（法医学专业论文）应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的研究.pdf

q i ：l 土- - 。 目录 f l lll ii ii i i i ff lii ir l l l f 17 7 9 8 8 6 中文摘要1 英文摘要4 英文缩写8 研究论文焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋 白基因进行性别鉴定的研究 前言9日u 舌y 第一部分新型短序列性别鉴定方法的建立 材料与方法l l 结果1 8 附图2 0 讨论_ 2 4 第二部分新型短序列性别鉴定方法在法医学中的应用 材料与方法2 9 结果3 5 附图3 7 讨论4 7 结 念4 9 参考文献5 0 综述焦磷酸测序技术分析单核苷酸多态性在法医学中的应用 ! ；z 4 致谢6 4 个人简历6 5 中文摘要 焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因 进行性别鉴定的研究 摘要 目的：性别信息是法医检案过程中及考古研究过程中最重要的信息之 一。通常在尸表保存完整的情况下，法医工作者可以通过形态学分析做出 判定。然而面对重大群体性灾难事件中人的骨架完整性被破坏，或者由于 小孩骨骼发育不全导致形态学分析难以得出鉴定结论时，分子水平的鉴定 方法就显得尤为重要了。目前，常用的进行性别鉴定的d n a 技术主要包 括，y 染色体的特异性探针、锌指蛋白( z f y z f x ) 基因和牙釉质蛋白基 因( a m e l o g e n i ng e n e ，a m e l ) 的检测，其中对牙釉质蛋白基因的检测应 用得最为广泛。自1 9 9 1 年，n a k a l l o r i 等人对牙釉质蛋白基因进行测序后， n a k a h o r i ( 1 9 9 1 ) 、a k a n e ( 1 9 9 1 ) 、b a i l e y ( 1 9 9 2 ) 、s u l l i v a n ( 1 9 9 3 ) 先后 用p c r 扩增单拷贝x 、y 同源区域进行性别测定。目前s u l l i v a n 法应用得最 广泛，在多个法医个人识别试剂盒中做为性别鉴定的方法，其扩增片段为 1 0 6 b p 和11 2 b p 。然而，对于一些高度腐败降解的生物检材，以及由于a m e l 序列突变及性染色体变异造成的“无效扩增”，现有的检测技术往往不能 获得明确的分型结果。针对这一问题，本研究建立了一种新的性别d n a 分析方法，即应用焦磷酸测序技术分析牙釉质蛋白基因4 5 b p 的d n a 片段， 并对该方法的灵敏度，种属特异性，降解模型，骨骼样本等法医学应用进 行初步研究，以期为一些疑难案件的性别鉴定提供参考。 方法：( 1 ) 根据g e n e b a n k 上提供的a m e l x 和a m e l y 的核苷酸序列 通过b l a s t 进行比对后，选择一段含有3 个单核苷酸多态性( s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 位点及1 个插入缺失位点的序列作为待测 靶序列。用p r i m e r 5 和o l i 9 0 6 等引物设计软件设计扩增引物和测序引物， 一条扩增引物标记生物素；利用焦磷酸测序软件建立预期模型；对反应体 系中的引物浓度、m 9 2 + 浓度、退火温度和循环次数等条件进行优化，选择 最佳反应条件进行p c r 扩增，应用焦磷酸测序技术对p c r 产物进行测序， 中文摘要 根据测序结果判定性别。应用该方法对1 0 0 份已知性别( 男女各5 0 份) 的中国汉族健康无关个体进行测序分析，验证本方法的可靠性和准确性。 ( 2 ) 选取男女两份d n a 样本，定量后稀释为l n g 、o 5 n g 、0 2 5 n g 、o 1 2 5 n g 和0 0 6 2 5 n g 进行灵敏度检测；应用本方法对猴、狗、兔、猪、牛、鱼、 鸡的d n a 样本以及大肠杆菌、肠球菌、念珠菌的菌株进行分析，验证其 种属特异性；将新鲜血液放置于6 月1 1 月的自然环境中2 6 周模拟高度降 解检材，用d n a s ei 制备人工降解d n a ，应用本研究构建的方法及商品 化a m p f s t ri d e n t i f i le r j 蹦试剂盒分别对其进行性别分析，比较二者的成 功率；提取骨骼样本d n a ，应用本方法对骨骼d n a 进行分析。 结果：( 1 ) 成功构建了应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基 因进行性别鉴定的方法。本方法的扩增片段包含上下游引物在内只有 4 5 b p ，同时包含了多个点突变和插入缺失突变。焦磷酸测序图清晰、直观、 容易判型。应用本方法对1 0 0 份已知性别个体d n a 的检测分析显示，所 有样本均能得到清晰的分型结果，与预期模型无异，分型结果准确。( 2 ) 法 医应用评估：本方法能够正确分型的最低d n a 模板量为l n g ，具有较 高的灵敏度；在检测的所有动物及菌株中，应用本方法进行分析，除 在恒河猴检出产物峰外，其余常见动物和微生物均未检测到特异性产物 峰，具有较好的人类种属特异性；对8 份降解2 6 周的血液检材进行分 析，本方法均得到了清晰正确的分型结果，而应用i d e n t i f i l e r t m 试剂盒检 测，6 份样本分型明确，2 份样本分型失败；对d n a s ei 制备的降解 d n a 进行分析，本方法对d n a s ei 消化5 m i n 、1 0 m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、 2 5 m i n 、3 0 r a i n 、4 0 m i n 的d n a 均能正确分型，测序结果非常清晰，而 i d e n t i f i l e r t m 试剂盒仅能对d n a s ei 消化5 m i n 、10 m i n 的d n a 进行正确分 型，且牙釉质蛋白基因产物峰的相对荧光单位( r f u ) 较低，对消化1 5 m i n 及更长时间的d n a 均未得到产物峰，分型失败；对6 份来自4 种不 同部位的骨骼进行d n a 的提取和分析，除牙齿由于取材量少导致分型失 败外，其余5 份骨骼d n a 均得到清晰的分型结果。 