（分析化学专业论文）六氮杂铜镍配合物与dna相互作用的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 签名：透查：魄塑乙! 兰 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公 布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 躲硷查聊虢 建挚辱隰塑z ： 硕士研究生学位论文六氮杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 摘要 d n a 是生物体遗传信息的载体，具有存储和传递信息的功能。对d n a 的研究 是生命科学研究中一个极其重要的方面。d n a 是大多数抗癌，抗病毒试剂在体内 的主要靶向分子。小分子物质，特别是一些药物分子，与d n a 的作用，影响到 d n a 的生理和物理化学性质，改变了d n a 的转译和复制。因此，研究小分子物质 与d n a 的相互作用有助于人们对d n a 与蛋白质相互作用方式的了解，并且对一些 致癌化合物的致癌机理，抗癌药物的药理和毒性，以及新型药物的设计合成方面 都有很大的意义。在医药研究中，d n a 与靶向分子相互作用的研究不仅对阐述一 些抗肿瘤抗病毒药物及致癌物的作用机理，而且对进一步指导人工核酸的合成 及d n a 高级结构的研究具有重要意义。 核酸切割试剂一直是生物化学和分子生物学中最为活跃的前沿领域之一。设 计和合成金属配合物作为人工核酸切割试剂具有非常重要的理论和应用价值。首 先，对人工核酸切割试剂的切割机理的研究将大大有助于我们对核酸酶催化机理 的透彻了解；其次，选择性识别和断裂d n a 的化学核酸酶在疾病的基因治疗中有 着十分重要的应用；第三，人工核酸切割试剂尤其是选择性高的切割试剂可以作 为重要的分子生物学工具，将切割试剂连上识别系统即构成人工核酸酶。 基于上述事实和观点，本文中首先对近年来人们关于具有生物活性的物质和 d n a 相互作用的研究进行了概述和总结，然后研究了六氮杂镍配合物与d n a 相互 作用以及六氮杂铜、镍配合物存在下电位控制的d n a 损伤检测。本论文的研究工 作可分为三个部分： 第一部分：综述 对d n a 的研究是生命科学研究中一个极其重要的方面。本部分主要综述了 d n a 的结构、d n a 与小分子的相互作用以及具有化学核酸酶活性的切割剂对d n a 的切割。d n a 与小分子的相互作用部分主要介绍了靶向物质的种类、d n a 与小分 子的相互作用的方式和研究方法；对d n a 的切割主要介绍了自由基氧化切割和酯 水解切割。确立了课题的立论依据，阐述了生物小分子与d n a 相互作用和切割剂 对d n a 的切割在药物筛选和生物分子化学中的重要理论和实践意义。 研究生：王秀杰 指导教师；康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向；生物电分析 3 硕士研究生学位论文六氮杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 第二部分：六氮杂镍配合物与d n a 相互作用的研究 六氮杂镍配合物是一种八面体的大环配合物，具有和b 。和血红素类似结构， 因此它也具有抗氧化、抗肿瘤等广泛的药理作用，所以我们选择此配合物作为研 究对象。 本部分内容中我们主要通过电化学方法，荧光光谱，黏度法，圆二色谱，凝 胶电泳法和高效液相色谱法研究了六氮杂镍( n i ( i i ) l ) 配合物与小牛胸腺d n a ( c t d n a ) 以及p b r 3 2 2 超螺旋d n a ( s c d n a ) 的相互作用。电化学实验结果表明 n i ( i i ) l 在缓冲溶液中的氧化还原是一个电子转移过程，镍( i i ) 和镍( ) 配合物 对d n a 键合常数的比值( 丘脚为3 2 ；荧光实验表明配合物同e b 有效的竞争了 嵌插位点，配合物与d n a 结合常数为2 1 5 1 0 4 ；黏度实验表明n i ( i i ) l 使d n a 发生卷曲或扭结，圆二色谱表明d n a 同n i ( i i ) l 结合后，d n a 的构象接近a 形式。 上述试验均表明能够相互作用，并且作用模式为部分嵌插。在h 2 0 2 存在下，凝胶 电泳和高效液相色谱方法均表明n i ( i i ) l 对c r - o n a 和p b r 3 2 2 d n a 劈裂能力均增 强。 第三部分：电位调控o n 损伤的高效液相色谱紫外可见检测 d n a 损伤包括糖一磷酸骨架的断裂。有氧条件下，过渡金属离子通过产生的活 性氧物种诱导d n a 的损伤。六氮杂铜( c u ( i i ) l ) 和n i ( i i ) l 配合物通过调控电 解质溶液的电位，促使d n a 链断裂，对断裂后的d n a 碎片使用液相色谱进行了分 离。用紫外检测器对切割后的产物进行了检测。根据获得的实验结果，c u ( i i ) l 或n i ( i i ) l 存在下，电解溶液的电位合适时( 足够负或足够正的电位，保证金属 离子的还原或氧化) ，不需要加入额外的氧化剂或还原剂，同样可以切割小牛胸 腺d n a ，c u ( i i ) l 劈裂能力强于n i ( i i ) l 配合物。