蔬菜对外界环境的适应性较强，其抗病力、耐寒力、耐旱力都 有所增加。刘文革等对蜜枚西瓜的二倍体、三倍体、四倍体采用不同浓度 n a c l 胁迫，发现不同倍性之间存在明显差异，四倍体比二倍体明显具有 较强的耐盐性。刘惠吉等( 刘惠吉，1 9 9 8 ) 研究发现，四倍体白菜细胞的原 生质水合度变化小、粘滞性强，因而受逆境的胁迫变化小，从而导致其抗 热性增强。刘文革等( 刘文革，2 0 0 9 ) 对不同倍性西瓜进行枯萎病抗性研究， 结果表明6 组同基因型不同染色体倍性的西瓜同源四倍体和三倍体发病 率均低于二倍体的，这与o r t i z 等( o r t i zr ，1 9 9 4 ) 研究结果一致。 1 2 4 多倍体蔬菜的育性 6 山东农业大学硕士学位论文 由于产生多倍体时体细胞染色体在减数分裂过程中配对紊乱，势必会 产生一些非整倍性的配子，导致育性的降低，尤其是同源多倍体的育性往 往随形态的增大而大幅度下降，有的甚至发生不育。同源三倍体的无籽西 瓜、自然形成的三倍体黄花菜，一般都是高度不育的。谭素英等( 谭素英， 1 9 9 8 ) 在对西瓜四倍体研究中发现花粉萌发率低、胚囊受精率低、胚乳过 早解体、大多数胚在发育过程中败育，是同源四倍体西瓜低稔性的胚胎学 原因。李俊星等( 李俊星，2 0 0 9 ) 对青花菜四倍体与二倍体受精前后生殖特 性进行比较研究发现，四倍体青花菜胚囊发育完整，与二倍体相似；四倍 体花粉萌发率较二倍体低；四倍体和二倍体青花菜自交均能正常受精，但 四倍体在受精后胚胎发育的进程上均较其二倍体滞后2d ，并存在胚胎败 育现象，导致四倍体结实率比二倍体降低2 2 6 。实验结果表明受精率低 也是造成四倍体自交稔性低的影响因素之一。 1 3 多倍体产生途径 自然突变有无性和有性两种方式。无性方式是自然界中存在的二倍体 生物在减数分裂过程中发生偶然的染色体加倍而产生多倍体，然后通过选 育和繁殖手段培育成多倍体植株，如典型的无性突变例子就是芽变。有性 方式是小孢子母细胞或大孢子母细胞在减数分裂过程中染色体未减数，直 接形成了2 n 配子，经杂交或直接形成多倍体种子产生多倍体植株。但自然 突变的发生频率低，且多为有害突变，极少的有利变异可被直接利用，但 也有报道。n u g e n t 和r a y ( n u g e n tp e ，1 9 9 2 ) 从田间栽培二倍体甜瓜品种中 发现了自然突变c 8 9 9 j 2 后绿标志的四倍体甜瓜，并选育出c 8 8 3 - m 6 - 4 x 和 6 7 m 6 1 0 0 - 4 x 优系( n u g e n tp e ，1 9 9 4 ) 。生产上主要通过人工诱导体细胞 不分裂和性细胞不减数来产生多倍体变异。 人们在分析、总结植物界多倍体自然变异现象和规律的基础上，对蔬 菜多倍体人工诱导方法进行了深入的研究和探索，总结归纳出了物理方法 诱导多倍体、化学方法诱导多倍体、有性杂交获得多倍体、体细胞融合获 得多倍体，遗传转化途径获得多倍体等多种方法。 1 3 1 物理方法诱导 用物理方法诱导植物多倍体变异，主要有温度激变( 高温或低温) 、 机械损伤、电离辐射( x 射线和y 射线) 、非电离辐射( 紫外线) 、渗透压 7 四倍体厚皮甜瓜植株形态特征和果实品质性状的研究 的改变、离心力、热冲击、超声波，干旱等环境胁迫和逆境处理等。2 0 世纪初，曾用切伤、嫁接、反复摘心法等形成四倍体的不定芽。最早的物 理诱导方式是在番茄上打项产生机械损伤来诱导四倍体番茄，之后，人们 利用高温或低温处理授粉后的幼胚以及采用射线、中子、激光等辐射来实 现染色体加倍。吴明珠等( 吴明珠，2 0 0 5 ) 对甜瓜进行辐射诱变获得多个多 倍体甜瓜材料。