（生物化学与分子生物学专业论文）一种新型mirna功能测定系统的建立.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 一种新型m i r n a 功能测定系统的建立 摘要 m i c r o r n a ( m i r n a ) 是一类1 9 2 5 b p 内源非编码小r n a ，在真核生物中普遍存在。 多数m i r n a 采用型启动子起始转录，转录产物在加工成熟过程中依次经历了三种主要 形式：初级转录产物p r i m a r ym i r n a ( p r i m i r n a ) ，发卡状前体( p r e c u r s o rm i r n a , p r e m i r n a ) ，和成熟体m i r n a ( m a t u r em i r n a ) 。目前有关m i r n a 功能的研究主要证实 其成熟体对靶标基因的表达起负调控作用。 常用的m i r n a 的研究方法主要是功能缺失或获得实验。测定待研究的m i r n a 的效应可 以在表达该m i r n a 的细胞系或不表达该m i r n a 的细胞系中分别进行。对于前者可以通过使 用甲基修饰的反义寡核苷酸敲除该m i r n a ，抑制它的功能活性。对于后者则可以通过转染 化学合成的m i r n a 或转染m i r n a 表达载体，实现该m i r n a 功能的增强或获得。直接转染 化学合成的m i r n a 对进行一般的研究工作固然方便快捷，但费用高、转染效果维持短暂， 这对满足长周期体外体内实验的要求，适应未来应用于临床治疗等方面都不如m i r n a 表达 载体。 目前文献中报导使用过的m i r n a 表达载体，按照载体直接转录出的m i r n a 的形式划 分，大致有以下三类，即p r i m a r ym i r n a 载体，p r e c u r s o rm i r n a 载体，和m a t u r em i r n a 载 体，这些载体各自的转录产物依次进入内源m i r n a 加工成熟过程的不同阶段，利用内源 m i r n a 加工成熟通路及内源m i r n a 行施功能的机制，来实现外源m i r n a 的表达与功能。 对这三类载体转录产生外源m i r n a 的效率，对内源m i r n a 的产生及功能的影响，对外源 m i r n a 是否能完全模拟内源m i r n a 而被整合进入m i r i s c 等各方面的集中比较分析鲜见 报道。 本实验起初为了能够找到m i r n a 的最佳表达载体以及构建特定m i r n a 靶标基因检测 系统，依据相关文献报导结合s h r n a 的设计原理，以人类m i r n al e t 7 a 为代表，依次构 建出p r i m i r n a 载体，模仿s h r n a 的p r e m i r n a 载体，和m a t u r em i r n a 载体，以及含有 l e t 7 a 靶点的荧光效应元件，希望通过分析比较三种形式的m i r n a 表达载体对含l e t 7 a 靶 标h m g a 23 末端非翻译区( h m g a 23 u t r ) 的荧光效应元件的抑制效果及程度，来初 步寻找最佳的m i r n a 表达载体以及构建l e t 7 a 靶标基因3 u t r 的检测系统。但在实验过 程中发现没有合适的细胞系能够作为工具性细胞系，即不对含h m g a 2 3 u t r 的荧光效应 】 浙江理工大学硕士学位论文 元件产生内源性干扰。为了解决这一矛盾，找到m i r n a 荧光效应元件不受细胞系内源性 m i r n a 表达谱影响的方法，突破细胞系的种类对检测特定m i r n a 的限制，产生具有普遍 适用性的细胞系，我们采用r n a i 的方法，直接敲除内源m i r n a 加工成熟通路上的关键 蛋白( 但避开外源m i r n a 加工成熟所需的蛋白) ，或直接特异性敲除内源1 e t 7 a ，尝试构 建减少细胞内源m i r n a 背景对荧光效应元件影响的一种新型的m i r n a 功能测定系统，以 期在这样一个检测系统内对不同形式的m i r n al e t 7 a 表达载体表达外源l e t 一7 a 的效率进行 评价。 ， 在h e l a 细胞系内我们初步完成了对这一工作的前期准备和探讨研究。通过实验的方法 证实了在h e l a 细胞系中我们自行设计的用于r n a i 敲除实验的基础载体质粒p c d n a 3 h 1 和s h r n a 表达框架是成功的，可以用于进行干扰内源蛋白或干扰内源m i r n a 表达的实验。 通过r n a i 实验，发现p c d n a 3 h 1 s h arl e t 7 a 对含有h m g a 23 u t r 的荧光效应元件 恢复荧光的效果最好。但是荧光恢复的程度相对比较微弱，这对我们今后要进一步对该系 统进行改造，提高荧光恢复的强度和效率提出了要求。 