结论：本研究建立了一种应用焦磷酸测序技术检测牙釉质蛋白基因进 行性别鉴定的方法，扩增产物仅为4 5 b p ，操作简单、快捷、通量高、成本 较低；检测的靶位点包括3 个点突变位点和1 个插入缺失位点，保证了良好 的准确性和稳定性；灵敏度达l n g ，具有较好的人类种属特异性；对高度 中文摘要 降解检材的检验成功率明显高于常规方法。综上，本方法对于高度降解检 材或古d n a 的性别鉴定，以及大规模样本调查具有较好的应用价值。 关键词：牙釉质蛋白基因；性别鉴定；焦磷酸测序；降解检材；骨骼 d n a ；古d n a 英文摘要 - 一一 s h o r tf r a g m e n to fa m e l o g e n i ng e n et e s t e db yp y r o s e q u e n c i n g f o r g e n d e ri d e n t i f i c a t i o n a b s t r a c t o b j e c t i v e ：g e n d e ri n f o r m a t i o ni so n eo f t h em o s ti m p o r t a n ti n f o r m a t i o n i nt h ef o r e n s i cc a s e w o r ka n da r c h a e o l o g i c a lr e s e a r c h u s u a l l yi ft h ec o r p s ei s u n b r o k e n 。f o r e n s i cw o r k e r sc a nm a k ea d e t e r m i n a t i o nb ym o r p h o l o g i c a l a n a l y s i s h o w e v e r , i ns o m e d i s a s t e r so fl a r g eg r o u p ，w h e nt h ei n t e g r i t yo ft h e h u m a ns k e l e t o ni sd e s t r o y e d ，o rb o n eh y p o p l a s i a a sac h i l dl e a dt o i d e n t i f i c a t i o nb ym o r p h o l o g i c a la n a l y s i sd i f f i c u l t y , u s i n gm o l e c u l a rb i o l o g i c a l m e t h o d st oi n d e n t i f yg e n d e rb e c o m e sp a r t i c u l a r l yi m p o r t a n t a tp r e s e n t ，t h e c o m m o n l y u s e dd n at e c h n i q u e si n g e n d e r i d e n t i f i c a t i o ni n c l u d ey h r o m o s o m e - s o e c i f i co r o b e s z i n f i n ) r o t e i n7 z f y z f x ) a n d c h r o m o s o m e s p e c i t i cp r 0 0 e s l x nt m g e r p r o t e mg e n et , l r ， - 一， a m e l o g e n i ng e n et e s t ，a m o n gw h i c ha m e l o g e n i n t e s ti st h em o s tw i d e l y a p p l i e d s i n c e 19 91 a m e l o g e n i ng e n eh a db e e ns e q u e n c e db yn a k a h o r i ， n a k a h o r i ( 1 9 9 1 ) ，a k a n e ( 1 9 9 1 ) ，b a i l e y ( 1 9 9 2 ) ，s u l l i v a n ( 1 9 9 3 ) h a du s e dp c r m e t h o dt oa m p l i f yt h es i n g l ec o p yx yh o m o l o g o u sr e g i o n so fa m e l o g e n i n g e n eb yd i f f e r e n tp r i m e r si ns e xd e t e r m i n a t i o n t h em e t h o dm a d eb y s u l l i v a n w i t hp c rp r o d u c t sb e i n g10 6 b pa n d112 b p ，h a sb e e nw i d e