实验证明c u ( i i ) l 通过和氧气 发生f e n t o n 反应产生自由基，这些自由基造成d n a 损伤。至于n i ( i i ) l 促进d n a 损伤可能是涉及氧化机制。本工作是在中性的p h 条件进行，并且这一切割过程 中不需要加入额外的氧化剂和还原剂，因而体系简单，不存在其它化学物质的干 扰，为d n a 断裂研究提供了新的手段。 关键词：d n a ；六氮杂铜、镍配合物；电化学；相互作用；裂解；高效液相色谱 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析4 硕士研究生学位论文六氨杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 a b s t r a c t d n a i st h ec a r r i e ro fg e n e t i ci n f o r m a t i o na n dp l a y sa l le s p e c i a l l yi m p o r t a n tr o l e i nt h ec o u r s eo fg e n e t i c i n v e s t i g a t i o no fd n ai si m p o r t a n ti nt h el i f es c i e n c e sf i e l d d n ai st h em a i nt a r g e tm o l e c u l et h a te x i s t si na n t i c a n c e ra n da n t i v i r a lt h e r a p i e s i n t e r a c t i o no fd n aw i t hs m a l l m o l e c u l e s ，e s p e c i a l l yd r u g m o l e c u l e sa f f e c t s p h y s i o l o g i c a la n dp h y s i c a lc h e m i c a lc h a r a c t e ro fd n a a n dc h a n g e st h et r a n s f e ra n d c o p yo fd n a h e n c e i ti sm e a n i n gt h a ti n t e r a c t i o n so fs m a l lm o l e c u l e sw i t hd n aa r e i n v e s t i g a t e dt ou n d e r s t a n db i n do fd n a w i t hp r o t e i n , a n t i c a n c e rm e c h a n i s ma n dt o d e s i g na n ds y n t h e s i z en e wd r u g i nm e d i c a m e n t ，i tp o s s i b l et of o r e s e em a j o rs t e p s f o r w a r di no u r u n d e r s t a n d i n go ft h em o l e c u l a rb a s i so fd i s e a s e b o t hf r o ma t t a c kb y e x t e r n a lp a t h o g e n sa n di n t e r n a l l yf i o mv a r i a t i o n sw i t h i nt h eh u m a ng e n o m er e s u l t i n g i na p l e t h o r ao fn e w m o l e c u l a rt h e r a p e u t i ct a r g e t sf o rd r u gd e s i g na n dd i s c o v e r y c l e a v a g er e g e n t so fn u c l e i ca c i da r ea na c t i v ef i e l di nb i o c h e m i s t r ya n db i o l o g y o fm o l e c u l e i ti sv e r yv a l u a b l et h a td e s i g na n ds y n t h e s i z ec o m p l e x e sa sa r t i f i c i a l c l e a v a g er e g e n t so fn u c l e i ca c i d i nt h e o r ya n da p p l i a t i o n f i r s t , t h es t u d yo f m e c h a n i s m sw i l lh e l pu st ok n o wt h ec a t a l y s i sm e c h a n i s m so fn u c l e i ca c i de n z y m e ； s e c o n d , i ti sv