（分析化学专业论文）过氧化氢生物传感器的构建及研究.pdf

西南大学硕十学位论文摘要 过氧化氢生物传感器的构建及研究 分析化学专业硕士研究生孙妮 指导教师袁若教授 士高可哥 j l 司；c 生物传感器是一个非常活跃的研究和工程技术领域，它与生物信息学、生物芯片、生物 控制论、仿生学、生物计算机等学科一起，处在生命科学和信息科学的交叉区域。生物传感 器诞生在2 0 世纪6 0 年代，而对其研究的全面展开是在2 0 世纪8 0 年代。2 0 年来该领域发展 迅速，成为当前的研究热点之一。生物传感器以其高度专一的选择性，高灵敏度、操作方便、 价格低廉等优越性，在各类传感器中占着重要的地位，已在生物技术、食品工业、临床检测、 医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。 生物传感器的性能主要取决予生物分子的周定化，因此如何将生物活性组分有效地同定 在电极表面上并保持其良好的生物活性是生物传感器研究和开发中最为重要的工作。由此， 具有良好的生物相容性的基质就应运而生，并极大地促进了生物传感器的应用范围。基于此， 本论文设计了一些新型生物分子固定技术，发展了一些固定材料来固载生物分子，结合各种电 化学方法，研究了生物分子的电化学性质并制各了相应的生物传感器。 本论文主要进行了以下两方面的研究工作： 1 利用壳聚糖n a n o t i 0 2 复合膜具有良好的生物相容性，可提供良好的微环境保持酶的生 物活性，固载量子点硒化镉( c d s e ) 后，能有效促进酶与电极表面的电子传递的原理，最 后吸附血红蛋白( h b ) 成功制备了以壳聚糖n a n o t i 0 2 复合膜为载体的性能优良的过氧 化氢( h 2 0 2 ) 生物传感器。本文探讨了p h 、工作电位、扫速等对生物传感器的影响，结 果表明，在优化的实验条件下，该传感器的响应电流与其浓度在3 9 x 1 0 面一1 2 x 1 0 之m o l l 范围内呈良好的线性关系，检出限为1 0 x l 矿m o l l 。该传感器的米氏常数为1 6 5m m o l l ， 表明所固定的酶具有较高的生物活性。此外该传感器还具有较高的灵敏度，良好的重现性 及较好的稳定性且易于制作等特点。 2 基于有机无机复合膜结构，纳米技术及h r p 的固定技术，本文研制了一种新型的高灵敏 度的电流型过氧化氢( h 2 0 2 ) 生物传感器。首先交联壳聚糖( c s ) 和氨丙基三乙氧基硅 烷( a p t e s ) 制得c s h m s 复合膜，并以该膜固载甲苯胺蓝( 1 1 3 ) 和纳米金，然后将h r p 与c s h m s - t b - g n p s 混合滴涂在玻碳电极的表面制得c s h m s - t b g n p s - h r p g c e 修饰电 极，最后在c s h m s - t b 岬s h r p g c e 修饰电极表面吸附一层n a t i o n 膜制得n a t i o n 西南大学硕十学位论文 摘要 c s h m s - t b g n p s - h r p g c e 修饰电极。n a t i o n 膜可以减少h r p 的泄漏。同时增强了传 感器的抗干扰能力。用紫外光谱法测定复合膜成分的组成，用循环伏安法对修饰电极进行 了表征，并用计时电流法对h 2 0 2 传感器的性能进行了研究。试验结果表明，在最佳实验 条件下，h 2 0 2 浓度在7 0 x l o - 7 2 3 x 1 0 。3 m o l l ( r 司9 9 8 ) 范围内与其还原峰电流成良好的 线性关系，检测下限为2 4 x 1 0 7m o f l ( 信噪比3 ) 。表明该传感器所固定的酶具有较高的 生物活性。 关键词：过氧化氢生物传感器固定方法有机一无机复合膜纳米金 两南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ef a b r i c a t i o na n ds t u d yo nh y d r o g e n p e r o x i d eb i o s e n s o r a n a l y t i c a lc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：n is u n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rr u o y u a n a bs t r a c t b i o s e n s o ri sav e r ya c t i v ea r e ao fr e s e a r c ha n de n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y t o g e t h e rw i t h b i o i n f o r m a t i c s , b i o - c h i p s ，b i o - c y b e m e t i c s ，b i o n i c sa n db i o l o g i c a lc o m p u t e r ，i ti sa tt h ec r o s s - c u t t i n g a r e ao fl i f es c i