免疫荧光技术应用.ppt

免疫荧光技术,威斯腾生物技术中心,威斯腾生物成立12周年庆,主要内容,免疫荧光技术(immunofluorescence)技术原理将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。,根据实验方法分类：直接法间接法补体法其他,补体法：利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光。,其他免疫荧光技术：时间分辨免疫荧光分析荧光偏振免疫分析技术,时间分辨免疫荧光测定,时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。,荧光偏振免疫分析技术,荧光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关。FPIA最适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素的测定。,激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量,配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。,荧光显微镜的不足之处：1、无法实现对荧光、透射光的同时采集，无法实现多重荧光的同时采集和共定位。2、荧光的散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3、荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4、无法对样品进行断层扫描，完成3D的工作。5、滤镜对荧光信号衰减大，灵敏度和荧光强度不够。6、可以观察活细胞和组织，但是细胞或组织内机构高度重叠。7、只能在二维坏境下观察。8、样品不能太厚。9、放大倍率小。,荧光常见基础术语：荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线，即荧光。受激发后能产生荧光的物质称为荧光物质或荧光素。激发光：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI，DAPI）、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）。自发荧光：组织和细胞中某些成分受激发时可发出荧光，即自发荧光。漂白：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失，即漂白现象。,多激光器系统（多通道激光检测）：在可见光范围内使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。,目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光(fluoresceinisothiocyanate,FITC)FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长为520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈现橘红色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。,酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。镧系镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用58521nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用57513nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。,多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。碘化丙啶（propidiumiodide，PI）可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。FL2探测器检测PI。,细胞爬片免疫荧光实验流程1.细胞爬片的制作；2.固定（4%的多聚甲醛）；3.细胞膜通透（0.5%TritonX-100，20min）；4.封闭（6%山羊血清，30min）；5.一抗孵育（一抗浓度，湿盒，4过夜，PBS漂洗）；6.二抗孵育（二抗种属，湿盒，室温1h，避光，PBS漂洗）；7.复染核（DAPI，避光，5min，PBS漂洗）；8.封片（荧光淬灭剂的封片液）；9.荧光显微镜下观察采集图像。,1.细胞的固定【固定的定义】将新鲜的活体组织或细胞，立即加入固定液中，以此使细胞保持原有形态、结构的一种方法。【固定的意义】1、组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，原位保存抗原，避免抗原失活或弥散。2、停止细胞中的生化反应，固定其中的各种生化物质状态，防止细胞死亡后出现自溶分解。3、使细胞中蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前形态。4、固定细胞形态，防止其变形或破裂。5、使组织内各种物质产生不同的折光率，便于观察和鉴定。6、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。,免疫荧光实验流程中一些注意事项,【固定液的选择】,2、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。封闭是血清与非特异性位点结