e r yi m p o r t a n tt h a tt h ec h e m i c a ln u c l e i ca c i de n z y m ew h i c hi d e n t i f y s e l e c t i v e l ya n dc l e a v ed n a i nt h eg e n ec a r eo fs i c k n e s s ；t h i r d ，a r t i f i c i a lc l e a v a g e r e g e n t so fn u c l e i ca c i de s p e c i a l l yh i g hs e l e c t i v i t ym a ya c ta st h ei m p o r t a n tt o o li n b i o l o g yo f m o l e c u l e t h ef i r s tp a r t ：g e n e r a li n t r o d u c t i o na n dc o n c l u s i o n i n v e s t i g a t i o no fd n a i si m p o r t a n ti nt h ef i f es c i e n c e sf i e l d t h i sp a r tm a i n l y s u m m a r i z e st h es t r u c t u r eo fd a n di t si n t e r a c t i o nw i t ht h es m a l lm o l e c u l a r , a sw e l l a st h es m a l lm o l e c u l ew h i c hh a v ec h e m i s t r yn u c l e a s ea c t i v i t yc l e a v ed n a t h ep a r t o ft h ei n t e r a c t i o no fd n aw i t hs m a l lm o l e c u l a rm a i n l yi n t r o d u c et h ek i n d so ft h e m a i nt a r g e tm o l e c u l e ，t h ew a y so fi n t e r a c t i o na n dt h em e a s u r e so fs t u d y t h e m e c h a n i s m sc l e a v ed n a i n c l u d i n gh y d r o l i s i sa n do x i d a t i o n i ti si m p o r t a n tt os t u d y d n ai n t e r a c t i o nw i t hd r u gi nt h e o r ya n di np r a c t i c e 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析 5 硕士研究生学位论文六氮杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 t h es e c o n dp a r t ：m e c h a n i s mo fd n as t r a n dc l e a v a g ei n d u c e db y h e x a a z am a c r o c y c l i cn i c k e l ( i dc o m p l e x t h eh e x a a z am a c r o c y c l i cn i c k e l ( 1 1 ) c o m p l e xh a sao c t a h e d r a ls t r u c t u r e ，s i m i l a r t ob 1 2a n dh e m o g l o b i n ，t h e r e f o r ei th a st h ea n t i 嘲i 由t i ，t h ea n t i t u m o ra n dw i d e p h a r m a c o l o g i c a la c t i o n t h ec o m p l e xm a yc h a n g et h ed u p l i c a t i o no fd n a a n dh i n d e r t u m o rc e l l g r o w t h t h r o u g h t h i s p a r t , w eh o p et h a tw ec a nu n d e r s t a n d t h e p h a r m a c o l o g i c a la c t i o no ft h ec a n c e rm e d i c i n ef u r t h e ra n dm a ye x p a n dt or e g a r dt h i s k i n d o fm a t e r i a lp h a r m a c o l o g i c a l i nt h i sp a r t , t h ee