（生物化学与分子生物学专业论文）基于转录激活的细菌双杂交载体的构建.pdf

摘要 大肠杆菌双杂交系统是继酵母双杂交系统和哺乳动物细胞双杂交系统之后， 产生的另一种直接于细胞内检测蛋白质与蛋白质相互作用的遗传学新方法。本研 究希望构建基于转录激活的细菌双杂交系统载体，并且进一步发展高通量的细菌 双杂交载体。其主要内容： ( 1 ) 将细菌双杂交诱饵载体p b t 、猎物载体p t r g 的克隆方式进行改进。最 初的系统是b a c t e r i o m a t c h 回i it w oh y b r i ds y s t e m ，为了能高通量地将诱饵、猎 物基因克隆到相应载体上，而且能利用实验室现有的大量引物，将两载体作出了 改进：在多克隆位点处两端依次引入现有引物中的长1 5 b p 的同源序列b f 、n r ， 两个酶切位点b g l l l 、n o t i ，中间为一个带强启动子p r r n 的g 詹作为反选择标记。 改进的诱饵载体和猎物载体分别命名为p b t - b n g f p ，p t r g b n g f p 。 基因片段经p c r 扩增后，与用b g i i i 、d 玎酶切的诱饵载体混合，无需用 连接酶进行连接反应，直接转化大肠杆菌。多基因可以平行操作，无需考虑基因 内的酶切位点，定向连接，载体背景低， ( 2 ) 利用生物信息分析，选取了代谢、物质转运，氧化应激、信号转导、转 录调控和细胞周期调控等肝脏蛋白质相关的3 5 条，将其全长o r f 经上述高通量 克隆方式克隆到改进的诱饵载体p b t - b n g f p 上，并测序验证命名为p b t - b a i t 。 ( 3 ) g a l 4 的二聚化区域与g a i t 9 蛋白为蛋白质互作对，验证了此双杂交系 统的有效性。 ( 4 ) 对所克隆的诱饵蛋白进行自激活验证。 关键词：蛋白质相互作用，高通量克隆，细菌双杂交，诱饵，猎物 a b s t r a c t a t w o h y b r i ds y s t e mf o re s c h e r i c h i ac o l ih a sb e e ne s t a b l i s h e da n di m p r o v e di n t h ep a s tf e wy e a s t h i ss t u d yi sh o p i n gt oc o n s t r u c tb a c t e r i a lt w o h y b r i dv e c t o rb a s e d o nt r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o n ，f u r t h e rm o r ew ee x p e c tt op r o m p t i n gh i 曲一t h r o u g h ! c l u t t w o - h y b r i dv e c t o ra ts a m et i m e 1 c h a n gt h ew a y o fc l o n eo fc o n v e n t i o n a ls y s t e m s t h eb a c t e r i o m a t c h 口t w o h y b r i da d o p tt h eu n i v e r s a lc l o n em o d e - t h r o u g ht h er e s t r i c t i o ne n z y m ea n dl i g a s e a t t h ea i mo f m a k i n gt h eb e s to f o u rl a b s e x i s t i n gp r i m e r s w ea m e l i o r a t et w ov e c t o r i nt h ei n t e r e s to fd e c r e a s eb a c k g r o u n do fv e c t o r ，w ei m p o r tt h e 曲( g r e e n f l u r e s c e n e p r o t e i n ) ，i tw a san e g a t i v es y m b 0 1 i nt h i ss y s t e m w h e nw ec l o n ei ti n t o t h ev e c t o r ，t w os e g m e n ts e q u e n c ea r ea d d e dt ot h et w op o l eo fp r i m e r so f 咖t h e y a r eh o m o l o g o u sp a r to f o r f sp r i m e r s - b f 、n r ，b g l l i 、n o t l r e s t r i c t i o ns i t e s t h et w o n e wv e c t o ra r en a m e dp b t b n g f p 、p t r g - n b g f p a tt h i sp r o c e d u r e ，w ed o n tu s et h el i g a s e i ti sv e r ye a s y ，a n dw eh a v en ou s eo