（分析化学专业论文）生物表面活性剂在微乳毛细管电动色谱中的应用.pdf

?，t#，一载 ，rjwr二 微乳毛细管电动色谱( m e e k c ) 是在胶束毛细管电动色谱( m e k c ) 基础上发展起来的 一种新型电泳技术。m e e k c 能同时分离带电的与电中性的、亲水的与亲脂性的物质。 鼠李糖脂是应用较为广泛的生物表面活性剂，表面活性高，仅需少量鼠李糖脂、无需助 表面活性剂即能得到稳定的微乳体系。本论文首次将鼠李糖脂应用于m e e k c ，旨在解 决经典微乳体系中因所需表面活性剂浓度过大而造成的焦耳热过大、柱效下降、分析时 间过长、基线噪声大等问题。论文共分为三个部分： 1 采用液液萃取方法，对生物表面活性剂鼠李糖脂粗产物进行了提纯，通过h p l c 测定，证明存在三种鼠李糖脂同系物，并采用h p l c m s 确定了三种鼠李糖脂同系物的 结构，根据h p l c 归一化结果计算得鼠李糖脂的平均分子量为5 2 3 2 2 。考察了影响鼠李 糖脂微乳体系稳定性的因素，包括鼠李糖脂浓度、p h 、助表面活性剂浓度和有机溶剂的 加入量，这些条件的考察对于下一步鼠李糖脂微乳体系应用在于m e e k c 中具有重要的 意义。 2 首次采用生物表面活性剂鼠李糖脂建立了无需助表面活性剂的微乳体系，并应用 于微乳毛细管电动色谱快速分析化妆品中皮质类激素泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松。 考察了p h 、鼠李糖脂浓度、离子强度、油相种类和浓度、分离温度、分离电压以及进 样电压和时间的影响，得出微乳体系最佳组成为0 1 ( w w ) 鼠李糖脂0 8 ( w w ) 正庚烷 9 9 1 ( w w ) 硼砂缓冲液( 8 0m m o l l ，p h9 2 ) 。分离温度2 0 ，分离电压2 0k v ，电 动进样3s l ok v 条件下，泼尼松、氢化可的松、泼尼松龙在9 4m i n 内可基线分离。 重复进样7 次，迁移时间和峰面积的r s d 分别 0 9 9 3 ， 维生素b 卜b 6 、b 5 、b l l 、a 、d 3 和e 的检出限分别为9 0 、4 0 、6 9 、1 5 、7 3 、2 0 和2 l 摘要 各分析物的迁移时间和峰面积的r s d 分别 3 的情况下，石英毛细管内表面硅羟基因发生解离而带负电荷，于是吸附缓 冲溶液带有正电荷的离子，在缓冲液本体中就形成了外层带正电荷的双电层结构。在高 压电场下，外层溶液发生电迁移，带动内层溶液一起向负极移动，形成电渗流。而缓冲 液中的带负电荷的微乳液滴，有向正极移动的趋势，由于电渗流速度大于电泳速度，因 此微乳液滴仍向负极移动。也有通过减小缓冲液的p h 值，进而抑制电渗流，使微乳的 迁移速度大于相反方向的电渗流速度。被分析物，由于在微乳相与水相中的分配差异， 表现出不同的表观淌度。因此m e e k c 可用于极性化合物和中性化合物的同时分析。由 于微乳的增溶作用，一些难溶于水的疏水性物质也可以用m e e k c 来分析，而时间窗口 的增大，使电泳峰容量增大许多，因此m e e k c 更加适用于多组分复杂体系的分析。而 且微乳毛细管电泳中的电渗流为“塞式流 ，见图1 2 ( a ) 溶质区带在毛细管内原则上不 会扩张，而h p l c 中，采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型，由图1 2 ( b ) 可见， 其中心处流速是平均速度的两倍，导致溶质区带本身扩张，而引起柱效下降，使其分离 效率不如c e 。 物质在m e e k c 中的分离是基于在微乳液滴和水相中的分配行为及带电部分在毛细 2 第一苹绪论 管中不同电泳淌度的综合结果，综合了色谱法和电泳法的分离机制。在普通未涂层石英 毛细管中，电渗流在高p h 条件下较大，因此多数m e e k c 分离介质的p h 大于7 ，酸 性条件下的分离需要用涂层毛细管或改变电压极性，采用反向高压，抑制电渗流，通过 物质本身带电来进行分离。图1 3 是在m e e k c 中，阴、阳离子和中性溶质的分离过程。 溶质在乳滴中的分配与其疏水性有关，亲油性溶质易进入到微乳内核中，而亲水性物质 则更易分散在水相中，带电溶质的电泳淌度除了与自身的荷质比有关外，还在一定程度 上受到液滴表面电荷的离子相互作用的影响。在正电压分离情况下，带负电的微乳液滴 向阳极移动，但由于向阴极流动的电渗流速度更大，微乳液滴及溶质总体的移动还是向 阴极的。物质在两相间不断分配，依据水溶性和所带电荷的不同进而得到分离。 e90009e900 90 0 _ i 1 1 1 090 990e 囝99990 a +。