l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e ro fn i ( i i ) lw a sm e a s u r e d ，a n dt h e i n t e r a c t i o no fn i ( i i ) lw i t hc a l ft h y m u sd n aw a ss t u d i e du s i n ge l e c t r o c h e m i c a l t e c h n i q u e s e m i s s i o na n dv i s c o m e t r ya n dc i r c u l a rd i c h r o i cs p e c t r a lm e 勰u f e m e n t s a l l o ft h ee x p e r i m e n t ss u g g e s tt h a tt h ec o m p l e xi n t e r a c t sw i t hd n a p r i m a r i l yb yp a r t i a l i n t e r c a l a t i o n t h ec y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) s h o w e dt h a t t h ec u r r e n t so fb o t ht h e r e d u c t i o np c a ka n dt h eo x i d a t i o np e a l 【d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi nt h ep r e s e n c eo fd n a c o m p a r e dw i t ht h o s ei n t h ea b s e n c eo fd n a , w h i c hi n d i c a t e st h a tn i ( 1 1 ) lc o u l d i n t e r a c tw i t hd n a t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h ed n a - e bs y s t e md e e a s e s d i s t i n c t l yw h e nn i ( 1 1 ) li sa d d e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tn i ( i i ) lm a yb ec o m p l e t e e f f e c t i v e l yw i t he bf o rt h ei n t e r c a l a t i v eb i n d i n gs i t e s t h ev i s c o s i t yo fd n a w o u l d b e d e c r e a s e ds f i g h t l yb ya d d i t i o no ft h ec o m p l e x c i r c u l a rd i c h f o i cs p e c t r a ls t u d i e sr e v e a l t h a tc a l ft h y m u sb d n ab e c o m e sm o r ea - l i k ei ns t r u c t u r eo ni n t e r a c t i o nw i t ht h e c o m p l e x n o t i c e a b l y , t h ec o m p l e xh a sb e e nf o u n dt oc l e a v ed o u b l e s t r a n dp l a s m i d p b r3 2 2b ya g a x o s cg e le l e c t r o p h o r e s i sa n dc l e a v ec t - d n ab yh i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h i nt h ea b s e n c eo rp r e s e n c eo fh 2 0 2 t h et h i r dp a r t ：p o t e n t i a l - c o n t r o l l e dd n ad a m a g ed e t e c t e db yh i g h p e r f o r m a n c eh q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t h u v - v i sd e t e c t i o n d a m a g et od n af r e q u e n t l yi n v o l v e si n t e r r u p t i o no fd n as u g a r - p h o s p h a t e s t r a n d s u n d e ra e r o b i cc o n d i t i o n s ，t r a n s i t i o nm e t a