关键词：m i r n a ，l e t 7 a ，m i r n a 表达载体，h m g a 23 末端非翻译i 叉( h m g a 23 u t r ) ， 荧光效应原件， 2 浙江理工大学硕士学位论文 e s t a b l i s h m e n to fn o v e ls y s t e mf o rd e t e r m i n a t i o no ff u n c t i o n so f m i r n a a b s t r a c t m i r n a s ( m i r n a s ) a r ee n d o g e n o u s s m a l l n o n c o d i n gr n a s ( 1 9 2 5 n u c l e o t i d e s ) ，t h a t u n i v e r s a l l ye x i s ti ne u k a r y o t e s ，a n dd o w n r e g u l a t em a n yt a r g e tm r n a s m o s to fr n i r n a sa r e t r a n s c r i p t e db yr n ap o l y m e r a s ei i ，a n dt h et r a n s c r i p t su n d e r g oas e q u e n t i a lm a t u r a t i o np r o c e s s ： t h ep r i m a r yt r a n s c r i p t s ( p r i m i r n a ) ，t h ep r e c u r s o rm i r n a ( p r e m i r n a ) ，a n dt h em a t u r e m i r n a i ti sac o m m o nm e t h o dt od os o m - er e s e a r c h e so nm i r n a sa p p l y i n gf u n c t i o nl o s i n go rg a i n e x p e r i m e n t t e s t sf o re f f e c t so ft h em i r n a u n d e rs t u d yc a l lb ed o n ee i t h e ri nac e l ll i n et h a t e x p r e s st h em i r n a o ri nac e l ll i n e t h a td o e sn o te x p r e s st h em i r n a i nt h ef o r m e rc a s e ， i n h i b i t i o no fe n d o g e n o u sm i r n aa c t i v i t yc a l lb eg a i n e db yu s i n ga n t i s e n s e2 一0 一m e t h y l o l i g o n u c l e o t i d e s ；i nt h el a t t e ro n e ，g a i no rr e i n f o r c e m e n tt h em i r n aa c t i v i t yu n d e rs t u d yc a nb e a c h i e v e db yt r a n s f e c t i n gc h e m i c a l l ys y n t h e s i z e dm i r n ao rm i r n ae x p r e s s i o nv e c t o r i ti s c o n v e n i e n c et ou s et h ec h e m i c a l l ys y n t h e s i sm i r n ai nf u n c t i o ng a i ne x p e r i m e n t s ，h o w e v e ri t c o s tal o ta n dt h ee f f e c to ft r a n s f e c t i o ni st r a n s i e n t t h e r e f o r e ，i tc a n tf i tt h en e e dw e l lf o ral o n g t i m ee x p e r i m e n ti nv i v oo ri nv i t r o ，o rt h ea p p l i c a t i o ni nt h ef u t u r ec l i n i c a lt h e r a p y , o nt h e c o n t r a r y , w h i c hi sj u s tt h ea d v a n t a g e so fm i r n ae x p r e s s i o nv e c t o l a tp r e s e n tt h e r ea r em a i n l yt h r e ec l a s s e so fm i r n