e 心 一 9e 矿 0 0 叟叟金qq 璺釜佥鱼垒鱼鱼 b 图1 - 2 电渗流流型和压力驱动流型比较 f i g 1 - 2t h ec o m p a r i s o no f t h ef l o wm o d eb e t w e e nt h ee o fa n dt h a td r i v e nb yp r e s s u r e + 图1 - 3m e e k c 分离示意图 f i g 1 - 3s c h e m eo fm i c r o e m u l s i o ne l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y 1 1 3m e e k c 的应用与发展 在分离物选择上，m e e k c 可同时分离水溶性和脂溶性，带电的或者不带电的物质， 因此在很多物质的分离上具有普遍适用性；同时m e e k c 具有进样量少、溶剂损耗小等 优点，因此在最近几年，有较多的研究报道其应用在药物分析、手性分离以及食品与环 境分析等领域。 1 1 3 1 维生素分析 关于水溶性维生素的报道比较岁1 4 。1 刀，但对脂溶性的维生素的报道还比较少，主要 是由于脂溶性维生素水溶性差、呈电中性，因此分离较困难。b o s 0 1 1 8 】等人用m e e k c 分 3 垩堕查兰堡主丝奎 离了水溶性和脂溶性维生素，分别考察了s d s 与c t a b 对分离的影响。发现以s d s 为 表面活性剂分离效果更好，并与相同条件下的m e k c 进行了对比，得出m e e k c 比 m e k c 具有更大的分离度。s f i n c h e z 1 9 】等人也以分离水溶性和脂溶性维生素对m e k c 和 m e e k c 进行了对比，得出在m e k c 在使用s d s 作为表面活性剂时，只适合水溶性维 生素的定量分析；同时分离水溶性维生素和脂溶性维生素只有选用m e e k c ，并且 m e e k c 具有更好的重现性。p e d e r s e n b j e r g a a r d t 2 0 】等人以抑制电渗流，阳极进样的方法 分离了脂溶性维生素a 棕榈酸盐、维生素e 醋酸盐和维生素d 3 ，体系中加入了大量的 乙腈，v ( 乙腈) ：v ( 水) = 8 0 ：2 0 。 1 1 3 2 手性药物的分离 毛细管电泳手性分离有两种基本策略【2 1 1 ，一是构建手性分离环境，二是手性消除。 让对映异构体与手性试剂进行化学反应，可以使之转变成非对映异构体。但由于手性消 除反应需要昂贵的手性反应试剂，而且产物的手性可能不可恢复，所以这种方法应用较 少，而选用构建手性环境的方法。由于在m e e k c 中可控因素比较多，因此在分离手性 异构体时，可以采用手性表面活性剂、手性助表面活性剂、手性油相等方法进行分离。 a i k e n l 2 2 】等以手性物质( 2 r 3 r ) 酒石酸二丁酯为油核，微乳缓冲液组成为：0 6 s d s 、 1 2 正丁醇、o 5 油相以及9 7 7 三羟甲基氨基甲烷缓冲液( 1 5m m o l l ，p h8 1 ) 成 功分离了两种麻黄碱异构体。m e r t z m a n 等【2 3 1 使用环糊精( c y c l o d e x t r i n ，c d ) 修饰的微 乳毛细管电动色谱( c d m e e k c ) 对几种手性药物的分离进行了研究，结果表明， c d 。m e e k c 的分离能力与c d 的类型与浓度紧密相关，适用于疏水性手性药物的分离。 1 1 3 3 分配系数的测定 测定化合物的油水分配系数( 1 0 9p ) 是m e e k c 最重要的一个用途。这是由于在 m e e k c 分离中，化合物通过在油与水之间不断分配而得到分离，与测定分配系数的原 理相一致。与反相薄层色谱、反相h p l c 等其它测定分配系数的体系相比，m e e k c 具 有快速、高通量、样品消耗量少，并能同时测定中性、弱酸性及弱碱性化合物的l o gp 的特点。a b r a h a m 等【2 4 】研究发现含有1 4 4 s d s 、6 4 9 正丁醇、o 8 2 正庚烷及硼酸一 磷酸缓冲液( p h7 o ) 的微乳特别适于测定油水间的分配系数。近年来其应用在油水分配 系数上的测定越来越多，s t e r g a a r d 2 5 】等用m e e k c 研究了碳酸酯及有机物分子的油水 分配系数，得到了一系列迁移指数( m i g r a t i o ni n d e x ，m i ) ，并考察了s d s 浓度计p h 对 m i 的影响。a l t r i a 2 6 】等用水包油m e e k c 分离了一系列中性化合物和酸性化合物，并与 油包水微乳体系进行对比，二者具有明显的不同。主要是中性化合物的出峰顺序，在水 包油体系中与分配比有关，而在油包水体系中，与其无关。 1 1 3 4 药物分析 药物种类繁多，分离困难。s u n l 2 7 】分离了大黄中九种蒽醌类化合物，分离体系以2 丁基酒石酸为油核，并加入了3 0 ( v v ) 乙腈提高了分离效率。p u i g 等【2 8 】分离了8 种 青霉素类抗生素，并使用了富集技术，提高检测灵敏度4 0 倍。在分离皂甙化合物的应 4 第一章绪论 用上，常规电泳方法难度很大，薄涛【2 9 】等利用c t a b 制备微乳体系，并加入了5m m 的 胆酸钠，成功分离了六种皂甙化合物，扩大了毛细管电泳法的应用范围。李楠1 3 0 】等用 m e e k c 法建立了不同来源大黄样品的指纹图谱，为质量控制提供依据。