（作物遗传育种专业论文）水稻斑马叶基因zb9t的遗传分析与初步定位.pdf

| c i a s s i f i e dl n d e x ：$ 3 3 0 s e c u r i t yc l a s s i f i c a t i o n ： iu d c ： 2 5s e c u r i t yp e r i o d ： d i s s e r t a t i o nf o r t h em a s t e r sd e g r e e g e n e t i ca n a l y s i sa n di n i t i a ll o c a t i o no f z e b r a b a n dg e n ez b 9 ( t ) i n r i c e ( o s a t i v al ) c a n d i d a t e ： s u p e r v i s o r ： s p e c i a l i t y ： r e s e a r c hf i e l d ： u n i v e r s i t y ： - s u b m i s s i o nd a t e ： t i a nd a c u i p r o f g r i oj i a n f u a s s o c i a t ep r o f z h uh o n g b o a g r i c u l t u r e t h e o r yo fp l a n tm a l es t e r i l i t y a n dh e t e r o s i su t i l i z a t i o n g u a n g d o n g o c e a nu n i v e r s i t y a p r i l2 0 ，2 0 1 0 广东海洋大学 学位论文原创性声明 1 i i i l l l l111 1 1 ii i i11i i ii l l l l l l l u l ? iy 18 0 4 7 10 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名：习天珲 2 0 o 年d 月f 1 i 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密d 。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：国六 导师签名：礴0()捃孑月月 广q、v，、咖历 年年 加纱 0 0 2 2 焱 、： 水稻斑马叶基因z b 9 例的遗传分析与初步定位 摘要 水稻斑马叶突变体h r l 5 m 是由籼稻恢复系h r l 5 田间自然突变获得的。主要表现 为苗期叶片出现黄绿相间的斑马状条纹。本研究对斑马叶突变体h r l 5 m 与野生型 h r l 5 的叶绿素含量及主要农艺性状进行了比较。并通过田间及瓮栽实验研究苗龄、 播种期、温度等因素对h r l 5 m 突变性状表达的影响。同时，以突变体与粳稻日本晴 的f 2 及f 3 群体作为定位群体，利用已有的s s r 标记及根据水稻基因组序列设计开发的 新的s s r 标记对突变基因进行了初步定位。主要研究结果如下： l 、突变体在突变性状表达期间叶绿素含量显著低于野生型，其中叶绿素b 降低 的幅度高于叶绿素a ，而在其它时期突变体与野生型的叶绿素含量无显著差异。 2 、对突变体和野生型主要农艺性状的调查分析表明，突变体在分蘖数与千粒重 方面高于野生型。而其他农艺性状与野生型没有显著差异。 3 、突变性状的表达与移栽有直接关系，一般在移栽后一周开始出现斑马叶突变 性状。突变性状表达受移栽的苗龄影响，苗龄过低或过高都不利于突变性状的表现。 4 、分期播种及低温处理实验表明，突变体h r l 5 m 与水稻温敏型间断失绿突变 体11 0 3 s 不同，其突变性状的表达与温度变化无直接关系。 5 、用h r l 5 i n 和粳稻日本晴杂交得到f l 和f 2 代群体，观察显示，f l 均不表现斑 马叶性状，而f 2 代群体野生型与突变型符合3 ：l 的分离比例，表明斑马叶突变性状 由隐性单基因控制。 6 、用籼粳交的f 2 矛i f 3 后代作为定位群体，利用s s r 标记将突变基因z b 9 定位在 水稻第1 2 染色体长臂上，连锁分析表明，该基因位于r m l 0 1 和i 洲2 7 7 之间，与二者的 遗传距离分别为4 。4 c m 和5 4 e m 。扩大群体后将该基因进一步定位在标记m m l 2 9 6 和 m m 0 9 4 8 之间4 7 7 k b 的范围之内。 