ae x p r e s s i o nv e c t o ra c c o r d i n gt ot h ef o r m o fd i r e c tt r a n s c r i p t so ft h e s ev e c t o r s ，t h e ya r er e s p e c t i v e l yp r i m i r n av e c t o r , p r e - m i r n av e c t o l a n dm a t u r em i r n av e c t o r , t h et r a n s c r i p t so fw h i c hs e q u e n t i a l l ye n t e rt h ed i f f e r e n ts t a g eo f p a t h w a yf o re n d o g e n o u sm i r n ap r o c e s s i n g ，e m p l o y i n gt h em e c h a n i s mf o re n d o g e n o u sm i r n a p r o c e s s i n ga n df u n c t i o n i n g ，a n d t h e n f u l f i l l i n g t h ee x p r e s s i o na n df u n c t i o no fe x o g e n o u s m i r n a s c o m p a r a t i v ea n a l y s e so ns u c ht h r e em i r n ae x p r e s s i o nv e c t o r sa r er a r e l yr e p o r t e d ，s u c ha s p r o d u c i n ge f f i c i e n c yf o re x o g e n o u sm a t u r em i r n a ，s i d ee f f e c t so nt h ep a t h w a yf o re n d o g e n o u s 3 浙江理工大学硕士学位论文 m i r n a p r o c e s s i n ga n df u n c t i o n ，a n dp r o b l e m se x i s t i n gi ni n c o r p o r a t i o no fe x o g e n o u sm i r n a s i n t ot h em i r i s c ，e t c i no r d e rt of i n do u tt h eb e s tm i r n a e x p r e s s i o nv e c t o ra n de s t a b l i s h i n gt h e s y s t e mt od e t e c tt h em i r n at a r g r tg e n e s ，w em a k em i r n a l e t - 7 aa sar e p r e s e n t a t i v et oc o n s t r u c t t h r e ek i n d so fm i r n ae x p r e s s i o nv e c t o r , r e s p e c t i v e l ye x p r e s s i n gp r i - m i r n a ，p r e - m i r n a i m i t a t i n gs h r n a , a n dm a t u r em i r n a b e s i d e s ，w ea l s oc o n s t r u c tv e c t o r sa sf l u o r e s c e n te f f e c t e l e m e n t sf o rd e t e c t i n gl e t - 7 a i n h i b i t i n gt h ef l u o r e s c e n c ew h i c hi st h ep r o d u c to ft h ef l u o r e s c e n t e f f e c te l e m e n tw i l ls u g g e s tt h a tm i r n ae x p r e s s i o nv e c t o r sw o r ki ns u c has y s t e m ，a n dt h e i n t e n s i t yo fi n h i b i t i o nw i l lb ea sas t a n d a r dt oe v a l u a t et h ee f f i c i e n c yf o rt h et h r e em i r n a e x p r e s s i o nv e c t o r s u n e x p e c t e d l y , w ef i n dw ec o u l d