f t h i n k i n go v e rt h ee n z y m er e s t r i c t i v ee n d o e n z y l n eo fo r f p o l y g e n ea r e c a l l m a n i p u l a e d a ts a m et i m e 2m a k eu s eo fb i o l o g yi n f o r m a t i o n ，w ep r e f e r3 5o r f s t h ei n t e r e s t i n go r f s f r o ml i v e ra r em n p l i f i db yp c r ，a n dc l o n e di m op b t - b n g f p t h e s eo r f sa r e r e l a t e dt oc e l lc y c l er e c o g u l a t i o np r o t e i n s 、t r a n s p o r t i o no fs u b s t a n c e s 、c e l l m e t a b o l i z a t i o n 、s i n g a lt r a n s d u c t i o n 3 p r i o rt op e r f o r m i n gt w o - h y b r i di n t e r a c t i o na s s a y ，w eu s et h er e c o m b i n a n tb a i t a n d t a r g e tp l a s m i d ( p b ta n dp t r g ，e a c hc o n t a i n i n gt h e i rr e s p e c t i v eg e n e so f i n t e r e s t ) t ot e s tt h eb a i t sa c t i v i t y i ti sp r u d e n tt od e t e n n i n ew h e t h e ras p e c i f i cr e c o m b i n a n ti s s u i t a b l ef o rd e t e c t i n gp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o ni nt h eb a c t e r i o m a t c h l it w o h y b r i d s y s t e m w et e s ts e l f - a c t i v a t i o nb y r e c o m b i n a n tp b t w ew i l lc o n s 廿c tp r e yl i b r a r y , t h e ns e l e c ta n da n a l y s ep r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n k e yw o r d s ：p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n ，h i g h t h r o u g h p u tc l o n e ，b a c t e r i a l t w o h y b r i ds y s t e m ，b a i t ，p r e y i i 月i j蟊 缨臌是生命体结构积功能黪熬本单位，两虽囱质与蛋自膜捆互作用鹚终构成 了纲稳囊命活动的慕獭。蛋自质之阕的相互作潮在细胞生命过程中扮演了如此重 要的作用。随着后熬网组时代的到来，刻画未知基因、未知骚白的功能已成为各 国科学窳硒究的热点。隧着越来越多物耱基因缀序列懿公蠢，绘毒l 大撅模瓣基因 组范圈肉的病毒、酵母、拟南芥、搽蝇、小鼠赞臼质相互作掰图已成为当今蛋自 质组学的一个重要的研究内容。 酵母双杂交系绞及其瑟生系统躲建立为磺究蛋自震龉夏作兵l 捷供了个强 有力韵遗传学手段。僚是出于酵母系统自身的缺陷性，使得酵母双杂交系统的假 阳性和假阴性偏高。细菌双杂交能为分析两特定的蛋白质或多肽的互作提供一个 莰蠢麓謦豹方法。缨藏双杂交硬究翅期短，搡嚣麓摹，l 够产鬟三容量更大弱文库， 更低的假阳性率和骰阴性率，而鼠是更好的小分子药物筛选宿主。而传统的细菌 双杂交系统由于高通鼹克隆表达技术的限制，真正意义的基因组范围的蛋囱质相 互圣# 弱筛选还未实溪。为了l 够羹客鼹、更正确数反映蛋自璇稳互佟用以觳送行 大规模的蛋白质相互作用筛选，发展高通量和灵敏的细菌双融交系统成为了目前 蛋白质棚互作用研究的一个重点。近几年来，该系统得到了飞速的发展，逐渐走 囊戒熟势运嗣到了诲多矮域。到嚣蓦蔻壹，已缎建立了许多不同俸系翡大麓柽蓥 双杂交系统。 与酵母双杂交的原理相似。通过将所要研究的蛋白质分别与d n a 结合域( d b d ) 与涯纯域( 勰) 聚合，嚣篾据互 筝惩蛋皇获提稷瓣餐联功巍，楚涯 乏域与d n a 结 合域结合，从而调控报告基因的袭达。报告基因袭达的调控结果可通过生化或遗 传学的方法检测到。 第一部分文献综述 1 1 原核生物基因的转录及其调控 1 1 1 原核生物基因的转录 无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别，转录起始， 通过启动子及转录的延伸和终止。