（基础兽医学专业论文）大骨鸡胚胎mstn基因不同转录子的克隆、测序及原核表达.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 碱雌轹套他 时间： 伽f 年6 月够日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 硷耗柃 时间：砌j 年f 月钥 导师签名： 占l 习 羔 时间：钾年f 月j ，同 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 骨骼肌的生长发育是动物个体发育的重要环节，目前的研究表明肌肉生长抑制素 ( m y o s t a t i n ，m s t n ) 对骨骼肌的生长发育起着极其重要的抑制作用，任何可以干扰m s t n 基因表达或表达产物活性的措施，都可能影响肌肉的正常发育。利用原核表达系统表达 真核基因，进而研究该基因的结构与功能是分子生物学技术也是基因工程的重要内容。 本实验主要研究内容如下： m s t n 基因的r t p c r 扩增、p m d1 8 一ts i m p f ev e c t o r 克隆及测序： 根据g e n e b a n k 中鸡m s t n 基因序列，采用叭i g o6 2 2 及p r i m e rp r e m i e r5 o 软 件设计一对寡核苷酸引物，进行r t p c r 扩增，扩增产物经凝胶回收后被克隆到p m d l 8 一t s i m p l ev e c t o r 克隆载体中，经测序证明获得了两个大小不等的阳性重组质粒并分别命 名为t 1 4 和t 一2 0 ，其中t 一2 0 重组质粒插入片段长度为1 1 2 8 b p ，该序列与g e n e b a n k 上 的g i ：3 8 3 4 9 5 1 6 序列同源性可达9 9 ；t 一1 4 重组质粒插入片段长度为9 8 5 b p ，与t 一2 0 相比缺失1 4 3 b p 碱基，缺失部位在3 7 4 5 1 7 b p 之间，其它部分与t 一2 0 相比在5 1 b p 、2 3 4 b p 、 3 2 4 b p 等处有三处碱基不同。到目前为止国内、外均未见到鸡体内同时存在m s t n 基因不 同转录子的报道，这一发现具有重大的研究意义。 m s t n 基因的表达： 从t 1 4 和t 一2 0 重组质粒上切下目的基因片段，然后与表达载体p g e x k g 连接，分 别构建表达重组质粒p g e x k g 一1 4 和p g e x k g 一2 0 ，经p c r 和双酶切鉴定其正确性，以各 转化表达工程菌用。将上述鉴定为阳性的表达重组质粒p g e x k g 1 4 和p g e x k g 一2 0 分别 转化到b l 2 l ( d e 3 ) 表达工程菌感受态细胞中，振荡培养后加入i p t g 进行诱导表达，诱 导表达结果经s d s p a g e 鉴定表明，在诱导后3 h 和5 h ，p g e x k g 2 0 均获得了清晰的外 源目的基因蛋白带，而p g e x k g 1 4 却未见清晰的表达。 外源重组融合蛋白的成功表达为下一步制备目的蛋白的抗体做好了充分的准备，为 迸一步研究m s t n 和淞硝基因的结构，功能以及该基因的遗传学本质等奠定了坚实的基 础。 关键词：m s t n 基因，r t p c r ，克隆，亚克隆，原核表达 英文摘要 a b s t r a c t 0 r o 叭ha 1 1 dd e v e l o p m e n to fs k e l e t a lm u s c l ei si m p o n a n tt a c h ei na 1 1 i m a lo n t o g e n e s i s ， 卜b ws t u d yi n d i c a t et h a tm y o s t a t i n ( m s t n ) p l a y sav i t a lr 0 1 ei ni n h i b i t i n gs k e l e t a lm u s c l e g r o 州ha n dd e v e l o p m e n t ，w h j c h e v e rc a ni n t e r 砖r ee x p r e s s i o no fm s t ng e n eo r t h em e a s u r e o ft h ea c t i v a t i o no f e x p r e s s i o np r o d u c t i o nm a y b e a 行色c tn o n n a l d e v e l o p m e n t o f m u s c l e s e x p r e s se u k a r y o n g e n eb ye c 0 1 ip r o n u c l e u se x p r e s s i o ns y s t e ma n dt e x t u r ea n d 如n c t i o no ft h j sg e n ei si n l p o r t a mc o n t e n to fm o l e c u l a rb i o l o g yt e c 上l n o l o g ya n dg e n e e n g i n e e r i n g 。 