这些研究结果 都表明，m e e k c 在药物分析上有着独特的优势，有望得到更广泛的应用。 1 1 3 5 食品与环境分析 食品成分的多样性及复杂性对m e e k c 应用于环境的分析方法提出了很高的要求。 由于毛细管电泳技术具有多种不同的分离模式可供选择，优化建立的方法就可以满足环 境所含的复杂组分的分析要求。对于食品中糖类和氨基酸的检测，由于其结构复杂性， 而且具有很高的微观不均一性等，对其分离分析相当困难。 盛筱【3 1 1 等以1 萘基3 甲基5 吡唑啉酮为衍生化试剂，用区带毛细管电动色谱在硼 酸浓度5 5m m o l l ，p h9 4 6 ，柱温2 0 ，分离电压2 2k v ，5 0k p 压力进样1 0s 条件下， 测定了9 种单糖，包括阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、木糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露 糖、岩藻糖和葡萄糖醛酸。王明清【3 2 j 等以咔唑9 乙基氯甲酸酯为柱前衍生试剂，采用非 水毛细管电泳分离了4 种小肽衍生物。 1 1 4m e e k c 分离影响因素 微乳是一个多组分体系，这使得在应用m e e k c 分离的影响因素较多。通过改变微 乳液的组成，可以改变m e e k c 的分离度、分离时间等重要参数。可调节的因素也比较 多，包括表面活性剂、助表面活性剂、油相及缓冲液等各个方面，这就决定m e e k c 与 其它c e 模式相比，具有峰容量大、可分离样品的种类多等优点【3 引，同时用于分离带电 与电中性的以及水溶性和脂溶性物质。 1 1 4 1 表面活性剂的影响 表面活性剂的种类及浓度对微乳的稳定性及分离效果有着决定性的作用。表面活性 剂浓度加大，微乳液滴的稳定性增强，表面电荷增多，对脂溶性物质的增溶作用加大， 可以得到更好的分离效果；但是高浓度的表面活性剂会增加微乳液的离子强度，致使电 泳电流变大、焦耳热变大、分离效率低下及基线不稳等，进而限制了高压电源的使用。 而表面活性剂浓度过低则会使得微乳不够稳定，易浑浊。s d s 是最常用的一类阴离子表 面活性剂，十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 、十四烷基三甲基溴化铵( t t a b ) 和 t e t r a d e c y l a m m o n i u m ( t d a + ) 3 4 - 3 6 】是较为常用的阳离子表面活性剂，常用的非离子表面活 性剂有b 哟7 6 ，b r i j 3 5 ，2 丁基酒石酸( a o t ) 等。非离子表面活性剂不带电荷，分析脂 溶性物质速度较快，但分离效果不够理想；而阳离子表面活性剂具有比电渗流更快的表 观迁移速度，分析窗口小，不适于如亲脂性较强物质的分离。 1 1 4 2 助表面活性剂的影响 助表面活性剂对分离的影响也很大，它可以起到稳定微乳的作用。一般用作助表面 活性剂的是中短链长的醇，最常用的助表面活性剂为正丁醇，异丙醇、异戊醇、丙二醇 等也有用作助表面活性剂的。过少的助表面活性剂起不到稳定微乳的作用，而过多的加 5 江南大学硕士论文 入量又会使助表面活性剂溶胀到微乳内部，使微乳破乳。因此适量的助表面活性剂对微 乳的稳定起到至关重要的作用。 1 1 4 3 缓冲液p h 的影响 缓冲液p h 决定了毛细管内壁的电荷量，以及电渗流的快慢，对分离的速度和效率 是一个重要的决定因素。较高的p h 使毛细管内壁硅羟基电离程度变大，电渗流变快； 而在较低的p h 环境下，硅羟基电离程度较小，因此电渗流较慢。一般较常用的p h 范 围为7 - 9 ，在此p h 范围内，硅羟基电离较多，大多数分析物也能被电离，具有较快的 分析速度和分离效率。而在弱酸性p h3 - 6 的范围内，电渗流速度较慢，而对于弱酸性 的物质，由于不能解离而电中性，不能得到更好的分离。对于一些极端p h 条件下的电 泳也有报道，p e d e r s e n b j e r g a a r d t 3 7 1 等在p h2 5 磷酸缓冲液条件f 配* u ts d s 微乳，分 离了v a p a l m i t a t e ，v d 3 和v ea c e t a t e ；w a t a r a i 3 8 1 在p h1 2 的微乳体系中，消除了碱性物 质的离子化并测定了其溶解度。而对带有弱电离基团的表面活性剂来说，p h 还决定了 微乳液滴表观电荷，影响了分析物在水相和油相之间的分配。因此改变缓冲液p h 值也 是改变分析速度和效率的一种有效手段。 1 1 4 4 缓冲液浓度的影响 低浓度的缓冲液具有较小的离子强度，因此具有较小的电泳电流和较大的电渗流； 而高浓度的缓冲液无疑增加了缓冲液的离子强度，导致了电渗流小、基线不稳、焦耳热 严重以及分离效率低下等问题，同时也限制了高压电源的使用。因此选择合适浓度的缓 冲液浓度也是有效分离的前提条件。 1 1 4 5 有机添加剂的影响 有机添加剂的加入影响电渗流、水油之间的分配系数以及带电物质电泳速率等电泳 参数【3 9 1 ，改变了分析物在两相间的溶解性，减小了分析物的分配系数，影响分析的速率。 