li o n sc a u s ed n ad a m a g et h r o u g h p r o d u c t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s f o r m a t i o n o fs t r a n db r e a k si n d u c e db y 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析 6 硕士研究生学位论文六氯杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 e l e c u o c h e m i c a lm e t h o di n p r e s e n c e o fc ! i l ( r d la n dn 田l c o m p l e x e sw a s i n v e s t i g a t e db yu s i n gh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( i i p l c ) b y c o n t r o l l i n gt h ep o t e n t i a lo ft h ee l e c t r o l y t es o l u t i o n s , t h i st e c h n i q u e 啪b ee m p l o y e d i ns t u d i e sf o r m a t i o no fd n as t r a n db r e a k s c t - d n aw a sc l e a v e db ya d d i n ga m o u n t s o fc u ( i i ) lo rn i ( i i ) lc o m p l e xi nt h ea b s e n c eo fc h e m i c a lr e a g e n tw h e na p p r o p r i a t e e l e c t r o d ep o t e n t i a l ( s u f f i c i e n t l yn e g a t i v eo rp o s i t i v et or e d u c eo ro x i d a t em e t a li o n s ) w a sa p p l i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ec l e a v ea c t i v i t yo fc u ( i i ) li sm u c h s t r o n g e rt h a n n i ( i i ) l f u r t h e r , t h e i rm e c h a n i s m so fp r o m o t i n gd n ad a m a g ew e r ee x p l a i n e d t h e r e s u l t ss u g g e s tt h a tc u ( i i ) lg e n e r a t eh y d r o x y lr a d i c a lf r o m0 2b yt h ef e n t o nr e a c t i o n ， a n dt h a tt h e s er a d i c a l sc a u s ed n ad a m a g e a sf o rn i ( i i ) l p r o m o t i n gd n a b r e a k s ，o x i d a t i o nm a yb ei n v o l v e di nt h em e c h a n i s m k e y w o r d s ：d n a ；h e x a a z am a c r o c y c l i cc o p p e r ( i i ) a n dn i c k e l ( i i ) c o m p l e x e s ； e l e c t r o c h e m i s t r y ；h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析 7 硕士研究生学位论文六氮杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 第一章综述 d n a 双螺旋模型的提出 1 从结构上为d n a 作为遗传物质提供了强有利的证 据，从此生物学进入了分子生物学的新时代分子生物学和分子药理学的发展使 人们能够从基因水平上理解某些疾病的发病机理，并通过分子设计来寻找有效的 治疗药物。d n a 靶向化合物成为很重要的药物选择对象 2 4 。临床上使用的许 多抗癌药物都以d n a 为作用的主要靶点，通过与癌细胞发生相互作用破坏其结 构，进而影响其基因调控与表达的功能，表现出抗癌活性 5 。因此，d n a 与其 靶向分子抗癌药物相互作用的研究不论是对阐述抗癌、抗病毒药物的作用机理， 药物的体外筛选，还是对致癌机理的研究都非常有意义。 核酸的断裂与基因重组技术是分子生物学和基因工程的核心技术，对d n a 、 r n 的定位断裂是该技术的关键。