l yu s e df o rg e n d e r i d e n t i f i c a t i o n ，w h i c hw a sa p p l i e db y m o s to ft h ef o r e n s i cp e r s o n a l i d e n t i f i c a t i o nk i t sa s as e xi d e n t i f i c a t i o nm e t h o d h o w e v e r , t h e s ee x i s t i n g t e c h n o l o g i e sc a nn o tf u l l ym e e tt h en e e d so fan u m b e ro fd i f f i c u l tc a s e s ，a n d u s u a l l yc a nn o tg e tc l e a rt y p i n gr e s u l t sf o rh i g h l y - d e g r a d e ds a m p l e so ra n c i e n t d n a o rc a l ll e a dt oi n v a l i da m p l i f i c a t i o nr e s u l tf r o ma m e l o g e n i ns e q u e n c e m u t a t i o na n ds e xc h r o m o s o m ev a r i a t i o n t os o l v et h e s ep r o b l e m s ，t h i ss t u d y e s t a b l i s h e dan e wg e n d e rd n aa n a l y s i sm e t h o d s ，n a m e l y , a4 5 b ps t r e t c ho f a m e l o g e n i ng e n ew a sc h o s e nf o ra n a l y s i sb yp y r o s e q u e n c i n g a t t h es a m e t i m e ，as e r i e so fv a l i d a t i o ne x p e r i m e n t s ，s u c ha st h es e n s i t i v i t y , a c c u r a c ya n d s p e c i e ss p e c i f i c i t y , d e g r a d a t i o nm o d e l s ，b o n es a m p l e s ，w e r ep e r f o r m e d f o rt h e 英文摘要 h o v e lm e t h o d w i t hav i e wt op r o v i d ear e f e r e n c ef o rs e xd e t e r m i n a t i o ni n s o m ed i f f i c u l tc a s e s m e t h o d s ：( 1 ) t h en u c l e o t i d es e q u e n c e so fa m e l x a n da m e l yw e r e a c q u i r e df r o mg e n e b a n k a c c o r d i n gt ot h eb l a s tr e s u l t s ，af r a g m e n ti n c l u d i n g t h r e es i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m1 0 c ia n da ni n d e lm o t i fw a sc h o s e nt ob e a st h et a r g e ts e q u e n c e t h e nap a i ro fa m p l i f i c a t i o np r i m e r sa n ds e q u e n c i n g p r i m e rw e r ed e s i g n e db yp r i m e rd e s i g ns o f t w a r e ，s u c ha sp r i m e r 5 ，o l i 9 0 6a n d s oo n t h ed o w n s t r e a mp r i m e rw a sl a b e l e dw i t hb i o t i n t h ee x p e c t e d s e q u e n c i n g m o d e lw a se s t a b l i s h e db y p y r o s e q u e n c i n g s o f t w a r e t h e c o n c e n t r a t i o no fp r i m e r , m 9 2 + ，t a qe n z y m ea n dt h ea n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea s w e l la st h en u m b e ro fc y c l e sw e r eo p t i m i z e d t o g e t t h eb e s tp c r c o n d i t i o n t h e n ，t h ep c rp r o d u c tw a ss e q u e n c e db yp y r o s e q u e n c i n g 1 0 0 r a