t 1 1 em 旬o rc o n t e r l t sa r ef o l l o w e d ： r t p c r 锄p l i f i t i o n 、c l o n ea i l ds e q u e n c i n go f m s d ig e n e ： c h e c kc h i c k e nm s t ng e n es e q u e n c ef r o mg e n e b a t l k ，d e s i 盟ap a i ro fo l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r sb yo l i g o6 2 2a n dp r i m e rp r e m i e r5 o s o f 沌忸r e ，m e na i l l p l i f ym s l ng e n eb y u p s t r e a m a n dd o w n s t r e 锄p r i i n e rt h r o u g hi 二p c r r e c l a i mm ea i md n ab a i l dw i t h u n i q l o s t e i ed n ag e l a t i nr e c l 锄i n gk i ta n dl i n kt h ea i md n a b a n di n t op m d l 8 一ts i n l p l e v e c t o lt w oi n e q u a i 时o fs i z ec l o n e s ，h i c ha r en 锄e da st 一1 4a i l dt - 2 0w e r ef o l l l l dt h m u 曲 c l o n es c r c e n i n g 、i d e n t i f i c a t i o na n ds e q u e n c i n g t h es e q u e n c i n gr e s u l t ss h o wm a ti n s e r t e d s e g m e n tl e n g t ho f - 2 0r e c o m b i n a n tp l a s m i di s1 1 2 8b p ，w 1 i c ho fs e q u e n c eh o m o l o g y i su p t o9 9 c o m p a r e dw i 血瓯3 8 3 4 9 5 1 6o ng e n e b a l l ka n di n s e r t e ds e g m e n tl e n g t l lo ft - 1 4 r e c o m b i n 缸tp l a s m i di s9 8 5b p ，w h i c hd e l e t e s1 4 3b a s e sa n l o n g3 7 4 5 1 7b po f7 r - 2 0 a n do t h e r p a r co fw h i c hh a s3b a s e sd i f 右：r e n c ef b m 2 0a t 51 ，2 3 4 、3 2 4 b p r e p o r t so fd i v e r s i t y t r a l l s c 邱t i o n so fm y s t o t i ng e n ei nc h i c k e na r en o tb ef o u n e di nc h i n aa n do t l l e rc o u l l 埘e su n 蜘 n o w s ot 王l i sf o u l l d a t i o nh a ss 堙n m c a n tr e s e a r c hs e n s e e x p r e s s i o no f m s t ng c n e ： s l i d e 吐【ea i md n as e q u e n c ef r o mt - 14a 1 1 dt 一2 0a n di n s e nt h e mi n t ot h ee x p r e s s i o n v e c t o rp g e x - k g ，s ois e p a r a t e l ya c h i e v et w oe x p r e s s i o nr e c o m b i n a n tp l a s m i d sw h i c ha r e n 跚e da sp g e x k g 一1 4a n dp g e x - k g 一2 0 、 血i c ho fe x a c t i t u d ea r ei d e n t i f i e db yp c ra n d e n d o n u c l e a s ed 迳e s 6 0 n ，p g e x k