但此类方法由于诱导率低、嵌合体现象严重、危害性大( 射 线) 而未能普及利用，只在一些具营养繁殖优势的植物上还有应用。 1 3 2 化学方法诱导 化学方法诱导即利用化学试剂如秋水仙素、植物激素及其他植物碱等 人工诱导多倍体，目前主要应用秋水仙碱，除草剂类药剂也取得了较好的 效果。秋水仙素的主要作用机理是抑制了细胞分裂时纺锤体的形成，使复 制后的染色体不能拉向两极，细胞不能继续分裂形成两个子细胞，从而导 致染色体加倍形成多倍体细胞，进一步发育成四倍体植株。利用化学方法 诱导多倍体已在多种园艺植物如大白菜、西瓜、甜瓜等植物上获得成功。 诱导方法可分为活体诱导和离体诱导两种方法。 1 3 2 1 活体诱导 在活体条件下，利用秋水仙素诱导多倍体的方法有滴液法、浸泡法、 琼脂法、喷雾法、注射法和涂抹法等。活体诱导处理部位可为种子、幼苗 茎尖、幼苗生长点、芽等，诱变率一般在o 1 1 。柴兴容( 柴兴容，1 9 9 8 ) 、 魏育国等( 魏育国，2 0 0 6 ) 采用诱导生长点分裂细胞染色体加倍，获得综合 性状较好的四倍体甜瓜材料。谭素英等( 谭素英，1 9 9 8 ) 通过剥去生长点外 幼叶后用1 秋水仙素的羊毛脂膏涂抹和0 2 的秋水仙素水溶液浸芽处 理，显著提高了西瓜变异频率和秋水仙碱处理效果。刘惠吉等( 刘惠吉， 1 9 9 8 ) 用0 4 的秋水仙素水溶液处理短白梗白菜具2 3 片真叶的幼苗，选 育出四倍体白菜热优2 号，用0 2 的秋水仙素溶液处理耐寒黑菜( 连 云港地区冬种春收的主栽小白菜) 子叶期的幼苗生长点获得四倍体。菘蓝 体细胞染色体是2 n = 1 4 ，用秋水仙素处理种子或茎生长点6 h - 1 2h ，获得 四倍体植株( 2 n = 2 8 ) ；用不同浓度的秋水仙素处理芦荟的丛生芽、生姜的 胚芽都获得了较高频率的四倍体植株。通过此方法已经在多种叶菜类、花 菜类、根菜类、瓜类、茄果类等蔬菜作物上获得了同源四倍体和三倍体品 山东农业大学硕士学位论文 系。但传统的活体诱导处理方法具有诱变率低、嵌合率高，且获得的四倍 体植株稔性低，不易获得大量四倍体个体等缺点，而离体培养过程中应用 诱变剂的诱导技术能够克服活体诱导技术的缺陷。 1 3 2 2 离体诱导 离体诱导是借助植物组织培养再生技术，利用细胞的全能性，在离体 组织水平上诱导细胞内染色体加倍，获得多倍体。离体材料一般是愈伤组 织、胚状体、茎尖组织，也可用叶片、子房、原生质体和茎段作材料。从 已有的报道来看，离体培养过程中用化学药剂诱导材料加倍可大体分为两 种，一是直接诱导法，即将材料放在含诱变剂的培养基中处理一段时间， 再转到不含诱变剂的培养基中培养；二是间接诱导法，即先在不含诱变剂 的培养基中培养一段时间，再转移到含诱变剂的培养基中培养，培养基可 以是固体培养基，也可以是液体培养基。离体组织细胞染色体加倍方法容 易控制试验条件和重复试验结果，提高了工作效率，减少或避免了常规处 理产生嵌合体的干扰，获得同质多倍体，现在被广泛重视和应用。n o v a k 早在1 9 8 3 年用3 秋水仙素“的d m s o 采用上述两种方法处理大蒜茎 尖，两种方法的诱导率分别为6 2 5 和2 4 3 2 。马国斌( 马国斌，1 9 9 9 ) 、 何欢乐等( 何欢乐，2 0 0 2 ) 用西瓜和甜瓜的未成熟子叶、子叶和真叶作外植 体进行离体培养，利用植株再生过程中发生染色体数目变异，获得了较高 频率的四倍体变异。王双武( 王双武，2 0 0 6 ) 在含有0 1m g l 的秋水仙素和 较低浓度细胞分裂素的液体培养基中处理8d 苗龄的甜瓜组培苗茎尖 2 4 4 8h ，诱导染色体加倍的频率达3 0 - - 4 0 。