e n c e sa n di n f o r m a t i o ns c i e n c e s b i o s e n s o rw a sb o r ni nt h e2 0 t hc e n t u r y , 6 0y e a r s ， w h i l et h er e s e a r c ho fi ti si nf u l ls w i n gi nt h e2 0 t hc e n t u r y ，8 0y e a r s 2 0y e a r so fr a p i dd e v e l o p m e n t i n t h i sa r e a ，i th a sb e c o m eo n eo fa c t l v er e s e a r c ha r e a s d u et oi t su n i q u ea d v a n t a g e so f h i g h s e l e c t i v i t y , p o r t a b l e ，h i 曲s e n s i t i v i t ya n dl o w - c o s t ，i to c c u p yak e yp o s i t i o no fv a r i o u sk i n do f b i o s e n s o r s b i o s e n s o r sh a v eb e e nw i d e l yu s e di nf o o d ，c l i n i c a l ，b i o m e d i c i n ea n de n v i r o n m e n t a l a n a l y s e s h o w e v e r , i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tt h ec r u c i a la s p e c ti nt h ef a b r i c a t i o no fab i o s e n s o ri st h e i m m o b i l i z a t i o no fb i o r e c o g n i t i o nm o l e c u l ei nh i g ha m o u n t sw i t hr e t e n t i o no ft h e i rb i o a c t i v i t y t h u s ， m a t r i c e sw i t hg o o db i o c o m p a t i b i l i t yc o m ei n t ob e i n g ，a n dg r e a t l yf a c i l i t a t et h es c o p eo fa p p l i c a t i o n o fb i o s e n s o r s t h em a t r i xi n c l u d e s h y d r o g e l ，s o l - g e l s o l u t i o nd e r i v e df r o mi n o r g a n i c - o r g a n i c c o m p o s i t i o na n dl i p i dm e m b r a n e b e s i d e s ，t h ei n t r o d u c t i o no fn a n o - m a t e r i a l sg r e a t l yi m p r o v e st h e p e r f o r m a n c eo fb i o s e m o r s i n t h i st h e s i s ，t h ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sb a s e do nd i f f e r e n t i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sa n dm a t e r i a l sh a v eb e e nd e v e l o p e di nt h i sp a p e r t h em a i nw o r k sa n d c o n c l u s i o n sa r ei n c l u d e da sf o l l o w s ： t h et h e s i si sd e s c r i b e da sf o l l o w s ： 1 ah i g h l ye f f i c i e n th 2 0 2b i o s e m o rw a sf a b r i c a t e db a s e do nc s n a n o t i 0 2 ，c d s ea n d h e m o g l o b i n i m m o b i l i z e do n g o l de l e c t r o d e c s n a n o - t i 0 2h y b r i d m e m b r a n eh a dh i 曲 b i o c o m p a t i b i l i t yf e a t u r ea n dp r o v i d eas u i t a b l em i