g 一1 4a n dp g e x - k g 一2 0a r er e a d yf o rt r a n s f o m i n gi n t o b l 2 1 ( d e 3 ) 1 y a n s f - 0 h np g e x k g - 1 4a n dp g e x k g 一2 0i n t oc o m p o n e n th o s tc e l le ，c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) a n di n d u c ee x p r e s s i o n 讯吐li p t ga n e rs h a k i n gc u l t u r e t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n a r e 柚a l y z e do ns d s p a g e ，w h i c hi n d i c a t e st h a tp g e x k g 一2 0i se x p r e s s e dc l e a r l yo n3 ，5 h a f t e ri n d u c i n gb u tp g e x - k g 14i sn o te x p r e s s e dc l e a r l y 2 沈刚农业大学硕士学位论文 h e t e m l o g o u sr e c o m b i n a n t 肌i o np r o t e 址a r ee x p r c s 奢e ds u c c e s s f u l l y a r er e a d yf o r p r o d u c eo fa i 】c i s e m mo fa i mp m t e i na i l dt h e s es u c c e s se s t a b l i s hf b u n d a t i o nf o r 如r t h e rs t u d y o f s t r u c t u r e ，如n c t i o na n de s s e n c eo f g e n e t i c so f m s l na n dm s n 叮g e n e k e yw o r d s ： m s t ng e n e ， r t p c r ，c i o n e ，s u b c l o n e ，e x p r e s s i o n 3 4 墓壅塑堕塑垂 英文缩写 c d n a a m v r t p a g e s d s s d s 英文缩略词表 英文全称 c o m p l e e t a r yd n a 中文全称 互补d n a a v i a nm y e l o b l a s t o s i sv i r u s 禽成髓细胞瘤 r e v e r s 。t r a n s c r i p t a s e病毒反转录酶 d i e t h lp y r o c a r b 。n a l e 焦炭酸一乙酯 e t h y l e n ed i 鲫i n e t e t r a a c e t i ca c l d 乙二胺四乙酸 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链反应 氰苄青霉素 e s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 i s o p r o p y l t h i o 一0 一dg a l a c t o s i d e 异丙基一0 一d 一卜硫代半乳糖苷 5 _ b r 。m o 一4 一c hjo r o 一3 一i n d o l y l 一 5 一溴4 氯3 吲哚 bdg a l a c t o s i d e b d 一半乳糖苷 p 。1y a c r y la i 【l i d e g e le l e c t r 。p h o r e s is 聚丙烯酰胺凝胶电泳 s o d i u md o d e c v l s u l f a t e s o d i u md o d e c v l s u l f a t e 十二烷摹磺酸钠 十二烷基磺酸钠 c a d 、j 引 哦 肌 阳 蛳 耋 她 沈阳农业大学硕士学位论文 冉i 】吾 生命现象繁杂纷飞，在分子水平研究生命，使我们认识到各种生命现象的基本原理 却是高度一致的，自然界中各种生物的最基本最重要的组成物质都是蛋白质和核酸，核 酸是生物体遗传信息的携带者，可世代相传，蛋白质则是生命活动的主要承担者。随着 分子生物学技术的快速发展，利用大肠杆菌表达系统获得大量科研与商业用途的蛋白质 己成为最简捷，廉价的生产方法，在蛋白质工程中，大肠杆菌系统应用最早，最广泛， 具有很多优点。 人们对畜禽肉用性状的研究，主要集中在肌肉方面，其中对瘦肉率及肌肉产量的追 求一直是努力的重点。已知动物的生长发育取决于相关基因在不同发育阶段或不同组 织细胞中的特异性表达，这是发育生物学中个十分复杂的基因时空表达调控过程，因 此寻找和研究与动物生长发育相关的基因，并探讨它的功能及作用机理是人类认识和 揭示动物生长发育机理的最直接、最有效的途径，同时也为人类改造和利用动物资源提 供宝贵的理论依据。