转录机器的主要成分： ( 1 ) r n a 聚合酶 大多数原核生物r n a 聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌r n a 聚合酶由2 个a 亚基，一个1 3 亚基，一个b 亚基和一个。亚基组成，称为核心酶。加上一个0 亚基后则成为聚合酶全酶( h o l y e n z y m e ) ，相对分子质量为4 6 5 1 0 5 。 o 亚基可能与核心酶的组装及启动予的识别有关，并参与r n a 聚合酶和部分 调节因子的相互作用。o 亚基可以极大提高r n a 聚合酶对启动予区d n a 序列的亲 和力，同时使r n a 聚合酶与模板d n a 上非特异性位点的结合常数降低1 0 4 倍，o 亚基的作用是负责模板链的选择和转录起始“1 。 ( 2 ) 转录复合物 转录复合物在启动子选择阶段形成，包括p 3 q a 聚合酶对启动子的识别，聚 合酶与启动子可逆性形成封闭复合物。 1 1 2 原核基因的转录调控 原核生物的基因调控主要发生在转录水平，根据调控机制的不同可分为负转 录调控和正转录调控，在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白，起着 阻止结构基因转录的作用。在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白。 以乳糖操纵子为例，大肠杆菌1 a c 操纵子上包括三个结构基因l a c z ( 1 3 半乳糖苷 酶) l a c y ( 透性酶) ，l a c a ( 乙酰基转移酶) ，以及启动子，控制子和阻遏子等。1 图1 1t h e l a c o p e r o n 转录时r n a 聚合酶首先与启动子区结合，通过操纵区( o p e r a t o r ，o ) 向右转 录，转录从0 区中间开始。 1 9 9 6 年，j a c o b 和m o n o d 建立了人们广泛接受的乳糖操纵子的控制模型，其 主要内容为：z 、y 、a 基因的产物由同一条多顺反子的m r n a 分子所编码； 该m r n a 分子的启动区( p ) 位于阻遏基因( i ) 与操纵区( o ) 之间，不能单独起 始三个结构基因的高效表达；操纵区是d n a 上的- 4 , 段序列，是阻遏物的结合 位点当阻遏物与操纵区结合时，l a c m r n a 的转录起始受到抑制：诱导物通过 与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵区相结合，从而激发l a c m r n h 的合成。“1 1 1 3 阻遏物 1 1 3 1l a c 阻遏蛋白 最初认为阻遏物与操纵基因阻碍了r n a 聚合酶与启动子的结合，不过现在 我4 f l 失n 道阻遏物与r n a 聚合酶可同时与d n a 结合，而且阻遏物与d n a 结合能 增强r n a 聚合酶结合d n a 的能力，只是此时结合的r n a 聚合酶不能起始转录。 r n a 聚合酶单独与l a c 启动子结合的平衡常数是1 9 + 1 0 7 m 。阻遏物存在时， 常数增加2 个数量级，达2 5 1 0 9 m 1 。r n a 聚合酶与阻遏物同时与d n a 结合， 使得一旦发生诱导就能立即进行转录，而无需等待r n a 聚合酶的结合。 阻遏物实际上使r n a 聚合酶被储存在启动子上。r n a 聚合酶一阻遏物一d n a 复合物通常使处于封闭状态，加入诱导物后，阻遏物释放，封闭复合体( c l o s e d c o m p l e x ) 转变为开放复合体( o p e nc o m p l e x ) 并起始转录。阻遏物总是与d n a 结合，大约9 9 9 9 的都结合在d n a 的随机位点上。但存在着单个高亲和力位点( 操 纵基因) 与大量低亲和力位点的竞争结合。”1 l a c i 基因是大肠杆菌中l a c 操纵子( o p e r o n ) 的调节基因，它所表达的阻 遏蛋白是l a c 操纵基因( o p e r a t o r ) 的抑制因子，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖 结合而失去对操纵基因的抑制，使l a c 操纵子上的结构基因l a c z ( 0 一半乳糖苷 酶) ，l a c y ( 透性酶) ，l a c a ( 乙酰基转移酶) 得以正常表达。i p t g ( 异丙基一b d 一卜硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与l a c 阻遏蛋白结合而使操纵基因不被 抑制，因此i p t g 经常作为l a c 操纵子的诱导剂而使用。“3 l a c i ”是l a c i 基因发生变异而使其表达大量的阻遏蛋白，从而使l a c 操纵基 因几乎完全被抑制。利用这种基因型的菌株进行表达时，可以使目的基因的表达 得到更有效的人为控制。 1 1 3 2c i 阻遏蛋白 c i 蛋白是噬菌体玎基因编码的阻遏蛋白。这个基因突变则不能建立噬菌体 的溶源性，而是进入裂解循环，因为c i 阻遏蛋白阻止早期基因的转录。c i 阻遏 蛋白是由2 3 6 个氨基酸组成的多肽，它有两个不同的结构域，一个是n 末端结构 域，它提供与操纵基因结合位点；另一个是c 末端结构域，其功能是负责二聚体 的形成。 