e r o e n v i r o n m e n tt ok e e ph p rb i o a c t i v i t y t h e p r e s e n c eo fc d s ei nm a t r i xc a ne f f e c t i v e l ye n h a n c ee l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e ne n z y m ea n de l e c t r o d e a tl a s t ，h e m o g l o b i n ( h b ) w a si m m o b i l i z e do nc d s eb ye l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o n t h ee l e c t r o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i co ft h eb i o s e n s o rw e r es t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r ya n dc h r o n o a m p e r o m e t r y e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n si n f l u e n c i n gt h eb i o s e n s o rp e r f o r m a n c es u c ha sp h ，p o t e n t i a la n ds c a nr a t e i i i 西南大学硕+ 学位论文 a b s t r a c t w f f l eo p t i m i z e d t h eb i o s e n s o rs h o w e dal i n e a rr e s p o n s et oh 2 0 2o v e rac o n c e n 乜- a t i o nr a n g ef r o m 3 9 x l 矿 1 2 1 0 - 2m o l lw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f1 o x l 0 6 m o l l i nt h i se x p e r i m e n t , h e m o g l o b i n c a r lr e t a i nah i g h e rb i o a c t i v i t yw i t ht h em i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n to f1 6 5m m o l l m o r e o v e r , t h e b i o s e m o ra l s oe x h i b i t e dh i g hs e n s i t i v i t y , g o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n dl o n g - t i m es t a b i l i t y 2 an o v e lm e t h o db a s e do n i n o r g a n i c - o r g a n i ch y b r i dc o m p o s i t e f i l m f a b r i c a t i o n ， n a n o t e c h n i q u ea n dh r pi m m o b i l i z a t i o n ，w 觞e x p l o i t e dt od e v e l o p ah i g h l ys e n s i t i v ea m p e r o m e t r i c h y d r o g e np c r o x i d e ( h 2 0 2 ) b i o s e n s o r i nt h i sm e t h o d ，t h eh y b r i df i i m s ( c s h m s ) a r ep r e p a r e db y c r o s s l i n k i n gc h i t o s a n ( c s ) w i t h3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ( a p t e s ) ，w h i c hc a nb er e a d i l yu s e d 舔a ni m m o b i l i z a t i o nm a t r i xt oc o - c n 缸- a pm e d i a t o ra n de n z y m e s t b et o l u i d i n eb l u e ) ，w h i c ha c t s a sam e d i a t o r , w a se m b e d d e di nc s h m sn e t w o r k - l i k ef i l m i n t h em e s n t i m e ，g o l dn a n o