骨骼肌的生长发育是动物个体发育的重要环节，与这一过程相关的 因子很多，其中有研究表明m s t n 对骨骼肌的生长发育起着极其重要的抑制作用。 一、m s t n 基因的概况 ( 一) m s t n 的结构特征 m c p h e r r o n 等( 1 9 9 7 ) 根据t g f b 超家族的保守区设计一对简并引物，经p c r 扩增出 一个约2 8 0b p 的新产物，以此为探针筛选小鼠骨骼肌c d n a 文库，得到全长c d n a 序列， 分析表明，该c d n a 中只有一个开放阅读框( o p e n i n gr e a d i n gf r 跏e ，0 r f ) ，可编码3 7 6 个氨基酸，它具有t g f 一0 超家族典型的结构特征：n 端疏水的信号肽序列，起分泌信号 的作用，将蛋白分泌到细胞外被酶解加工；前区的糖基化位点；紧接着生物活性区的是 由4 个氨基酸( r s r r ) 组成的蛋白水解酶加工位点：位于c 端的包含9 个保守的半胱氨 酸的生物活性区等，m s t n 靠分子间的二硫键形成二聚体与细胞膜上的活性素( a c t ) i i 型受体结合，发挥生物学功能。c 端序列在t g f 一口和i n h i b i n 一吕家族中存在9 个保守的 半胱氨酸，而且其中至少有7 个半胱氨酸在所有t g f b 超家族中是保守的，但目前无法 将m s t n 归入已有的t g f 一0 超家族中的亚家族中，因此被列为t g f b 超家族中新的一类 因子。 ( 二) m s t n 基因的表达规律及影响表达的因素 前言 l e e 等研究了小鼠胚胎的不同发育阶段m s t n 基因的表达规律，结果表明在胚胎发 育的早期阶段，m s t n 位于发育的体节中：在交配后的第9 5 天，就能检测到m s t n 的表达， 此时主要集中在吻体节；到交配后第1 0 5 天，表达位于生肌节，随后m s t n 在发育的骨 骼肌中广泛表达，m s t n 基因在成年动物所有骨骼肌中都可检测到其表达( m c p h e r r o na c ，e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，但表达量多少与年龄有直接关系。吕文发等( 2 0 0 4 ) 利用制备的猪m s t n 抗体，采用免疫组织化学方法检测了猪肺脏、肝脏、小脑、胰脏、心脏、脂肪、肌肉、 肾脏和子宫中的m s t n 分布，结果表明m s t n 在肺脏、肝脏、小脑、胰脏、心脏和脂肪细 胞中呈现重度染色，说明m s t n 在这些组织细胞中均有分布，而在肌肉、肾脏、子宫细胞 中出现轻微染色，这说明m s t n 在这些组织细胞中分布较弱( 2 0 0 倍光镜) 。牛胚胎从1 5 2 9 d 均可检测到很低水平的m s t nm r n a ，3 1 d 后表达增加。猪m s t n 基因m r n a 在胎儿发育 的第2 1 和3 5 天即可在整个胚胎中检测到，至第4 9 天时显著上升( p 取卜4 m 1 的过夜培养菌液，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟，弃上清。 c 用2 5 0 u 1 的s o l u t i o ni 加入2 5 0 u l 的s o l u t i o n 轻轻地上下翻转混合5 6 次，使菌体充分的裂解，形成 透明溶液。( 注意：此步骤不宜超过5 分钟) e 加入4 0 0 u l 的4 预冷的s 。l u t i 。n ，轻轻地上下翻转混合5 6 次，直至形成紧 实凝集块然后室温静置2 分钟。 f 室温1 2 0 0 0 r p 【f i 离心5 分钟，取上清。( 注意：此时4 离心不利于沉淀沉降) g 将试剂盒中的s p i nc 0 1 u 肌安置于c o l l e c t i o nt u b e 上。 h 将上述操作f 的上清液转移至s p i nc 0 1 u 珈n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟，弃滤液。 i 将5 0 0 u 1 的r i n s ea 加入s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒钟，弃滤液。 j 将7 0 0 u l 的r i n s eb 加入s p i nc 0 1 u 帆中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒钟，弃滤液。 k 重复操作步骤j 。 l 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u 衄膜的中央加入6 0 u l 的灭菌水或e l u t i o nb u f f e r ，室温静置1 分钟( 注意：把灭菌水或e 1 u t i o nb u f f e r 加 热至6 0 使用时有利于提高洗脱效率。) m ) 1 2 0 0 0 r p 离心1 分钟洗脱d n a 。 ( 4 ) p m d l 8 ts i m p l ev e c t o r 阳性重组克隆的双酶切鉴定： 将上述菌落p c r 鉴定为阳性的重组质粒进行双酶切鉴定，以b a m hi 和x h oi 进行 酶切，酶切体系如下： 沈刚农业大学硕士学位论文 质粒d n a b a m h i x h oj l o kb u f f e r d d h 。0 t o t a l 4 u l l u l l u l 2 u 1 1 2 u l 2 0 u l 酶切体系在3 7 条件下酶切2 3 小时，之后酶切产物进行1 2 的琼脂糖凝胶电泳，染 色和凝胶图像采集，这些过程同( 四) 。 ( 5 ) 将菌落p c r 鉴定和双酶切鉴定均为阳性的重组质粒送交宝生物工程( 大连) 有限公 司测序，用b l a s t2s e q u e n c e 软件对所测定的m s t n 基因核苷酸序列与g e n e b a n k 上的m s t n 基因核苷酸序列的同源性进行比较。 ( 七) 目的基因片段与表达载体的亚克隆 1 表达载体质粒p g e x k g 的特点： p g e x k g 载体本身含有一2 6 k d 的g s t 标签蛋自，可以与目的蛋白发生融合，有利于 目的蛋白的表达。它含有p t a c 启动子，可以用i p t g 进行诱导表达，含有的l a c l 4 基因适 用于所有的大肠杆菌。而且该载体表达的融合蛋白在过柱洗脱时，所需的条件比较温和。 2 将( 六) 当中鉴定为阳性的重组质粒进行双酶切处理： 用b a m h i 和x h o i 进行双酶切，酶切体系如下 两种酶切体系酶切完之后，经1 2 的琼质糖凝胶电泳检测酶切效果，然后用凝胶回收试 剂盒回收目的片段基因，具体的电泳和回收过程参考( 四、五) ，回收的目的片段d n a 在 2 9 材料与方法 一2 0 条件下保存备用。 3 p g e x k g 表达载体的处理： 取低温保存的p g e x 水g 表达载体菌液少量3 7 ，1 8 0 r 阳条件下进行小量摇菌培养 过夜，次日重新保菌之后，用小量质粒提取试剂盒提取载体质粒，质粒经1 o 电泳检测正 确性之后，按上述( 七2 ) 的酶切体系和酶切步骤对原核表达载体p g e x k g 进行b a r 【i i i 和x h o i 双酶切，酶切之后的1 0 的琼质糖凝胶电泳检测和凝胶回收等的方法和过程参 考( 四、五) ，回收的酶切好的载体d n a 在一2 0 条件下保存备用。 4 目的d n a 片段与p g e x k g 表达载体的连接： 将上述的2 和3 制备的双酶切胶回收纯化物经微量d n a 浓度测定仪测定浓度之后按 正确的大致连接比例进行连接，连接体系如下： 粘末端m s t n 基因的纯化物 粘末端p g e x k g 的纯化物 l i g a t i o ns 0 1 u t i o n i d d h t o t o t a l 2 u l ( 约2 0 3 0 n g u 1 ) 3 u 1 ( 约1 5 3 0 n g u 1 ) 5 u 1 o u l l o u l 反应体系共1 0 u 1 ，1 6 连接过夜，连接产物将用于转化大肠杆菌感受态细胞d h 5d 。 5 d h 5a 大肠杆菌感受态细胞的制备： 参照“分子克隆试验指南”( 第二版) 方法用c a c l ：法制备大肠杆菌感受态细胞d h 5q 菌株 的感受态细胞，步骤简述如下： ( 1 ) d h 5q 菌液( 无质粒) 用5 0 甘油保存于一7 0 ，取出解冻后无菌条件下吸取2 0 0 u l 菌液，在琼脂平板表面均匀涂布菌液，3 7 振荡培养过夜。 ( 2 ) 无菌条件下用牙签在新鲜平板中挑取一单菌落接种于3 f f l 含1 0 0 m g m la m p 的l b 液体培养基中，3 7 ，2 0 0 r p m 振荡培养过夜。 ( 3 ) 次日无菌条件下按l 的比例接种到装有1 0 0 m l 预冷的含i o o m g m la p 的l b 液体 培养基的烧瓶中，3 7 。2 5 0 r p m 剧烈振荡培养卜2 h 即可，用可见分光光度计测得菌液 o d m o 的值约为0 5 o 6 左右，为了得到有效转化，活细胞数不应该超过1 0 8 个m l 。 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 4 ) 在无菌条件下将细菌转移到事先灭菌的和预冷的聚丙烯管中，冰上放置l o 分钟或 3 0 分钟，使菌液冷却到o 。 ( 5 ) 4 ，5 0 0 0 r p m ，离心l o 分钟以回收细胞。 ( 6 ) 倒出培养液，将管倒置1 分钟，以使最后残留的痕量培养液流尽。 ( 7 ) 无菌条件下将菌体悬浮于0 1 体积的预冷的c a c l ：一t r is h c l 溶液中，其中c a c l ： 的浓度为1 0 0 1 1 1 m ，t r i s f i c l 的浓度为1 0 m m 且p h 为6 5 ，冰上放置1 5 分钟。 ( 8 ) 倒出培养液，将管倒鼍1 分钟，以使最后残留的痕量培养液流尽。 ( 9 ) 4 ，5 0 0 0 r p f n ，离心5 一1 5 分钟回收细胞，弃上清。 ( 1 0 ) 无菌条件下每5 0 m 1 初始培养物所形成的沉淀用2 m 1 的冰预冷的含1 5 甘油的1 0 0 i i i m 的c a c l ：一t r i s h c l ( 1 0 m m ，p h 6 5 ) 溶液重悬。用冷却的无菌吸头将感受态菌液以 1 0 0 2 0 0 u l e p p e n d o r f 管分装，之后一7 0 保存备用。 6 目的d n a 片段与p g e x k g 表达载体的连接产物的转化和转化后的阳性克隆的鉴定 ( 1 ) 此步骤的连接转化方法可参考( 六3 ) ，但不同的是所用的平板培养基可不含i p t g 和x g a l 。 ( 2 ) 此步骤的阳性克隆的鉴定过程可参考( 六4 ) ，但不同的是不用蓝白斑筛选。 ( 八) 亚克隆阳性重组质粒的转化和表达及鉴定 1 转化： 将上述( 七) 鉴定为阳性的重组质粒转化到b l 2 1 ( d e 3 ) 表达工程菌中，转化方法 和阳性菌的鉴定方法基本同t 一载体克隆和亚克隆的方法。 2 重组蛋白的表达： 无菌条件下挑取鉴定为阳性的单克隆转化重组菌落到2 m ll b + a m p 的液体培养基中， 3 7 1 8 0 r p m 振荡培养到o d 。的值为o 5 左右时为止取出置于4 中，第二天，将2 m 1 菌 液离心重新用新鲜l b + a 1 i l p 液体培养基悬浮，然后按1 一2 的比例再加入l b 十a m p 液体 培养基进行扩大培养，3 7 2 2 0 r p m 振荡培养到o 风。的值为o 6 1 o 时为止取出，分成 两份，一份加入1 0 0 f 【i m 的i p t g 至其终浓度为1 【f i m 进行诱导表达，在诱导o ，3 ，5 小时 时分别取菌液1 m l ，另一份作为未诱导阴性对照，取样时间同诱导组。 3 表达的重组蛋白的s d s p a g e 电泳鉴定： ( 1 ) 样品的处理： 将每次取出的菌液5 0 0 0 r p m 低温离心1 5 m i n ，然后用2 0 1 1 1 m 的t r i s h c l2 0 0 u 1 重悬，再 材料与方法 7 0 0 0 r p m 离心l o f 【 i n ，之后用1 0 0 u 1p b s 液重悬，加入上样缓冲液一2 0 保存。最后表达 剩余的菌液用中等强度的超声波破碎仪破碎2 0 m i n ，之后菌液低温离心，5 0 0 0 r p m 离心 2 0 m i n ，分别取上清和沉淀，沉淀处理方法同前述，之后上清和沉淀都加入上样缓冲液 一2 0 保存。在s d s p a g e 电泳之前将处理好的样品和未预染的蛋白m a r k e r 煮沸3 5 m i n 再上样。 ( 2 ) s d s p a g e 电泳： 按常规方法制备1 2 的分离胶和5 的浓缩胶 1 2 分离胶的配制 水 3 0 丙烯酰胺 1 5 m o l 几t r i s ( p h 8 8 ) 1 0 s d s l o 过硫酸铵 t e m e d 5 5m l 1 3m l 1 om l o 0 8m l o 0 8m l o 0 0 8m l 5 浓缩胶的配制： 水6 6m l 3 0 丙烯酰胺 8 oi i l l 1 5 m o l l t r i s ( p h 6 8 ) 5 om l 1 0 s d s 1 0 过硫酸铵 t e m e d o 2m l o 2m l o 0 0 8m l 先配制分离胶，按顺序加好上述试剂后要及时用微量移液器加入制胶用的0 7 5 唧的 双玻璃夹层中，并用水封顶，大约十几分钟即可凝固，这时候可以看到水与胶的交界处有 一条水印，分离胶凝固之后将封顶的水倒掉，之后将按上述顺序加入配制好的浓缩胶灌 至分离胶的上部，同时将配套的梳子插入浓缩胶内，待凝固后将固定好的胶放入电泳槽 内，然后拔下梳子，将煮沸好的样品和蛋白m a r k e r 用微量上样器1 0 u 1 上样电泳，先用低 电压6 0 v ，待电泳界面越过浓缩胶后把电压换成8 0 v ，大约经3 4 个小时至溴酚蓝泳出胶 沈阳农业大学硕士学位论文 底即可终止电泳，之后取下胶置于5 倍体积的考马斯亮兰r 。染色l 小时，再用含冰醋酸 和甲醇的脱色液脱色，最后用捷达凝胶图像采集器采集图像并进行凝胶分析。 4 表达的重组蛋白表达量的分析 将上述s d s p a g e 电泳之后采集到的凝胶图像经捷达凝胶成像系统的凝胶定量分析， 确定表达的重组蛋白占菌体总蛋白的百分比。 结果与分析 结果与分析 一、总r n a 的浓度与质量检测 在r n a 中含量最高是r r n a ，真核细胞中r r n a 为1 8 s 、2 8 s 和5 s 。当它们在凝胶中 呈现独立的条带时，表明其它r n a 也完整。将提取的肌肉组织总r n a ，经1 5 凝胶电泳， e b 染色，紫外灯下可清楚看见1 8 s 、2 8 s 和5 s 三条独立的条带，表明r n a 质量很好( 见 图1 ) 。