尤其在分离一些脂溶性的物质时，加入适量的有机添加剂，分离效率和峰形可以得到很 好的改善。但并不是有机添加剂加的越多越好，过多的有机添加剂会使微乳破乳，而过 少的加入量也不能起到提高分离效率的效果。因此，考察有机添加剂的种类以及加入量 对于分离效率的改善尤其重要。 1 1 4 6 温度的影响 温度对电渗流以及分离效率的影响主要是从分析物溶解度和缓冲液粘度来考虑的。 温度每变化1 ，离子淌度变化2 ，低温下淌度小，电渗流小分离度好，在较高温度 下淌度大，分析时间短，但分离度小。 1 1 4 7 测定条件的影响 电压、进样时间等分析条件都会影响分离的性能。一般来说在较高分析电压下，电 渗流快、分析速度快，但同时基线噪声也随之变大。进样时间对峰形和灵敏度都有影响， 在具体应用中应兼顾分离效果和迁移时间两个因素，确定最佳的分离条件。 6 第一章绪论 1 1 5m e e k c 的优缺点 m e e k c 是毛细管电泳模式中的一类，它是m e k c 的一种变形，它的非极性假固定 相是由表面活性剂疏水端包住有机相所形成的，比如庚烷、辛烷等，有机相外面则由表 面活性剂和助表面活性剂构成，以稳定其结构，这与m e k c 分离模式有所不同。因此 m e e k c 分离模式具有溶解脂溶性物质能力更强、减少有机添加剂挥发和得到更好的分 离度等优点。 在分离脂溶性物质上，m e e k c 可以得到比m e k c 更好的分离效果。s h n c h e z 4 0 】等 对比了m e k c 和m e e k c 分离脂溶性维生素的区别，发现m e e k c 相对m e k c 在脂溶 性物质的分离上，具有大溶解性、更好的稳定性和更好的分离效率，而m e k c 不能用 于分离复杂基质的脂溶性物质。 但m e e k c 也存在如下不足之处，如：由于受微乳体系稳定性的要求，在表面活性 剂的选择上受到限制，目前为止仍以阴离子表面活性剂s d s 的使用最为广泛；微乳体 系组分较多，一般至少需要表面活性剂、助表面活性剂、缓冲液和油核四种组分，配制 微乳体系步骤繁琐；微乳液中含有高浓度的表面活性剂，存在较大的质谱吸收背景，进 而与质谱技术联用困难；此外，m e e k c 在理论和技术上还不够完善，微乳液的稳定性 和分析的重现性还有待于提高，新的体系和方法还有待进一步研究，以完善并发展 m e e k c 自身的理论基础。 1 2 鼠李糖脂 1 2 1 生物表面活性剂简介 生物表面活性剂( b i o s u r f a c t a n t ) 是指有严格的亲水和疏水基团，是由微生物产生的化 学物质，这种微生物生长在水不溶的物质中并以其为营养物【4 1 1 。由于生物表面活性剂具 有高效、低毒和对环境友好等特性，因此得到了广泛的应用。生物表面活性剂大多为非 离子型和阴离子型，由一个或多个亲水性和疏水性基团组成。根据其亲水基的类别，分 为以下五种类型：( 1 ) 以糖为亲水基的糖脂系生物表面活性剂；( 2 ) 以低缩氨酸为亲水 基的酰基缩氨酸系生物表面活性剂；( 3 ) 以磷酸基为亲水基的磷脂系生物表面活性剂； ( 4 ) 以羧酸基为亲水基的脂肪酸系生物表面活性剂；( 5 ) 结合多糖、蛋白质及脂的高分 子生物表面活性剂( 生物聚合体) 。 和传统的化学表面活性剂相比，生物表面活性剂不但具有降低表面张力、分散和增 溶作用，而且还具有以下优点：( 1 ) 可生物降解，不会造成二次污染；( 2 ) 无毒或低毒， 对生态环境影响小；( 3 ) 对生物的刺激性较低；( 4 ) 可利用工业废物为原料进行生产， 并用于生物环境治理；( 5 ) 具有更高的表面活性和更好的起泡性；( 6 ) 稳定性好，在极 端温度、p h 、盐浓度下具有更好的选择性和专一性；( 7 ) 结构多样，可适用于特殊的领 域。因此，近年来生物表面活性剂越来越受到人们的关注，被广泛应用在食品工业、精 细化工、医疗卫生等行业。 1 2 2 鼠李糖脂的结构与性质 7 i | 吲下一一一 l 第一覃绪论 中鼠李糖脂与转化剂和助表面活性剂比例为5 0 0 ：1 ：1 0 时耐温8 0 ，抗盐度达到2 0 0 0 0 m g l ，且具有较好的重现性。o z d e m i r t 5 3 j 等比较了两种鼠李糖脂( r 1 和r 2 ) 的表面活 性和起泡性，发现两种表面活性剂均具有很小的临界胶束浓度。在临晃胶束浓度以下 r l 相对r 2 具有更高的表面活性，且不受体系p h 的影响。然而无论是临界胶束浓度还 是临界胶束浓度处最小的表面张力受鼠李糖脂类型的影响都不大。但若在p h5 0 下，未 解离的鼠李糖脂结构更为紧密。并且两种鼠李糖脂在临界胶束浓度以下的界面行为相差 不大，但在以癸烷为油核的微乳体系下，r l 比r 2 更能降低表面张力。因为分子间存在 较强的静电相互作用力，因此只有在小流量空气流速下才可起泡，而r 1 形成的泡沫稳 定性更好。以该表面活性剂为起泡剂，所形成的泡沫的大小受体系p h 的影响而不受鼠 李糖脂类型的影响。h e l v a e l 5 4 】等在p h6 8 的条件下，利用光学显微镜考察了氯化钠对 两种类型鼠李糖脂表面行为的影响。