p a r t i c l e ( g p n s ) w e r ei m m o b i l i z e di n t oc s h m s v i at h ew i l d l y 【r e s e n ta m i n og r o u p si nc s h m sa n dt o l u i d i n e b l u ec o n j u g a t i o n am o d e le n z y m e ，h r p , w a sm i x e dw i t ht h ec s h m s - t b g n p ss o l u t i o na n dc a s t o nt h es u r f a c eo fg l a s sc a r b o ne l e c t o d e st of o r mr o b u s tc s h m s t b g n t s - h r p g c em o d i f i e d e l e c t r o d e f i n a l l y , t h er e s u l t i n gc s h m s t b - g n p s - h r p g c e e l e c t r o d ew a sc o v e r e db yat h i nl a y e r o fn a t i o nt oa v o i dt h el o s so fh r pi nd e t e r m i n a t i o na n dt oi m p r o v et h ea n t i i n t c r f e r e n ta b i l i t y t h e e l e t r o d ew a sd e n o t e da sn a f i o n c s h m s - t b - g n p s - h r p g c e u v - v i s i b t es p e c t r o s c o p i e sw a su s e d t od e t e r m i n et h ec o m p o s i t i o no ft h ef i l m t h ep a r a m e t e r si n f l u e n c i n gt h ep e r f o r m a n c eo ft h e r e s u l t i n gb i o s e n s o rw e r eo p t i m i z e da n dt h ec h a r a c t e r i t i co ft h er e s u l t i n gb i o s e n s o rw a sc h a r a c t e r i z e d b yc y c l iv o t a m m e t r ya n dc h r o n o a r n p e r o m e t r y t h ep r o p o s e db i o s e n s o rd i s p l a y s e x c e l l e n t e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t ya n dr a p i dr e s p o n s ef o rh 2 0 2 t h eh n e a rr a n g ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh 2 0 2 i sf r o m7 0 x l o 7t o2 3 1 0 一m o l l 晰n lad e t e c t i o nl i m i to f 2 4 1 0 - 7 m o f la t3 0 k e y w o r d s ：h y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r ； i m m o b i l i z a t i o n m e t h o d s ； i n o r g a n i c - o r g a n i ch y b r i dc o m p o s i t ef i l m ；g o l dn a n o p a r t i c l e s i v 独创性声明 学位论文题目：过氢丝氢生塑佳壁墨数趁建星婴究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：铡、始签字e l 期：加7 年i1 月 6 e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 k， 学位论文作者签名：孙如导师签名：陟 v ， 签字日期：( 年，f 月了日签字e l 期：砷7 年i 月了日 西南大学硕士学位论文第一章 第一章综述帚一早琢逊 生物传感器的产生是生物学、医学、电化学、热学、光学及电子技术等多门 学科相互交叉渗透的产物f l l ，是一种集现代生物技术与先进的电子技术于一体的高 科技产品，具有选择性高、分析速度快、操作简单、价格低廉等f 2 。5 】特点，在发酵 工艺、环境监测、食品工程、临床医学、军事及军事医学等方面得到了深度重视 和广泛应用【6 ，7 1 。 