关键词：水稻，斑马叶，z b 9 例基因，遗传分析，分子标记，s s r g e n e t i c a n a l y s i sa n d i n i t i a ll o c a t i o no fz e b r a b a n d g e n ez b 9 何i nr i c e ( o s a t i v al ) a b s t r a c t an a t u r a lz e b r a - b a n dr i c em u t a n th r l5 mw a sf o u n di na ni n d i c ar e s t o r e rl i n eh r l 5 t h ep h e n o t y p i ct r a i t ss h o w e dl e a v e so fy e l l o wa n dg r e e nz e b r a b a n di nt h es e e d l i n gs t a g e t h em u t a n tw a st e n t a t i v e l yn a m e dh r l5 ma n dt h em u t a n tg e n ez b 9 ( t ) i nt h i ss t u d y , c h l o r o p h y l lc o n t e n ta n dm a i na g r o n o m i ct r a i t so ft h ez e b r a b a n dm u t a n th r 15 ma n dt h e w i l dt y p eh r i5w e r ec o m p a r e d e f f e c t so ff a c t o r si n c l u d i n gs e e d l i n gs t a g e ，s o w i n g d a t e ， a n dt e m p e r a t u r eo nh r 15 mm u t a n te x p r e s s i o nw e r et e s t e dt h r o u g ht h ef i e l da n dp o t e x p e r i m e n t s m e a n w h i l e ，i n i t i a ll o c a t i o no ft h em u t a n tg e n ew a sm a d eu s i n gt h ee x i s t i n g a n dn e w d e v e l o p e ds s rm a r k e r st a k i n gf 2a n df 3g r o u po ft h em u t a n ta n dn i p p o n b a r ea s t h em a p p i n g p o p u l a t i o n t h em a j o rr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 c h l o r o p h y l lc o n t e n to ft h em u t a n tw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to ft h ew i l dt y p e d u r i n gt h em u t a n te x p r e s s i o n c h l o r o p h y l lb h a dd e c r e a s e dm o r et h a nc h l o r o p h y l la w h i l e i no t h e rp e r i o d st h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nc h l o r o p h y l lc o n t e n t 2 a n a l y s i so nm a i na g r o n o m i ct r a i t so fb o t ht h em u t a n ta n dt h ew i l dt y p ei n d i c a t e d t h a tt h em u t a n tw e r eh i g h e ri nt i l l e rn u m b e ra n d10 0 0g r a i nw e i g h tt h a nt h ew i l dt y p eb u t t h e r ew e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e si no t h e ra g r o n o m i ct r a i t s 3 m u t a n te x p r e s s i o nw a sd i r e c t l yr e l a t e dt ot r a n s p l a n t a t i o n ，a n di tg e n e r a l l ys h