c i 阻遏蛋白可独立结合在o l 和o r 操纵基因上，在每个操纵基因上都有3 个结合位点，而且c i 阻遏蛋白总是首先结合在0 l 1 和0 r 1 ，c i 阻遏蛋白与位点 1 的结合大大增加了第二个c i 二聚体与位点2 的亲和力。在一个溶源菌通常的 阻遏蛋白浓度下，每个操纵基因上的位点1 和位点2 被占据后，不再占据位点3 。 由于0 l 1 和0 r 1 或多或少分别与尼和朋的r n a 聚合酶结合位点中心重叠，因 此，c i 蛋白结合0 l 1 0 l 2 和0 r 1 0 r 2 ；从物理上阻止r n a 聚合酶接近相应的启 动子，从而关闭了从尼和朋启动子开始的转录，则整个左向早期转录的表达被 阻止。 1 1 4 激活蛋白 大肠杆菌中的代谢激活蛋白，由c r p 基因编码，它是与c a m p 特异结合的 c a m p 受体蛋白c r p ( c a m pr e c e p t o rp r o t e i n ) ，当c r p 未与c a m p 结合时它是 没有活性的，当c a m p 浓度升高时，c i 廿与c a m p 结合并发生空间构象的变化 而活化，称为c a p ( c r y ，c a m pa c t i v a t e dp r o t e i n ) ，能以二聚体的方式与特定的 d n a 序列结合。在l a c 操纵元的启动子p 船上游端有一段序列与。部分重叠的 序列，能与c a p 特爨结合，称为c a p 结合位点( c a pb i n d i n gs i t e ) 。l a c 操纵启 动子的7 0 至l 一5 0 嚣怒c a p 结合倥点；c a p 缭合至a ca c t i v a t o rs i t e ，褥r n a p o l y m e r a s e 招募到l a cp r o m o t e r 上形成闭合的扁动子复合物，然后再形成开放的 启动予复合物。即c a p 与这段序列结合时，可增强r n a 聚合酶的转录活性，使 转录稳舞5 0 镶。 c a p 蛋白激活乳糖操纵子转添的方式有两种，第一种是作用与d n a ，即c a p 复合物与d n a 结合藤，使d n a 发生弯曲，促邂了r n ap o l y m e r a s 与启渤子的 结合；茄辨，c a p 囊合秘与d n a 结舍磊改交了这一区羧d n a 豹二缀终擒，健 进了r n a p o l y m e r a s 结合区的解链，从而有利于转录的顺利i 攮行。第二种怒c a p 直接作用于r n ap o l y m e r a s ，即c a p 蛋白与r n ap o l y m e r a s 中的a 亚基的羧基 臻相接触，通过c a p 与r n a p o l y m e r a s 之耨匏褶互终矮挺鬻转录承平。( 阉l 。2 ) 豳1 。2 ：激活鼹囱对乳糖操纵子的影响 凡c r p 及腺营黻环化酶基因突变的细菌都不能合成1 a c m r n a ，c r p 和c a m p 都是合成l a cm r n a 所必需的。攀实上，细菌对此复合物的需要是独立的，与阻 遥癸系无关。瑟戬，我髓谈交c a m p c r p 是一令不凌子阻i 萋拐戆歪调控爨予，焉 t a c 操纵子的功能怒在这两个独立的调控体系作用下实现的。对大量操纵予启动 区的研究结果表明，c a m p c r p 结合位点不仅猩启动子区的相对位置不恒定，而 显渗粥瓷存在姆舅瞧。1 1 2 鬣白质组学及蛋白质组计划 。2 。 蛋白蒺缝擎 蛋囱质组( p r o t e o m e ) ，n m a r cw i l k i n s 最早于1 9 9 4 年夜s i e n a 双向凝胶电泳 会议上提出。它是搬一个有机物所有的蛋自质，具体指一个缀腿或组织基因所表 达的仝部蛋自质。飘阶段蛋自葳缀的研究已经成为了生物技术静一个熏聚领域， 并形成了一门新的学科一蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) ，它是门以全面的避白质性 质研究( 如表达水平转录后修饰、细胞内定位、相互作用等) 为基础，在蛋白质整体 水平对疾病机理细胞模式功能联系等方面进行探索的科学“1 。 蛋白质组学集生物技术手段、分析技术、信息技术和材料技术等之精华，采 用了大规模、高通量、高速度的技术手段，通过研究全部基因所表达的所有蛋白 质在不同时间与空间的表达谱和功能谱，全景式地揭示生命活动的本质，特别是 人体健康与疾病的机制。蛋白质组是开发疾病防治诊治药物和技术的直接靶体 库，人类蛋白质组已成为新世纪最大的战略资源之一，是国际生物科技的战略制 高点，将直接关系到未来整个生物技术及相关产业的发展空间和市场份额，有限 的蛋白质组资源将是各国国力世纪性角逐的主要“战场5 1 。 蛋白质组学从其研究目标方面可分为功能蛋白质组学和结构蛋白质组学。功 能蛋白质组学是研究细胞或组织在不同条件如药物或疾病状态下蛋白质的表达 和功能，这将有助于识别疾病特异蛋白、药物作用靶点、药物功效和毒性标记等， 目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛，主要依赖双相凝胶电泳 ( t w o d e m e n s i o n a lg e le l e t r o p h o r e s i s ，2 d g e l ) 技术以及质谱技术。