1 1 生物传感器的简介 1 1 1 基本结构及工作原理 生物传感器是对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，通 常由生物识别元件( b i o r o 印t o r ) 和信号转换器件( t r a n s d u c e r ) 两个部分组成【8 9 】： 生物识别单元即生物活性材料( 酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、生物膜等) ，具 有专一的选择性，可以获得极其高的灵敏度；而信息转换器通常是一个独立的化 学或物理敏感元件，它可以将产生的化学或物理的变化转换成可用信号的装置。 其设计原理是待测物质通过生物识别部件将被感知物质的非电信号转换成可测量 的电信息，再经过放大信号处理，进行信号输出【l o , l l 】。把分子识别功能基底同高灵 敏的信号转换器件相结合，就构成多种多样的生物传感器。 生物体中能够选择性地分辩特定物质的物质有酶、抗体、组织、细胞等。这 些分子识别功能物质通过识别过程可与被测目标结合成复合物，如抗体和抗原的 结合，酶与基质的结合。在设计生物传感器时，选择适合于测定对象的识别功能 物质，是极为重要的前提。要考虑到所产生的复合物的特性。根据分子识别功能 物质制备的敏感元件所引起的化学变化或物理变化去选择换能器，是研制高质量 生物传感器的另一重要环节。敏感元件中光、热、化学物质的生成或消耗等会产 生相应的变化量。根据这些变化量，可以选择适当的换能器。 1 1 2 生物传感器的特点 生物传感器一般具有以下的特点： ( 1 ) 生物传感器的制作成本低，且可反复使用( 与其他大型分析仪器相比) 。 ( 2 ) 操作系统比较简单，容易实现自动分析。 ( 3 ) 专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。 ( 4 ) 体积小、响应快、样品用量少，可以实现携带及连续在位检测。 ( 5 ) 可进行在线活体分析。 ( 6 ) 准确度高，一般相对误差可以达到1 。 ( 7 ) 根据生物反应的特异性和多样性，理论上可以制成测定所有生物物质的传 西南大学硕士学位论文第一章 感器，因而测定范围相当广泛。 1 1 3 生物传感器的分类 最初，生物传感器主要是以研制酶电极制作的生物传感器为主，但是由于酶 的价格昂贵并不够稳定，因此以酶作为敏感材料的传感器，其应用受到一定的限 制。近些年来，随着微生物固定化技术的不断发展，产生了微生物电极，它可以 克服价格昂贵、提取困难及不稳定等弱点。此外，还可以同时利用微生物体内的 辅酶处理复杂反应。而目前，光纤生物传感器的应用也越来越广泛。而且随着聚 合酶链式反应技术( p c r ) 的发展，应用p c r 的d n a 生物传感器也越来越多。一 般可从以下3 个角度来进行分类【l2 】： 1 根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为五类：酶传感器 ( e n z y m e s e n s o r ) ，微生物传感器( m i c r o b i a ls e n s o r ) ，d n a 传感器( d n as e n s o r ) ， 细胞传感器( o r g a n a l ls e n s o r ) ，组织传感器( t i s s u es e n s o r ) 和免疫传感器( i m m u n o l s e n s o r ) 。显而易见，所应用的敏感材料依次为酶、微生物个体、细胞器、动植物 组织、抗原和抗体： ( 1 ) 酶传感器是通过检测反应前后底物浓度或产物浓度的差异，或利用氧化还原 中电子转移的特性，通过换能器检测产生的电位或电流变化，可以间接地测定复 杂化合物中某特定成分的含量。目前，国际上已经研制成功的酶传感器有几十种， 如过氧化氢【1 孓15 1 、葡萄糖【1 6 18 1 、维生素【1 9 捌、乳酸【2 1 。2 3 1 、胆固醇陟2 7 1 和氨基酸【2 8 - 3 0 】 等传感器。 ( 2 ) 微生物传感器有呼吸机能型微生物传感器和代谢机能型微生物传感器两种 类型。微生物传感器是应用细胞固定化技术，将各种活体微生物固定在膜上的生 物传感器。它的基本原理是：固定化的微生物数量和活性在保持恒定的情况下， 它所消耗的溶解氧量或所产生的电极活性物质的量，反映了被检测物质的量。微 生物传感器的优点是灵敏度高、选择性好、元件成本低、容易制作且使用寿命长， 因而应用广泛。它在基础理论研究、临床医学检测、工业产品分析和环境质量监 测等方面具有重要作用【3 1 】。 ( 3 ) d n a 传感器【3 2 3 3 1 是通过固定在传感器或称换能器探头表面上的已知核酸序 列的单链d n a 分子( 也称s s d n a 探针) ，和另一条互补的s s d n a 分子( 也称目标d n a ) 杂交，形成的双链d n a ( d s d n a ) 会表现出一定的物理信号，最后由换能器将杂交过 程所产生的变化转变成电信号，根据杂交前后电信号的变化量，求出被检测d n a 的含量。 ( 4 ) 细胞传感器瞰l 是由固定或未固定的活细胞与电极或其他转换器组合而成的 一类生物传感器。当活细胞与分子识别元件特异性结合后，产生的信息通过换能 2 西南大学硕十学位论文第一章 器转换为可定量和可处理的信号，从而达到分析检测的目的。