随着遗传和蛋白质工程、分子生物学和分析生 物化学的不断发展，核酸酶的化学模拟研究吸引了众多的研究者。一方面是因为 核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。它在生物的生长发育和繁 殖等正常活动中具有十分重要的意义。当今社会发现越来越多的疾病，如肿瘤、 放射损伤、遗传病等均与核酸有密切关系。另一方面核酸酶是基因工程中的重要 工具，基因物理图谱的绘制、d n a 核苷酸序列的分析、基因片段的体外切割重组、 转化菌中重组子的筛选，都要使用限制性内切酶。除此以外通过基因的限制性内 切酶酶谱的多态性分析和分子杂交技术的应用，可以从基因水平来研究遗传性疾 病的发病机理。从八十年代以来国际上开始了积极的研究工作，许多科学工作者 投身于这一领域，获得了许多有意义的认识。 1 d n a 的结构 6 - 9 d n a 的结构如图1 所示。脱氧核糖核酸( d n a ) 是生物的基本遗传物质，它是 一种由脱氧核糖核苷单磷酸通过3 ，5 一磷酸二酯键连结而成的多聚核苷酸， 其基本的化学组成是：戊糖( b - d - 2 一脱氧核糖) 、磷酸和碱基。生物遗传物质就储 存在d n a 分子中四种碱基一腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 的核苷酸序列( 即d n a 一级结构) 中。d n a 是两条多聚脱氧核苷酸链上方向相反的 互补碱基( - t 和g - c ) 之间的氢键作用而形成有规律的d n a 双螺旋二级结构。四 种疏水性的碱基位于螺旋的内侧，带负电荷的、亲水性的磷酸基与脱氧核糖单位 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析 8 硕士研究生学位论文六氰杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 处于外侧。相邻碱基对平面之间间隔处于v a n d e r w a a l s 距离内，因此碱基平面上 分布的p 电子云系统之间的吸引力、碱基上永久性偶极问的作用力和诱导偶极的 相互作用等分子间作用力使碱基之间存在堆积作用 由于d n a 是一种柔性的生物分子，这使得d n a 双螺旋可采用不同的构象，如 a 、b 、c 、d 、z 等形式。d n a 采用哪种构象很大程度上取决于环境条件，如盐的 种类，相对湿度等。b 型是大多数天然d n a 的存在形式，其结构特点是两条呈反 平行的多核苷酸链围绕同一螺旋轴旋绕而形成右手双螺旋，每十个碱基对旋转 一圈形成一个螺旋结构，螺距3 4 n m ，螺距直 径2 n m 。d n a 不同构象所具有的特征使得小分 子配合物来识别d n a 的二级结构成为可能。 d n a 二级结构是生命遗传信息得以传递的基 础，也是目前d n a 传感器、基因芯片以及d n a 作为生物材料应用的基础。d n a 分子在双螺旋 结构的基础上再通过超螺旋形成各种拓扑结 构，即i ) n a 三级结构，甚至还出现四链的d n a 结构。d n a 结构的稳定性主要来源于三种力： 一是互补碱基对之间的氢键；二是碱基堆积 力，由芳香碱基上的p 电子之间的相互作用产 生，是比较主要的力；三是来自于磷酸基上的 负电荷与介质中的阳离子。 2 d n a 与小分子的相互作用 图i d n a 双螺旋结构 在核酸化学研究中，小分子一般是指分子量不大于1 0 0 0 的一类有机化合物、 络合物等，药物是这类化合物中典型的一类。这类小分子化合物一般属于癌治疗 化学试剂、核酸的裂解试剂、核酸染色及结构探针。小分子与核酸相互作用的研 究，对于了解核酸的结构和功能，对于控制和改善基因表达，对于阐明药物的机 理以及对于一些药物的诊断、治疗均有着很重要的价值。因此，对它们的研究一 直非常活跃。 2 1 靶向物质的种类 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析 9 一 硕士研究生学位论文六氮杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 2 i 1 过渡金属离子及其配合物 近年来金属配合物与d n a 键合作用之所以引起了人们日益重视，是因为这 类化合物有广泛的应用前景。如可作为d n a 的结构探针、d n a 断裂配基、对d n a 的某些位点的特定性剪切、研究核酸结构和测定核酸序列、d n a 传感器的杂交剂 及抗癌化疗药物等。研究其与d n a 的键合与机理识别成为近十多年来国内外研究 比较活跃的领域之一。 1 铂配合物 自从6 0 年代r o s e n b e r s 1 0 发现顺二氯二氨合铂( i i ) 的抗癌活性以来，有 关顺铂及其具有类似结构的平面四边形铂配合物的抗癌活性研究一直非常活跃 1 l ，1 2 1 。目前除顺铂及卡铂已用于临床外，还有几种也已处于临床实验阶段。 大量的研究表明，这类药物的抗癌活性与其能和d n a 链共价结合并导致d n a 结构 变化的能力密切相关 1 3 ，1 4 。 2 金属卟啉配合物 金属卟啉是一类广泛存在于自然界中的生物活性物质。对铜卟啉的研究表明 1 5 ：c u ( n e a e ) 可能主要靠带正电荷的吡啶基与d n a 上带负电荷的磷酸基团通过 静电作用结合。