张兴平等( 张兴平，1 9 9 6 ) 在西瓜幼胚子叶不定芽再生的前7 天，在再生培养基中添加o 0 5 的秋水 仙素，使再生植株中四倍体的频率由对照( 不加秋水仙素) 的8 提高到 了5 2 ，大大提高了组织培养再生四倍体的频率和效率。郭启高等( 郭启 高，2 0 0 0 ) 在培养过程中，用秋水仙素溶液处理培养材料并在西瓜芽再生 培养基中添加b a ，即可产生高频率的四倍体变异。王志敏等( 王志敏，2 0 1 0 ) 用秋水仙素加入液体培养基法处理姜丛生芽离体诱导四倍体，比 a a a n i y a ( a d a n i y as ，1 9 9 8 ) 和s h i r a i 等用含o 2 秋水仙素的培养基处理留 有2 3 个叶原基的姜芽8d 的四倍体诱变率提高了6 3 6 。 1 3 2 3 化学方法诱导的影响因素 9 四倍体厚皮甜瓜植株形态特征和果实品质性状的研究 一般来说，直接处理外植体产生的药害大，经预培养后再用诱导剂处 理可提高四倍体诱导率，h a n s e na l 等研究表明，预培养时间从0 天延 长到1 0 天时，四倍体诱导率从1 0 提高到2 5 。 渗透剂二甲基亚枫( d m s o ) 是运输化学物质进入组织的一种载体，它 能促进秋水仙素快速浸透到植物组织中，能减轻秋水仙素的药害作用，显 著提高秋水仙素的加倍效果并降低嵌合率，在作物的多倍体研究中得到了 验证。 离体培养条件下外植体类型不同，芽再生率有很大差异。a d e l b e r g 等( a d e l b e r gj w ，1 9 9 0 ) 对甜瓜子叶再生四倍体进行了探索和研究，结果 表明从授粉后1 8 天到2 2 天的幼胚子叶再生植株中高达5 0 为四倍体， 而从授粉后3 4 天的成熟胚子叶再生植株中只有7 为四倍体。不同子叶 部位再生的植株，四倍体的频率也大不相同，近胚轴端子叶组织再生植株 中四倍体频率显著高于从其他子叶部位再生的植株。 培养基类型和激素种类对四倍体的获得率有很大影响。s h i n i c h i a d a n i y a ( s h i n i c h i ，a d a n i y as ，2 0 0 1 ) 分别用固体培养基和液体培养基培养 姜的茎尖外植体，结果表明固体培养基对四倍体的诱导更有效，而液体培 养基促进了茎尖的生长。b a 浓度不同，四倍体出现频率也不同，如西瓜 品种郑杂五号在b a 浓度为2 2 5m g l 时，四倍体出现频率高达5 4 2 ； 而浓度为4m g m 时四倍体出现频率为零。 同时，基因型也影响四倍体的出现频率。c o m p t o n ( c o m p t o nm e ， 1 9 9 6 ) 和g r a y 用四种四倍体西瓜品系f 9 2 u 8 、s p 9 0 1 、s p 9 0 2 和s p 9 0 - 4 作子叶外植体来源，结果表明，在不同外植体不同年龄段，这四种基因型 的芽分化能力各不相同。品系f 9 2 u 8 和s p 9 0 2 两天大幼苗的子叶外植体 分化率最高，分别为6 6 和6 0 。当用成熟种子或超过两天大的幼苗子 叶作时，分化出较少的芽。 1 3 3 有性杂交获得多倍体 在小孢子和大孢子时期减数分裂异常产生2 n 配子，通过单向多倍化 ( 双亲之一产生2 n 配子) 或双向多倍化( 双亲均能产生2 n 配子) 均能提高 杂交后代的倍性水平，以此方法获得的四倍体比用秋水仙素处理获得的四 倍体稔性提高快。刘学岷等( 刘学岷，1 9 9 8 ) 用5 个不同包球类型并含有2 n l o 山东农业大学硕士学位论文 配子的二倍体大白菜与四倍体大白菜杂交，选育出具有不同熟性、抗逆性 强、品质优良的大白菜材料和多育1 、2 、3 号杂交一代。