细胞传感器已成为 生物传感器研究中的一个热点，近来被广泛用于药物筛选、环境监测、毒素检测 等 ( 5 ) 组织传感器是直接利用( 植物或动物) 组织中的酶作为分子识别元件，实 质上也是一种酶电极。由于大自然中酶源丰富，生物材料价廉易得，所以组织电 极一度受到分析化学家重视，国内外先后有综述报道【3 5 。8 1 。但是组织电极的主要 缺点是酶容易从组织薄膜表面流失，影响电极稳定性，且生物材料会腐败变质， 使用寿命缩短，影响其实际应用。 ( 6 ) 免疫传感器【3 1 1 是基于以抗体作为生物化学检测器，对化合物、酶或者蛋 白质等物质进行定性和定量分析的生物传感器。由于抗原和抗体的特异性反应， 免疫传感器较其他生物和化学传感器有更高的专一性和选择性，是生物传感器中 最为成熟，应用最广泛的一种。 2 以被测目标与分子识别元件的相互作用方式进行分类【4 2 】：有生物亲合型生 物传感器( a f f i n i t yb i o s c n s o r ) 和代谢型生物传感器( m c t a b o t r o p i cb i o s e n s o r ) ： ( 1 ) 亲和型生物传感器是被测物与分子识别元件上敏感物质具有生物亲和作用 的一类传感器。 ( 2 ) 代谢型生物传感器是底物( 被测物) 与分子识别元件上敏感物质相作用并生 成产物，信号转化器将底物的消耗或产物的增加转变为输出信号的一类传感器。 3 根据生物传感器的换能器即信号转换器分类有：生物电极传感器 ( b i o e l e c t r o d e ) ，半导体生物传感器( s e m i c o n d u c tb i o s e n s o r ) ，光生物传感器( o p t i c a l b i o s e n s o r ) ，热生物传感器( c a l o r i m e t r i cb i o s e n s o r ) ，压电晶体生物传感器 ( p i e z o e l e c t r i cb i o s e n s o r ) 等，换能器依次为电化学电极、半导体、光电转换器、 热敏电阻、压电晶体等。其中较为常见的有光生物传感器，热生物传感器和压电 生物传感器。 ( 1 ) 光生物传感器【4 3 埘】是一种选择性的识别分子信息，引发光学变化，且把光 学变化转换为电信号输出。光生物传感器具有灵敏度高，不需要参比传感器，光 传播信号不受外界电磁干扰等特点，主要包括生物光极和表面等离子体共振生物。 传感器【4 5 4 。 ( 2 ) 生物体分子在相互反应时伴随着能量的交换，其中热能的交换是最为常见 的形式之一。热生物传感器【4 鲥9 】适用于大多数生物样品的分析，具有不受光电化 学性质等干扰因素的影响、固定化酶部分可以更换、器件可以重复使用、便于采 用流动注射技术、操作简单等【5 0 】优点。近年来热生物传感器越来越广泛的应用于 临床医学、环境监测、食品卫生、工业进程监测等方面【5 1 】。 西南大学硕士学位论文第一章 ( 3 ) 利用压电石英晶体对表面电极区附着质量的敏感性，并结合生物功能分子 ( 如抗原和抗体) 之间的选择特异性，使压电晶体表面产生微小的压力变化，引 起其振动频率改变可制成压电晶体生物传感器【5 2 1 。压电生物传感器装置简单、灵 敏度高、选择型好，因此得到人们的广泛关注【5 2 粕】，已经用于微生物检测，免疫 球蛋白等蛋白物质的检测和生物小分子的检测。 以上三种分类方法之间实际上可以互相交叉使用。 1 2 生物传感器的固定技术 将具有分子识别能力的生物功能物质，如酶、抗原一抗体、细胞等，包裹或吸 附于某些高分子材料、生物高分子或无机材料( 如分子筛) 上制各成感应器，这些 称为生物组分的固定化。在生物传感器的构建中，其关键技术之一就是如何将生 物分子稳定、高活性地固定到换能器表面。因此，生物组分固定技术的发展是提 高传感器性能的关键因素之一，通常的生物组分固定技术应满足以下条件：( 1 ) 固 化后的组分仍能保持良好的生物活性；( 2 ) 生物膜与转换器需紧密接触，且能适应 多种测试环境；( 3 ) 固定化层要有良好的稳定性和耐用性；( 4 ) 减少生物膜中生物 组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。 为了研制寿命长、灵敏度高、选择性好、成本低的生物传感器，固定化技术 已成为世界各国竞相研究和探索的目标。对生物分子识别物质的固定化方法一般 有吸附法、共价键合法、分子自组装法、电化学聚合法及包埋法等。 1 2 1 吸附法 吸附固定法是一种较为简单的固定化方法，通过生物分子如酶，蛋白质分子 等分子的极性键、氢键、疏水键的作用，将生物吸附在不溶性载体上。此过程是 通过非化学键力的直接吸附固定生物分子，所以对生物分子的活性影响较小，传 感器可获得较好的响应，方便简单、操作条件温和，但是它有生物分子与载体相 互作用力弱，易脱落等弱点，若能找到适当的载体，这是很好的固定生物分子的 方法。吴国琪【5 5 】用羧甲基化的n ，n 一甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基葡聚糖凝胶树脂 为载体，对谷氨酸脱羧酶进行吸附固定，固定谷氨酸脱羧酶对底物专一性未发生改 变，热稳定性和贮存稳定性良好。