功能蛋 白质组学研究的主要内容包括：( 1 ) 从复杂的组织和个体中分离和纯化蛋白质； ( 2 ) 识别蛋白质在参与生理活动中的修饰情况，如糖基化，磷酸化及乙酰化等： ( 3 ) 追踪蛋白质在亚细胞中的定位；( 4 ) 识别蛋白质相互作用图谱。结构蛋白 质组学是研究在基因组范围内决定蛋白质三维结构的科学，从而更好的阐明基因 产物的生物学功能以及更好理解蛋白质序列，结构和功能三者之间的关系。结构 蛋白质组学研究的主要内容包括：( 1 ) 预测蛋白质的三维空间结构；( 2 ) 从蛋白 质的序列和结构阐明其功能；( 3 ) 解释蛋白质与蛋白质之间的相互作用”1 。 蛋白质组学的分析方法在各国学者的努力下己取得了长足进展，但由于蛋白 质组本身具有成分复杂且量微等特点，要求其分析技术也应具有也应具有自动 化、超微量、高通量和高特异性等性能，目前的研究技术或多或少在这“四性” 上均存在着局限，有待创新和发展。同时，蛋白质组学是一信息学科，与基因组 学有着密切的联系，它们的产生发展形成了众多的数据库，并开发了相应的查询 工具和分析软件来对不同的蛋白质鉴定技术产生的数据进行同源性和差异性比 较，分析被测蛋白质的性质、结构和功能，但至今尚无一高级智能化的咨询工具， 今后如何使蛋白质组成分的“分离一鉴定一检索数据库”这一全过程能超微量、 高通量、赢特异性和全自动化的实施，是蛋白质级学中一个极富挑战性的课题和 亟待瓣浃静闻踅。穗德淹羞生穆技术豁发震添入和纳米技术豹兴起，将为凝自蒺 组分析技术的发展、党善或突破带来新的生机，从而为最终实现功能蛋白质组图 谱的建立提供有用工具0 1 。 1 2 2 人类蛋白质耋鼠计划 人类蛋白质组组织( h u p o ) 成立于2 0 0 1 年2 月，该缀织的宗酸怒倡导、 餐织久炎蛋自震缀诗翻，全覆簿谈久类基蠢缀。滚缀竣残立露，毙嚣囊动了人类 血浆、肝脏、脑等体液、器官的鬣白质组计划。 肝脓是人体的箱一大器官，是物质代谢、能量转换及供应的“枢纽”，是机 体蠹多耱菱要痿惑谣获分子兹燕羧氇”，天露媳综台整懿“垒浆亿学_ i 厂”，是秘 体内稃生能力最强的器官，在人类生命活动中占有重要地位。同时，肝脏又是淋 巴细胞以外最常见的瘸原体持续感染的场所，控制肝病的发生发展和提高肝病患 者赘生活藏量事关鬻计甏生，对溪代医学瘫赉了匿太豹撬黢。串藿是一令瓣薤病 多发国，其诊断和治疗仍然是医学届面临的重大难题。由中豳科学家破解熟致病 原因责溉旁贷。各国科学家包括我国科学家己缀认识到蛋白质组学将为全蕊认识 爵藏及箕疾病提供了新酶瑟史瞧掇遥，逶过深入静_ | l 手整蛋鑫漂组研究，必将发现 一批肝脏疾病的新型诊断标志物、药物作用靶标和创新药物，正因为如此，它己 成为全馓界竞争的焦点。 肝魅其有除大麓外最复杂鞠基因转录组，表达豹基鬣怒遘1 0 0 ，0 0 0 ，这些 基因编码的蛋白中的大多数尚无功能线索。北赢蛋白质组研究中心主任贺福初院 士领掰酶中国科学家团队于2 0 0 2 年率先提出了“人类脬脏蛋白质缒计划 ( h l p p ) ”，获褥瀚际学术同行酌认同与响应。这通过分褥入类肝醚组织蛋白质 组，寻找并解析与人是第一个人体组织器官的骚白质组计划，是中国倡导并领导 的第一个重大国际莓萼搜合作计划。 h l p p 韵战略强标是：主导入类第一个缝织、器官、缁德的蛋自袋缀计翔， 为人类所有组织、器官、细胞的鬣白质组计划掇供模式与示范；实现肝脏转录组、 野脏虽盔质组、盘浆臻皇质组的对接与整合；虢认或发现8 0 以上的人类餐自厦， 在蛋氨獗水平上全疆注解与验证人类基因组计划所预测静编码基嚣；借渤肝脏蛋 白质组与转录组数据，揭示人类转录、翻译水平的整体、群集调控规律；系统建 了 立肝脏“生理组”、“病理组”；探索并建立一批新的预防、诊断和治疗方法。其科 学目标是完成“二谱、二图、三库”任务：新思路和新方法建立符合国际标准的肝 脏标本库；构建蛋白质表达全谱和蛋白质修饰谱：绘制蛋白质相互作用连锁图和 细胞定位图；发展规模化抗体制备技术并建立肝脏蛋白质抗体库；建立完整的肝 脏蛋白质组数据库；寻找药物作用靶点和探索肝脏疾病防治诊治的方案。 123 研究蛋白质组学的常用技术和方法 1 2 3 1 双相凝胶电泳( t w o d e m e n s i o n a lg e le l e t r o p h o r e s i s ，2 d g e l ) 技术 2 d g e l 出现在1 9 7 5 年”3 ，是一项广泛应用于分离细胞、组织或其他生物样 品中蛋白质混合物的技术。它根据蛋白质的不同特点分两相分离蛋白质。第一相 是等电聚焦( i e f ) 电泳，根据蛋白质等电点的不同进行分离。i e f 时，蛋白质处 于一个p h 梯度中，在电场的作用下，蛋白质将移向其静电荷为零的点，静电荷 为正的蛋白将移向负极，静电荷为负的将移向正极，直到到达其等电点，如果蛋 白质在其等电点附近扩散，那么它将带上电荷重新移回等电点，这就是i e f 的聚 焦效应，它可以在等电点附近浓集蛋白，从而分离极微量的蛋白质。第二相是 s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) ，根据蛋白质的相对分子质量不同进行分 离。在s d s 一聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质相对分子质量的对数与它在胶中移动的距 离基本成线性关系”3 。