n te a s i l yr e a l i z eo u re x p e r i m e n tp l a n ，f o rw ec o u l d n tf i n da w o r k i n gc e l ll i n ew h o s ei t s e l fe n d o g e n o u sc e l lc o n t e x td o s e n ti n t e r f e r ew i t ht h ef l u o r e s c e n t e f f e c te l e m e n tw o r k i n g t os o l v et h i sp r o b l e ma n dt of i n dam e t h o dp r o d u c i n gau n i v e r s a lc e l l l i n e ，w ee m p l o yr n a it e c h n i q u et ok n o c k d o w nt h ek e yp r o t e i n sl o c a t i n gi nt h ep a t h w a yf o r e n d o g e n o u sm i r n ap r o c e s s i n g ，o rs p e c i f i ck n o c k d o w nt h ee n d o g e n o u sl e t - 7 a ，a n dt r yt o e s t a b l i s han o v f ls y s t e mf o rd e t e r m i n a t i o no ff u n c t i o n so fm i r n at w h i c hc a ne v a l u a t et h e e f f i c i e n c yo fd i f f e r e n tm i r n ae x p r e s s i o nv e c t o r sw i t h o u ti n t e r f e r e db y t h ew o r k i n gc e l l e n d o g e n o u sm i r n ap r o f i l e w eh a v e b e e ne s t a b l i s h e da p r i m a r ys u c hn o v a ls y s t e mi nh e l ac e l l i th a sb e e na p p r o v e dt h a t t h ee l e m e n t si nt h i ss y s t e mw o r kw e l l t h er n a i a p p l y i n gb a s i cp l a s m i dp c d n a 3 一h 1a n dt h e s h r n a e x p r e s s i o nf r a m es u c c e e di nr n ai n t e r f e r i n g ( r n a i ) e x p e r i m e n t sf o rk n o c k d o w n i n gt h e e n d o g e n o u sp r o t e i n s o re n d o g e n o u sm i r n a , a n dt h ep l a s m i dp c d n a 3 - h 1 - s h a r - 7 ah a st h e b e s te f f e c to nr e c o v e r i n gt h ef l u o r e s c e n c eo ft h ef l u o r e s c e n te f f e c te l e m e n tc o n t a i n i n gt h e h m g a 23 u t rs e q u e n c e h o w e v e r , t h er e c o v e r e df l u o r e s c e n c ei s r e l a t i v e l yw e a k a n di t r e q u i r e sf u r t h e ri m p r o v e m e n tf o rt h i ss y s t e mt og e tah i g h e ri n t e n s i t ya n de f f i c i e n c yf o rt h e f l u o r e s c e n c er e c o v e r i n g k e yw o r d s ：m i r n a , l e t - 7 a ，m i r n ae x p r e s s i o nv e c t o r , f l u o r e n s c e n te f f e c te l e m e n t ，h m g a 2 3 u t r 4 髫艮 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：猫 日期： 姗年；月二午日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后使用本版权书。 