杨吴【5 6 】等直接用亲水纳米二氧化硅颗粒作为固定 化酶的载体，采用温和的物理吸附与包埋相结合的方式固定葡萄糖氧化酶，制作 了生物敏感膜。 1 2 2 共价键合法 共价键合法是生物分子如酶、蛋白质等与载体通过共价键与电极表面结合的 固定方法。归纳起来有两类：一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 4 西南大学硕士学位论文 第一章 偶联反应；另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。参与偶 联的生物活性物质的功能团有4 m 2 ，- c o o h ，一s h ，o h 和咪唑基、酚基等，但 这些基团不能是活性中心及其附近的基团。最常使用的交联剂是戊二醛。它是一 种双功能试剂，其末端有两个醛基基团，它们能和酶或蛋白质的氨基发生反应， 形成类似s c h i f f 碱的衍生物。应太林【5 7 】采用牛血清白蛋白一戊二醛交联方法固定酶， 然后再滴加到已制备好的n a t i o n n - 甲基吩嗪修饰电极上制成了h 2 0 2 生物传感器。 该传感器选择性好、灵敏度高、响应时间少于3 0s 。孔德领【5 8 】等利用氧化纤维素 上的醛基与酶的氨基间的反应，实现了血红蛋白的固定，稳定性较好。将过氧化氢 酶通过共价键方式固定于经活化处理的醋酸纤维素上，并与氧电极偶合，制成了 静态和流通二种h 2 0 2 生物传感器。此外，巯基乙胺，半胱胺酸等双功能试剂也常 被用作交联剂，一方面一s h 可以与金电极表面形成共价键合作用，另一方面残余 的一s h 和- c o o h 也为电极的下一步组装提供了活性基团。 电极表面的共价键合吸附较困难，但提供了比较稳定的固定化生物敏感膜， 因此目前较多地被研究。当向电极表面共价键合生物组分时，需考虑许多因素【5 9 】。 附着过程通常包括三个步骤：基底电极表面的功能化，生物分子的偶联及除去键 合疏松的生物分子。 共价键合法的优点是它通过特殊键的形成而将生物分子固化于固体表面，因 而不易发生分子的泄露，并且改善了分子在表面的定向、均匀的分布状况，使生 物分子与载体结合牢固，有利于满足大规模生产和商业化的需要。但是该法通常 要求在低温、低离子强度和生理p h 值条件下进行，反应条件苛刻，会引起酶蛋白 高级结构变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶，酶 活回收率一般为3 0 左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化【鲫。 1 2 3 分子自组装法 分子自组装法是一种基于静电作用固定带有相反电荷化合物的化学吸附法。 自组装形成的分子聚合体具有特定的排列顺序，可以维持自组装体系的稳定性和 完整性，但是并不是所有分子都能够发生自组装。它的产生需要两个条件：自组 装的动力和导向作用。自组装的动力为分子自组装提供能量，导向作用是指分子 的空间尺寸和方向要达到重排的要求。自组装膜的基本组装步骤是：将基片放入 含有活性物质的溶液或活性物质的蒸汽中，活性物质在基片表面发生自发的化学 吸附或化学反应，在基片表面形成化学键连接的二维有序单层膜。如果单层膜表 面也是具有某种反应活性的活性基团，则又可与别的物质反应，如此反复，构筑 同质或异质多层膜【6 1 越】。自组装膜( s a m s ) 是分子通过化学键作用自发吸附在载 体表面，形成热力学稳定和能量最低的紧密的有序的二维纳米级的超薄膜。其中， 西南大学硕士学位论文第一苹 硫醇类子自组装单层c ( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ，s a m ) 是被研究得最为广泛和 深入的体系【6 3 7 。此类膜可望用于研究膜中生物分子之间定向的电子转移，能量 传递以及生物化学传感器的设计与制造。自组装单分子膜制作简便，具有良好的 稳定性、有序性。但由于起步较晚，仍是一种不成熟的方法，许多问题如杂质吸 附、分子聚合、溶剂选择、基片表面加工、分子设计、有序性、缺陷的程度和性 质等需要更深入的研究。 1 2 4 电化学聚合法 将聚合物单体和生物功能物质同时混合于电解液内，通电使单体在电极表面 阳极氧化而聚合成聚合物膜。与此同时可以将酶作为掺杂阴离子，靠静电吸引作 用与带正电荷的聚合物骨架相作用，把酶掺杂在聚合物膜中而直接固定到电极表 面上的固定化方法称之为电化学聚合法【7 2 1 。常用于固定化的聚合物有聚吡咯【7 3 , 7 4 】、 聚二茂铁、聚苯胺1 0 7 6 1 、聚硫堇【7 7 。7 8 】和聚邻苯二胺f 7 9 8 3 】等。其中，聚苯胺、聚 吡咯、聚二茂铁、聚硫堇是导电型聚合物，聚苯酚和聚邻苯二胺是非导电聚合物。 李得加【8 4 】等聚合邻苯二胺固定抗坏血酸氧化酶修饰电极测定抗坏血酸。李建平【8 5 】 等用聚吡咯电化学固定胆固醇氧化酶以测定胆固醇。该法制备的生物传感器制作 简单，响应快，抗干扰能力强，聚合层厚度和酶的量易控制，修饰层重现性好， 但是用该法固定的酶量可能比较小，容易造成酶在聚合液中的浪费，所构造的生 物传感器的稳定性较差。 1 2 5 包埋法 包埋法是将生物组分包埋于高分子三维空间网状结构中，形成稳定生物组分 敏感膜。