经过2 d g e l 以后，二维平面上每一个点一般代表一种蛋 白质，这样成千种不同的蛋白即可被分离，有关蛋白质的等电点、相对分子质量 及每种蛋白的数量信息也可以得到“。 2 d g e l 是目前唯一的一种能溶解大量蛋白质并进行定量的方法，具有高通 量、重复性好、敏感性较高等优点“”1 。其缺点是由于蛋白表达水平的差异较大， 一些低丰度的蛋白不易检测”“。 1 2 3 2 质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y ) 技术 对2 d g e l 所产生的上千个蛋白用传统的方法如g d m a n 降解法等进行分析将 是一个很艰巨的任务，质谱技术的发展解决了这一难题。它需三个步骤，首先通 过离子化装置将分子转化为气态离子，接着通过质谱分析器按照质荷比的不同进 行分离，最后转化到离子检测装置。目前，用来分析蛋白质和肽的样品离子化技 术主要包括基质辅助激光解吸收离子化质谱( m a l d i ) 和电子喷射离子化质谱 ( e s i ) 。m a l d i 通常与飞行时间质谱( t o f ) 相结合，t o f 主要用来测量分析物飞过 固定的路径所需的时间。另一种鉴别蛋白质的方法是串联质谱( m s m s ) 。在这种 情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱分析，这样可得到肽序列 的部分信息“。 质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的相对分子质量、 氨基酸序列及翻译后的修饰。目前m s m s 是唯一能够迅速测序n 端封闭或共价修 饰肽段的方法“。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技术联用，对普通 的缓冲液成分相对耐受，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏“。在实际工作 中可将几种技术结合应用，如串联质谱与e d m a n 微测序技术相结合、m a l d i 质谱 与纳米电子喷射质谱相结合“。 1 2 3 3 蛋白质芯片( p r o t e i nc h i p ) 技术 蛋白质组学研究的另一重要技术是蛋白质芯片技术。基于功能的不同，它分 为分析芯片( a n a l y t i c a lm i c r o a r r a y ) 和功能性蛋白芯片( f u n c t i o n a lp r o t e i n m i c r o a r r a y ) 。前者是把一系列顺序排列的蛋白质特异性配体，主要是抗体，点 样到特殊性材料表面，监测蛋白质的差异表达、进行蛋白质的表达谱分析或者应 用于临床诊断、预后判断等等。后者是把蛋白质或蛋白质结构域点样到特殊性材 料表面，着重于解读复杂的细胞调控过程，比如：细胞凋亡、生长因子信号、细 胞间的信息交流等等。高特异性、高亲和性抗体的开发，齐全的、高纯度蛋白质 的表达以及新型特殊性材料表面的研究是目前大量开展蛋白质芯片技术有待解 决的问题。“” 1 3 蛋白质相互作用 1 3 1 蛋白质相互作用的意义 生命体的基本结构和功能的单位是细胞，而行使细胞结构和功能的单位是 蛋白质。尽管有一些蛋白质是以单体的形式发挥作用，但确有相当多的蛋白质是 通过与别的配体分子结合或作为大的多元复合物的一部分来参与细胞中的生命 活动。因此了解细胞的功能必须从在孤立情况下和在别的蛋白质相互作用的情况 下这两个层次上认识蛋白质的功能。由于细胞处于不断变化的过程中，使得对细 胞的功能研究更为复杂。一方面，内源性和外源性的信号都能诱使细胞的形状， 分裂状态，生活能力，代谢和别的内在特性发生改变。对于这些信号解释和应答， 都要求细胞中蛋白质的组成和细胞内蛋白质问的作用方式随时发生变化。细腿功 能努褥复杂；蓬豹另一令漂霆是生佘传懿掰有绥魏是不丽懿，对予离一个舔豹不秘 类型的细胞含有不同类型的蛋白质，对同样的外界刺激的反成鼹不一样的。同样， 同一类型的细胞在不同物种问，鬣囱质的组成和功能模式都谢很显著的差辩。 获褥簧自囊不潮方瑟翡信惑，对予了解邋耱复杂犍霆鬻有嗣的。对予任 何给定的鬣白质，这熄信息包括以下几个方面：( 1 ) 蛋白质的序列和结构，这些 信息可用予按照功能分桊和推测蛋白质相互作用的模式；( 2 ) 滠白质进化过程和 保守彦翔，这些信惠露利于确定一魏关键静残鍪：( 3 ) 蛋壹溪躺表达谱，镪括产 生该蛋白质的细胞类粼的丰度，以及在细胞进稷中蛋白质表达谱的变化：( 4 ) 蛋 白质在驻细胞中的定位以及与之关联的细胞器：( 5 ) 蛋白质翻译后修饰的方式， 包摇磷酸纯，糖基纯，乙酝纯等；( 6 ) 与其捐关遵翡其它蛋囱庚，鄯蛋自溪福互 作用图谱。实际上，上述前5 个方顾的信息决寇了该蛋白质的箔六个特征，即表 明相关功憩的蛋白质瞬间是以复合体的形式存擞的。因此，对一个蛋白质楗夏作 爝谱的认谚 是最终了繇细照中该蛋臼质豹功靛昭最重要静一步。“8 13 2 豳前研究蛋白箴相互作用的定要方法 l 。3 。2 1 免疫荚沉淀( i m m u n o p r e c i p a t i o n ) 免痰共沉淀的原理是当细胞在非变性条件下裂解时，完熬细胞内许多骚白质 依然以复合物的形式存在。