c u t m y p 和c u ( n a c n ) 则分别主要通过嵌入和沟槽作用与d n a 结合。 现在，虽然已有很多有关卟i i t - d n 之间相互作用的研究，但不同结合模式与其 生物活性间的关系尚未阐明，因此探讨在生物体内具有最佳活性的作用模式是十 分重要的。 3 其它过渡金属配合物 具有八面体结构的过渡金属配合物，尤其是r u ，r h ，c 0 配合物与d n 相互 作用的研究也一直受到人们的重视。许多r u 配合物具有的独特发光性能，使其 成为研究d n a 性质的一种有效的光物理和光化学探针 1 6 ，4 。因此某些d n a 序列 特异性识别分子可以作为由基因突变所引起的特殊的d n a 拓扑形变的结构探针， 也可作为诊断试剂。另外，许多r u 配合物还作为d n a 损伤的光敏剂 1 7 ，即活 化的r u 配合物与d n 鸟嘌呤间的电子转移产生鸟嘌呤自由基，经一系列反应， 最终导致d n a 断链。s i g m a n 等在研究邻菲咯啉( p h e n ) 对大肠杆菌d n a 聚合酶i 抑制作用机理时发现，铜邻菲咯啉配合物具有能切割d n a 的化学核酸酶活性将 p h e n 与特定的核酸结合蛋白连接可以进行特定切割，铜氨基酸配合物具有催化 超氧阴离子自由基歧化分解的作用，有望成为辐射病、免疫性、疾病、心血管疾 病、癌症等疾病的药用酶；铜氨基酸水杨酸s h i f f 碱配合物不仅是研究金属酶反 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析 1 0 硕士研究生学位论文六氮杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 应的模型体系，而且具有抗菌、抗癌活性，因此，研究s h i f f 碱金属配合物与 d n a 的作用就具有特别重要的意义。 2 1 2 药物分子 小分子物质，特别是一些药物分子，与d n a 的作用影响至u d n a 的生理和物理化 学性质，改变了d n a 的转译和复制，因此，研究小分子物质与d n a 的相互作用有助 于人们对d n a 与蛋白质相互作用方式的了解，并且对一些致癌化合物的致癌机理， 抗癌药物的药理和毒性，以及新型药物的设计合成方面都有很大的意义。另外在 d n a 碱基序列识另h 方面也有帮助。 1 烯二炔类抗生素 烯二炔是一类在临床和理论研究中都有很大价值的抗癌抗生素，这类抗生素 结构上的独特之处在于其分子中含有一个张力比较大的烯二炔环，一个能与d n a 接近的引导系统，另外有激发系统以激发并启动反应 1 8 。研究表明这类抗生素 通过与d n a 序列特异性结合并进而引起s s d n a 或d s d n a 的损伤而表现出生物活性。 2 葸环抗生素 葸环抗生素是一类研究得比较多的抗癌抗生素，阿霉素( a d r i a m y c i n ，a d l d 、 道诺霉素( d n m ) 、诺加霉素( n o g a l a m y c i n ，n g ) 、阿克拉霉a ( a c l a c i n o m y c i n ，a c 岫 都属于这一类抗生素。其共同结构特征是含有一个由3 个共平面的六元环所构成 的四氢并四苯酮发色团。s p i n e l l 和d a b r o v o i a k 证实：c u ( i i ) 既能与阿霉素( a d 吣 天然d n a 形成三联体配合物，又能与a d m - 变性d n a 生成三联体配合物。杨频等 研究表明，n i ”只能与变性的d n a 形成三联体，这种差别可能是由于c u ”主要和 d n a 碱基对反应，而n i “既能与碱基对反应，同时还能与磷酸根作用，因而产生 对d n a 变性作用以使d n a 双链收缩的程度不同。因此利用n i ”与蒽环类药物的作 用部位以及在n d n a 和d d n a 存在时可否生成三联体配合物，极易判断葸环类药物 是否以其发色团平面插入d n a 碱基对之间，即在研究蒽类药物与d n a 作用位置方 面，n i “实为一种方便的离子探针 1 9 。这些分子水平机理的发现为以后抗癌药 物的发展提供了有用的理论依据。 3 多肽及蛋白质类抗生素：博莱霉素( b l e o m y c i n ，b l m ) 在f e 或c u 等具有氧化还原活性的金属离子与氧同时存在的条件下，对d n a 的单链及双链进行切割 2 0 ，2 1 。l e v y 等人 2 2 提出，b l m 分子无需从d n a 链上 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析 1 1 硕士研究生学位论文六氨杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 解离，即可同时催化互补的双链被切割b l a s k o 等 2 3 用二维n m r 及约束分子 动力学方法对z n ( 1 1 ) b u i 与一种核苷酸八聚物d ( c g c t a g c g ) ：的相互作用进行 研究，认为b l m - d n a 间究竟采取何种结合模式取决于d n a 的碱基序列。进一步的 研究将通过对b l m 分子不同功能区的修饰，以增强其对d n a 分子的特异性识别能 力，并降低其毒副作用及某些肿瘤细胞对其所产生的抗药性。 