利用2 n 配子可 便利地转移抗性基因，如马铃薯的细菌性萎蔫病在湿热条件下发生严重， 其四倍体栽培种的抗性较弱，w a t a n a b e 等用抗病的二倍体与感病的四倍 体杂交，获得了抗病的四倍体后代。 1 3 4 体细胞杂交获得多倍体 体细胞杂交又称原生质体融合，该技术的发展是建立在组织培养和原 生质体培养的基础上的。原生质体融合可以克服远缘杂交造成的生殖障 碍，获得有价值的多倍体植株。可通过电融合和或p e g 融合等方法将原 生质体融合，经培养产生愈伤组织，再诱导分化为杂种植株获得异源多倍 体或同源多倍体。t e o d o r oc a r d i 等( t e o d o r oc a r d i ，2 0 0 4 ) 利用电融合技术将 马铃薯和野生种的二倍体原生质体融合，得到的再生植株比亲本更有活 性，同时杂种株获得了野生种的耐冷性、高比重、有丝分裂突变率高等特 性。s w a r r a 等( s w a r r a , 1 9 9 2 ) 将马铃薯双单倍体的原生质体用化学方法 融合获得了四倍体和六倍体杂种植株。 1 3 5 遗传转化途径获得多倍体 t s u y o s h ii m a i 等( t s u y o s h ii m a i ，1 9 9 3 ) 研究发现，利用二倍体马铃薯块 茎片进行农杆菌介导的转化体系中四倍体出现频率高达6 5 ，利用再生 植株在含抗生素的培养基上的生根情况来确认具抗性编码基因的整合：通 过s o u t h e r n 杂交验证，所有被选择株都带有编码基因。在后代植株的继 代繁殖中，这一抗性性状可稳定遗传表达。转化体系中二倍体和四倍体比 率为l ：2 ，而在没有与农杆菌共培养的7 8 株转化植株中，表现出相当低 的四倍体比率，只有2 7 株是四倍体。 1 4 多倍体鉴定方法研究 在蔬菜多倍体的诱导过程中，准确并及时的鉴定出多倍体植株是多倍 体育种的重要环节。运用适当的鉴定方法不仅可以缩短培育周期，还可提 高多倍体育种的工作效率。多倍体由于染色体加倍，其外部形态特征、内 部结构和生理生化都发生了相应变化。根据这些变化就可以鉴定和区别二 倍体与多倍体。 1 4 1 形态学鉴定法 四倍体厚皮甜瓜植株形态特征和果实品质性状的研究 植物体细胞染色体加倍后，分化生成的多倍体植株，一般表现出巨大 性。通常植株高大，茎变粗壮；叶片变大加厚，叶色加深，叶形指数变小， 有时比较粗糙或生皱纹、多毛：花朵、果实和种子变大；生育期延长。这 些特征都可作为判别多倍体的根据。通过对植株生长发育期间的外部形态 特征观察，初步判定植株倍性，便于对多倍体的生长状况和经济性状做比 较观察。c o m p t o n 和g r a y 在西瓜倍性研究中发现子房直径、雄花的花瓣、 花粉囊直径，叶长与叶宽比是很好的倍性水平标志。如四倍体子房直径是 二倍体的1 4 倍，而叶长与叶宽比却小于相应的二倍体。四倍体和二倍体 雌花的花瓣直径和子房长度没有差别；而雄花中，四倍体的花瓣直径和花 粉囊直径比二倍体大。江舰等( 江舰，1 9 9 9 ) 通过对花粉粒大小和育性比较 进行甜瓜的倍性鉴定：乔传卓等( 乔传卓，1 9 8 9 ) 发现菘蓝花粉粒的大小及 其不同形状的花粉数目可鉴定倍性。 形态观察是较粗放而简易的鉴定方法，同时，形态学鉴定法也是最直 观的鉴定方法。因受到外界环境条件影响，这种方法只能做判断依据，仅 供参考。 1 4 2 细胞学鉴定法 叶片气孔大小和密度、保卫细胞大小及叶绿体数目等可作为倍性鉴定 的依据。与二倍体相比，多倍体气孔大，保卫细胞中的叶绿体数目多。 c o m p t o n 和g r a y 用显微镜观察再生植株叶片中每对保卫细胞的叶绿体数 目来鉴定二倍体和四倍体植株。四倍体西瓜植株中，平均每对保卫细胞有 1 9 个叶绿