不保密口 。 学位论文作者签名：烫秦 f i 期：夕卅吃年月) 牛一日 指导教师签名：拽迪、 日期：。1 年、月斗闩 浙江理工大学硕士学位论文 前言 m i c r o r n a s ( m i r n a s ) 是一类长1 9 2 5 b p 的内源性非编码r n a ，普遍存在于真核细 胞中，它们对细胞内一系列生命活动事件产生了普遍而广泛的影响，承担着基因调控者的 作用。自2 0 0 0 年发现第二个m i r n a l e t 7 以来，对m i r n a 的研究进入了高潮，目前出现 在n c b i 上以m i r n a 为关键词的文章以每周2 0 3 0 篇的速度大量涌现，不容置疑m i r n a 已经成为当代生物学研究的焦点和热点。对m i r n a 的研究包含的内容纷繁复杂，大致上 可分为m i r n a 自身的转录调控，m i r n a 抑制基因表达的机理与过程，m i r n a 靶标位点 的预测和分析，特殊种类m i r n a 的功能和应用，m i r n a 与细胞内其它调控元件或调控网 络之间的关系和作用，m i r n a 对细胞新陈代谢各类生命活动的影响和干预。对m i r n a 的 研究手段也从早期的单基因单通路，向大通量、多元化的方向发展，这种高通量的研究特 点也使生物信息学的发展和应用成为当代m i r n a 研究不可或缺的组成部分。尽管在 m i r n a 研究领域新发现、新资料层出不穷，但即使是m i r n a 研究之初就已公认的m i r n a 抑制翻译这一现象的作用机理迄今依然不清楚，没有获得统一认可的最基本的分子机制模 型。如此来看虽然m i r n a 已经被深入研究分析，但对它们的了解仍然是远远不足够的， 我们如何能在这样一个竞争激烈的国内外研究浪潮中找到合适自己的研究内容和方向，机 遇与风险并存。 m i r n a 研究概述 目前m i r n a 已经被认为是一大类通用的基因调控因子。例如2 0 0 7 年8 月份最新发布 的m i r n a 数据库m i r b a s es e q u e n c ed a r a b a s er e l e a s e1 0 0 ( h t t p ：m i c r o m a s a n g e r a c u k ) 中已经列出了8 5 1 条不同的人类基因组编码m i r n a 。经生物信息学的分析预测人类编码蛋 白的基因中大概有三分之一是m i r n a 调控的靶标，并且一种m i r n a 可调控上百条基因的 表达，而同一条基因又可接受若干种不同m i r n a 的调节【1 3 】。如此看来m i r n a 涉及到的 是一个错综复杂的的网络体系。 m i r n a 是一段2 0 b p 上下的非编码r n a ，接受i i 型或i i i 型启动子的转录调控【4 ，5 1 。包 括l e t 7 在内的多数m i r n a 是由i i 型r n a 聚合酶转录的，形成的初级转录产物p r i m a r y m i r n a ( p r i m i r n a ) 5 端有帽，3 端有多聚腺苷酸尾。p r i m i r n a 在细胞核内经 d r o s h a d g c r 8 等蛋白及因子组成的微处理器( m i c r o p r o c e s s o r ) 加工剪切形成七十到八十 个碱基大小的前体转录产物p r e c u r s o rm i r n a ( p r e m i r n a ) 6 - 8 】，p r e m i r n a 经 浙江理工大学硕士学位论文 e x p o r t i n 5 e n g t p 组成的核膜通道出核f 9 】，在细胞质内由d i c e r 剪切成为具有成熟体结构的 双链m i r n a ( g u i d es t r a n d p a s s e n g e rs t r a n d ) ，然后只有g u i d es t r a n d 被选择进入由a g o ， t r b p 等蛋白组成的m i r i s c 复合体，行使功能【1 叭3 1 。如果g u i d es t r a n d 与靶标m r n a 完全 互补，则可能在特定位点诱导靶m r n a 裂解【1 4 ，1 5 】；如果只有g u i d es t r a n d5 端第2 到第8 位( 或第7 位) 碱基( 称为m i r n a 的种籽序列s e e ds e q u e n c e ) 与靶标m r n a3 端非翻译 区( 3 u t r ) 互幸b ，即不完全互补配对，则抑制m r n a 转录或翻译。 1 6 - 2 3 】 虽然m i r n a 也具有裂解靶m r n a 的能力，但鉴于人类基因组中编码蛋白的m r n a 通 常缺乏与m i r n a 完全互补的位点，所以对m i r n a 如何下调基因表达的机理的研究通常集 中于不完全互补配对时m i r n a 的功能。