n d o m l yc h o s e nd n as a m p l e so fh e a l t h yd o n o r so fk n o w ns e x ( 5 0f r o m m a l e s ，5 0f r o mf a m a l e s ) w e r et y p e dt ov e r i f yt h er e l i a b i l i t ya n da c c u r a c yo f t h i sm e t h o d ( 2 ) t w od n a s a m p l e so fm e na n d w o m e nw e r eq u a n t i f i e da n d d i l u t e dt ol n g ，o 5 n g ，0 2 5 n g ，o 1 2 5 ，a n d0 0 6 2 5 n gt ot e s tt h es e n s i t i v i t y t h e m e t h o dw a sb e e na p p l i e dt ot e s td n as a m p l e so fm o n k e y ，d o g ，r a b b i t ，p i g ， c o w ，f i s h ，a n dc h i c k e n ，a sw e l la se s c h e r i c h i ac o l i ，e n t e r o c o c c u sf a e c a l i s ， c a n d i d aa l b i c a n s ，t ov e r i f yt h es p e c i e ss p e c i f i c i t y t h eb l o o dw a sl a i do u t s i d e f o r2 6w e e k sf r o mj u n et on o v e m b e rt om o d e ld e g r a d e ds a m p l e s ，a n d a r t i f i c i a ld e g r a d e dd n aw a sp r e p a r e db yd i g e s t i n gw i t hd n a s ei ，w h i c hw e r e a n a l y z e db yt h ep y r o s e q u e n c i n g m e t h o da n dc o m m e r c i a la m p f s t r i d e n t i f i l 矗刑k i tt oc o m p a r e dt h es u c c e s sr a t eo ft h et w om e t h o d s i na d d i t i o n ， 6b o n es a m p l e sw e r ea n a l y z e du s i n gt h i sm e t h o dt oi d e n t i f yg e n d e r r e s u l t s ：( 1 ) am e t h o do fs h o r tp c r p r o d u c t so fa m e l o g e n i ng e n et e s t e d b yp y r o s e q u e n c i n gw a ss u c c e s s f u l l yd e v e l o p e df o rg e n d e ri d e n t i f i c a t i o n t h e 4 5 b pp c rp r o d u c t si n c l u d e dp r i m e r s ( 4 0 b p ) a n dt a r g e ts e q u e n c e ( 5 b p ) c o n s i s t i n go f3p o i n tm u t a t i o n sa n da l li n d e lm u t a t i o n t h ep y r o s e q u e n c i n g g r a p hw a sc l e a ra n de a s yt ob et y p e d 1 0 0d n a s a m p l e so fk n o w ns e xw e r e t y p e dw i t ht h ea b o v em e t h o da n da l lo fw h i c hg o tc l e a rt y p i n gg r a p h sa n d c o r r e c t r e s u l t s i n d i c a t i n g t h em e t h o dw a sa c c u r a t ea n dr e l i a b l e ( 2 ) 1 _ 英文摘要 e v a l u a t i o no ff o r e n s i ca p p l i c a t i o n ：1 1 1 es e n s i t i v i t yo ft h em e t h o dw a sln g t e m p l a t ed n a t h es t u d yo fs p e c i e s s p e c i f i c i t ys h o w e dt h a ta m o n ga l lo f t h ed e t e c t e dn o n - p r i m a t ea n i m a l s ( d o g ，r a b b i t ，c o w , f i s h ，p i g ，c h i c k e n ) ，p r i m a t e a n i m a l s ( m o n k e y ) a n dc o m m o nl a b o r a t o r ys t r a i n s ( c a n d i d aa l b i c a n s , e n t e r o c o c c u s ，e s c h e r i c h i ac o l i ) ，n os p e c i f i cp e a kw a sd e t e c t e di na l lo ft h e s p e c i e se x c e p tf o rm o n k e y , i nw h i c ht h ep y r o s e q u e n c i n gg r a p hw a sd i f f e r e n t f r o mt h a to fh u m a n s f o rt h ee i g h ts a m p l e so fh i g h l yd e g r a d e dd n a e x t r a c t e df r o mb l o o dl a i e do u t s i d ef o r2 6w e e k s ，a l lo ft h e mw e r ec o r r e c t l y t y p e db yt h en e wm e t h o d ，w h e r e a so n l ys i xo ft h e mw e r ea c q u i r e dr e s u l t sb y i d e n t i f i l e r k i t ，s u g g e s t i n gt h en e wm e t h o dh a dah i g h e rs u c c e s s f u lr a t ef o r a n a l y s i so fd e g r a d e ds a m p l e st h a nt h ec o n v e n t i o n a lg e n d e ri d e n t i f i c a t i o n m e t h o d f o rt h ea r t i f i c i a ld e g r a d e dd n ad i g e s t e db yd n a s eif o r8 d i f f e r e n tt i m e so f5 m i n ，10 m i n ，2 0 m i n ，2 5 m i n ，3 0 m i n ，4 0 m i na n d4 5 m i n ，a l l o ft h e mw e r et y p e dc o r r e c t l ya n dc l e a r l yb yt h en e wm e t h o de x c e p t4 5 m i n h o w e v e r , w h e nt e s t i n gw i t hi d e n t i f i l e r k i t ，t h e r ew e r el o w e rp e a k so f a m e l o g e n i ng e n ep r o d u c to n l yf o rt h ed n ad i g e s t e df o r5 m i na n d10 m i n ，a n d o t h e rd e g r a d e dd n a d i g e s t e df o rl o n g e rt i m ew e r ef a i l e dt ob et y p e d a m o n gt h e6b o n e sa n a l y z e d ，e x c e p tt h a tt h et e e t hh a daf a i l u r et y p i n gd u et o l e s sm a t e r i a l ，t h er e m a i n i n gf i v ew e r et y p e dc l e a r l y c o n c l u s i o n s ：ag e n d e ri d e n t i f i c a t i o nm e t h o dw a sc o n s t r u c t e d ，w h i c h t e s t e da m e l o g e n i ng e n eb yp y r o s e q u e n c i n gw i t ha m p l i f i c a t i o np r o d u c tb e i n g o n l y4 5 b p t h i s m e t h o dw a se a s i l y o p e r a t e d ，q u i c k ，l o w c o s t ，w i t h h i g h t h r o u g h p u t ，h i g hs e n s i t i v i t yo fln gd n 八a n dh u m a ns p e c i e ss p e c i f i c i t y i tw a sa l s oa c c u r a t ea n ds t a b l eb e c a u s eo ft a r g e ts e q u e n c ei n c l u d i n g3p o i n t m u t a t i o n sa n da ni n d e lm u t a t i o n e s p e c i a l l yt h en e wm e t h o dh a dah i g h e r s u c c e s s f u lr a t ef o ra n a l y s i so fh i 曲l yd e g r a d e ds a m p l e st h a nt h