4 乙撑亚胺类抗生素( 氨丙啶类抗生素) 乙撑亚胺类抗生素是一类非常重要的烷化剂，丝裂霉素c ( m i t o m y c i i n c ，m c ) 作为临床上常用的抗肿瘤剂，是这类化合物的代表。研究表明，l l c 所具有的抗 肿瘤能力及强细胞毒性均与它和d n a 双链共价交联的能力有关。l l c 在与d n a 结 合之前，必须经过还原活化过程，活化后的m c 先与d n a 结合使之单烷基化，然 后产生双烷基化产物。m c 在单烷基化d n a 时具有高度的序列选择性，即有限与5 c g 和5 g g 序列上的鸟嘌呤结合。丝裂霉素c 的还原以及形成与d n a 的亲核中 心共价反应的机理研究已经证明，这个抗生素紧紧地结合在d n a 的大沟区 2 4 ，2 5 5 其他种类的抗生素 纺锤霉素( n e t r o p s i n ) 是一种抗病毒物质，d i c k e r s o n 等已经得到了纺锤霉 素结合到d n a 双螺旋结构d ( c g c g a t t c g c g ) ：的结晶，纺锤霉素结合到d n a 双螺旋 的从t t 中心，并取代了游离寡聚核苷酸区域中的水和骨架部分 2 6 。 此外还有氨茵霉素、茅屋霉素、西伯利亚霉素以及新乳霉素a 和b 偏端霉素 等，均有与d n a 相互作用的相关文献报道 2 7 。2 8 。z h a n gry 等也对其进行了 综述 2 9 ，3 0 。 2 2 作用方式 小分子与核酸结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环，核酸由平行堆 积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸链形成的大沟、小沟组成小分 子识别位点。虽然d n a 靶向化合物的数量非常之大，但与d n a 的结合模式归纳起来 大致可分为非共价结合、共价结合和剪切作用三类。近期研究结果表明，小分子 与d n a 相互作用形式还有“半嵌插结合( h a l fi n t e r c a l a t i o n ) ”，由于超分子化学 的发展，分子与核酸还涉及到长组装( 1 0 n gr a n ga s s e m b l y ) 。 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业；分析化学 研究方向：生物电分析 1 2 硕士研究生学位论文六氰杂铜、镶配合物与d n a 相互作用的研究 2 2 i 非共价结合 非共价结合包括嵌插结合、沟内结合和静电结合，如图2 所示。另外还有氢 键、离子键、范德华力、疏水键这些弱的相互作用。金属配合物通过沟内或嵌插 结合在核酸的螺旋沟或碱基中，加上静电力的作用，常会诱发许多生物效应，阻 碍核酸信息的正常表达。同时，这三种力还凭借氢键、范德华力、疏水作用等使 相互作用加强。 1 嵌插结合 即平面或几乎平面的芳香环嵌入碱基对之间，这是芳环的离域体系与碱 基体系间的丌一丌相互作用及疏水作用的结果。通常稠环芳香体系都倾向于 结合在g c 富集区 3 1 ，而对于一些含有庞大取代基的分子，则使取代基尽量旋 转，以保持与母环的共平面，从而形成良好的堆积形状与d n a 碱基嵌合。嵌插结 合模式最引人注意，因为现在已经发现某些抗癌药的抗癌作用与嵌插结合有关， 这种作用是药物分子与d n a 发生作用的重要形式之一。这种作用与配合物的手 性、配合物和d n a 的对称性匹配程度以及d n a 的沟相对于手性配合物的大小等因 素有关。当配合物与d n a 通过嵌插模式结合时，还会引起配合物的光物理性质的 一系列变化，如配合物的吸收峰强度减弱，吸收峰最大值红移和荧光增强等。同 时，由于配合物的插入，会导致d n a 的熔点升高，粘度增大 2 沟槽结合 即小分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接作用，大沟区、小沟区在电 势能、氢键特征、立体效应、合作用上都有很大不同。大分子蛋白质与d n a 的特 异性结合是通过大沟区作用，而小分子化合物一般在小沟区结合，主要是靠碱基 疏水性起稳定作用。小沟区一般结合简单的芳香环结构，如呋喃、吡咯、苯环等。 它们通过扭转自由键而连接，从而配合小沟区的螺旋曲线，取代沟区内的水分子 并与碱基对边缘通过范德华力接触，即为其特异性。小沟区内是a t 富集区，小 分子通过与胸腺嘧啶基c 2 上的羰基氧( c _ o ) 或腺嘌呤碱基n 3 上的氮形成氢键与 a t 碱基结合。对于金属配合物来讲，嵌插结合和沟内结合是它们与d n a 作用的 两种最常见的模式。含有平面刚性大环配体的金属配合物通常与d n a 嵌插结合， 但对于空间位阻较大而不能插入的金属配合物来讲，则主要以 沟内结合模式与d n a 作用。 研究生：王秀杰 指导教师：康敬万、卢小泉 专业：分析化学 研究方向：生物电分析 1 3 硕士研究生学位论文六氮杂铜、镍配合物与d n a 相互作用的研究 3 表面结合 即小分子通过非特异性的相互 作用结合于带负电的d n a 双螺旋外部 的磷酸酯骨架。核酸是一种带负电荷 的多聚阴离子，通常以钠盐形式存 在，金属离子及许多配合物带正电 荷，因此它们与核酸在外层通常发生 静电结合。 2 2 2 共价结合 馘瓷， 图2 d n a 与小分子作用的结合模式 共价结合包括与亲核试