发现氯化钠在o 0 5 、0 5 和1m o l l 三个浓度条件下， 直接影响了鼠李糖脂中羧酸基团的行为。p h6 8 的条件下，羧酸基团解离，分子间存在 较大的静电作用力，因此气液界面张力存在静电荷，这些静电荷受到钠离子的屏蔽，导 致了临界胶束浓度的下降和表面张力的变化。结果表明o 5m o l l 浓度的氯化钠所形成 的分子层更为紧密，而r 1 又比同样条件下形成的r 2 分子层更紧密：鼠李糖溶液微结 构的刚性随着氯化钠浓度的增加而增大，由于r 1 具有更低的亲水基团，在任何浓度氯 化钠下，r 1 微结构比r 2 微结构具有更大的刚性；受到氯化钠浓度的影响，鼠李糖脂可 形成不同的胶束，如球形胶束、双层胶束和棒状胶束。b e l l i n c a s a 【”】等考察了制备鼠李糖 脂的条件，并用h p l c 分离了六种同系物。随后考察了鼠李糖脂的表面张力和临界胶束 浓度。为鼠李糖脂应用在生物降解、食品、化妆品和医药行业中的应用提供了参考。 毛细管电泳作为一种新颖的分离技术，在模式上有c z e ，m e k c ，m e e k c 等，在分 析大分子物质，如蛋白质、氨基酸和肽类物质上有着独特的优势，其应用势必会越来越 受到重视。而后两种分离模式需要表面活性剂组成假固定相，目前大都使用阴离子表面 活性剂s d s ，但其配置的微乳存在离子强度大、焦耳热大以及分析时间长等缺点。用鼠 李糖脂配置的微乳可以很好地解决上述问题，而且由于表面活性高，其用量也大大减少。 随着仪器分析技术的发展，鼠李糖脂的应用势必也会越来越受到重视。 1 3 课题意义 在m e e k c 中，经典的微乳组成为3 3 ( w w ) s d s 一6 6 ( w w ) 正丁醇0 8 ( w w ) i e 己 烷一8 9 3 ( w w ) 硼砂缓冲液。该体系离子强度很高，3 3 ( w w ) 的浓度已使得电泳电流过 大从而导致焦耳热大，柱效低，样品分析时间延长；若减d s d s 浓度又使得微乳体系不 稳定。因此，找到一种高表面活性的表面活性剂对提高分离效率，扩大m e e k c 的应用 至关重要。 鼠李糖脂是应用最为广泛的生物表面活性剂之一，它具有很高的表面活性，其临界 胶束浓度比s d s 低两个数量级，在较低浓度下可以不加助表面活性剂而形成稳定的微 乳，因此应用于m e e k c 具有很大的潜力。 但到目前为止，国内外关于鼠李糖脂表面活性的研究大多集中在电解质及分子结构 翌塑奎兰堡主丝茎 的影响方面【5 3 巧5 1 ，也有很多关于采油和环境修复方面的。以鼠李糖脂为表面活性剂制备 微乳体系也有报道【5 6 1 ，主要通过相行为的研究来探索生物表面活性剂形成微乳的作用机 理。针对微乳的制备，谢颖玮【5 6 】等测定 j 2 9 8 1 5 k 下鼠李糖脂羧基完全电离所需的氢氧 化钠量级临界胶束浓度，并探索了用鼠李糖脂制备微乳状液的可行性和基本条件，得到 了鼠李糖脂正庚烷正丁醇水微乳体系的相图，研究了氢氧化钠对体系相态、界面张力 和最佳盐度的影响。结果显示：该体系能够形成微乳状液；体系中氢氧化钠具有双重作 用，既可以促进羧酸根电离，又起到了电解质的作用，并且在完全电离时体系的最佳盐 度达到最大。 基于鼠李糖脂的高表面活性，本论文首次以鼠李糖脂为表面活性剂制备微乳体系并 应用于m e e k c ，旨在解决在m e e k c 中，经典微乳体系中离子强度大而造成的高焦耳热、 低分离效率和分离时间长等问题。 1 0 第二二章鼠李糖脂提纯、分析及微乳液的配制 第二章鼠李糖脂提纯、分析及微乳液的配制 2 1 引言 鼠李糖脂通常可通过萃取、沉淀、超滤及过柱色谱等方法进行提纯。由于在微生物 发酵液中的产量很低且发酵液成分复杂，其分离、提纯和浓缩工艺不仅难度大，还成为 鼠李糖脂生产成本中的主要组成部分，费用占生产总成本的6 0 7 0 。因此选用合适的 提纯方法可以大大降低成本，国内提纯方法一般包括离心沉淀、氯仿- 甲醇萃取、旋转 蒸发及硅胶柱层析等。本实验因所需的鼠李糖脂量很少，选用成本较低的液一液萃取进 行实验。 由于鼠李糖脂不存在紫外吸收，因此在h p l c 分析时，采用蒸发光散射检测器进行 检测，并采用面积归一化进行定量，根据同系混合物的分子量和所占的含量计算求得平 均分子量。 鼠李糖脂作为一种高表面活性的表面活性剂，具有用量少、生物相容性好以及可降 解等优点。其用在微乳的配制上有报道，但其侧重于氢氧化钠对微乳体系相态、界面张 力等方面的研究，谢颖玮【5 6 】等测定了2 9 8 1 5 k 下鼠李糖脂羧基完全电离所需的氢氧化钠 量级临界胶束浓度，并探索了用鼠李糖脂制备微乳状液的可行性和基本条件，得到了鼠 李糖脂正庚烷正丁醇水微乳体系的相图和最佳盐度。 鼠李糖脂在微乳体系的配制上具有用量少、生物相容性好以及在极端温度、p h 、盐 浓度下也具有更好的选择性和专一性等优点。在微乳配制微乳影响因素上的研究，对进 一步扩大鼠李糖脂和m e e k c 的应用具有非常重要的意义。 