ec o n v e n t i o n a l g e n d e ri d e n t i f i c a t i o nm e t h o d b a s e do nt h e s ea d v a n t a g e s ，t h i sm e t h o dc a l lb e r e c o m m e n d e dt oi d e n t i f yg e n d e ro fh i g h l y d e g r a d e ds a m p l e so ra n c i e n td n a s a m p l e s ，a n di n v e s t i g a t i o no fl a r g es c a l es a m p l e s k e y w o r d s ：a m e l o g e n i ng e n e ；g e n d e ri d e n t i f i c a t i o n ；p y r o s e q u e n c i n g ； d e g r a d e dd n a ；b o n ed n a ；a n c i e n td n a 英文缩写 a b b r e v i a t i o n a m e l a m e l x a m e l y a p s a t p c c d d n a s ei d n t p d t r e d t a h p l c m t d n a p a g e p c r p y r o r 如 s d s s n p s t r z f x z f y 英文缩写 f u l le n g l i s hn a m e a m e l o g e n i ng e n e a m e l o g e n i nx c h r o m o s o m e g e n e s a m e l o g e n i ny c h r o m o s o m eg e n e s a d e n o s i n e 5 7 p h o s p h o s u l f a t e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e c h a r g e - c o u p l e dd e v i c e d e o x y r i b o n u c l e a s ei d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d l d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m i t o c h o n d r i a ld n a p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p y r o s e q u e n c i n g r e l a t i v ef l u o r e s c e n c eu n i t s d o d e c y ls u l f a t e ，s o d i u ms a l t s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s h o r tt a n d e mr e p e a t s z i n c - - f i n g e r - xg e n e z i n c f i n g e r - yg e n e c h i n e s e 牙釉质蛋白基因 x 染色体牙釉质蛋白基因 y 染色体牙釉质蛋白基因 5 磷酸化硫酸腺苷 三磷酸腺苷 电荷耦合元件 脱氧核糖核酸酶i 三磷酸脱氧核糖核苷 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 高压液相层析 线粒体d n a 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 焦磷酸测序 相对荧光单位 十二烷基硫酸钠 单核苷酸多态性 短串联重复序列 x 染色体上锌指结构基因 y 染色体上锌指结构基因 8 研究论文 焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因 进行性别鉴定的研究 ! - 刖菁 在法医学实践中，常遇到肢解尸体、高度腐败以及白骨化尸体；在大 规模灾难事故中常多人罹难，尸体外表严重毁坏，均对个人识别和性别鉴 定造成一定难度【l 】。由于在这一类案件中，无法运用形态学的方法进行性 别的判断，所以，应用分子生物学的方法对来自人体的生物学检材进行性 别鉴定，对案件的侦破起到了重要作用。此外，在一些临床诊断中如胎儿 早期诊断和考古学白骨化尸体的鉴别，也都需要区分性别【2 】。 牙釉质蛋白基因( a m e l o g e n i n ) ，位于人类x 染色体p 2 2 ，编码牙釉质 蛋白，并且在y 染色体中心粒附近分布与牙釉质蛋白基因的序列具有9 0 的同源性的基因【2 】。在这两段同源序列中，存在很多多态性位点，同时又 有足够长的同源序列设计引物，即用一对引物在一个p c r 反应中同时扩 增x 、y 染色体上的牙釉质蛋白基因，可实现性别判定。1 9 9 1 年，n a k a h o r i 等【3 卅就已报道用牙釉质蛋白基因的一对同源引物进行性别鉴定。此外， a k a n e 5 】( 1 9 9 1 ) 、b a i l e y 6 ( 1 9 9 2 ) 、s u l l i v a n 7 】( 1 9 9 3 ) 等也先后都用p c r 扩增单拷贝x 、y 同源区域进行性别测定。