如果蛋囱质x 用其抗体进行免疫沉淀，则细胞内与x 稳定结含麴蛋自蒺￥穗可麓被沉淀下来。蛋自麓y 静沉淀是蒸予与蛋自藤x 豹物 理性相瓦作用，因此免疫共沉淀可用于检测和确定生理条件下相关蛋白质问的相 互作用。这种方法最窜是用s v 4 0 大t 抗原的抗体和腺病毒e l a 的抗体来黢定与 病毒转化豹癌蛋自楣互佟丽靛宿主缡耱蛋自餍，褥至l 与之稳互 乍弱兹蛋鑫溪是瓣 瘤抑制鬣自p 5 3 和p r b “。 1 。3 2 。2 酵母双杂交系统( y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ，y 2 hs y s t e m ) 酵簿双杂交系绕( y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ) 是强裁辑究蛋蠢演组中蛋自 质之间相互作用的一个重要手段( 杨齐衡等) 。此系统是1 9 8 9 年，s o n g 和f i e l d 建立了籁个基于酵母静细胞内检测蛋白闻楣曩 乍用的遗传聚统。“1 。很多冀核生 物的位点特异转录激活西子通索熬有两个可分剿_ 开的结构域，邵d n a 结合域( d n a b i n d i n gd o m a i n ，b d ) 与转录激活域( t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o nd o m a i n ，a d ) 。 这两个结构域各具功能，互不影响。怛个完数的激活特定綦因畿达的激活因子 必矮嚣黠翕露这嚣个结构滚，否簧无法完成激滔功髓。不鞠寒源澈活透予靛黼 嚣与舶区终合嚣臻特舅镳激活麓鞠络合兹瑟鬻表达。基予懑个辣壤，霹将穗个 待测蛋囱分剐与这两个绻构域构建成融合蛋白，并熬表达于间一个酵母细胞内。 翔栗嚣个镑瓣蛋蠢阗耱发生稿蔓黪蠲，藏会逶避舞蛰淄蛋交粒褥浆终霆嫠鸯蚤与 鞠澎畿一个完整酌转录激滔西予并澈懑相应瓣报拳麓因袭遮。逶过对豢豢蒸藤 袭型的测定w 以很容易地知道待测蛋白分子间照否发生了相互馆用。见嘲； e 炙多 显基 聪锻熬灏 。3 辩母双絷交系统瓣基零藤瑾示慧鞭 醵薄双杂交系统鑫三个部努缀戚：( 1 ) 与酾融合静蛋蠢袭选载体，被表达 的蛋白称诱懈蛋白( b a i t ) ；( 2 ) 与a d 融合的蛋白表达载体，被麓液达的蟹岛：祢靶 蛋鑫( p r e y ) ；3 ) 警蠢一个或多令掇餐穗遨懿鬻主蘩拣。雾臻鹣擞裔基鑫鬻h i s 3 ， u r a 3 ，l a c z 和a d e 2 祷，黼酵母麓株粥基有相应酶缺陷型。敝杂交质粒上分剐带 有不圜瓣撼性基医和营养标记基阈，这些有利予实验后期杂交攒粒的撩宠与分 离；搽攥这耱转录嚣予鬟擒激滔疆蠢繁邈转漾镌瓢邂，人翻愁经笈袋了爨鏊双絷 交系统。6 。”和哺乳韵物双杂交蕊统。根据懿前通用的系统中釉来源的不同主 要分必g a l 4 系统秘l e x a 系统，嚣卷围其髓来源予原核生物，焱冀核生甥内缺少 爨懑戆，戮魏胃强减少徽麓注鲮逛臻。 出于该技术存程假阳性和骰阴性问题，有魏细胞关键蟹岛威也不适予霜该法 分梗，罄定的蛋白威之游耀互l 乍滕还必须用其它方法予以证实，露则会谈入蛟途a 尽誊麴_ | 避，该按术熬发袋与截毅，在骚鑫蔟鬻褪互 誊羁磅炎、终选瑟蛋爨襄、搿 究蛋自质功能等诸多方磷发挥着煎要作用；为建立有视体的全部嚣白质( 鬣岛璇 组组分) 的相互作用及其功能关系图谱提供了基础条件，在没有更好的方法问世 之前，该技术仍是开展这类研究的有力工具( 詹显全，陈主初等) 。 1 3 2 3 噬菌体展示( p h a g ed i s p l a y ) 技术 噬菌体展示技术是噬菌体表面展示技术，是一种对多肽功能非常有效的筛选 技术，即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到f 1 或m 1 3 丝状噬菌体基因组中， 与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面啪1 。一组随机多肽编码序 列或基因群体插入噬菌体展示载体，形成噬菌体展示文库。”。每个噬菌体粒子只 展示一种序列的外源肽链，不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链。目前，利 用噬菌体展示技术构建随机肽库、蛋白质库和抗体库研究受体或抗体的结合位置， 改造和提高蛋白质、酶和抗体的生物学和免疫学属性，研究用于检测治疗用途的 新型多肽药物、疫苗和抗体等，都具有广阔的应用前景o 。 1 3 2 4 荧光共振能量转移( f l u o r e s e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 显微成像技术 f r e t 是一个非辐射的，偶极一偶极耦合的过程，在这个过程中电子激发能从 供体荧光分子向极近距离的( 典型距离是l o n m 以内) 受体荧光分子转移。这样， 供体分子激发后可导致受体分子受激发射。蛋白质既可以与遗传编码的g f p 突变 体融合，也可以用合成的荧光分子共价结合进行化学修饰瞌9 1 ，这样蛋白质分子间 的相互作用就可以利用荧光分子间的f r e t 现象进行推断。荧光能量转移的效率 是受供体与受体之间的距离( r 。值是发生5 0 能量转移的分子距离) 影响的。 用f r e t 研究蛋白质相互作用时，要得到理想的r 。