o w e d z e b r a b a n dl e a fo n ew e e ka f t e rt r a n s p l a n t i n g m u t a n te x p r e s s i o nw a sa f f e c t e d b y t h e s e e d l i n ga g ew h e nt r a n s p l a n t i n ga n dt o os m a l lo rt o ob i gw a su n f a v o r a b l et om u t a n t c h a r a c t e r 4 s o w i n ge x p e r i m e n t sa n dl o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n ts h o w e dt h a tt h em u t a n t h r l5 mw a sd i f f e r e n tt ot e m p e r a t u r es e n s i t i v em u t a n t11 0 3 s ，t h ee x p r e s s i o no fh r l5 m w a sn o td i r e c t l yr e l a t e dt ot e m p e r a t u r ec h a n g e s 5 f ja n df 2g e n e r a t i o nw e r eg o tf r o mc r o s sb e t w e e nt h em u t a n ta n dt h en i p p o n b a r e o b s e r v a t i o ns h o w e dt h a tf 1p e r f o r m a n c e dn oz e b r a - b a n dl e a fa n dt h es e g r e g a t i o nr a t i oo f f 2w a s3 ：1 ，i n d i c a t i n gt h a tt h ez e b r a - b a n dm u t a n tc h a r a c t e rw a sc o n t r o l l e db yas i n g l e r e c e s s i v eg e n e 6 t a k i n gf 2a n df 3g r o u pf r o mt h ej a p o n i c aa n di n d i c ac r o s sa st h em a p p i n g p o p u l a t i o n ，t h em u t a n tg e n ez b 9l t ) w a sl o c a t e do nt h el o n ga r mo fr i c ec h r o m o s o m e12 u s i n gs s rm a r k e r s l i n k a g ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eg e n ew a sl o c a t e db e t w e e nr m101 a n dr m 2 7 7 ，w i t ht h eg e n e t i cd i s t a n c e so f4 4 c ma n d5 4 c mr e s p e c t i v e l y a f t e ri n c r e a s e d t h eg r o u pt h em u t a n tg e n ez b 9 ( t ) w a sf i n a l l yl o c a t e db e t w e e nm m 12 9 6a n dm m 0 9 4 8 i l l 、析t hap h y s i c a lr e g i o n4 7 7k b k e y w o r d s ：r i c e ，z e b r a - l e a f , z b 9 例g e n e ，g e n e t i ca n a l y s i s ，m o l e c u l a rm a r k e r ，s s r i v 目录 前言1 l 水稻叶色突变体的研究现状1 1 1 叶色突变体的类型1 1 2 叶色突变体的遗传2 1 3 水稻叶色突变体的生理研究3 1 3 1 水稻叶色突变体的叶绿素含量3 1 3 2 水稻叶色突变体的叶绿体结构。