该技术的特点是：可采用温和的实验条件及多种凝胶聚合物；大多数生 物组分可以很容易的掺入聚合物膜中，一般不发生化学修饰，对生物组分的活性 影响较小；膜的孔径和几何形状可任意控制，可固定高浓度的活性生物组分等。 其局限性为必须控制很多实验因素；聚合物形成过程中产生的自由基对生物组分 可能产生去活化作用等。研究结果表明采用溶胶一凝胶技术将生物分子固定在无机 陶瓷或者玻璃材料内，能明显改善活性的保持。将生物分子包埋在凝胶的细微格 子里制成固定化酶，是较为直接，更接近生物体的一种固化方式。此法多以天然 或合成的聚合物凝胶为载体，如：硅溶胶、树脂【8 6 1 、藻酸“8 7 1 、聚丙烯酰胺【8 8 】、 聚乙烯醇f 8 9 】、n a t i o n 、e a s t m a naq l 州等。d i 9 1 1 等以硅溶胶一凝胶法制的了第三代 s o d 生物传感器，不仅实现了s o d 在电极表面的直接电子转移，而且酶分子在硅 溶胶一凝胶膜内非常稳定。陈晓君等【9 2 】以离子交换法制得硅溶胶膜直接固定酶，简 单快捷。由于只有小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还 会导致固定生物分子动力学行为改变，降低生物分子活性，因此，包埋法只适合 6 西南大学硕十学位论文第一章 于小分子底物和产物的生物分子【9 3 9 7 1 。 1 3 生物传感器的应用 生物传感器是一个非常活跃的研究和工程技术领域。2 1 世纪生物传感器技术 必将是介于信息和生物技术之间的新的增长点。生物传感器研究的全面展开是在 2 0 世纪8 0 年代，2 0 多年来发展迅速，在食品工业、环境监测、医学和军事等方面 得到了高度重视和广泛应用。 1 3 1 食品工业 生物传感器在食品检验中的应用相当广泛，主要包括食品成分、食品添加剂、 有害毒物及食品鲜度等的测定分析。利用氨基酸氧化酶传感器可测定各种氨基酸 ( 包括谷氨酸、l 一天冬氨酸、l 一精氨酸等十几种氨基酸) 。食品添加剂的种类很 多，如甜昧剂、酸味剂、抗氧化剂等，生物传感器用于食品添加剂的分析已有许 多报道。该生物传感器具有选择性好，不需对蛋黄酱和可乐类饮料样品预处理，就 可进行检测【9 8 1 。 1 3 2 环境监测 近年来，环境污染问题日益严重，环境监测对于环境保护非常重要。传统的 监测方法有很多缺点：分析速度慢、操作复杂、且需要昂贵的仪器，无法进行现 场快速监测和连续的在线分析。人们迫切希望拥有一种能对污染物进行连续、快 速、在线监测的仪器。生物传感器由于选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本 低，已为环境检测提供了新的手段。生物传感器在环境监测中的应用最多的是水 质分析。此外，生物传感器还可以用来监测c 0 2 、n 0 2 、n i - 1 3 、c h 4 之类对大气造 成污染的气体，以及用于农药和抗生素残留量的分析。b a i g e n t 9 9 】等用鳗鲡乙酰胆 碱酯酶( a c h e ) 作为生物传感元件，对有机磷进行了检测，可以检测到1 0n m m o l l 水平的对氧磷，而敌敌畏和焦磷酸四乙酰等农药的检测下限则更高。 1 3 3 医学方面： 医学领域的生物传感器发挥着越来越大的作用。主要有基础研究、临床应用 和生物医药。( 1 ) 基础研究：生物传感器可实时监测生物大分子之间的相互作用。 借助于这一技术动态观察抗原、抗体之间结合于解离的平衡关系，可较为准确的 测定抗体的亲和力及识别抗原表位。( 2 ) 临床应用：用酶、免疫、基因生物传感 器等生物传感器来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊断提出依据。生物传 感器还可以预知疾病的发作。( 3 ) 生物医药：利用生物工程技术生产药物时，将 生物传感器用于生化反应的监视，可以迅速地获取各种数据，有效地加强生物工 7 西南大学硕十学位论文第一章 程产品的质量管理。生物传感器已在癌症药物的研制方面发挥了重要的作用1 叫。 如将癌症患者的癌细胞取出培养，然后利用生物传感器准确的测试癌细胞对各种 治癌药物的反应，经过这种试验就可以快速的筛选出一种最有效的治癌药物。 1 3 4 军事上的应用： 在军事医学方面，也具有广阔的应用前景l i o l l 。生物传感器以其高度特异性、 灵敏性和能快速地探测化学战剂和生物战剂( 包括病毒、细菌和毒素等) 的特性， 将成为最重要的一类化学战剂和生物战剂侦检器材。对生物毒素的及时快速检测 是防御生物武器的有效措施。用生物传感器检测生物战剂、化学战剂具有经济、 简便、迅速、灵敏的特点。 1 4 生物传感器的研究进展，发展趋势及展望 2 0 世纪的6 0 年代，u p d i k e 和h i c k s 把葡萄糖氧化酶( g o d ) 固定化膜和氧电极 组装在一起，制成了第一种生物传感器，即葡萄糖酶电极。到8 0 年代生物传感器研 究领域已基本形成。近些年来，微生物固定化技术的不断发展，产生了微生物电 极。微生物电极以微生物活体作为分子识别元件，与酶电极相比有其独到之处。 它可以克服价格昂贵、提取困难及不稳定等弱点。此外，还可以同时利用微生物 体内的辅酶处理复杂反应。而目前，光纤生物传感器的应用也越来越广泛，光纤 传感器和微型生物传感器结合可以直接用于体内分析。而且随着聚合酶链式反应 技术( p c r ) 的发展，应用p c r 的d n a 生物传感器