2 2 实验 2 2 1 实验试剂与仪器 2 2 1 1 试剂 2 212 仪器 江南大学硕士论文 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 鼠李糖脂的提纯 取1 0 0g 鼠李糖脂粗产物于烧杯中，加入1 0 0m m o l l 的硼砂缓冲液2 0m l ，用滤 纸过滤，调节滤液至p h4 0 并于具塞分液漏斗中加入等体积的氯仿，进行萃取、静置， 收集下层氯仿层，并重复萃取两次，合并氯仿层。氯仿收集于1 0 0m l 烧杯中，加入搅 拌子并置于通风橱中于常温下搅拌。待氯仿挥发后，即得到鼠李糖脂的提取物。 2 2 2 2 鼠李糖脂同系物的分离与鉴定 取适量提纯后的鼠李糖脂，用甲醇溶解配制为1 0m g m l 的溶液，通过o 4 5l u n 的 微孔滤膜，不用时于4 下保存。 用l c m s 进行鼠李糖脂同系物结构的鉴定，并采用h p l c 对各同系物进行面积归 一化，并计算平均分子量。进样量2 0 此。 h p l c 条件：a l l t i m ac 1 8 柱( 1 5 0m m 4 6m m x0 5 韭m ) 。流动相a 为水，b 为乙 腈，o 1m i n ，a ：b 为5 0 ：5 0 ，1 2 0m i n ，a ：b 由5 0 ：5 0 线性变化为2 0 ：8 0 ，并保持5m i n ， 2 5 4 5m i n ，a ：b 由2 0 ：8 0 线性变为0 ：1 0 0 ，4 5 8 0m i n 保持0 ：1 0 0 的比例，流速为lm l m i n 。 检测器参数为：气体压力：2 5p s i ，增益：1 0 0 ，喷雾器加热器级别：6 0 ，漂移管 温度：6 0 。各组分质量分数的确定采用面积归一化法。 质谱条件：雾化气和干燥气都为n 2 ；毛细管电压：3 0k v ；椎孔电压：3 0v ；碰撞 电压：7 0v ；喷雾电压：3 8k v ；离子源温度：1 0 0 ：脱溶温度：2 5 0 ；柱后流出 物导入离子源速率：5 肛l m i r a 质谱扫描质量数范围：2 0 0 1 1 0 0 删亿；检测方式为正离 子检测。 2 3 结果与讨论 2 3 1 鼠李糖脂同系物的分析及平均分子量的测定 2 3 1 1l c m s 分析鼠李糖脂同系物 对提纯后的大庆油田鼠李糖脂用l c m s 进行了分析，分离条件如2 2 2 2 所示，得 到三种同系物的选择离子图及质谱图如图2 - 1 0 , b ) 、2 - 2 伉b ) 和2 3 瓴b ) 所示。可以确定 鼠李糖脂含有3 种同系物，分别为r h a - c 1 0 、r h a - r h a c 1 0 c 1 0 和r h a - c 1 0 c 1 0 。 1 2 第二章鼠李糖脂提纯、分析及微乳液的配制 2 0 1 0 1 1 2 0 - 3 1 ：t o fm se s + 9 1 51 3 0 7 6 1 9 也b ：譬文嚣。馏一一 j 图2 一l ( a ) 选择离子流图 f i g 2 1 ( a ) s e l e c t e di o nc h r o m a t o g r a m 2 0 1 0 1 1 2 9 - 31 0 0 4 ( 73 s 4 ) 1 3 5 3 8 1 3 t l i n e ：t o f m se s + ，3 s 3 1 5 3 l 强硬 赳也心山 3 镐 4 3 9 5 7 6 j 。d 。i 。 _ 一j 一 图2 - 1 ( b ) 质谱图 f i g 2 一r b ) m a s sc h r o m a t o g r a m 2 0 1 0 1 1 2 秘0 1 ：t o fm se s + 6 1 7 6 7 3 5 7 e 3 t i m e 图2 - 2 ( a ) 选择离子流图 f i g 2 - 2 ( a ) s e l e c t e di o nc h r o m a t o g r a m 2 0 1 0 1 1 2 931 0 8 6f 9 8 7 )：t ( ) fm se s + 1 o 1 1 捌西 8 陷、 r ，2 妇 尹 6 5 1 ，。f 1 1 描3 2 4 小。j划+li ll 。t 哩蛐 | ：一 i i il。l 图2 - 2 ( b ) 质谱图 f i g 2 - 2 ( b ) m a s sc h r o m a t o g r a m 1 3 2 0 1 江南人学硕士论文 9 6 4 图2 - 3 ( a ) 选择离子流图 f i g 2 3 ( a ) s e l e c t e di o nc l l r o m a t o g r a m e s + 5 2 7 9 & 略 图2 - 3 ( b ) 质谱图 f i g 2 - 3 ( b ) m a s sc h r o m a t o g r 锄 2 3 1 2h p l c 测定鼠李糖脂平均分子量 按分离条件2 2 2 2 ，用h p l c 分析了提纯后的鼠李糖脂，其分离图谱如图2 - 4 所示。 对3 种同系物面积归一化，由各同系物式量m 和所占含量q ，根据公式： m = ( p l x m l + q 2 x m 2 + q ) 3 x m 3 计算得出鼠李糖脂提取物平均分子量为5 2 3 2 2 。其中9 l 、啦、 q 3 分别为按照出峰顺序所对应的同系物的相对含量，m l 、m 2 、m 3 分别为对应三种同系 物的式量。