3 1 3 3 水稻叶色突变体的光合特性4 1 4 水稻叶色突变体基因的定位与克隆5 1 5 叶色突变体的应用7 1 5 1 叶色变异作为形态标记7 1 5 2 叶色突变体用于品种改良7 1 5 3 叶色突变体用于光合作用和光形态建成的研究8 1 5 4 叶色突变体在功能基因组学中的作用8 1 6 水稻斑马叶突变体的研究现状9 1 6 1 水稻斑马叶的发现与形态特征一9 1 6 2 水稻斑马叶基因的定位9 1 7 水稻基因定位的主要方法l o 1 8 本研究的目的和意义1 l 2 材料与方法1 2 2 1 材料12 2 2 方法12 2 2 1 水稻田间种植与观察1 2 2 2 2 斑马叶突变体与野生型叶绿素含量的差异1 2 2 2 3 突变体与野生型重要农艺性状的差异1 2 2 2 4 斑马叶突变体表达条件的初步探究1 3 2 2 5z b 9 御基因的遗传分析13 2 2 ，6 基因定位群体的构建1 3 2 2 7 水稻基因组d n a 的提取1 3 2 2 8 引物来源与新引物的开发设计1 4 2 2 9p c r 反应体系及程序1 4 2 2 1o 染色体定位1 4 2 2 1 1 基因定位14 3 结果与分析15 3 1 斑马叶突变体的表型特征1 5 3 2 突变体与野生型叶绿素含量的差异1 5 3 3 斑马叶突变体和其野生型重要农艺性状分析16 3 4 苗龄对斑马叶突变体表达的影响1 7 3 5 播期对斑马叶突变体表达的影响1 8 3 6 特殊处理对斑马叶突变体表达的影响1 8 3 7 斑马叶突变体的遗传分析1 9 3 8z b 9 ( t ) 基因的初步定位1 9 4 讨论2 3 4 1h r l 5 m 区别于其他的斑马叶突变体2 3 4 2h r l 5 m 斑马叶突变体基因的定位2 4 5 结论2 5 参考文献2 6 附录a 非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳3 2 附录b 试剂配制3 3 附录c 缩略词3 4 致谢3 5 作者简介3 6 导师简介3 7 广东海洋大学硕士学位论文 j - 一 月i j 吾 水稻( o r y z as a t i v al ) 是重要的粮食作物，为世界上半数以上的人口提供食物和营 养来源。因为具有较小的基因组( 4 3 0 m b ) ，以及与其他禾本科植物具有很高的共线性， 水稻已经成为研究植物分子生物学和功能基因组学的一种重要的单子叶模式生物，随 着水稻测序工作的完成【l 】，水稻基因组的研究重点已转移到功能基因组学，应用遗传 突变体成为其基本的研究手段之一。 水稻植株9 0 9 5 的干物质来自光合作用。叶片是水稻进行光合作用的主要器 官。水稻的光合作用从光合色素对光的吸收开始。水稻光合色素包括叶绿素和类胡萝 卜素。叶绿素外部表现为绿色，类胡萝卜素则表现为黄色，水稻叶片中叶绿素与类胡 萝b 素的比值一般为3 ：1 ，所以正常的水稻叶片一般表现为绿色。当叶绿素的合成量 减少时水稻就会表现出各种叶色突变。在高等植物中，叶色突变的频率较高并且易于 鉴定，早在2 0 世纪3 0 年代就已有报道【2 j 。目前为止，在水稻、小麦、大麦、玉米、 大豆、棉花、烟草、玉米、向同葵、番茄、马铃薯、桑树等几乎所有的高等植物中都 发现了叶色突变体。叶色突变可以自然发生1 3 j ，但理化条件诱变与组织培养等诱发的 叶色突变更为常见，突变的频率也更高【4 】。叶色突变体不仅对光合作用的研究具有重 要意义，而且在叶绿素生物合成、叶绿体结构和功能、遗传和分化、发育、细胞器的 移植、细胞融合、遗传转化以及基因表达调控等的基础研究中都具有重要意义，并可 作为标记性状用于不育系繁殖、杂交水稻种子生产等方面。例如在水稻杂种优势利用 中，将淡绿叶性状或紫叶性状导入水稻不育系，借助标记性状就可在实验室或秧田中 对假杂种做出识别并剔除，能较好地解决杂交稻制种过程中因不育系育性波动而导致 的种子纯度降低的难题，是提高杂交稻的大面积生产应用安全性的一条简捷而十分有 效的途径。一些叶色突变体因具有特殊的优良特性而为作物遗传育种提供优异的种质 资源1 5 j 。因此，发掘和鉴定水稻叶色突变体基因，开展叶色突变基因的定位、克隆以 及对突变体作用机理等方面的研究，具有重要的理论意义和实际应用价值。 1 水j f f i n t 色突变体的研究现状 1 1 叶色突变体的类型 叶色突变在植物中是一种比较常见的性状突变，可以自然发生，也可经辐射诱变 处理或组织培养的过程中发生，它最明显的特点是叶色发生了某种改变。关于叶色突 变的研究在2 0 世纪3 0 年代就有报道，迄今，在水稻【6 1 、大豆【7 】、玉米【引、大麦【9 】、小 麦【1 0 1 、番茄、油梨12 1 、烟草【1 3 】等很多植物上均已发现了叶色突变体0 4 1 。 植物中的叶色突变体种类很多。叶色突变性状常在苗期表达，故根据苗期叶色的 i 水稻斑马叶基因z 鲫俐的遗传分析与初步定位 表型差异进行分类一直是最为常用的分类方法，例如g u s t a f t s s o n 把叶色突变体分为5 大重要类型：白化( a l b i n a ) 、黄化( x a n t h a n ) 、浅绿( v i r i d s ) 、条纹( s t r i a t a ) 、斑点( t i g r i n a ) ： a w e n l l 5 1 等则将其分为白化、黄化、浅绿、白翠、绿白、黄绿、绿黄和条纹等8 种类 型。