因为m i r n a 通过靶标基因3 u t r 区抑制基因表 达的机理，因不同细胞，不同受测m i r n a ，以及不同研究方法和研究重点而异，所以迄今 为止也没有建立起统一的分子机制模型来解释这一现象。据相关文献报导，m i r n a 通过 3 u t r 区抑制基因表达的机制大体有以下几种： ( 1 ) 通过p b o d i e s 抑制翻译：在哺乳动物的细胞质里，存在一种称为处理体( p r o c e s s i n g b o d i e s ，p b o d i e s ) 的细胞器。a r g o n a u t e 蛋白一r n a 干扰效应器复合体( r n a i n t e r f e r e n c e e f f e c t o rc o m p l e x 。r i s c ) 的标志性组分，就定位在p b o d i e s 上。内源m i r n a l e t 7 的靶标m r n a , 模拟m i r n a 功能的外源c x c r 4s i r n a 的报告m r n a , 都以依赖m i r n a 的方式聚集在 p b o d i e s 内。这种m i r n a 功z 月匕l - - , 和p b o d i e s 之间的联系暗示了由r i s c 运送m r n a 到p b o d i e s 弓i 起的翻译抑制，但是这种抑制翻译的现象，既可能是抑制蛋白质合成的起因也可能是抑制 蛋白质合成的结果【2 4 1 。其后有报导进一步发现，p c k p 5 4 ，一种d e a d 盒解螺旋酶，在体内 直接和a g o l ，a 9 0 2 作用，促进p - b o d i e s 的形成，普遍引起翻译的抑制。敲除p c k p 5 4 ，就破 坏t p b o d i e s 的结构，驱使a 9 0 2 遍布于细胞质中，虽然实验结果显示这对s i r n a 介导的裂解 靶m r n a 没有显著的干扰，但却缓解了普遍存在的由l e t 7 介导的翻译抑制。由此作者认为 翻译的抑制是p c i ( p 5 4 通过影响m i r i s c 的功能实现的1 2 2 1 。 ( 2 ) 直接抑制翻译的起始在人类细胞内l e t 7m i r i s c 复合体中t 拘a r g o n a u t e 蛋白抑制翻译 的起始。m i r i s c 对翻译起始的抑制作用可能是其干扰了翻译因子对m r n a 5 端7 甲基鸟嘧 啶帽结构的识别。【2 5 ，2 6 】 ( 3 ) 加速p o l y a 降解，l e t 7 a 与含有不完全互补序列的靶m r n a 结合，加速3 端p o l y a l 拘 切除，这是起始靶m r n a 降解的第一步。p o l y a 的缺失利于靶m r n a 的降解。值得注意的 是m i r n a 加速p o l y a 降解并不依赖m r n a 的翻译过程，m i r n a 不需要p o l y a 的降解也可 以下调m r n a 翻译的效率【2 1 1 。 7 浙江理工大学硕士学位论文 ( 4 ) 阻断p o l y m o s o m e 多聚核糖体的活性：l e t 7 a 强烈抑制含l i n 4 13 u t r 的报告m r n a 的 翻译。通过蔗糖密度梯度离心，多聚核糖体，伴随多聚核糖体的m i r n a l e t 7 a ，m i r i s c 蛋 白a g o ，以及连有l i n 4 13 u t r 的报告m r n a 共同沉淀，若再用嘌呤霉素处理，多聚核糖体 结构就解体了。含有l i n 4 13 u t r ，5 u t r 铁离子反应元件( i r o nr e s p o n s ee l e m e n t ) 的r n a ， 当细胞与铁离子共同孵育时，该m r n a 与多聚核糖体一同沉淀，但是当铁离子被螯合，核 糖体就会脱靶。这意味着l e t 7 am i r n a 对正在翻译中的核糖体有抑制作用i 矧。 通过上述对m i r n a 抑制翻译过程的研究，得出的m i r n a 抑制翻译的机制在实际的 m i r n a 抑制翻译的过程中可能是单独起作用，也可能是多过程有序的结合。机体进行代谢 调节既复杂精细又适应环境需要，m i r n a 抑制翻译的不同层面，既可相互独立，又可彼此 联系，可能用以适应处理不同信号所传达的信息。如p b o d i e s o p 可降解与m i r n a 结合的靶 m r n a , 又可作为暂时储存该m r n a 的细胞器【1 4 】；加速靶m r n a 的p o l y a 降解，会启动一个 不可逆的降解m r n a 的过程，也是一个不可逆的抑制翻译的过程，这个过程是否会和 p b o d i e s 降解而不是储存靶m r n a 的过程有联系? 当大量的实验证据开始逐一揭示m i r n a 抑制翻译过程的诸多细节时，新的问题也在一个接一个的产生。除了对已知的抑制基因表 达问题的探索以外，目前最令人感兴趣的莫过于m i r n a 与靶标基因之间的关系是否也存在 正调控现象，即促进靶基因的表达? 