通过对各色谱峰的检索，确定各色谱峰所对应的物质见表2 1 。 1 02 03 04 05 0 r r 帆 图2 - 4 鼠李糖脂提纯物的h p l c 分离色谱图 f i g 2 - 4h p l cc l l r o m a t o g r a mo ft h er a h a m n o l i p i de x t r a c t i o n 1 4 珊 瑚 渤 瑚 伽 伽 o 娜 牮番s 1 第二章鼠李糖脂提纯、分析及微乳液的配制 表2 1 鼠李糖脂提取物中三种同系物组分的相对含量 t a b 2 - 1a b u n d a n c eo f t h r e eh o m o l o g u e so f t h er h a m n o l i p i d s 2 3 2 鼠李糖脂微乳体系稳定性的考察 2 3 2 1 鼠李糖脂浓度的影响 鼠李糖脂作为表面活性剂对微乳体系稳定性起到决定性作用。考察了鼠李糖脂浓度 对形成微乳体系的影响，发现当鼠李糖脂浓度大于0 0 3 ( w w ) 时，可以形成微乳；但当 鼠李糖脂浓度逐渐加大时，受到溶解度的限制，当浓度大于0 5 ( w w ) 时，微乳液中有 少量鼠李糖脂开始析出。因此可以形成稳定微乳的鼠李糖脂浓度范围为0 0 3 0 4 ( w w ) 。 2 3 2 2 缓冲液p h 考察了p h 从7 5 9 2 范围内，微乳体系的稳定性。在该p h 范围内以微乳组成为： 0 0 3 ( w w ) 李糖脂- 0 8 ( w w ) i e 庚烷9 9 1 7 ( w w ) 2 0m m o l l 硼砂缓冲液制备微乳 液，经过超声与静置，最终可得到稳定的微乳体系，在p h 为8 4 和9 2 时，1 2h 内就能 形成微乳体系，而其他p h 下需放置2 4h 才能得到澄清透明的微乳液。在p h9 2 下， 微乳液最为稳定，至少可保存一个月。 2 3 2 3 油相浓度 考察了以正庚烷为油核，通过改变油核浓度对微乳稳定性的影响，发现当油核浓度 为o 4 2 ( v ) 时，易形成稳定的微乳。 2 3 2 4 助表面活性剂 通常选用中等链长的醇作为助表面活性剂，最长用的是正丁醇，考察了正丁醇的量 对体系稳定性的影响，发现不选用正丁醇也能形成稳定的微乳，正丁醇的加入反而不易 形成微乳。 2 3 2 5 有机溶剂 通过考察发现，鼠李糖脂微乳体系对于甲醇和乙腈有很大的容忍度。加入和微乳液 相同体积的有机溶剂而不破乳。 2 4 小结 以液一液萃取法提纯鼠李糖脂，通过考察不同的萃取溶剂，发现氯仿无明显乳化现 象。随后对提取物进行定性和定量分析，以h p l c 分离了鼠李糖脂的三种同系物，并用 m s 确定了三种同系物的结构。 1 5 垩塑盔兰婴主丝苎 通过对鼠李糖脂微乳体系稳定性的考察发现，鼠李糖脂在弱碱条件下可以形成稳定 的微乳，其配比为：0 1 ( w w ) 李糖脂0 8 ( w h ) 正庚烷- 8 0m m o l l 硼砂( p h9 2 ) 。该 微乳中表面活性剂所需的用量很少，并且不需助表面活性剂，其稳定性受鼠李糖脂浓度、 p h 、助表面活性剂和有机溶剂的影响，在最佳配制比例下，微乳液至少可保持1 个月澄 清透明。该体系可以承受很高比例的有机溶剂而不破乳。在m e e k c 中，有机溶剂的加 入可以增加脂溶性分析物的洗脱，提高其分离度并改善峰形：并且鼠李糖脂所制得的微 乳离子强度小，有望获得更快的电渗流速。该微乳体系稳定性考察，对于鼠李糖脂在 m e e k c 中的应用有着重要意义。 1 6 第三章鼠李糖脂制各微乳并应用于m e e k c 快速分析化妆品中糖皮质激素类物质 第三章鼠李糖脂制备微乳并应用于m e e k c 快速分析化妆品中 糖皮质激素类物质 3 1 引言 激素( h o r m o n e ) 是指生物体中内源产生的作用于器官组织的分化和调节代谢功能的 微量有机物质。糖皮质激素( g l u c o e o r t i c o i d ) 是应用最为广泛的激素之一，它又叫肾上腺 皮质激素，是由肾上腺皮质产生，被广泛用于治疗入和动物的炎症及免疫调节疾病；由 于皮质激素可以使皮肤在短时间内光滑、细腻、白皙，也被一些违法厂家添加到化妆品 中，因此存在皮肤损害，骨质疏松、肌肉萎缩、生长迟缓以及免疫系统疾病等副作用1 5 。 皮质激素在化妆品行业中属于违禁品【5 8 】。糖皮质激素属于电中性的物质，具有较强的疏 水性，有些结构极其相似，如氢化可的松( h y d r o c o r t i s o n e ) 、泼尼松( p r e d n i s o n e ) 、泼尼松 龙( p r e d n i s o l o n e ) ( 结构见图3 1 ) 等等。在临床上糖皮质激素也可用来一些炎症和过敏 症状的治疗，例如类风湿性关节炎、风湿病、胶原性疾病、红斑狼疮、重症哮喘、急性 炎症和肾病综合症等。 糖皮质激素的基本结构见图3 1 ，维持生理功能必需基团基本结构为甾核、c 3 的酮 基、c 4 5 的双键、c 2 0 的羰基。 o h o 图3 - 1 糖皮质激素基本结构式 f 嘻3 - 1b a s i cc h e m i c a ls t r u c t u r eo fg l u c o e o r t i e o i d s 在糖皮质激素的分离方法上主要有色谱法、电化学法和电泳法。