然而，苗期叶色分类法是以表型性状为基础的，具有很大的局限性。因为植物的 表型性状与其内部的遗传物质之间并非一一对应。且同一种叶色突变性状可能受不同 基因控制和环境影响；即使同一基因发生的突变，由于基因功能缺损的程度不同，也 可能造成不同的表现类型。叶色突变可能是数量性状，也可能是质量性状；其遗传方 式可能是细胞核遗传，亦可能是细胞质遗传。因此，简单地以苗期叶色为标准对突变 体进行划分，不利于研究基因的生物功能。而且，随着新型叶色突变体不断被发现， 按照传统的苗期叶色突变体分类方法已经很难将某些叶色突变体归入到具体某种类 型，如c h a 等【l6 j 发现的水稻常绿叶突变体。苗期叶色突变体分类方法已经很难满足 研究发展的迫切需要，但由于还未找到更为合理的分类方法，且按苗期叶色表型进行 划分较为直观、简单，所以目前仍以苗期叶色为依据来确定叶色突变体的类型。 1 2 叶色突变体的遗传 叶色变异的种类繁多，不同突变体的遗传规律相差很大。叶色突变可以是质量性 状也可以是数量性状，既可以是细胞质遗传也可以是细胞核遗传，甚至是互作效应， 因此，为了确定突变性状的遗传模式，必须将突变体与野生型进行正反交试验和测交 试验。细胞质遗传表现为正反交结果不一致，子代的叶色总是和母本一样，不发生性 状分离；而细胞核遗传的正反交结果是相同的，f 2 群体和b c f l 群体均会发生叶色分 离现象，且表现出一定的分离比。 关于水稻叶色突变性状的遗传，大多数研究结果认为是由隐性核基因控制的。现 已证明，水稻白化基因a l l a l l o 皆为隐性基因。胡忠等【l 7 】对粳稻黄绿色突变体、夏英 武等【1 8 1 9 】对水稻温敏型突变体、吴殿星等1 2 0 】对水稻转绿型白化突变系w 2 5 、c h a 等【1 6 1 对水稻常绿叶色突变体的研究都表明叶色突变是由隐形核基因控制的。d o n g 等【2 1 1 对 水稻热敏感叶色突变体t s c 、吴关庭等【2 2 对儿m 2 紫叶突变体、龚红兵等对水 稻镇恢2 4 9 叶绿素b 减少突变体、沈圣泉等【2 4 j 对苗期转绿型仍刀叶色突变体、赵海 军等【2 5 j 对一个携带白化转绿型叶色标记的新型不育系玉兔s 、以及吴自明等【2 6 1 对黄绿 叶y g t l 突变体的遗传分析也都证明了这一点。核基因控制的叶色突变既有单基因控 制的，也有多基因控制的，例如王海风【2 7 】对紫色突变体的研究表明紫色突变体的紫叶 性状是隐性性状，其中紫1 、紫3 、紫6 、紫8 的紫叶性状是由两对基因控制的，且 有一对起抑制作用；紫2 、紫4 、紫5 、紫7 和紫l o 是由3 对基因控制的，且其中有 一对基因起抑制作用。目前已经筛选了许多受单隐性核基因控制的突变体，已经应用 于基础研究和育种工作中。但是有关显性基因和叶绿体基因控制的叶色突变体报道极 2 广东海洋大学硕士学位论文 少见。房贤涛【2 8 j 对白化转浅绿类型、白化转绿后期、转白复绿类型、白化转绿类型和 白化转黄绿型突变体进行了系统的研究，发现，只有白化转黄绿型的2 ，聊的叶色是 由一对显性基因所控制之外，其它突变体的叶色都是由一对隐性基因所控制的。一般 认为，白化性状的遗传是隐性单基因遗传，是由于白化基因的表达使细胞质产生了不 利于质体发育的一种生理状态，在这种情况下突变是由核基因控制的。t o m o k o 掣2 9 】 的研究则认为，控制水稻白化突变体性状的是两对隐性核基因。但是，也有人认为白 化性状在某些植物中不是核遗传，而是细胞质遗传的，即是由于质体本身发生的突变 所导致的。 全世界已经报道了大约8 0 个水稻叶色突变体基因，但是针对这些基因进行的等 位性分析还不够系统全面。已有研究表明，不同诱变剂诱发的突变位点往通常是不等 位的，即使相同的诱变剂诱变产生的突变位点也极少是等位的。然而，h s i e h l 3 0 1 研究 发现z j 4 和y l b 是一对等位基因。 1 3 水稻叶色突变体的生理研究 1 3 1 水稻叶色突变体的叶绿素含量 水稻叶色突变体的叶绿素含量变化与突变体表型变化有密切的关系。夏英武等p l j 的研究发现叶绿素含量的变化规律与叶色表型变化相一致，水稻白色转绿型突变系 w 2 5 转绿前叶绿素的含量明显低于正常植株，随着叶色的不断加深，叶绿素的含量逐 渐增加。完全转绿时，叶绿素含量达到正常植株的水平。何瑞峰等1 3 2 j 对“斑马叶”水稻 突变体的叶绿素含量分析表明：叶片发生间断失绿，叶绿素含量的下降、上升与“斑 马纹”的出现、消失相一致。通常认为植物叶色的深浅是叶绿素含量的外在表现，但 林钰琼等【3 3 】研究却发现了一个很有趣的现象，水稻突变体t 1 5 7 a 4 1 的叶色比野生型 植株略淡，而叶绿素a 、叶绿素b 和总叶绿素的含量却明显地高于野生型植株。 