少数一些研究对此做出了肯定的答复。早在2 0 0 5 年 s c i e n c e - - 项关于肝脏特异性m i r 1 2 2 a 的研究发现，m i r 1 2 2 a 作用于丙肝病毒h c v 基因组5 非翻译区，对h c v 的复制起正调控作用【2 7 】；今年十二月份的s c i e n c e 贝, l j 报导了一项有关 m i r n a 正调控作用的突破性研究进展，在细胞周期受到抑制时，m i r n a 普遍上调3 u t r 含 a u r i c he l e m e n t s ( a r e s ) l 拘靶标基因的表达，但是当细胞处于增生状态时则抑制这些靶标基 因的翻译【2 8 】。m i r n a 与基因表达的关系因细胞状态的不同出现或上调或下调的关系，令原 本已经复杂的m i r n a 调控基因表达的现象变得更加奇妙，极大扩展了m i r n a 作为基因表达 调控者的功能。 在对m i r n a 的转录调控，作用机理进行研究的同时，对单个m i r n a 或全体m i r n a 的 生物学功能的研究也在如火如荼的进行。研究发现m i r n a 参与生命体生理活动的一系列过 程，生长发育，疾病肿瘤，物质代谢，免疫防御等。通过大通量的研究手段结合生物信息 学的研究分析，针对m i r n a 在基因组中的分布特点，转录模式，靶点预测，功能作用，不 同生物调控网络间的交互模式等方面进行的研究，从宏观上揭示了m i r n a 的部分功能作用 机理并为今后m i r n a 的研究方向予以指导。 g r o r g e a d r i a nc a l i ne ta l 和l i nz h a n ge ta l 在研究m i r n a 与癌症之间的联系时，分别 8 浙江理工大学硕士学位论文 研究了m i r n a 在基因组中的定位和m i r n a 基因在基因组中拷贝数的改变，确定了m i r n a 与肿瘤发生之间存在基因组结构学基础【7 2 9 1 。研究发现m i r n a 基因常常位于染色体脆性位 点，此外还存在于含杂合性缺失的最小区域，最小扩增子区域，或常见的断裂点区域。被 分析的1 8 6 个m i r n a 中有9 8 个( 5 2 5 ) m i r n a 基因位于癌症相关的区域或脆性位点。在对 上皮组织起源的癌症进行研究时发现，2 8 3 个已知人类m i r n a 基因中，m i r n a 基因拷贝数 的改变在乳腺癌中占7 2 8 ，在卵巢癌中占3 7 1 ，在黑色素瘤中占8 5 9 。尽管不同类型 的肿瘤涉及m i r n a 的基因组改变不同，但一些异常的m i r n a 基因组改变在三类肿瘤中是相 同的。许多m i r n a 基因拷贝数的改变与m i r n a 转录水平相关，但也有许多m i r n a 的转录 水平与基因拷贝数目的改变不一致，这可能涉及到另外的一些因素参与形成肿瘤m i r n a 表 达谱紊乱。 在对m i r n a 的转录组进行研究时发现，当若干条不同的m i r n a 基因紧邻成簇时，它们 通常共同表达，有代表性的产生于同一个转录本内；但当彼此间的距离超过5 0 k b 时，它们 的相关性则出现剧变。另外内含子m i r n a 常和它们的宿主基因m r n a 一起表达，这也意味 着它们起源于同一个转录本，这样就可以对内含子m i r n a 的表达进行时空定位，从而对 m i r n a 发挥作用的细胞背景进行研究1 3 0 1 7 , 3 1 】。在对细胞整体m i r n a 转录后水平调节的研究 中发现，m i r n a 经不同加工途径成熟，使m i r n a 的表达具有组织和发育特异性。一篇以 m i r 1 3 8 为研究对象的文章发现，成熟m i r 1 3 8 的表达具有组织细胞特异性，但它的前体 p r e m i r 1 3 8 2 的表达却具有普遍性，前体在加工成熟的过程中受时空调控，有抑制因子阻 止它受d i c e r 处理为成熟m i r n a 1 3 8 3 2 , 3 3 】。除了 d i c e r 受到转录后调控外，研究l e t 7 的文章揭 示了d r o s h a 和与p r i 1 e t 7 、p r e 1 e t 7 结合的不同复合体对产生成熟l e t 7 的影响。在小鼠发育阶 段的早期，许多p r i m i r n a , 包括l e t 7 家族，富集却不被d r o s h a 酶加工处理。而在原发性肿 瘤中观察到的广泛的m i r n a 表达水平下调可能部分是源于d r o s h a 加工处理过程的失败【3 3 1 。 通过删除d i c e r 抑制所有m i r n a 的表达，揭示m i r n a 不是决定发育分化的关键性调控 因子，它们只是作为一种授予遗传基因表达稳健性的微调因子【3 4 , 3 5 】。近来有人通过果蝇实 验证实，提出一种假设认为m i r n a 是遗传网络的一部分，发挥前馈环路的作用。