再通过紫外分光光度计检测r n a 浓度，结果总r n a 浓度符合要求，可用于r t p c r 反应。 图1 提取的腿肌总对吁a f i 9 1t o t a lr n ao fl e gm u s c l e s 二、m s t n 基因的r 卜p c r 扩增结果( 见图2 ) r t p c r 扩增的结果在1 1 k b 处可见清晰条带，与预期的鸡的m s t n 基因全长c d n a 序列大小相符，但是我们还发现在此条带的上下两侧均有条带可见，其中7 5 0 b p 左右处 的条带是比较清晰的，是否可以通过这些非特异条带进一步克隆到不同大小的转录子有 待于进一步证明。 沈阳农业大学硕士学位论文 1 、4 为d l 一2 0 0 0m a r k e r ；2 、3 为p c r 扩增片段 图2 腼t n 基因全长c d n ar t p c r 扩增结果 f i 9 2r t p c ra m p l i f i c a t i o np r o d u c t so fl e gm u s c l e sm s t ni n t e g r a t e dc d n a 三、p m d l 8 ts i m p l ev e c t o r 阳性克隆的筛选鉴定结果 目的基因片段经切胶回收与载体连接转化至j m l 0 9 后，通过蓝，白斑筛选具有氨苄 青霉素抗性基因菌落，如( 图3 ) ，随机挑选耐药性的白色菌落做菌落p c r 鉴定，结果发现 有四个阳性菌落，且鉴定为阳性的4 个菌落中有一个与其它3 个大小不一致，如( 图4 ) 对p c r 鉴定为的阳性的插入片段大小不等的两种菌落摇菌提质粒，后将这两种大小不等 的质粒分别命名为t 1 4 和t 一2 0 ，质粒电泳结果如( 图5 ) 。对t 1 4 和t 一2 0 两个阳性质 粒进行双酶切，切成的条带大小与预期相符，如( 图6 ) 。 图3p m d l 8 - ts i m p l ev e c t o r 克隆的兰、白斑菌落 f i 鲷b l u ea n dw h i t ec o e n o b - u m so fp m d l 8 - 丁s i m p l ev e c t o rcl o n e 结果与分析 图4 随机挑选白色菌落进行菌落p c r 鉴定 f i 9 4c o e n o b i l l i 乜p c ri d e n t i f i c a t i o n0 fp i c k e db l a n cc o e n o b i u m sr a n d o m l y 2 ，3 泳道为t 一1 4 ，6 ，7 泳道为卜2 0 图5t - 1 4 ，t - 2 0 的质粒电泳结果 f i 9 5a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so ft 一1 4 ，t 一2 0r e c o m b i n a n tp l a s m i d s 3 泳道为t 一1 4 ，4 泳道为t 一2 0 剧6t - 1 4 ，t 2 0 重组质粒的双酶切鉴定 f i 9 6d o u b l ed i g e s t i o no ft 一1 4 ，t 一2 0r e c o m b i n a n tp l a s m i d 四、测序结果 将t 1 4 ，t 一2 0 两种质粒送交宝生物工程( 大连) 有限公司进行测序，将测序结果与 沈阳农业大学硕士学位论文 设计引物时参考的g e n e b a n k 上的鸡m s t n 基因序列进行比较，比较结果在下面已经列出。 测序序列包括载体上的上下游通用引物、保护碱基、酶切位点和全部的m s t nc d n a 序列， 经测序证明获得了两个大小不等的阳性重组质粒分别命名为t 一1 4 和t 一2 0 ，其中t 一2 0 重组质粒插入片段长度为1 1 2 8 b p ，该序列与g e n e b a n k 上的g i ：3 8 3 4 9 5 1 6 序列同源性可 达9 9 ；t 一1 4 重组质粒插入片段长度为9 8 5 b p ，与t 一2 0 相比缺失1 4 3 b p 碱基，缺失部位 在3 7 4 5 1 7 b p 之间，其它部分与t 一2 0 相比在5 l b p 、2 3 4 b p 、3 2 4 b p 等处有三处碱基不同， 分别是a g ，a 卜g ，t - c 。这两个不同的质粒是用切下1 1 k b 左右的条带经回收、 克隆挑选到的，r t p c r 产物电泳图上表明在1 1 k b 条带的上下两侧均有条带，是否能够 克隆到不同大小的m s t n 基因c d n a 克隆需进一步验证，到目前为止国内、外均未见鸡体 内同时存在m s t n 基因不同转录子的报道，这一发现具有重大的研究意义。 