1 3 2 水稻叶色突变体的叶绿体结构 叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，多数研究发现由叶绿素合成缺陷而产生 的突变体，其叶绿体内部结构也发生了一定的变化。为了揭示叶色突变的性状发生与 结构变化的关系，许多学者对叶色突变体的超微结构进行了深入研究，很多突变体其 类囊体的结构都发生了不同程度的改变。孙敬三等【3 4 】对水稻白化苗质体的亚显微结构 观察显示，白化苗叶片中有前质体存在，并可以发育出初始片层，从而否定了白化苗 是因细胞内缺乏质体而造成的看法。但白化苗的前质体不能发育成完整的基粒片层， 质体中虽有d n a 状纤丝存在，但没有核糖体，所以认为质体中因缺乏核糖体不能合 成蛋白质才是造成白化苗的直接原因。邵继荣等p 5 】观察研究了水稻间断失绿突变体 1 1 0 3 s ，在失绿性状表达期间，淡黄区叶绿体的类囊体膜结构发生了退化，基粒垛叠 但是从净光合速率来看，无论是在一天中的不同时间段，还是在不同的发育时期，突 变体均高于野生型，叶绿素含量下降的情况下突变体的光合效能不降反增。 胡忠等1 4 列在研究一水稻黄绿色突变体的光合特性时发现，突变体的叶绿素悬浮液 具有较高的铁氰化钾光还原活性，在6 0 0 0 l x 光照下，以叶绿素为单位计算，其光还原 活性达到对照的2 2 3 。在弱光照条件下，突变体叶片同化二氧化碳的速率明显低于 对照，但在2 0 0 0 0 l x 的强日光下，以单位叶面积计算为对照叶片的7 5 ，以单位叶绿 素计算达到对照的1 8 5 。且该突变体的捕光c h la c h lb 蛋白质复合物极少，并且基粒 明显缺乏。研究表明，叶绿体基粒结构与捕光c h la b 蛋白质复合物的含量成正相关， 它并非为光合作用基本过程所必需。戴新宾等 4 4 1 对一个水稻缺失叶绿素b 的突变体研 究发现，其截光率为0 4 2 ，较野生型的0 8 1 明显要低。进一步研究还表明，该突变体 在叶片在全展前后主要是降低了外周捕光天线色素蛋白复合体i i ( l h c i i ) 的含量，只为 野生型的2 3 ，到叶片发育后期接近野生型，但它的光合机构在叶片一生中较稳定， 且在强光下似乎比野生型更稳定，具有较强的耐受强光的能力，与以往的研究结果截 然相反。许晓明等 4 5 1 的研究表明，此突变体主要是通过减少光能吸收量，提高电子传 递活性从而减轻高光照下过剩光能对光合结构带来的伤害。 4 广东海洋大学硕士学位论文 1 4 水稻叶色突变体基因的定位与克隆 水稻叶色突变基因在染色体上的分布比较广泛。据不完全统计，目前水稻中已经 发现8 0 多个相关的叶色突变体【4 6 j ( 表1 ) 。这些突变体的基因绝大多数已经定位，分 布在水稻1 11 号染色体上【4 7 “引，但是迄今为止在1 2 号染色体上没有发现这类突变体基 因。王彩莲【4 9 j 将水稻浅绿色早熟突变基因定位于第3 染色体上，黄绿色突变基因定位 于第1 0 染色体上。邓国由【5 0 】对水稻紫叶进行了详细研究，并将紫叶水稻i r l 5 2 2 的紫叶 基因定位于第6 染色体的短臂端的标记r m 5 8 7 和r m 5 8 4 之间，遗传距离分别为3 1 c m 和2 2 c m 。朱丽等1 5 l 】利用水稻s s r 标记将浅绿基因硝2 定位第8 染色体着丝粒附近分子 标记p h 7 2 和p h 7 8 之间约2 3 7 m b 的范围内。王军等1 5 2 j 将黄绿基因脚2 定位在s s r 6 1 6 和r m 7 4 3 4 之间，遗传距离分别为0 6 2 c m 和0 7 4 c m 。余庆波掣5 2 】将一个白化突变体 a l b 2 1 基因定位于第3 染色体上标记r 3 m 5 2 2 和r 3 m 5 2 5 之间约1 5 2 0 k b 的区域内。x i a 等t s 4 j 利用s s r 标记将低温白a l l 2 基因定位在第8 染色体上，两侧最近的s s r 标记 r m s 0 6 8 和r m 3 7 0 2 分别距基因0 5 1 1 c m 和4 9 c m 。c h a 掣1 6 j 利用分子标记将水稻常绿 叶色突变体基因s g r ( t ) 定位于第9 染色体标记r g 6 6 2 和c 9 8 5 之间。w a n g 等【5 5 1 则是第一 个利用s s r 标记将控制水稻黄绿色叶片的基因定位在第5 染色体上，距离r m 3 8 3 8 为3 4 c m ，距r m l 6 8 为1 3 9 c m 。黄晓群【5 6 j 将一个新的黄化突变基因幽，定位于水稻 第3 染色体短臂上的s s r 标记r m 2 8 2 与m r g 5 9 5 9 之间，与二者的遗传距离分别为 5 2 c m 和2 1 8 c m 。