色谱法具有分离效 率高、检测灵敏度高、样品用量少、选择性好、多组分同时分析以及易于自动化等优点， 与质谱联用已经发展成熟。因此出现了气相色谱质谱( g c - m s ) 5 9 啦】和液相色谱- 质谱 ( h p l c m s ) 法。它们结合了色谱的定量和质谱的定性能力，是目前比较常用的定性定量 方法。a m e n d o l a 6 3 】等用g c m s 分析测定了6 种动物体中含有的激素和1 7 种人工合成的激 素，分析前对样品进行了预处理，并用两种衍生化试剂在微波加热条件下，对样品进行 了衍生化。但g c m s 通常需要衍生化使分析物汽化，增加了分析操作的复杂程度。h p l c 具有良好的重现性、分离效率和灵敏度，已经成为首选分析方法【“7 1 。g a o 6 8 】等利用在 线萃取液质联用法对6 种激素进行了测定，检测限已经低于一个飞摩尔，大大提高了分 析的灵敏度。但前处理复杂，需要大量时间进行预处理，去除样品基质，否则复杂样品 1 7 江南大学硕士论文 易污染色谱柱，影响分析结果的准确性。 电化学法具有高灵敏度、响应快、选择性好等优点，r a j e n d r a t 6 9 1 等以富勒烯c 6 0 修饰过 的玻碳电极，利用方波伏安法测定了药物和血浆中肾上腺激素激素地塞米松的含量，灵 敏度达到o 6 8 5 p 2 坤t m 。n i t 7 0 】等用电位滴定法同时测定泼尼松、泼尼松龙和地塞米松， 发现峰电位重叠严重，因此采用了两种化学计量学方法，进而可应用于三种物质的同时 测定。但电化学方法受周围环境影响较大，不具有足够好的重现性。而且修饰电极需要 大量的时间，不适用于快速测定分析。 毛细管电泳具有快速、高效、超低样品量、低溶剂用量等优点，近年来发展迅速。 胶束毛细管电动色谱( m e k c ) 已用于分离皮质激素这类电中性的小分子，单独使用十二 烷基硫酸钠( s d s ) 的胶束体系选择性较低1 7 l 】，w i e d m e r 【7 1 - 7 3 等采用- j s d s 与胆酸钠( s c ) 复配的胶束体系，同时加入有机添加剂，分离了六种激素类物质，但体系复杂，难以分 离的激素如氢化可的松和泼尼松龙没有涉及；w u 7 4 】等采用了1 7 ( w w ) s d s 7 ( w w ) 乙腈1 2 ( w w ) 正丁醇的4 0m o l lp b s ( p h7 0 ) 的m e k c 体系，但该体系并没有将氢化 可的松和泼尼松龙完全分开，同时存在有机溶剂的挥发导致重现性下降。w u 【7 4 】等在原 来胶束配比上加了o 5 ( w w ) 中等极性的酒石酸二乙酯作油相制备微乳体系，采用微乳 毛细管电动色谱( m e e k c ) ，可在5 0m i n 内分离两种激素，但分离度仍不够理想，且分 析时间长。p o m p o n i o1 7 5 】等用4 0 ( w w ) 去氧胆酸钠( s t d c ) 和2 5 ( w w ) 十二烷基聚氧 乙烯醚，除了加入助表面活性剂正丁醇还添加了b 一环糊精，完成分析需要2 4m i n ，分 离度虽有所改善，但该体系的组成依旧复杂。 3 2 实验 3 2 1 实验试剂与仪器 3 2 1 1 试剂 1 8 第三章鼠李糖脂制备微乳并应用于m e e k c 快速分析化妆品中糖皮质激素类物质 高效毛细管电泳仪 超声清洗器 电子天平 0 4 5 岬尼龙过滤器 电位测定仪 激光光散射系统 t h 一3 0 0 0 b ) ( 2 2 0 0 h e l 2 0 4 m i l l e x - h n z e t as l z e r 2 0 0 0 a l v d l s s l s 一5 0 2 2 f 保定天惠分离科学研究所 上海新苗医疗器械制造有限公司 梅特勒托利多有限公司 美国密理博 英国马尔文公司 德国a l v 公司 3 2 2 实验方法 3 2 2 1 样品储备液配制 分别称取所需的泼尼松、氢化可的松和泼尼松龙( 结构式如图3 2 所示) 标准品溶于甲 醇，超声3m i n ，配制成三种物质浓度均为2 5g l 的标准储备液。 3 2 2 2 微乳液制备 鼠李糖脂( o 1 ，w w ) 一正庚烷( 0 8 ，w w ) - 硼砂缓冲液( 8 0m m o l l ，p h9 2 ，9 9 1 w w ) 混合于2 5m l 容量瓶中，超声3 0 m i n ，静置1d 成澄清、稳定的微乳液。该微乳 液在室温下至少稳定一个月。以此作为电泳运行缓冲液。进行运行缓冲液组成优化时， 制备方法同上。 3 2 2 3 样品处理 准确称取1 0 0g 化妆品样品( 1 撑) ，1 0m l 甲醇超声提取2 0m i n 。以5 0 0 0r m i n 离 心5m i n ，静置1 0m i n ，移去上层清液，下层沉淀重复提取一次。合并上层清液旋转蒸 发，浓缩。甲醇定容至5m l ，待测。其余样品( 2 “，3 撑) 的处理步骤同前。 3 2 2 4z e t a 电位的测定 测定微乳体系的z e t a 电位来表征