t 一2 0 的测序序列与参考的g e n e b a n k 上的gi ：3 8 3 4 9 5 16 鸡m s t n 基因序列比较结果 s c o r e = 2 2 2 0b i t s ( 1 1 2 0 ) e x p e c t = 0 0 i d e n t i t i e s = 1 1 2 6 1 1 2 8 ( 9 9 ) ，g a p s = 0 1 1 2 8 ( o ) s t r a 【1 d = p 1 u s p 1 u s 0 u e r y 5 6 a t g c a 从a g c t a g c a g t c t a t g t t t a t a t t t a c 胛g t t c a t g c a g a t c g c g g t t g a t c c g1 1 5 s b j c t l a t g c 从 a g c t a g c a g t c t a t g 竹t a t a t t t a c c w t t c a t g c a g a t c g c g g t t g a t c c a6 0 q u e r y1 1 6g t g g c 研g g a t g g c a g t a g t c a g c c c a c a g a g a a c g c t g a a a a a g a c g g a c t g t g c a a t1 7 5 s b j c t 6 l g g c t c t g g a t g g c a g t a g t c a g c c c a c a g a g 从c g c t g a a a a a g a c g g a c t g t g c a a t1 2 0 0 u e r y 1 7 6g c m t a c g t g g a g a c a g a a t a c a a a a t c c t c c a g a a t a g a a g c c a t a a a a a t t c a a a t c2 3 5 s b j c t 1 2 1 g c t t g t o g t g g a g a c a g a a t a c a a a a t c c t c c a g a a t g a a g c c a t a a a a a t t c 从a t c1 8 0 0 u e r y 2 3 6 c t c a g c a a a c t g c g c c t g g a a c a a g c a c c t a a c a t t a g c a g g g a c g t t a t t a a g c a g c t t2 9 5 s b j c t 1 8 1 c t c a g c a a a c t g c g c c t g g a a c a a g c a c c t a a c a t t a g c a g g g a c g t t a t t a a g c a g c t t2 4 0 口u e r y 2 9 6 丌a c c c a a a g c t c c t c c a c t g c a g g a a c t g t t g a t c a g t a t g a t g t c c a g a g g g a c g a c3 5 5 s b j c t2 4 it t a c c c a a a g c t c c t c c a c t g c a g 6 a a c t g a t t g a t c a g t a t g a t g t c c a g a g g g a c g a c3 0 0 q u e r y 3 5 6 a 6 t a g c g a t g g c t c t t t g g a a g a c g a t g a c t a k a t g c c a c a a c c g a g a c g a t t a t c a c a4 1 5 s b j c t 3 0 l a g t a g c g a t g g c t c t t t g g a a g a c g a t g a c t a t c a t g c c a c a a c c g a g a c g a t t a t c a c a3 6 0 结果与分析 日u e r v4 t 6a t g c c t a c g g a g t c t g a t t t t c t t g t c a a a t g g a g g g a a a a c c a a a a t g t t g c t t c t t t4 7 5 s b j c t 3 6 l a t g c c t a c g g a g t c m a t t t t c t t g t a c a a a t g g a g g g a a m c c a a a a t g t t g c t t c t t t4 2 0 q u e r y 4 7 6 a a g t t t a g c t c t a a a a t a c a a t a t 从c a a a g t a g t a a a 6 g c a c a a t t a t g g a t a t a c t t g5 3 5 s b j c t 4 2 1 触g t t t a g c 代t a a a a t a c a a t t a a c a a a g t a g t a a a g g