王宝和f 5 7 l 利用水稻s s r 标记将一个水稻黄绿叶基因y g l 2 ( t ) 定位在水 稻第6 染色体长臂上，位于s s r 6 1 6 和r m 7 4 3 4 两个标记之间，遗传距离分别是0 6 2 c m 和0 7 4 c m 。孙旭等【5 8 】利用代换系将水稻紫色叶鞘基因删例定位到第6 染色体上并且 证明紫色是由一对显性基因控制的。刘梦梦等【5 9 】利用e m s 诱变恢复系缙恢1 0 号，获 得了一个稳定遗传的全生育期黄绿叶色突变体，并利用微卫星标记将y g l 定位于第 1 0 染色体r m l l 6 2 和r m 7 0 9 3 之间，分别距其1 8 c m 和4 0 c m 。虽然船，与y g l 4 都位于第 1 0 染色体长臂上，( g p g l 基因是利用初级三体进行的定位，而y g l 是利用分子标记定位 所得，因此难以证明y g l 4 - 与p g l 基因是否等位。龙美西【6 0 】同样利用微卫星标记将一 个黄化矮杆基因s d y ( t ) 定位于水稻第9 染色体上，与标记r m 7 4 8 1 矛h r m 4 4 4 的遗传距离 分别为4 4 c m 和2 5 c m 。 随着生物化学与分子生物学的快速发展，很多叶色突变基因已经被定位，但被克 隆的基因数目却很少。叶色突变相关基因的克隆研究已经成为国内外研究的热点，但 是主要集中在编码叶绿素合成与降解途径中的酶基因。在拟南芥中编码叶绿素合成途 径中的所有酶基因已经全部被克隆【6 。但迄今为止，水稻这一途径中相关酶的基因在 g e n e b a n k 中登录的仅有4 个2 。j u n e 等p 3 j 利用基因捕获系统，通过t d n a 标签插入的 方法克隆了控制水稻失绿性状的基因o s c h l h ，该基因是通过编码镁鳌合酶最大亚基 c h l h 来影响叶绿素的生物合成的，这是水稻中第一个被克隆的叶色突变基因。 水稻斑马叶基因z b 9 ( t ) 的遗传分析与初步定位 表l 水稻叶色突变体基因 t a b i e1g e n eo fl e a f e o l o u rm u t a n ti nr i c e 染色体基因编号 叶色表型染色体 基冈编号叶色表型 c h r o m o s o m eg e n e l e a fc o l o u rc h r o m o s o m e g e n el e a fc o i o u r la l - 4 白化 5 z 7 斑马叶 la l - 8 白化 5 y l ( t )黄绿叶 1 c h l - 5 缺绿 5z - 1 5 斑马叶 1 c h i 6 缺绿 6a l - 1 白化 l f s - 2 细条斑 6 a l 9 ( t )白化 1 v 6 淡绿色 6 c h l 一4 缺绿 l z - 8 斑马叶 6c h l 7 缺绿 l c h l - l l 缺绿 6 f s - l 细条斑 2 c h l - 1 0 缺绿 6 s t 1 条斑 2 z - ll 斑马叶 6 v - 3 淡绿色 2 z - 1 2 斑马叶 6z 1 3 斑马叶 2 g r a ( t ) 白化转绿 6 p l l紫叶 3 a i - 1 0 白化 6 y g l 一2黄绿叶 3 b g l 亮绿色 7s t 一8 条斑 3 c h l - 1 缺绿 7v 1 1 淡绿色 3 c h l - 2 缺绿 7z 一6 斑马叶 3 c h l 一3 缺绿 7z - l o 斑马叶 3 s t 一6 ( t ) 条斑 8c h l 8 缺绿 3 v - 1 淡绿色 8c h l 9 缺绿 3 v 2 淡绿色 8v - 8 淡绿色 3 v 5 淡绿色 8z 4 斑马叶 3 v - 7 淡绿色 8 p g l 2浅绿 3 z - 3 斑马叶 8a l 一1 2 低温敏感缺绿 3 z - 9 斑马叶 9 c h s l ( t )低温敏感缺绿 3 c h l l l ( 0缺绿 9 s g r ( t )常绿叶 3 a b l 2 1 白化 1 0 龟l褪绿色 4 a l 5 白化 1 0 瓜 卷细条斑 4 a l 7 ( t ) 白化 l o y g l黄绿叶 4 s t - 4 条斑 1 0 p g l 3 ( t )苍白叶 4 s t - 5 条斑 1 0 y g l 4 黄绿叶 4 s t 7 条斑 l o p g l浅绿色 4 y l m黄n t 缘 l l v - 4 淡绿色 4 z 5 斑马叶 l l v 一9 淡绿色 5 a l - 2 白化 l l z - l 斑马叶 5 a l - 3 白化 1 l z - 2 斑马叶 5 a l 6 ( t )白化 1 1 z l d ( t )斑马叶 5 s t - 2 条纹 - c h s 2 ( t )低温敏感缺绿 5 v l o 淡绿色 - c h s 3 ( t )低温敏感缺绿 5 z - 1 4 斑马叶 一 c h s - 4 ( t )低温敏感缺绿 5 y l b黄色条斑 一 l g p亮绿叶 5 y g l i 黄绿色 注：现已经证明z - 1 4 和m 为一对等位基因 m i y o s h i 等叫克隆了水稻施，朋丹基因。