这种前馈 环路维持了发育程序的保真度，而不是起始发育转变，通过授予稳健性防止转录遗漏，缓 冲遗传噪音【3 6 l 。在上述模型中m i r n a 矛i l 它们含有保守结合位点的靶标呈现相互排斥的表 达模式，这意味着m i r n a 弄d 它们的靶标在空间和时间相邻的组织中分别高度表达，但它们 彼此排斥出现在同一组织内，暗示了 m i r n a 阻止多余的，遗漏的转录本的错误表达1 3 7 1 。 实验和生物信息学研究表明，m i r n a 在基因表达调控中的作用是相当复杂的，比如能够 q 浙江理工大学硕士学位论文 同时调节数以百计的靶基因【1 。3 1 。早期对线虫的研究认为m i r n a 起到发育开关的作用，通 过与靶m r n a 3 非翻译区多个l e t 7 结合位点结合，关闭一些对线虫不同发育阶段转变起决 定性作用的靶基因的表达，但近期研究表明m i r n a 发育开关作用可能只是特殊事件，靶标 预测清楚的表明含某一种m i r n a 多个结合位点的m r n a 非常稀少，大约只有2 的预测靶基 因有一个以上同一个m i r n a 结合位点。大多数推测的靶基因只有一个某m i r n a 结合位点， 即只能结合一个该m i r n a , 这对m i r n a 行使开关式的调控功能来说是不足够的。通过 m i r 3 0 a 3 b 敲除或过表达实验发现蛋白质水平的改变，虽然已确认的转录物序列与 m i r 3 0 a 3 p 部分互补，但没有一个是被常用的靶点预测的方法所确认的。这暗示t m i r n a 与靶标m r n a 功能性的相互作用比以前意识到的复杂的多1 3 引。多项靶点预测的报导也认同 存在多m i r n a 对同一靶点协同调控的作用【3 9 。4 1 1 。为了确认靶标预测的准确性，曾有多个 m i r n a , m i r 1 2 4 ，m i r 3 7 5 ，l e t 7 b 联合转染细胞观察到了预测靶点的抑制效应【4 2 1 。最近的实验 通过分析观测基因中相同或不同m i r n a 种子序列结合位点之间的距离，提出m i r n a 联合抑 制的效果与靶点之间的距离有关，最佳的靶点间距是1 3 3 5 n t l 3 9 1 ，另外具有二级结构的靶标 m r n a 自身可能拮抗m i r n a 的抑制作用。 m i r n al e t 7 研究概述： 2 0 0 0 年在新秀丽小杆线虫发育时序调控的研究中，意外地发现了l i n - 4 以外的第二个 m i r n al e t 7 ，自此m i r n a 在机体发育调控中的作用引起了人们极大的关注。研究发现， 长度在2 i n t 上下的m i r n a l e t 7 在一系列广泛的动物样本中都能检测得到，包括节肢动物， 环节动物，软件动物，半索海生动物，脊椎动物。l e t 7 在机体发挥时序调节的作用，首次 检测出l e t 7r n a 表达的时期是线虫，果蝇幼虫发育的晚期，斑马鱼受精后的4 8 小时，环 节动物和软件动物的成虫阶段。l e t 7 及其家族成员m i r 4 8 ，m i r 8 4 分别通过下调l i n 4 1 和 其它尚未确定的基因调控线虫的四期幼虫向成虫转变1 4 3 1 。 在人类基因组，l e t 7 的同源序列构成了目前发现的人m i r n a 中最大的一个家族，共 有1 2 个，位于不同的染色体上。对人体组织进行分析检测，发现l e t 7 的转录产物在人体 多种组织中都有表达，但在不同的组织中，表达水平不同，以骨髓中最低。因骨髓中大部 分是未成熟细胞，这与在其它动物身上发现的l e t 7 在发育晚期表达这一现象相符合。l e t 7 组织表达水平的差异性，也表明l e t 7 可能调控细胞种类的形成。鉴于此，p a s q u i n e l l ie t a l 曾 提议，把这种类型的r n a s 命名为小时序r n a s ( s m m lt e m p o r a lr n a s ，s t r n a ) 1 4 3 】。目前 对人类l e t 7 的研究主要集中在l e t 7 对神经系统发育和癌症发生的影响。 1 0 浙江理工大学硕士学位论文 l e t 7 家族目前发现有前体基因1 2 个，分别编码9 个不同的1 9 2 2 个核苷酸长的成熟 m i r n a 序列。该家族成员分布在3 ，9 ，1 1 ，1 2 ，1 9 ，2 1 ，2 2 及x 染色体上，位于内含子 区，外显子区或基因间区。它们有的与本家族m i r n a 或其它家族m i r n a 簇状分布，有的 则单独分布于基因组中。l e t 7 家族成熟m i r n a 的命名按照从1 e t 7 a 到l e t 7 j 的顺序进行， 此外还有一个高度相关的m i r 9 8 。命名遵循以下规则：1 与成熟的l e t 7 a 序列相比，该家 族其它成熟m i r n a 核酸序列存在1 3 个碱基的不同，则该成员按字母表顺序以下一个不 同的字母来命名，如l e t 7 b ，l e t 7 c ，l e t 7 d ；2 成熟m i r n a 的核酸序列完全相同，但前体m i r