目前最常用的牙釉质蛋白基因 的检测方法就是s u l l i v a n 法用同一对引物扩增x 、y 同源的牙釉质蛋 白基因，引物旁侧同源区内含子1 有6 - b p 的缺失，扩增产物x 染色体为 1 0 6 b p ，y 染色体为11 2 b p t7 1 。然而该方法也有其局限性，当被检样品在牙 釉质蛋白基因引物结合区存在突变，或者对于性染色体变异的个体， s u l l i v a n 法检测易导致无效扩增。而且对于一些疑难案件的高度降解检材 而言，该方法的片段长度还是稍显过长以至于不能做出正确的判型。大量 研究表明，高度降解d n a 检材的检测成功率随p c r 扩增产物片段缩短而 增高【8 。9 】。所以，我们拟针对解决常规分型失败的性别鉴定，建立新的检 测方法，缩小扩增产物长度，并包含更多的突变位点，分析牙釉质蛋白基 因，进行性别判定。 研究论文 焦磷酸测序技术( p y r o s e q u e n c i n g ) 是新近发明的一种新型d n a 测序 技术，是基于一种引物引导的多聚酶延伸下的核酸合成的检测方法【lo 】，特 别适用于短序列的d n a 测序分析，而且商品化的p y r o m a r k r m i ds y s t e m 又具备同时对大量样品( 9 6 个) 进行测序分析的能力。本法可以在1 0 分 钟内检测9 6 个样本，只需设计一对扩增引物和一个测序引物即可，无需 胶检测，不需要荧光标记和同位素标记，具有操作简单、费用较低、高通 量、结果准确和自动化程度高等优点【1 1 1 。 本研究旨在建立一种基于焦磷酸测序技术的新型性别鉴定方法，用于 高度降解检材的性别判定。并将此方法应用于一些疑难检材中，探讨其在 法医学实际工作中的应用价值。 研究论文 第一部分 新型短序列性别鉴定方法的建立 本部分研究根据g e n b a n k 中a m e l x 和a m e l y 的核苷酸序列，设 计合适的同源扩增引物及测序引物，使其扩增产物在5 0 b p 以内，扩增片 段包含多个点突变及一个插入缺失突变，摸索并优化扩增条件及测序条 件。应用焦磷酸测序方法进行测序分析，建立一种新型的短序列性别鉴定 方法。 1 材料 1 1 主要仪器 8 0 m d f 3 8 2 e 型超低温冰箱 微量移液器 m i c k o c l2 i r 冷冻离心机 3 k1 8 型低温超速离心机 t d a 8 0 0 2 型电热恒温水浴箱 m l s 3 0 2 0 型高压消毒锅 x w 8 0 a 旋涡混合器 7 9 1 磁力加热搅拌器 d y y i i i 水平电泳槽 d y c z 2 4 a 型电泳槽 u v 型紫外分析仪 凝胶成像系统 n d1 0 0 0 微量核酸蛋白检测仪 m i l l i qs y n t h e s i s 超纯水仪 t h e r m op c r 仪 p t c 2 0 0p c r 扩增仪 s e v e ve a s yp h 计 材料与方法 日本s a n y o 公司 法国g i l s o n 公司 德国t h e r m o 公司 美国s i g m a 公司 天津市泰斯特仪器有限公司 日本s a n y o 公司 上海医科大学仪器厂 上海浦东物理光学仪厂 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 美国d n a i m a g i n gs y s t e m s 公司 美国d n a i m a g i n gs y s t e m s 公司 美国基因公司 美国密理博公司 美国热电公司 美国m j 公司 德国梅特勒托利仪器有限公司 研究论文 p y r om a r ki d 焦磷酸测序仪 t h e m o m i x e rc o m f o r t 混合器 1 2 主要试剂 血液基因组d n a 提取试剂盒 c h e l e x 1 0 0 p c r 扩增引物 d n ” 1 0 p c r 反应缓冲液 m g c l 2 t a q d n a 聚合酶 硝酸银分析纯 d n am a r k e r e b 显色液1 0 m g m l 琼脂糖 乙醇 n a o h p y r o g o l dk i t b e a d s b i n d i n gb u f f e r w a s h i n gb u f f e r a n n e a l i n gb u f f e r d e n a t u r a t i o nb u f f e r 1 3 主要试剂的制备 美国基因公司 美国a b 公司 t i a n g e n 生化科技有限公司 美国s i g m a 公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 北京益利精细化学品有限公司 大连宝生物公司 北京天为时代生物公司 美国s i g m a 公司 天津永大试剂化学公司 天津科密欧公司 美国基因公司 美国基因公司 美国基因公司 美国基因公司 美国基因公司 美国基因公司 1 3 15 c h e l e x 1 0 0 储备液( 室温保存) 试剂名称加入量 c h e l e x 1 0 0 颗粒 灭菌去离子水 1 mn a o h 5 9 1 0 0 m l 调节p h 值至9 11 研究论文 1 3 25 t b e 试剂名称加入量 t r i s - 碱 2 7 5 9 硼酸 0 5 me d t a ( p h8 0 ) 1 3 7 5 9 1 0 m l 双蒸水至5 0 0 m l 1 3 33 0 a p ( 1 9 ：1 ) 试剂名称加入量 丙烯酰胺 2 8 5 7g 双叉丙烯酰胺 1 5 9 双蒸水至1 0 0m l 1 3 4 1 0 变性聚丙烯酰胺凝胶( 3 0 m 1 ) 试剂名称 加入量 3 0 a p 5 t b e l o a p s t e m e d 尿素 10 m l 3 m