伪硎尸3 基因控制着叶绿体的发育和叶 绿素的合成。吴自明 2 6 1 首次利用水稻叶色突变体图位克隆了水稻的叶绿素合成酶基因 6 广东海洋大学硕士学位论文 y g l l ，且对其功能进行了相关的分析。孙焕明j 根据已公布的分子标记和其实验室 检l l ! i ! i 的多态性标记，用图位克隆法首先将苍白叶突变体基 p g l 3 ( t ) 初步定位在第l o 号染色体的长臂端，并进一步发展的新s t s 标记、s s r 标记和c a p s 标记，利用这些标 记最终将蹦3 基因精细定位于1 0 号染色体长臂上的两个c a p s 标记c 2 和c 3 之间，物 理距离为6 4 k b ，然后进行序列分析与基因预测，发现该区域内共含有3 个开放性阅读 框，目前j 下在进行基因序列的预测。陆斌【6 5 1 将一个新的缺绿突变体基因c 办，俐定位 到第1 染色体的两个标记c h 0 9 和c h l 0 之间1 1 0 k b 的区域内，基因预测显示：在该区域 内共有1 5 个可查基因，其中5 个基因有相应全长e d n a 支持。 1 5 叶色突变体的应用 1 5 1 叶色变异作为形态标记 随着分子生物学和遗传学的快速发展，遗传标记的发展主要经历了4 个阶段，即 形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记。分子标记虽然得到长足发展，但主要还 是在实验室基础研究工作中，在实际田间生产应用中比较少。叶色突变体具有性状极 易辨别和苗期即可去杂的特点，已成为生产应用中一种较好的形态标记。可将叶色变 异作为形态标记应用于纯种制备和杂交育种，该方法程序简易、操作简单方便、结果 直观可信，同时也克服了田间种植鉴定周期较长且受地域i i i i i i 的不足。因此，叶色变 异作为标记性状对简化杂交稻纯度鉴定的手续、节约纯度鉴定的时间和费用及提高田 间杂交稻生产的纯度具有重要意义【2 5 】。近年来，叶色突变在杂交水稻生产应用上的研 究愈来愈受到众多学者的关注，一些具有较高应用价值的不育系m j 也已经成功育成 了。如董风高等【6 7 】采用杂交和回交方法将浅绿叶色标记导入籼型温敏核不育系育成了 m 2 s ；曹立勇等【6 8 】利用同样的方法将紫叶标记转到籼型光温敏核不育系中，成功地选 育出中紫s 。 1 5 2 叶色突变体用于品种改良 少数作物会因缺失叶绿素而具有特殊的优良品质。如安吉白茶是阶段性返白突变 体，其叶片白化过程伴随着叶绿素含量降低，蛋白水解酶活性升高，可溶性蛋白含量 降低，游离氨基酸含量升高，返白期间氨基酸总量高峰值可达5 。叶为原料的玉风 茶氨基酸含量为一般茶叶的一倍以上，滋味鲜爽、风味独特，有很高的营养价值和经 济价值。目前安吉白茶已被列为珍稀茶树种质资源【删。缺少叶绿素对烟草也有特殊的 利用价值，如白肋型、灰黄型、黄绿型是烟草叶绿素缺少常见的变异型，其中白肋突 变体来自马里兰的深色晒烟，茎和叶脉呈现乳白色，叶绿素含量为正常绿色品种的三 分之一，现已发展成为烟草新类型【7 们。一些叶色突变体材料虽然叶绿素含量下降， 但具有某些新的优良光合特性，是培育能够适应恶劣生态条件水稻的重要种质资源。 7 水稻斑马叶基因z b 9 ( t ) 的遗传分析与初步定位 水稻镇恢2 4 9 中的黄叶突变体虽然光合速率低于野生型，但光合速率仍较强，c h l a c h l b 的比值较适中，具有一定的捕光能力，同时能使植株避免强光照射而引起的光抑制， 有利于培育耐光抑制的高产或超高产品种1 2 3 1 。因为叶色容易通过突变发生改变，而生 产中观赏类植物常用无性繁殖方式进行扩大繁育，其突变材料在m 代即可以鉴定、 筛选和保存，所以叶色突变体在观赏植物培育方面得到广泛应用。如色彩绚丽的彩叶 植物的成功培育【7 1 1 。 1 5 3 叶色突变体用于光合作用和光形态建成的研究 叶片是植物进行光合作用的主要器官，叶绿素含量高低、叶绿体形态结构和功能 是影响光合作用效率高低的主要因素。而叶色突变体往往与叶绿素合成途径以及叶绿 体的分化和发育有关，因此，叶色突变体是研究光合作用的优良材料。植物光形态建 成的光受体一光敏色素是由生色团和蛋白质组成的复合物，并且光敏色素受体家族的 所有成员均使用同一生色团，缺失光敏色素生色团的叶色突变体对光不敏感，可用于 研究光感受和信号转导，生色团含量降低导致所有光敏色素活性下降【7 2 】，因而缺失 光敏色素生色团的叶色突变体是研究植物光形态建成的理想材料，并可通过缺失生色 团的突变体研究光敏色素在光形态