值，在选择荧光分子对时需要 注意两个因素：( 1 ) 供体荧光的量子产出量：( 2 ) 供体发射光谱与受体发射光谱 的重叠的多少。目前用f r e t 研究蛋白质相互作用都是选择g f p 突变体作为分子 对来进行检测。g f p 有许多蓝移和红移的工程突变体，如青色( c f p ) 和黄色( y f p ) 荧光蛋白。增强型的青色荧光和增强型的黄色荧光是一对理想的可遗传分子，这 对分子的r 。值为4 9 n m 1 ，则f r e t 的距离是1 6r 0 _ 7 8 n m 。r 。值越大，f r e t 可 检测的有效距离越大，然而r 。值不超过7 n m ，即f r e t 可检测的距离限制为1 i n m 。 在实际操作中，还需要考虑蛋白质分子的平均大小，一般分子量小于i o o k d 的蛋 白质间发生相互作用时，蛋白质分子上的荧光分子对之间可能产生f r e t ，而大 于2 0 0 k d 的球蛋白上荧光蛋白对之间发生f r e t 的可能性很小。”3 。目前f r e t 技术 已广泛用于研究胞内及跨膜蛋白的磷酸化过程，蛋白质在胞内的折叠川】，蛋白 质之间的相互作用。 1 3 2 5 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 技术 a f m 从扫描隧道显微镜( s t m ) 演变而来，最初是作为一种成像工具而设计 的。a f m 在对样品进行扫描的过程中弹性悬臂随样品表面形貌而偏折，通过将 悬臂偏折转化为表面高度起伏，从而获得原予级分辨率的表面形貌图像。a f m 还 能以力扫描方式进行操作，它能以单分子水平的分辨率测量两相对表面之间的作 用力。在配体一受体间作用力研究中，配体固定在a f m 的弹性悬臂表面，受体被 固定于适当的基底表面，首先悬臂与基底接触，随后悬臂离开直至结合键断裂。 在测量的过程中，一束激光照在悬臂表面，悬臂受力偏折引起激光反射角度的改 变，这种角度改变信号由光二极管接受并放大后输入计算机进行分析，从而可测 量配体和受体之间的作用力。最近出现了将配体和受体间作用力测量与a f m 的成 像功能结合起来，将特异性受体或配体固定于探针悬臂，a f m 可以提供一幅粘附 图，从而能够反映配体一受体结合在细胞表面的分布密度。“。另外，a f m 还能用来 研究细胞一细胞间的黏附作用。“。 1 3 2 6 表面等离子体共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 技术 s p r 是一种光学共振效应，当表面等离子波在金属液体界面激发时，光线 直射表面的边缘并反射回去，不与样品接触。s p r 将在特定的角度和波长的组合 下使反射光强度下降，生物分子结合事件导致表面层折射指数变化，进而以s p r 信号变化的形式检出。 表面等离子体共振生物传感器是利用表面等离子体共振现象和s p r 谱峰对 金属表面上电介质变化敏感的特点，通过将受体蛋白固定在金属膜上，检测受体 蛋白与液相中配体蛋白的特异性结合。s p r 技术的特点是测定快速、安全、不需 标记物或染料及灵敏度高。其除了应用于检测蛋白质一蛋白质外，还可检测蛋白质 一核酸及其他生物大分子之间的相互作用，并且能对整个反应过程进行实时监测 。因此，s p r 技术在检测生物大分子特异性相互作用上比传统的方法更具优势， 其对基础理论、医学诊断及治疗等都具有十分重要的意义”3 。 1 3 2 7 串联亲和纯化一质谱( t a n d o ma f f i n i t yp u r i f i c a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y ，t a p - m s ) 技术 t a p m s 技术是激遮箍密霜予豢爨质复合傣缝纯以及鉴定鬻自矮稳互佧蠲戆 新策略。”。它将靶蛋白喊诱饵蛋白与两个蛋白质标签融合并在天然宿主细胞躐生 物体中进行表达。从这嫂宿主细胞或生物体中制蛋提取物，然朦采用标准的两步 纯纯方法霪获鞋蛋警搬褶关静鞠互馋爱豹缍分。共缝纯螽静蚤秘覆滢舍貔可经凝 胶分离，消化，最后用质谱进行分析和鉴定，找到与靶蛋白相互作用的新组分。 t a p - m s 常用的橼靛有f l a g 呻1 ，h i s “，葡萄球菌蛋白a 的两个免疫球骚自 i g g 结含薄位( p r o t a ) 3 ，钙调蛋酝结合魏( c b p ) “”，c h i t i n 一结合结稳壤( c b d ) “。p r o t a 和c b p 是最为有效的标髂，分别具有溉8 0 和5 0 的靶复合物重获率。 实验表明，一步纯化法并不足以从细腿总粳提物中重获高纯度的蛋白质，因此一 般在耗滋囱豹n 溃或e 端依次融合p r o t a 编璃侉捌，蛋自酶t e v 识魏位煮，c b p 编码序列，通过四步简效特异的结食和洗脱过程，可将靶蛋白及其复合物纯化出 来3 。出予t a p 技术熬和了m s 技术，即使纯化岛掇其微量的爱鑫质也可以遴过 高灵敏震的质谱鉴是滋来，困踅t a p - m s 技米毪筛选和鉴定蛋白震相互 筝溺这方 面有良好的前景“。 1 3 ，2 。8g s t 融会蛋国技术 鲁弓l 入谷肮甘酝s 一转移酶( g l u t a n t h i o n e s - t r a n s f e r a s e g s t ) 融合蛋 白作为细菌合成重组灏白的工具“”以来，g s t 融仑蛋白技术已的到广泛应阁，如：